PL238871B1 - Peptydomimetyk oraz jego zastosowanie jako środek fluorescencyjny in vitro - Google Patents
Peptydomimetyk oraz jego zastosowanie jako środek fluorescencyjny in vitro Download PDFInfo
- Publication number
- PL238871B1 PL238871B1 PL424583A PL42458318A PL238871B1 PL 238871 B1 PL238871 B1 PL 238871B1 PL 424583 A PL424583 A PL 424583A PL 42458318 A PL42458318 A PL 42458318A PL 238871 B1 PL238871 B1 PL 238871B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- o2oc
- compound
- cell
- resin
- dap
- Prior art date
Links
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 title description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 33
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- PECYZEOJVXMISF-REOHCLBHSA-N 3-amino-L-alanine Chemical compound [NH3+]C[C@H](N)C([O-])=O PECYZEOJVXMISF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- RUVRGYVESPRHSZ-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2-azaniumylethoxy)ethoxy]acetate Chemical compound NCCOCCOCC(O)=O RUVRGYVESPRHSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 20
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 19
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 19
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 9
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 7
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical group OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 3-aminoalanine Chemical compound [NH3+]CC(N)C([O-])=O PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 5
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 4
- LRAMQBKQEYONOM-UHFFFAOYSA-N 9h-fluoren-9-ylmethyl n-(3-aminopropyl)carbamate Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)NCCCN)C3=CC=CC=C3C2=C1 LRAMQBKQEYONOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- -1 amino, hydroxyl Chemical group 0.000 description 4
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical group OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 3
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 description 2
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 229910000071 diazene Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- RZICEOJUAFHYFO-UHFFFAOYSA-N 1-hydroperoxyhexane Chemical compound CCCCCCOO RZICEOJUAFHYFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YILMHDCPZJTMGI-UHFFFAOYSA-N 2-(3-hydroxy-6-oxoxanthen-9-yl)terephthalic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(C(O)=O)C(C2=C3C=CC(=O)C=C3OC3=CC(O)=CC=C32)=C1 YILMHDCPZJTMGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000394635 Acetomicrobium mobile Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 101000798100 Bos taurus Lactotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 101000798114 Homo sapiens Lactotransferrin Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N O-(3-O-D-galactosyl-N-acetyl-beta-D-galactosaminyl)-L-serine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](OC[C@H]([NH3+])C([O-])=O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N 0.000 description 1
- 108010063654 YTA2 peptide Proteins 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000004323 caveolae Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000050459 human LTF Human genes 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical group 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000034701 macropinocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- ZYWUVGFIXPNBDL-UHFFFAOYSA-N n,n-diisopropylaminoethanol Chemical compound CC(C)N(C(C)C)CCO ZYWUVGFIXPNBDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest peptydomimetyk oraz zastosowanie tego związku do wykrywania kwasów nukleinowych w jądrach komórkowych jako środek fluorescencyjny do użycia in vitro.
Peptydy penetrujące błonę komórkową (ang. cel penetrating peptides, CPPs) zawierają zazwyczaj w sekwencji do 30 reszt aminokwasowych i są w stanie wydajnie przenikać przez błonę komórkową bez istotnych oznak cytotoksyczności. Są to peptydy amfipatyczne i dodatnio naładowane zdolne do transportu przyłączonej do nich cząsteczki chemicznej (ang. cargo) do wnętrza komórki. Jednym z przykładów syntetycznych CPP jest motyw poliargininy - peptydu zawierającego co najmniej sześć reszt Arg. Dane literaturowe wskazują na większą wydajność translokacji tego peptydu w porównaniu do naturalnych CPP. Wiadomo też, że peptydy o tych właściwościach wydajnie transportują przyłączony do nich związek o masie 100-krotnie większej niż sam peptyd. Przenoszony związek może być przyłączony do CPP wiązaniami kowalencyjnymi lub też niekowalencyjnie (wykorzystując odziaływania hydrofobowe lub elektrostatyczne) poprzez utworzenie kompleksu CPP-cargo.
Istnieje szereg teorii opisujących mechanizm przenikania CPP przez błonę komórkową. Zalicza się do nich transport bezpośredni oraz różne formy endocytozy. Transport bezpośredni przebiega poprzez wytworzenie porów w błonie komórkowej, która po wniknięciu peptydu ulega regeneracji. Istnieje również szereg doniesień o transporcie CPP poprzez różne szlaki endocytozy w tym makropinocytozę lub endocytozę wykorzystującą kaweole lub tratwy lipidowe.
