PL231469B1 - Nowy związek, sposób jego otrzymywania, roztwór farmaceutyczny zawierający nowy związek, sposób określania obecności choroby nowotworowej, zestaw do wykrywania nowotworów oraz zastosowanie hydrolizy nowego związku do wykrywania nowotworów - Google Patents

Nowy związek, sposób jego otrzymywania, roztwór farmaceutyczny zawierający nowy związek, sposób określania obecności choroby nowotworowej, zestaw do wykrywania nowotworów oraz zastosowanie hydrolizy nowego związku do wykrywania nowotworów

Info

Publication number
PL231469B1
PL231469B1 PL416395A PL41639516A PL231469B1 PL 231469 B1 PL231469 B1 PL 231469B1 PL 416395 A PL416395 A PL 416395A PL 41639516 A PL41639516 A PL 41639516A PL 231469 B1 PL231469 B1 PL 231469B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
dap
resin
anb
solution
fmoc
Prior art date
Application number
PL416395A
Other languages
English (en)
Other versions
PL416395A1 (pl
Inventor
Adam LESNER
Adam Lesner
Magdalena WYSOCKA
Magdalena Wysocka
Dawid NIDZWORSKI
Dawid Nidzworski
Original Assignee
Inst Biotechnologii I Medycyny Molekularnej
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inst Biotechnologii I Medycyny Molekularnej filed Critical Inst Biotechnologii I Medycyny Molekularnej
Priority to PL416395A priority Critical patent/PL231469B1/pl
Priority to EP17727737.3A priority patent/EP3423111B1/en
Priority to US16/082,032 priority patent/US10556925B2/en
Priority to PL17727737.3T priority patent/PL3423111T3/pl
Priority to PCT/PL2017/000018 priority patent/WO2017150997A1/en
Publication of PL416395A1 publication Critical patent/PL416395A1/pl
Publication of PL231469B1 publication Critical patent/PL231469B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1019—Tetrapeptides with the first amino acid being basic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57557—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of other specific parts of the body, e.g. brain
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/976—Trypsin; Chymotrypsin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest nowy związek, sposób jego otrzymywania, roztwór farmaceutyczny zawierający nowy związek, sposób określania obecności choroby nowotworowej, zestaw do wykrywania nowotworów oraz zastosowanie hydrolizy nowego związku do wykrywania nowotworów.
Synteza peptydów na fazie stałej (nośniku) została wprowadzona po raz pierwszy w latach 80 ubiegłego wieku przez Bruca Merfielda, który za to osiągnięcie otrzymał nagrodę Nobla.
Proteasom jest multikatalitycznym kompleksem endopeptydazy (EC 3.4.25.1) odpowiedzialnym za nielizosomalne usuwanie białek uszkodzonych i nieprawidłowo ukształtowanych w wyniku wystąpienia mutacji lub pod wpływem czynników zewnętrznych powodujących stres oksydacyjny. Dotychczas opracowane związki umożliwiające oznaczanie aktywności proteasomu 20S lub 26S to krótkie peptydy zawierające 4-5 reszt aminokwasowych zawierające na C-końcu ugrupowanie fluorescencyjne. Związki te umożliwiają oznaczanie aktywności proteasomu w tym w obecności proteasomu lub innego enzymu proteolitycznego C-końcowa grupa fluorescencyjna ulega uwolnieniu wykazując wysoki stopień fluorescencji. Przykładowe sekwencje takich substratów fluorogenicznych opisano w pracy Ma, wykorzystując tego typu związki do oznaczania aktywności proteasomu w osoczu. Leu-Lcu-Val-Tyr-AMC, AMC to aminokumaryna.
Przegląd danych literaturowych wskazuje że głównym obiektem badań monitorujących poziom aktywności proteasomu są nowotwory układu krwionośnego. Zdecydowana większość pochodnych peptydowych będących substratami proteasomu została opracowana w laboratoriach komercyjnych takich jak Promega czy Molecular Probes. Alternatywnie pomiar stężenia proteasomu przeprowadza się stosując techniki immunochemiczne (testy ELISA) które wykorzystują rozpoznanie określonej podjednostki proteasomu przez określony typ przeciwciał. Jednak procedura ta jest czasochłonna i prowadzi do oznaczania całej populacji proteasomu a nie jego aktywnie enzymatycznej frakcji.
Opracowany i otrzymany nowy związek - znakowany peptyd charakteryzuje się wysoką wartością stałej specyficzności (rzędu 4,3 x 106 M’1s’1) oraz właściwym dla tego typu oznaczeń limitem oznaczalności i detekcji, wynoszącym odpowiednio 10 pM i 0,4 pM. Wartości te świadczą o tym że związek jest hydrolizowany przez proteasom z dużą wydajnością, a ponadto już w obecności 10 pM tego enzymu. Cała procedura oznaczania aktywności proteasomu wymaga niewiele czasu (30 minut), nieskomplikowana (wymaga zmieszania 2 roztworów oraz wymaga niewielkiej ilości łatwo dostępnego materiału biologicznego jakim jest ludzki mocz (minimalna objętość 50 μ^. Podstawową zaletą otrzymanego związku i związanej z nią metody jest możliwość diagnostyki nowotworu pęcherza moczowego poprzez opisaną poniżej procedurę. Wynik dodatni (wzrost fluorescencji w czasie) jest jednoznaczny z obecnością w moczu aktywnego proteasomu co z kolei silnie koreluje z obecnością nowotworu.