Niezależnie od mechanizmu w jaki CPP przenikają przez błonę fosfolipidową, związki te są wykorzystywane w terapii wybranych chorób w tym nowotworowych, w których cargo stanowią chemoterapeutyki w niewielkim stopniu penetrujące komórkę.
Lindgren i współautorzy wykorzystali metotreksan skonjugowany z peptydem YTA2 uzyskując zniesienie oporności na ten lek w liniach komórkowych raka piersi.
W chwili obecnej wykorzystanie peptydów penetrujących błonę komórkową stanowi część badań klinicznych w terapii zapalenia skóry, raka i niewydolności kardiologicznej.
Jądro komórkowe jak powszechnie wiadomo stanowi główny i najważniejszy składnik większości komórek, w którym zachodzi transkrypcja przez co stanowi cel molekularny wielu terapii. Transport substancji terapeutycznych do wnętrza jądra komórkowego wciąż stanowi wyzwanie dla świata nauki. Wiadomo, że aby efektywnie dostarczyć cząsteczkę do jadra należy oznaczyć ją sekwencją lokalizacji jądrowej (ang. nuclear localization sequences (NLSs)). Sekwencja ta musi zawierać co najmniej dwa fragmenty składające się z czterech lub więcej reszt aminokwasów zasadowych. Typowym przykładem tego typu sekwencji jest PKKKRKV stanowiąca fragment antygenu T małpiego wirusa 40 (SV40). Wykorzystanie tej sekwencji prowadzi do efektywnego wprowadzenia do jądra komórkowego szeregu związków takich jak peptydy, białka czy DNA.
Istnieje szereg patentów dotyczących tematyki związków penetrujących błonę komórkową które wykorzystywane są jako nośniki substancji czynnych (terapeutycznych). Związki te w ogromnej swej większości stanowią zasadowe syntetyczne peptydy zbudowane z znaczącej ilości reszt argininy lub lizyny [1, 2] lub fragmenty białek lub peptydów naturalnych [3, 4].
Znane peptydomimetyki (związki zawierające aminokwasy niebiałkowe) o podobnych właściwościach to grupa peptydów zawierających reszty aminokwasowe w konfiguracji D (4).
W opisie wynalazku WO 2015075747 ujawniono peptyd penetrujący komórki poprzez dostarczanie biomolekuł do komórki eukariotycznej. Niniejszy wynalazek w szczególności dotyczy układu dostarczania leku opartego na peptydzie do dostarczania kwasów nukleinowych i/lub białek i/lub peptydów / małych cząsteczek do komórek, in vitro lub in vivo. W innym opisie wynalazku WO2014053880A1 również ujawniono nowy peptyd do penetracji komórek.
Wynalazek US 9572900 dotyczy koniugatu peptydu penetrującego komórki i składnika aktywnego oraz jego zastosowania.
W opisie WO 2007076904 A1 ujawniono peptyd, który ma sekwencję aminokwasową obejmującą co najmniej 8 kolejnych aminokwasów białka ludzkiej laktoferyny lub białka laktoferyny bydlęcej, przy czym peptyd jest odpowiedni do działania jako peptyd penetrujący komórkę.
Twórcy przedmiotowego wynalazku zaprojektowali i zsyntetyzowali nowy rodzaj peptydomimetyków składających się z reszt kwasu L-2,3-diaminopropinowego, którego grupy aminowe łańcucha bocznego zostały zmodyfikowane przez krótkie sfunkcjonalizowane reszty glikolu etylenowego. W efekcie otrzymano szereg mimetyków reszt aminokwasowych o wysokim stopniu rozpuszczalności i posiadająPL 238 871 B1 cych w łańcuchu bocznym szereg grup funkcyjnych (aminową, hydroksylową, guanidynową, karboksylową, alifatyczną i aromatyczną). Związki składające się z tak otrzymanych monomerów charakteryzują się wysoką odpornością na proteolizę oraz stabilnością w warunkach hodowli komórkowej.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest peptydomimetyk o strukturze przedstawionej na schemacie 1. Związek ten ma wzór F1-O2Oc-[Dap(GO2)]6-O2Oc-NH2, gdzie F1 to fluoresceina, O2Oc to kwas 8-amino-3,6-dioksaoktanowy, Dap to kwas L-2,3-diaminopropionowy, GO2 to kwas 8-guanidyno-3,6-dioksaoktanowy. Związek zawiera w sekwencji ugrupowanie fluorescencyjne (5/6-karboksyflouresceinę). Związek ten inkubowany z komórkami skóry (fibroblasty i keratynocyty) efektywnie przenika do jądra komórkowego, a co więcej ulega w tej organelli zauważalnej akumulacji. Związek ten zbudowany jest z sześciu reszt DAPEG (kwasu L-2,3-diaminopropionowego (DAP) modyfikowanego w łańcuchu bocznym resztami sfunkcjonalizowanego glikolu etylenowego (PEG). Nasze badania dowodzą, że związek ten efektywnie penetruje błonę komórkową testowanych komórek i jest akumulowany w jądrze komórkowym nie wykazując przy tym istotnej cytotoksyczności. Ponadto związek ten jest stabilny proteolitycznie.