W wynalazku P. 408905 ujawniono nowy związek, którego hydroliza w pozycji 5 poprzez proteasom 20s ma zastosowanie do wykrywania nowotworów, korzystnie nowotworu pęcherza. Jednak związek zastrzeżony w przedmiotowym wynalazku jest bardziej selektywny od poprzedniego przez co jest bardziej czuły w stosunku do wykrywania nowotworu (3,2 razy czulszy w oznaczalności i 12,5 razy czulszy w detekcji), ponadto jest w stanie wykryć mniejszą ilość proteasomu 20s. Nowy związek nie jest peptydem czyli nie jest podatny na degradację.
Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowego związku i sposobów, które mogłyby być zastosowane do wykrywania nowotworów, korzystnie nowotworu pęcherza.
Przedmiotem zgłoszenia jest związek o wzorze ogólnym: ABZ-Dap(O2(Cbz))-Dap(O1)-Dap(O2)-Arg-ANB-NH2 metoda jego syntezy oraz zastosowanie.
W syntezie związku wykorzystano nowe bloki budulcowe będące pochodnymi kwasu diaminopropionowego (Dap) zmodyfikowane sfunkcjonalizowanymi resztami glikolu mono lub dietylenowego (PEG) (których proponowana nazwa ogólna to DAPEG (DAP+PEG) których przykładowa synteza przedstawiona jest na rys 1.
Przedmiotem wynalazku jest nowy związek o wzorze ogólnym:
ABZ1-Dap(O2(Cbz))2-Dap(O1)3-Dap(O2)4-Arg5-ANB6-NH2 gdzie:
ABZ oznacza kwas 2-aminobeznoesowy
DAP oznacza pochodne kwasu diaminopropionowego (Dap) zmodyfikowane sfunkcjonalizowanymi resztami glikolu mono lub dietylenowego (PEG)
ANB oznacza kwas 5-amino-2-nitrobenzoesowy
PL 231 469 B1
Ponadto przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania nowego związku zdefiniowanego powyżej, który następuje w etapach:
a) usunięcie ugrupowania Fmoc z grupy aminowej żywicy TENTA GEL S RAM poprzez wytrząsanie z roztworem 20% piperydyny w DMF;
b) do tak przygotowanego nośnika przyłączono cząsteczkę ANB;
c) w następnym etapie do ANB-żywicy przyłączono Fmoc-Arg(Pbf);
d) następnie usunięto ugrupowanie Fmoc z grupy aminowej Arg(Pbf)-ANB-żywicy przy użyciu roztworu 20% piperydyny w DMF;
e) do tak przygotowanej żywicy przyłączono Fmoc-Dap(Mtt) według standardowej procedury z użyciem HBTU i DIPEA (1:2);
f) z Fmoc-Dap(Mtt)-Arg(Pbf)-ANB-żywicy w kolejnym kroku usunięto ugrupowanie Mtt za pomocą roztworu 2% TFA w chlorku metylenu (DCM) z dodatkiem 1% triisopropylsilanu, czas mieszania 15 minut;
g) po tym czasie do próbki żywicy dodano 3 krople kwasu trifluorooctowego (TFA) i obserwowano powstawanie żółtego koloru wynikającego z obecności wolnych grup Mtt;
h) procedurę powtarzano aż do uzyskania bezbarwnego roztworu;
i) w kolejnym etapie żywicę przepłukano trzykrotnie roztworem diizoproplyloetanoloaminy w DMF (30%) i otrzymano Fmoc-Dap-Arg(Pbf)-ANB-żywicę do której dodano roztwór PEG/DIPCI/HOBt w mieszaninie DMF/NMP (1:1, v/v);
j) reakcję acylowania reszty O2(Boc) prowadzono aż do uzyskania negatywnego testu keisera wskazującego na brak wolnych grup aminowych na żywicy;
k) następnie usuwano ugrupowanie Fmoc i przyłączano kolejną resztę Fmoc-Dap(Mtt) i całą procedurę powtarzano stosując różne reszty PEG i tak w pozycji 3 stosowano O1(Boc) a w pozycji 4 O2(Cbz);
l) syntezę peptydomimetyku zakończyło przyłączenie ugrupowania ABZ;
m) otrzymany peptydomimetyk usunięto następnie z żywicy z jednoczesnym usunięciem osłon bocznych, przy użyciu roztworu TFA/fenol/triisopropylsilan/H2O 88:5:2:5,v/v), otrzymując ABZ-Dap(O2(Cbz))-Dap(O1)-Dap(O2)Arg-ANB-NH2.
Sposób gdzie etap b) przed przystąpieniem do przyłączenia ANB do nośnika stałego przygotowano żywicę z wolną grupą aminową poprzez przemycie jej trzykrotnie 5% roztworem N-metylomorfoliny (NMM) w DMF, a następnie DMF (również trzykrotnie), następnie w kolbie okrągłodennej rozpuszczono ANB w 40 ml DMF i dodałam kolejno HBTU, DMAP oraz DIPEA w następujących stosunkach molowych:
ANB : HBTU : DMAP : DIPEA (3 : 3 : 2 : 6), roztwór ten połączono z żywicą, reakcję prowadzono przez 3 godziny, po tym czasie odsączono żywicę pod zmniejszonym ciśnieniem i przepłukano, procedurę przyłączania ANB do polimeru powtórzono dwukrotnie.
Sposób gdzie etap c) proces ten rozpoczęto od rozpuszczenia 9-krotnego nadmiaru danej pochodnej w pirydynie (22,2 ml) (na 1 g peptydylożywicy przypada 10 ml pirydyny), następnie mieszaninę aminokwasu w pirydynie połączono z porcją żywicy z osadzonym kwasem 5-amino-2-nitrobenzoesowym, całość schłodzono w łaźni lodowej (sporządzonej poprzez zmieszanie 1 cz. wagowej lodu, 1 cz. wagowej NH4CI i 1 cz. wagowej NaNO3) do temperatury -15°C, po czym dodano 9-krotny nadmiar tlenochlorku fosforu(V) (POCI3), całość mieszano na mieszadle magnetycznym przez 20 minut, po tym czasie zmieniono temperaturę reakcji do temperatury pokojowej przez kolejne 30 minut, a następnie kolbkę z mieszaniną umieszczono w łaźni olejowej i w temperaturze 40°C ogrzewano przez 6 godzin; po zakończonej reakcji odsączono żywicę z przyłączoną pierwszą resztą aminokwasową na lejku Schotta pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie przemyto ją metanolem (MeOH) oraz chlorkiem metylenu.
Przedmiotem wynalazku jest również roztwór farmaceutyczny do wykrywania nowotworów zawierający substancję czynną i bufor gdzie jako substancję czynną zawiera nowy związek określony powyżej oraz bufor o pH 7-9.
Roztwór gdzie bufor stanowi TRIS HCl.
Roztwór, który wykrywa nowotwory, korzystnie nowotwór pęcherza moczowego.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób określania obecności choroby nowotworowej, która obejmuje analizowanie in vitro pobranej od człowieka próbki moczu, do której dodaje się nowy związek określony w zastrzeżeniu 1 i/lub inkubuje się z inhibitorem podjednostki trypsynowej PR671A.
PL 231 469 B1
Sposób, gdzie dokonuje się w czasie 1 min, 60 min. pomiaru intensywności fluorescencji powstałej na skutek uwolnienia fragmentu zawierającego znacznik fluorescencyjny ABZ-Dap(O2(Cbz))-Dap(O1)-Dap(O2)-Arg.
Sposób, który wykrywa nowotwory, korzystnie nowotwór pęcherza moczowego.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest zestaw do wykrywania nowotworów, korzystnie nowotworu pęcherza moczowego, który zawiera nowy związek określony powyżej oraz inhibitor podjednostki trypsynowej PR671A.
Zastosowanie hydrolizy nowego związku określonego powyżej w pozycji 5 poprzez proteasom 20s do wykrywania nowotworów, korzystnie nowotworu pęcherza.
Określenia stosowane powyżej oraz w opisie i zastrzeżeniach patentowych, mają następujące znaczenie:
ABZ - kwas 2-aminobenzoesowy
ANB - kwas 5-amino-2-nitrobenzoesowy
Dap - pochodne kwasu diaminopropionowego
DAPEG - związek zawierający reszty Dap i PEG
PEG - sfunkcjonalizowane reszty glikolu mono lub dietylenowego
DIPCI - to diizopropylokarbodiimid
PEG = (O2(Cbz) - Kwas 8-(benzyloksykarbonyloamino)-3,6-dioksaoktanowy
O1(Boc) - Kwas 5-(t-butyloksykarbonyloamino)-3-oksapentanowy
Opis figur:
Fig. 1 - przedstawia syntezę przykładowej reszty DAPEG
Fig. 2 - przedstawia elementy budulcowe biblioteki zawierające reszty DAPEG.
Fig. 3 - przedstawia przykład syntezy związku zawierającego reszty DAPEG
Fig. 4 - przedstawia wzór związku - substratu selektywnie hydrolizowanego przez podjednostkę trypsynopodobna proteasomu 20S.
Fig. 4A - przedstawia widmo masowe związku ABZ-Dap(O2(Cbz))-Dap(O1)-Dap(O2)Arg-ANB-NH2 (masa cząsteczkowa 1283). Obecne jony 1282.6 (pseudomolekularny) i M-15 jon fragmentacyjny.
Fig. 5 - przedstawia wpływ inhibitorów na stopień hydrolizy związku. Gdzie PR523 A - carfilzomib inhibitor podjednostki chymotrypsynopodobnej proteasomu 20S. NCOO1 inhibitor podjednostki kaspazopodobnej proteasomu 20S, PR671A inhibitor podjednostki trypsynopodobnej proteasomu 20S, epoksymycyna - inhibitor wszystkich trzech aktywności proteasomu 20S.