Wynalazek stanowi zastosowanie związku przedstawionego na wykresie 1 jako środek in vitro do fluorescencyjnej wizualizacji kwasów nukleinowych obecnych w jądrze komórkowym.
Sposób otrzymywania nowego związku zdefiniowanego powyżej, następuje w etapach:
a) usuwa się ugrupowania Fmoc z grupy aminowej żywicy TENTAGEL SRAM poprzez wytrząsanie z roztworem 20% piperydyny w DMF,
b) następnie do tak przygotowanego nośnika przyłącza się cząsteczkę linkera będącego O2Oc za pomocą standardowej procedury syntetycznej z wykorzystaniem diizopropylodiimidu, oba składniki rozpuszcza się w DMF,
c) roztwór ten łączy się z żywicą, reakcję prowadzono przez 3 godziny, d) następnie odsącza się żywicę pod zmniejszonym ciśnieniem i przepłukuje się, e) procedurę przyłączania linkera do polimeru powtarza się dwukrotnie,
f) do tak przygotowanej żywicy przyłącza się Fmoc-Dap(Mtt) wg standardowej procedury z użyciem HBTU i DIPEA (1:2),
g) czynność tą powtarza się sześciokrotnie,
h) następnie do grupy aminowej kwasu diaminopropionowego przyłącza się Fmoc-O2Oc (kwas fluororenylometyloksykarbonylo-amino)-3,6-dioksaoktanowy,
i) następnie po usunięciu ugrupowania Fmoc z grupy aminowej przyłącza się 5/6-fluoresceinę służącą jako znacznik fluorescencyjny,
j) następnie z F1-O2Oc-[Dap(Mtt)]6-O2Oc-żywicy w kolejnym kroku usuwa się ugrupowanie Mtt za pomocą roztworu 2% TFA w chlorku metylenu (DCM) z dodatkiem 1% triisopropylsilanu, czas mieszania 15 minut,
k) po tym czasie do próbki żywicy dodaje się trzy krople kwasu trifluorooctowego (TFA) i obserwuje powstawanie żółtego koloru wynikającego z obecności wolnych grup Mtt, l) procedurę powtarza się aż do uzyskania bezbarwnego roztworu, m) następnie żywicę przepłukuje się trzykrotnie roztworem diizoproplyloetanoloaminy w DMF (30%),
n) otrzymuje się F1-O2Oc-Dap6-O2Oc-żywicę do której dodaje się roztwór GO2//DIPCI/HOBt w mieszaninie DMF/NMP (1:1, v/v), gdzie DIPCI to diizopropylokarbodiimid a GO2 to kwas 8-guanidyno-3,6-dioksaoktanowy,
o) reakcję acylowania prowadzi się aż do uzyskania negatywnego testu Kaisera wskazującego na brak wolnych grup aminowych na żywicy,
p) otrzymany peptydomimetyk usuwa się następnie z żywicy z jednoczesnym usunięciem osłon bocznych, przy użyciu roztworu TFA/fenol/triisopropylsilan/H2O 88:5:2:5, v/v) otrzymując F1-O2Oc-[Dap(GO2)]6-O2Oc-NH2.
Określenia stosowane powyżej oraz w opisie i zastrzeżeniach patentowych, mają następujące znaczenie:
Peptydomimetyk - oznacza związek o strukturze naśladującej peptyd zawierający aminokwasy niebiałkowe.
Cargo - oznacza cząsteczki chemiczne przyłączone do peptydów.
Dap - oznacza pochodną kwasu 2,3-diaminopropionowego.
DAPEG - oznacza związek zawierający reszty Dap i PEG.
PL 238 871 B1
PEG - oznacza sfunkcjonalizowane reszty glikolu mono lub dietylenowego (na przykład O2Oc to kwas 8-amino-3,6-dioksaoktanowy lub GO2 to kwas 8-guanidyno-3,6-dioksaoktanowy).
DIPCI - oznacza diizopropylokarbodiimid.
O2Oc - kwas 8-amino-3,6-dioksaoktanowy
F1 - oznacza fluoresceinę.
Wynalazek przybliżono na schematach gdzie na schemacie 1 pokazano wzór związku zaś na schemacie 2 wizualizację ścieżki powstawania związku - etapy metody syntezy.
Opis figur:
Fig. 1 - przedstawia analizę MS MALDI-TOF. Masa obliczona wynosi 2306,45. Sygnał 2037,6 stanowi jon pseudomolekularny [M+H]+. Pozostałe sygnały pochodzą z fragmentacji związku.
Fig. 2 - przedstawia chromatogram RP-HPLC peptydomimetyku w gradiencie 10-90% B w ciągu 40 minut. Faza A: 0,1% roztwór TFA w wodzie, faza B: 80% roztwór acetonitrylu w fazie A. Przepływ fazy ruchomej 1 ml/min. Detekcja prowadzona przy długości fali 226 nm.
Fig. 3A i B - przedstawia zdjęcie z mikroskopu gdzie widać fluorescencję jądra komórki - związek inkubowany z ludzkimi fibroblastami A) oraz związek inkubowany z ludzkimi keratynocytami B).
Fig. 4 - Przedstawia zdjęcie Western-Blot jako efekt doświadczenia gdzie związek w różnych stężeniach inkubowany był z DNA plazmidowym (10 nmol), co powoduje powstanie kompleksu o zmienionej szybkości migracji w stosunku do samego DNA gdzie systemy 2-11 to mieszanina związku (o wzrastającym stężeniach) i DNA, system 12 to samo DNA, 13 sam związek, linie 1 i 14 stanowią marker masowy DNA o różnych masach.
Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia.
P r z y k ł a d 1
Potwierdzenie struktury chemicznej
Widmo mas oraz analiza HPLC (odpowiednio Fig. 1 i Fig. 2) jednoznacznie potwierdzają właściwą masę związku oraz jego jednorodność. Sygnał jonu masowego m/z=2307 oraz pik o czasie retencji 21,06 potwierdzają jednorodność i właściwą masę otrzymanego związku.
P r z y k ł a d 2
Synteza chemiczna
W syntezie związku wykorzystano nowe bloki budulcowe będące pochodnymi kwasu diaminopropionowego (Dap) zmodyfikowane sfunkcjonalizowanymi resztami glikolu mono lub dietylenowego (PEG) (których proponowana nazwa ogólna to DAPEG (DAP+PEG)) których przykładowa synteza przedstawiona jest na schemacie 2.
Synteza peptydomimetyku F1-O2Oc-Dap[(GO2)]6-O2Oc-NH2, składa się z następujących etapów:
1) Pierwszy z nich to usunięcie ugrupowania Fmoc z grupy aminowej żywicy TENTA GEL S RAM poprzez wytrząsanie z roztworem 20% piperydyny w DMF. W kolejnym kroku do tak przygotowanego nośnika przyłącza się cząsteczkę linkera będącego O2Oc za pomocą standardowej procedury syntetycznej z wykorzystaniem diisopropylodiimidu. Oba składniki rozpuszcza się w DMF. Roztwór ten połączono z żywicą, reakcję prowadzono przez 3 godziny. Po tym czasie odsączono żywicę pod zmniejszonym ciśnieniem i przepłukano. Procedurę przyłączania linkera do polimeru powtórzono dwukrotnie.
Do tak przygotowanej żywicy przyłączono Fmoc-Dap(Mtt) wg standardowej procedury z użyciem HBTU i DIPEA (1:2). Czynność tą powtórzono sześciokrotnie. W kolejnym kroku do grupy aminowej kwasu diaminopropionowego przyłączono Fmoc-O2Oc (kwas fluororenylometyloksykarbonylo-amino)-3,6-dioksaoktanowy, a następnie po usunięciu ugrupowania Fmoc z grupy aminowej przyłączono 5/6-fluoresceinę służącą jako znacznik fluorescencyjny.