Fig. 6 - przedstawia krzywą miareczkowania związku przez zmniejszające stężenie 20S proteasomu. Osiągnięto limit detekcji na poziomie 10-11 M co odpowiada 5x10-16 g.
Fig. 7 - przedstawia hydrolizę związku ABZ-Dap(O2(Cbz))-Dap(O1)-Dap(O2)-Arg-ANB-NH2 w obecności proteasomu 20S. A) czas 1 minuta B) 60 minut. Pik o czasie retencji 16,15 to związek ABZ-Dap(Cbz)-Dap(O1)-Dap(Cbz)-Arg-ANB-NH2 pik o czasie retencji 15,23 to fragment ABZ-Dap(Cbz)-Dap(O1)-Dap(Cbz)-Arg-OH
Fig. 8 - przedstawia hydrolizę związku ABZ-Dap(O2(Cbz))-Dap(O1)-Dap(O2)-Arg-ANB-NH2 w ludzkim moczu (A) zdrowy (B) zdiagnozowany nowotwór pęcherza. Pik o czasie retencji 16,15 to związek ABZ-Dap(O2(Cbz))-Dap(O1)-Dap(O2)-Arg-ANB-NH2 pik o czasie retencji 15,23 to fragment ABZ-Dap(O2Cbz)-Dap(O1)-Dap(O2)-Arg-OH
Fig. 9 - przedstawia wpływ inhibitorów na hydrolizę związku przez próbkę moczu z diagnozą nowotworową.
Fig. 10 - przedstawia wstępną diagnostykę raka pęcherza. Próbki 1-21 pochodzą od pacjentów z diagnozą raka pęcherza. 22-28 próbki kontrolne osób zdrowych.
Fig. 11 - przedstawia żel SDS PAGE Barwiony srebrem (A) analiza Western blot (B) próbek moczu osób zdrowych (22-24) i chorych (2,5,8,10,14,16,20,21). Mysie przeciwciało monoklonalne anty20S IgG1 zostało stosowane jak przeciwciało pierwszorzędowe a królicze przeciw-mysie IgG-HRP jako drugorzędowe. Sygnał uzyskano stosując substrat chemiluminescencyjny.
Wynalazek ilustruje następujący przykład wykonania, nie stanowiący jego ograniczenia
P r z y k ł a d
Synteza peptydomimetyku ABZ-Dap(O2(Cbz))-Dap(O1 )-Dap(O2)-Arg-ANB-NH2
Synteza peptydomimetyku ABZ-Dap(O2(Cbz))-Dap(O1)-Dap(O2)-Arg-ANB-NH2, składa się z kilkunastu etapów.
PL 231 469 B1
1. Pierwszy z nich to usunięcie ugrupowania Fmoc z grupy aminowej żywicy TENTA GEL S RAM poprzez wytrząsanie z roztworem 20% piperydyny w DMF. W kolejnym kroku do tak przygotowanego nośnika przyłącza się cząsteczkę ANB (kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego). Przed przystąpieniem do przyłączenia ANB do nośnika stałego przygotowano żywicę z wolną grupą aminową poprzez przemycie jej trzykrotnie 5% roztworem N-metylomorfoliny (NMM) w DMF, a następnie DMF (również trzykrotnie). Następnie w kolbie okrągłodennej rozpuszczono ANB w 40 ml DMF i dodano kolejno HBTU, DMAP oraz DIPEA w następujących stosunkach molowych: ANB : HBTU : DMAP : DIPEA (3 : 3 : 2 : 6). Roztwór ten połączono z żywicą, reakcję prowadzono przez 3 godziny. Po tym czasie odsączono żywicę pod zmniejszonym ciśnieniem i przepłukano. Procedurę przyłączania ANB do polimeru powtórzono dwukrotnie.
2. W następnym kroku do ANB-żywicy przyłączono Fmoc-Arg(Pbf). Proces ten rozpoczęto od rozpuszczenia 9-krotnego nadmiaru danej pochodnej w pirydynie (22,2 ml) (na 1 g peptydylożywicy przypada 10 ml pirydyny). Następnie mieszaninę aminokwasu w pirydynie połączono z porcją żywicy z osadzonym kwasem 5-amino-2-nitrobenzoesowym. Całość schłodzono w łaźni lodowej (sporządzonej poprzez zmieszanie 1 cz. wagowej lodu, 1 cz. wagowej NH4Cl i 1 cz. wagowej NaNO3) do temperatury -15°C, po czym dodano 9-krotny nadmiar tlenochlorku fosforu(V) (POCI3). Całość mieszano na mieszadle magnetycznym przez 20 minut. Po tym czasie zmieniono temperaturę reakcji do temperatury pokojowej przez kolejne 30 minut, a następnie kolbkę z mieszaniną umieszczono w łaźni olejowej i w temperaturze 40°C ogrzewano przez 6 godzin. Po zakończonej reakcji odsączono żywicę z przyłączoną pierwszą resztą aminokwasową na lejku Schotta pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie przemyto ją metanolem (MeOH) oraz chlorkiem metylenu.