Następnie z F1-O2Oc-Dap(Mtt)6-O2Oc-żywicy w kolejnym kroku usunięto ugrupowanie Mtt za pomocą roztworu 2% TFA w chlorku metylenu (DCM) z dodatkiem 1% triisopropylsilanu. Czas mieszania 15 minut. Po tym czasie do próbki żywicy dodano 3 krople kwasu trifluorooctowego (TFA) i obserwowano powstawanie żółtego koloru wynikającego z obecności wolnych grup Mtt. Procedurę powtarzano aż do uzyskania bezbarwnego roztworu.
PL 238 871 B1
2) W kolejnym etapie żywicę przepłukano trzykrotnie roztworem diizoproplyloetanoloaminy w DMF (30%). W efekcie otrzymano F1-O2Oc-Dap6-O2Oc żywicę do której dodano roztwór GO2/DIPCI/HOBt w mieszaninie DMF/NMP (1:1, v/v), gdzie DIPCI to diizopropylokarbodiimid a GO2 kwas 8-guanidyno-3,6-dioksaoktanowy.
Reakcję acylowania prowadzono aż do uzyskania negatywnego testu Kaisera wskazującego na brak wolnych grup aminowych na żywicy.
Otrzymany peptydomimetyk usunięto następnie z żywicy z jednoczesnym usunięciem osłon bocznych, przy użyciu roztworu TFA/fenol/triisopropylsilan/H2O 88:5:2:5, v/v). otrzymując F1-O2Oc-Dap[(GO2)]6-O2Oc-NH2.
P r z y k ł a d 3
Właściwości
Związek został rozpuszczony w PBS (bufor fosforanowy z dodatkiem NaCl) i wprowadzony w stężeniu 10 μM do hodowli komórkowej fibroblastów ludzkich. Po inkubacji trwającej 1 godzinę hodowlę przemyto PBS i analizowano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Axio Vert Zeis stosując filtr umożliwiający detekcję fluoresceiny.
Analogiczny eksperyment przeprowadzono wykorzystując ludzkie keratynocyty. W efekcie zaobserwowano silną fluorescencję jądra komórki (Fig. 3A i 3B).
Związek inkubowany (w stężeniach od 10 nmol/dm3 do 8 μmol/dm3) z plazmidowym DNA (10 nmol) powoduje powstanie kompleksu o zmienionej szybkości migracji w stosunku do samego DNA (Fig. 4).
Literatura
1. Chugh A, Eudes F, Shim YS. IUBMB Life. 2010 Mar; 62(3): 183-93.
2. Lindgren M, Hallbrink M, Prochiantz A, Langel U. Trends Pharmacol Sci. 2000 Mar;
21(3): 99-103.
3. Frankel AD, Pabo CO. Cell. 1988 Dec 23; 55(6): 1189-93.
4. Reyes-Cortes R, Acosta-Smith E, Mondragón-Flores R, Nazmi K, Bolscher JG, Canizalez-Roman A, Leon-Sicairos N. Biochem Cell Biol. 2017 Feb; 95(1): 76-81.
5. Robison AD, Sun S, Poyton MF, Johnson GA, Pellois JP, Jungwirth P, Vazdar M, CremerPS. J Phys Chem B. 2016 Sep 8; 120(35): 9287-96.
6. Munoz-Alarcón A, Eriksson J, Langel ϋ. Nucleic Acid Ther. 2015 Dec; 25(6): 306-10.
7. Jones AT, Sayers EJ. J Control Release. 2012 Jul 20; 161(2): 582-91.
8. Wadia JS, Stan RV, Dowdy SF. Nat Med. 2004 Mar; 10(3): 310-5.
9. Wallbrecher R, Ackels T, Olea RA, Klein MJ, Caillon L, Schiller J, Bovee-Geurts PH, van Kuppeveit TH, Ulrich AS, Spehr M, Adjobo-Hermans MJW, Brock R. J Control Release. 2017 Jun 28; 256: 68-78.
10. Chugh A, Amundsen E, Eudes F. Plant Cell Rep. 2009 May; 28(5): 801-10.
11. Eudes F, Chugh A. Plant Signal Behav. 2008 Aug; 3(8): 549-50.
Claims (2)
- Zastrzeżenia patentowe1. Związek o wzorze:F1-O2Oc-Dap[(GO2)]s-O2Oc-NH2, gdzie F1 to 5,6-fluoresceina, O2Oc to kwas 8-amino-3,6-dioksaoktanowy, Dap to kwas L-2,3-diaminopropionowy, GO2 to kwas 8-guanidyno-3,6-dioksaoktanowy.