Następnie usunięto ugrupowanie Fmoc z grupy aminowej Arg(Pbf)-ANB- żywicy przy użyciu roztworu 20% piperydyny w DMF.
3. Do tak przygotowanej żywicy przyłączono Fmoc-Dap(Mtt) wg standardowej procedury z użyciem HBTU i DIPEA (1:2). Z Fmoc-Dap(Mtt)-Arg(Pbf)-ANB-żywicy w kolejnym kroku usunięto ugrupowanie Mtt za pomocą roztworu 2% TFA w chlorku metylenu (DCM) z dodatkiem 1% triisopropylsilanu. Czas mieszania 15 minut. Po tym czasie do próbki żywicy dodano 3 krople kwasu trifluorooctowego (TFA) i obserwowano powstawanie żółtego koloru wynikającego z obecności wolnych grup Mtt. Procedurę powtarzano aż do uzyskania bezbarwnego roztworu.
4. W kolejnym etapie żywicę przepłukano trzykrotnie roztworem diizopropyloetanoloaminy w DMF (30%). W efekcie otrzymano Fmoc-Dap-Arg(Pbf)-ANB-żywicę do której dodano roztwór PEG/DIPCI/HOBt w mieszaninie DMF/NMP (1:1, v/v), gdzie DIPCI to diizopropylokarbodiimid a PEG to kwas 8-(benzyloksykarbonyloamino)-3,6-dioksaoktanowy (O2(Boc). Reakcję acylowania prowadzono aż do uzyskania negatywnego testu keisera wskazującego na brak wolnych grup aminowych na żywicy. Następnie usuwano ugrupowanie Fmoc i przyłączano kolejną resztę Fmoc-Dap(Mtt) i całą procedurę powtarzano stosując różne reszty PEG i tak dla pozycji 3 stosowano O1(Boc) (5-(t-butyloxycarbonylamino)-3-oxapentanoic acid) a w pozycji 4 O2(Cbz).
5. Syntezę peptydomimetyku zakończyło przyłączenie ugrupowania ABZ (kwas 2 aminobenzoesowy).
Otrzymany peptydomimetyk usunięto następnie z żywicy z jednoczesnym usunięciem osłon bocznych, przy użyciu roztworu TFA/fenol/triisopropylsilan/H2O 88:5:2:5, v/v). otrzymując ABZDap(O2(Cbz))-Dap(O1)-Dap(O2)-Arg-ANB-NH2.
Tożsamość/charakterystyka nowego związku
Otrzymany związek hydrolizowany jest selektywnie przez podjednostkę trypsynową ludzkiego proteasomu 20S. Wyniki eksperymentu w ramach którego inkubowano otrzymany związek z proteasomem 20S z wybiórczo zablokowanymi podjednostkami enzymatycznymi to jest: PR523A, carfilzomib selektywne inhibitory podjednostki chymotrypsynowej, NCOO1 selektywny inhibitor podjednostki kaspazowej oraz PR671A inhibitor podjednostki trypsynowej jasno wskazują że brak hydrolizy związku (brak wzrostu fluorescencji) obserwowany jest tylko dla systemu gdy zastosowano inhibitor PR671A (Fig. 5). Ponadto brak aktywności proteasomu zainkubowanego w obecności epoksymycyny (inhibitora wszystkich trzech podjednostek) potwierdza że opracowany związek jest hydrolizowany przez proteasom 20S.
PL 231 469 B1
Miareczkowanie otrzymanego związku zmniejszającymi się ilościami proteasomu 20S (Fig. 6) wskazuje na to że zauważalny przyrost fluorescencji (stosunek sygnału do szumu 3:1) obserwuje się przy stężeniu 10 pM co odpowiada 5x10-16 g proteasomu w próbce.
Na Fig. 7 przedstawiono (A) analizę HPLC RP otrzymanego związku, sygnały około 10 minuty pochodzą ze składnika buforu (bufor to 50 mM TRIS-HCI pH 8,2 z dodatkiem 0,02 % SDS (soli sodowej siarczanu dodecylu), w którym związek rozpuszczono (B) analizę HPLC RP związku inkubowanego w obecności komercyjnie dostępnego ludzkiego proteasomu 20S przez 60 minut. Na fig. 8 przedstawiono podobną analizę z tym że w miejsce proteasomu 20S użyto próbek moczu zdrowego człowieka (A) oraz (B) osoby ze zdiagnozowanym nowotworem pęcherza. Analiza obu rysunków jasno wskazuje że otrzymany związek rozpada się pod wpływem ludzkiego proteasomu 20S na dwa fragmenty ANB-NH2 i fluorescencyjny ABZ-Dap(O2(Cbz)-Dap(O1)-Dap(O2)-Arg-OH.
Fakt ten potwierdza fig. 9 w którym analizie poddano próbkę z fig. 8B (nowotwór raka pęcherza) i 8A (zdrowa) oraz 8B inkubowaną z inhibitorem podjednostki trypsynowej PR671A. Otrzymane wyniki jasno wskazują że w moczu osoby zdrowej nie zachodzi rozpad badanego związku, zaś w moczu osoby z diagnozą raka pęcherza związek się rozpada, co więcej jego rozpad zahamowany jest przez selektywny inhibitor podjednostki trypsynowej.
W dalszym etapie analizie poddano 21 próbek moczu pacjentów z diagnozą nowotworu pęcherza oraz 8 zdrowych osób. Wyniki otrzymane w wyniku takiej analizy wskazują ze wzrost fluorescencji obserwujemy w 20 z 21 próbek osób chorych.
Wybrane próbki poddano analizie za pomocą techniki immunochemicznych (western blot) w którym detekcji ulegał proteasom 20S. Fig. 11 wskazuje że pozytywną odpowiedź (obecność proteasomu uzyskano dla wszystkich próbek osób chorych, zaś dla osób zdrowych nie stwierdzono obecności tego enzymu.

Claims (12)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Nowy związek o wzorze ogólnym: ABZ1-Dap(O2(Cbz))2-Dap(O1)3-Dap(O2)4-Arg5-ANB6-NH2 gdzie:
    ABZ oznacza kwas 2-amino benzoesowy
    DAP oznacza pochodnymi kwasu diaminopropionowego (Dap) zmodyfikowane sfunkcjonalizowanymi resztami glikolu mono lub dietylenowego (PEG)
    ANB oznacza kwas 5-amino-2-nitrobenzoesowy
  2. 2. Sposób otrzymywania nowego związku zdefiniowanego w zastrzeżeniu 1, znamienny tym, że w następujących etapach:
    a. usunięcie ugrupowania Fmoc z grupy aminowej żywicy TENTA GEL S RAM poprzez wytrząsanie z roztworem 20% piperydyny w DMF;
    b. do tak przygotowanego nośnika przyłączono cząsteczkę ANB;
    c. w następnym etapie do ANB-żywicy przyłączono Fmoc-Arg(Pbf);
    d. następnie usunięto ugrupowanie Fmoc z grupy aminowej Arg(Pbf)-ANB-żywicy przy użyciu roztworu 20% piperydyny w DMF;
    e. do tak przygotowanej żywicy przyłączono Fmoc-Dap(Mtt) według standardowej procedury z użyciem HBTU i DIPEA (1:2);
    f. z Fmoc-Dap(Mtt)-Arg(Pbf)-ANB-żywicy w kolejnym kroku usunięto ugrupowanie Mtt za pomocą roztworu 2% TFA w chlorku metylenu (DCM) z dodatkiem 1% triisopropylsilanu, czas mieszania 15 minut;
    g. po tym czasie do próbki żywicy dodano 3 krople kwasu trifluorooctowego (TFA) i obserwowano powstawanie żółtego koloru wynikającego z obecności wolnych grup Mtt;
    h. procedurę powtarzano aż do uzyskania bezbarwnego roztworu;
    i. w kolejnym etapie żywicę przepłukano trzykrotnie roztworem diizoproplyloetanoloaminy w DMF (30%) i otrzymano Fmoc-Dap-Arg(Pbf)-ANB-żywicę do której dodano roztwór PEG/DIPCI/HOBt w mieszaninie DMF/NMP (1:1, v/v);
    j. reakcję acylowania reszty O2(Boc) prowadzono aż do uzyskania negatywnego testu keisera wskazującego na brak wolnych grup aminowych na żywicy;
    PL 231 469 B1
    k. następnie usuwano ugrupowanie Fmoc i przyłączano kolejną resztę Fmoc-Dap(Mtt) i całą procedurę powtarzano stosując różne reszty PEG i tak w pozycji 3 stosowano O1(Boc) a w pozycji 4 O2(Cbz);
    l. syntezę peptydomimetyku zakończyło przyłączenie ugrupowania ABZ;
    m. otrzymany peptydomimetyk usunięto następnie z żywicy z jednoczesnym usunięciem osłon bocznych, przy użyciu roztworu TFA/fenol/triisopropylsilan/H2O 88:5:2:5, v/v), otrzymując ABZ-Dap(O2(Cbz))-Dap(O1)-Dap(O2)Arg-ANB-NH2.
  3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że etap b) przed przystąpieniem do przyłączenia ANB do nośnika stałego przygotowano żywicę z wolną grupą aminową poprzez przemycie jej trzykrotnie 5% roztworem N-metylomorfoliny (NMM) w DMF, a następnie DMF (również trzykrotnie), następnie w kolbie okrągłodennej rozpuszczono ANB w 40 ml DMF i dodałam kolejno HBTU, DMAP oraz DIPEA w następujących stosunkach molowych:
    ANB : HBTU : DMAP : DIPEA (3 : 3 : 2 : 6), roztwór ten połączono z żywicą, reakcję prowadzono przez 3 godziny, po tym czasie odsączono żywicę pod zmniejszonym ciśnieniem i przepłukano, procedurę przyłączania ANB do polimeru powtórzono dwukrotnie.