- 2. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1 jako środek fluorescencyjny do wykrywania substancji in vitro w jądrach komórkowych.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL424583A PL238871B1 (pl) | 2018-02-13 | 2018-02-13 | Peptydomimetyk oraz jego zastosowanie jako środek fluorescencyjny in vitro |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL424583A PL238871B1 (pl) | 2018-02-13 | 2018-02-13 | Peptydomimetyk oraz jego zastosowanie jako środek fluorescencyjny in vitro |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL424583A1 PL424583A1 (pl) | 2019-08-26 |
| PL238871B1 true PL238871B1 (pl) | 2021-10-18 |
Family
ID=67683621
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL424583A PL238871B1 (pl) | 2018-02-13 | 2018-02-13 | Peptydomimetyk oraz jego zastosowanie jako środek fluorescencyjny in vitro |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL238871B1 (pl) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NO20033115D0 (no) * | 2003-07-08 | 2003-07-08 | Amersham Health As | Peptid-baserte forbindelser |
| WO2014053880A1 (en) * | 2012-10-04 | 2014-04-10 | Centre National De La Recherche Scientifique | Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules |
| PL231469B1 (pl) * | 2016-03-04 | 2019-02-28 | Inst Biotechnologii I Medycyny Molekularnej | Nowy związek, sposób jego otrzymywania, roztwór farmaceutyczny zawierający nowy związek, sposób określania obecności choroby nowotworowej, zestaw do wykrywania nowotworów oraz zastosowanie hydrolizy nowego związku do wykrywania nowotworów |
-
2018
- 2018-02-13 PL PL424583A patent/PL238871B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL424583A1 (pl) | 2019-08-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8614194B1 (en) | Anionic cell penetrating peptide and its use for intracellular delivery | |
| Brunsveld et al. | Lipidated ras and rab peptides and proteins—synthesis, structure, and function | |
| JP2023153945A (ja) | 細胞透過性ペプチド、それを含んだコンジュゲート、及びそれを含んだ組成物 | |
| Szabó et al. | Cell-penetrating conjugates of pentaglutamylated methotrexate as potential anticancer drugs against resistant tumor cells | |
| US20110182920A2 (en) | Identification of a novel cysteine-rich cell penetrating peptide | |
| EP1950294A1 (en) | Novel cell penetrating peptide | |
| AU2021224412A1 (en) | Human transferrin receptor binding peptide | |
| Kozhikhova et al. | A novel peptide dendrimer LTP efficiently facilitates transfection of mammalian cells | |
| CN115536730B (zh) | 一种穿越血脑屏障的多肽及其制备方法、纳米结构及其制备方法和应用 | |
| CN101781356A (zh) | 一种精氨酸杂合细胞穿膜肽及其应用 | |
| US10046024B2 (en) | Cyclic-GluR6 analogs, methods of treatment and use | |
| Tréhin et al. | Cellular internalization of human calcitonin derived peptides in MDCK monolayers: a comparative study with Tat (47-57) and penetratin (43-58) | |
| P Del Borgo et al. | Using β-amino acids and β-peptide templates to create bioactive ligands and biomaterials | |
| CN105085631A (zh) | 一种特异靶向her2蛋白的多肽及其应用 | |
| US8207293B2 (en) | Peptides derived from maurocalcine used as vectors for intracellular addressing of molecules of interest | |
| AU2022335128A1 (en) | Human transferrin receptor-binding antibody-peptide conjugate | |
| Parthasarathy et al. | The medicinal chemistry of therapeutic peptides: Recent developments in synthesis and design optimizations | |
| Kubi et al. | Cell-penetrating and mitochondrion-targeting molecules | |
| CN106916207A (zh) | 细胞穿膜肽hPP‑chol、生产及其介导的质粒DNA转染的方法 | |
| Neundorf et al. | Cymantreneconjugation modulates the intracellular distribution and induces high cytotoxicity of a cell-penetrating peptide | |
| Bang et al. | Targeted delivery of self-assembled nanocomplex between fusion peptides and siRNAs for breast cancer treatment | |
| US11230586B2 (en) | Exosome production method | |
| KR20090122769A (ko) | 세포내로 단백질을 전달하는 방법 및 이를 위한 펩타이드 | |
| EP3556767A1 (en) | Cell penetrating peptides | |
| US20250326865A1 (en) | C-met protein-binding peptide complex |