  4. 4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że etap c) proces ten rozpoczęto od rozpuszczenia 9-krotnego nadmiaru danej pochodnej w pirydynie (22,2 ml) (na 1 g peptydylożywicy przypada 10 ml pirydyny), następnie mieszaninę aminokwasu w pirydynie połączono z porcją żywicy z osadzonym kwasem 5-amino-2-nitrobenzoesowym, całość schłodzono w łaźni lodowej (sporządzonej poprzez zmieszanie 1 cz. wagowej lodu, 1 cz. wagowej NH4CI i 1 cz. wagowej NaNO3) do temperatury -15°C, po czym dodano 9-krotny nadmiar tlenochlorku fosforu(V) (POCI3), całość mieszano na mieszadle magnetycznym przez 20 minut, po tym czasie zmieniono temperaturę reakcji do temperatury pokojowej przez kolejne 30 minut, a następnie kolbkę z mieszaniną umieszczono w łaźni olejowej i w temperaturze 40°C ogrzewano przez 6 godzin; po zakończonej reakcji odsączono żywicę z przyłączoną pierwszą resztą aminokwasową na lejku Schotta pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie przemyto ją metanolem (MeOH) oraz chlorkiem metylenu.
  5. 5. Roztwór farmaceutyczny do wykrywania nowotworów zawierający substancję czynną i bufor, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera nowy związek określony w zastrzeżeniu 1 oraz bufor o pH 7-9.
  6. 6. Roztwór według zastrz. 5, znamienny tym, że bufor stanowi TRIS HCl.
  7. 7. Roztwór według zastrz. 5, znamienny tym, że wykrywa nowotwory, korzystnie nowotwór pęcherza moczowego.
  8. 8. Sposób określania obecności choroby nowotworowej, znamienny tym, że obejmuje analizowanie in vitro pobranej od człowieka próbki moczu, do której dodaje się nowy związek określony w zastrzeżeniu 1 i/lub inkubuje się z inhibitorem podjednostki trypsynowej PR671A.
  9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że dokonuje się w czasie 1 min, 60 min. pomiaru intensywności fluorescencji powstałej na skutek uwolnienia fragmentu zawierającego znacznik fluorescencyjny ABZ-Dap(O2(Cbz))-Dap(O1)-Dap(O2)-Arg.
  10. 10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że wykrywa nowotwory, korzystnie nowotwór pęcherza moczowego.
  11. 11. Zestaw do wykrywania nowotworów, korzystnie nowotworu pęcherza moczowego, znamienny tym, że zawiera nowy związek określony w zastrzeżeniu 1 oraz inhibitor podjednostki trypsynowej PR671A.
  12. 12. Zastosowanie hydrolizy nowego związku określonego w zastrzeżeniu 1 w pozycji 5 poprzez proteasom 20s do wykrywania nowotworów, korzystnie nowotworu pęcherza
PL416395A 2016-03-04 2016-03-04 Nowy związek, sposób jego otrzymywania, roztwór farmaceutyczny zawierający nowy związek, sposób określania obecności choroby nowotworowej, zestaw do wykrywania nowotworów oraz zastosowanie hydrolizy nowego związku do wykrywania nowotworów PL231469B1 (pl)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL416395A PL231469B1 (pl) 2016-03-04 2016-03-04 Nowy związek, sposób jego otrzymywania, roztwór farmaceutyczny zawierający nowy związek, sposób określania obecności choroby nowotworowej, zestaw do wykrywania nowotworów oraz zastosowanie hydrolizy nowego związku do wykrywania nowotworów
EP17727737.3A EP3423111B1 (en) 2016-03-04 2017-03-03 Compound, process for its preparation, a pharmaceutical solution containing the compound, a method of determining the presence of cancer, a kit for cancer detection, and the of hydrolysis of the compound for the detection of cancer
US16/082,032 US10556925B2 (en) 2016-03-04 2017-03-03 Compound, process for its preparation, a pharmaceutical solution containing the compound, a method of determining the presence of cancer, a kit for cancer detection, and the use of hydrolysis of the compound for the detection of cancer
PL17727737.3T PL3423111T3 (pl) 2016-03-04 2017-03-03 Związek, sposób jego otrzymywania, roztwór farmaceutyczny zawierający związek, sposób określania obecności choroby nowotworowej, zestaw do wykrywania nowotworów oraz zastosowanie hydrolizy związku do wykrywania nowotworów
PCT/PL2017/000018 WO2017150997A1 (en) 2016-03-04 2017-03-03 Compound, process for its preparation, a pharmaceutical solution containing the compound, a method of determining the presence of cancer, a kit for cancer detection, and the use of hydrolysis of the compound for the detection of cancer

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL416395A PL231469B1 (pl) 2016-03-04 2016-03-04 Nowy związek, sposób jego otrzymywania, roztwór farmaceutyczny zawierający nowy związek, sposób określania obecności choroby nowotworowej, zestaw do wykrywania nowotworów oraz zastosowanie hydrolizy nowego związku do wykrywania nowotworów

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL416395A1 PL416395A1 (pl) 2017-09-11
PL231469B1 true PL231469B1 (pl) 2019-02-28

Family

ID=58995198

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL416395A PL231469B1 (pl) 2016-03-04 2016-03-04 Nowy związek, sposób jego otrzymywania, roztwór farmaceutyczny zawierający nowy związek, sposób określania obecności choroby nowotworowej, zestaw do wykrywania nowotworów oraz zastosowanie hydrolizy nowego związku do wykrywania nowotworów
PL17727737.3T PL3423111T3 (pl) 2016-03-04 2017-03-03 Związek, sposób jego otrzymywania, roztwór farmaceutyczny zawierający związek, sposób określania obecności choroby nowotworowej, zestaw do wykrywania nowotworów oraz zastosowanie hydrolizy związku do wykrywania nowotworów

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL17727737.3T PL3423111T3 (pl) 2016-03-04 2017-03-03 Związek, sposób jego otrzymywania, roztwór farmaceutyczny zawierający związek, sposób określania obecności choroby nowotworowej, zestaw do wykrywania nowotworów oraz zastosowanie hydrolizy związku do wykrywania nowotworów

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10556925B2 (pl)
EP (1) EP3423111B1 (pl)
PL (2) PL231469B1 (pl)
WO (1) WO2017150997A1 (pl)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL238871B1 (pl) * 2018-02-13 2021-10-18 Univ Gdanski Peptydomimetyk oraz jego zastosowanie jako środek fluorescencyjny in vitro

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL224854B1 (pl) * 2013-08-23 2017-02-28 Univ Warszawski Nowy peptydomimetyk o aktywności antyangiogennej i zawierająca go kompozycja farmaceutyczna

Also Published As

Publication number Publication date
US20190248835A1 (en) 2019-08-15
US10556925B2 (en) 2020-02-11
PL3423111T3 (pl) 2024-09-02
EP3423111B1 (en) 2023-08-16
PL416395A1 (pl) 2017-09-11
WO2017150997A1 (en) 2017-09-08
EP3423111A1 (en) 2019-01-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL231469B1 (pl) Nowy związek, sposób jego otrzymywania, roztwór farmaceutyczny zawierający nowy związek, sposób określania obecności choroby nowotworowej, zestaw do wykrywania nowotworów oraz zastosowanie hydrolizy nowego związku do wykrywania nowotworów
IL312534A (en) Enzymatic FRET substrate and its uses in the treatment of liver cancer
US20250270617A1 (en) Compound - diagnostic marker for kidney cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of kidney cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of kidney cancer
JP2026500952A (ja) 化合物 － 胆道がんの診断マーカー、酵素活性の検出法、胆道がんの診断法、本化合物を含むキット、本化合物の使用、及び胆道がんの治療法
US20250003970A1 (en) Fret enzymatic substrate and uses thereof in lung cancer
JP2025535688A (ja) 化合物 － 卵巣がん用診断マーカー、酵素活性の検出法、卵巣がんの診断法、本化合物を含むキット、本化合物の使用、及び卵巣がんの治療法
US20250206777A1 (en) Compound - diagnostic marker for intestinal cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of intestinal cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of intestinal cancer
WO2025005815A1 (en) Compound, diagnostic marker for breast cancer, method for detecting enzymatic activity, method for the diagnosis of breast cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of breast cancer
CN112794878B (zh) 去泛素化酶活性探针及其制备和应用
HK40113726A (zh) 化合物-肾癌诊断标志物、酶活性检测方法、肾癌诊断方法、包含该化合物的试剂盒、化合物的用途及肾癌治疗方法
HK40121437A (zh) 化合物-卵巢癌诊断标记物、检测酶活性的方法、诊断卵巢癌的方法、包含所述化合物的试剂盒、所述化合物的用途和治疗卵巢癌的方法
PL241174B1 (pl) Związek chemiczny-marker diagnostyczny nowotworu trzustki oraz sposób diagnozowania in vitro nowotworu trzustki
JP2025521809A (ja) 化合物 － 子宮体がん用診断マーカー、酵素活性の検出法、子宮体がんの診断法、本化合物を含むキット、本化合物の使用、及び子宮体がんの治療法
PL236125B1 (pl) Związki chemiczne mające zastosowanie jako markery diagnostyczne stanu zapalnego i nowotworów, sposób ich otrzymywania, marker diagnostyczny i metoda diagnozowania procesów zapalnych i nowotworów nabłonkowych
JP2026506172A (ja) 化合物、胃がんの診断マーカー、酵素活性の検出法、胃がんの診断法、本化合物を含むキット、本化合物の使用、及び胃がんの治療法
WO2025216642A1 (en) Enzymatic activity based method and marker for the diagnosis of brain tumour
HK40111059A (zh) 化合物——肠癌诊断标志物、酶活性检测方法、肠癌诊断方法、包含该化合物的试剂盒、化合物的用途和治疗肠癌的方法
EP3431490A1 (en) Chemical compounds for use as diagnostic markers of inflammation and neoplams, the method for synthesis of the chemical compounds, diagnostic kit for use in diagnosis of inflammatory processes and epithelial neoplasms and in vitro diagnostic method of inflammatory processes and epithelial neoplasms
HK40066280A (zh) 类胰蛋白酶活性测定用底物
HK40066280B (zh) 类胰蛋白酶活性测定用底物
PL238699B1 (pl) Związek chemiczny mający zastosowanie jako marker diagnostyczny nowotworów, sposób otrzymywania, metoda diagnozowania nowotworów nabłonkowych