PL232494B1

PL232494B1 - Sposób otrzymywania przeszczepu gruzu korowo-gąbczastego do regeneracji tkanki kostnej, oraz przeszczep do tej regeneracji

Info

Publication number: PL232494B1
Application number: PL415287A
Authority: PL
Inventors: Henryk BURSIG; Henryk Bursig; Stanisław DYLĄG; Stanisław Dyląg; Fabian KĘPSKI; Fabian Kępski
Original assignee: Henryk Bursig; Dylag Stanislaw; Kepski Fabian; Regionalne Centrum Krwiodawstwa I Krwiolecznictwa
Priority date: 2015-12-14
Filing date: 2015-12-14
Publication date: 2019-06-28
Also published as: PL415287A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania przeszczepu gruzu korowo-gąbczastego do regeneracji tkanki kostnej, oraz przeszczep do tej regeneracji.

Rozwiązania według wynalazku znajdują zastosowanie w klinice człowieka np. ortopedii, stomatologii, chirurgii onkologicznej do wypełniania ubytków kostnych - cyst, nowotworów, przetok, a także w zabiegach rewizyjnych endoprotezoplastyki stawu biodrowego.

Współczesna medycyna, zwłaszcza ortopedia odczuwa brak wystarczającej podaży allogenicznych przeszczepów tkanki kostnej gąbczastej. Pobranie tkanki własnej chorego nie zawsze jest możliwe (np. u dzieci), a u dorosłych występuje konieczność pobrania podczas tej samej operacji i przeszczepienia jej, co wydłuża czas zabiegu oraz zwiększa ryzyko ze względu na dwa pola operacyjne.

Niewystarczająca liczba dawców tkanek ludzkich, powoduje, że dostępne w Bankach Tkanek przeszczepy tkanki kostnej gąbczastej nie są w stanie zabezpieczyć wszystkich potencjalnych odbiorców - szpitali oraz chorych, stąd poszukiwanie metod wytwarzania syntetycznych materiałów kościozastępczych, lub od zwierząt - przeszczepy ksenogeniczne.

Żaden z tych materiałów i substytutów, nie jest jednak tak efektywny w działaniu jak natywna kość ludzka.

Tkanka kostna to rodzaj tkanki łącznej zbudowanej z komórek - osteoblastów, osteocytów, osteoklastów, które stanowią ok. 5% masy tkanki oraz istoty międzykomórkowej.

Istota międzykomórkowa stanowiąca ok. 25% masy tkanki, składa się z części organicznej tzw. osteoidu, i części nieorganicznej, która stanowi 60-70% masy tkanki. Osteoid w skład którego wchodzi kolagen, osteonektyna, osteokalcyna, proteoglikany i mukopolisacharydy, nadaje tkance kostnej sprężystość i wytrzymałość, natomiast składniki nieorganiczne, którymi są sole wapnia, magnezu i fosforu, odpowiedzialne są za jej twardość. Tkanka kostna ma charakterystyczną organizację przestrzenną, tworząc kość.

Wyróżnia się tkankę kostną zbitą, która znajduje się w zewnętrznej części kości oraz tkankę kostną gąbczastą. Najwięcej tkanki kostnej gąbczastej, występuje przy nasadach kości długich.

Na rynku dostępne są granulaty kostne wprowadzane do obrotu jako wyrób medyczny lub produkt leczniczy. W ortopedii i stomatologii w przypadku braku dostępności przeszczepów ludzkich stosowane są syntetyczne substytuty kości.

Przykładowo z publikacji P. Myciński, J. Zarzecka: Przegląd materiałów do rekonstrukcji kości stosowanych w chirurgii jamy ustnej, Poradnik Stomatologiczny, 2011, XI, 10; 426-431, znane są materiały ksenogenne (heterogenne), które są często stosowanymi w stomatologii wszczepami kostnymi. Materiały te pozyskiwane są z kości wołowych i wieprzowych i są praktycznie nieresorbowalne, biokompatybilne i bezpieczne w stosowaniu. Są przygotowywane w formie bloków lub granulatu zarówno kości gąbczastej, jak i zbitej, czasami z domieszką kolagenu. Przygotowanie takiego materiału polega na całkowitym odbiałczaniu pod wpływem wysokiej temperatury i promieniowania jonizującego. Pozostała matryca nieorganiczna stanowi rusztowanie dla nowej kości. W wyniku tego procesu dochodzi do usunięcia czynników wzrostowych, a tym samym właściwości osteoindukcyjnych. Odbiałczone kości zwierzęce stosowane do przeszczepów mają strukturę i powierzchnię zbliżoną do kości i dlatego wykazują potencjał osteokondukcyjny. Możliwe jest też otrzymywanie materiałów z wapniejących korali i alg, jednak są one rzadko stosowane ze względu na ryzyko późnych powikłań i gorsze właściwości osteokondukcyjne.

Na rynku znany jest preparat kostny pochodzenia bydlęcego produkowany przez firmę Geistlich Pharma AG z Wolhusen w Szwajcarii, który wykazuje bardzo wysoki stopień podobieństwa do ludzkiej kości, zarówno pod względem powierzchni, składu chemicznego jak i struktury materiału. Stanowi on jeden z najczęściej stosowanych obecnie substytutów kostnych w stomatologii. Preparat ten produkuje się ze specjalnie dobranego materiału w postaci kości kończyn bydlęcych, które spełniają konieczne wymogi dotyczące struktury i dojrzałości tkanki kostnej, jak również umożliwiają uzyskanie odpowiedniej ilości surowca. Przetwarzanie obejmuje kilka etapów, które wykazują wysoką skuteczność w zakresie inaktywacji prionów 10: produkt poddawany jest między innymi działaniu wysokich temperatur przez okres ponad 15 godzin, a także specyficznym procesom oczyszczania chemicznego, które obejmują poddawanie produktu działaniu roztworów silnych zasad przez okres kilku godzin. Zróżnicowane procesy chemiczne, jak również działanie wysokich temperatur wywierają silny efekt na inaktywację prionów, osiągając wysoką skuteczność usuwania potencjalnych czynników patogenetycznych.

PL 232 494 B1

Znaną metodą oczyszczania kości zwierząt jest odbiałczanie, polegające na pozbawieniu kości wszystkich substancji biologicznych występujących pomiędzy tzw. beleczkam i kostnymi (szpik, naczynia, system nerwowy), jak też komórek kostnych obecnych w jamkach kostnych (osteoblasty, osteoklasty i osteocyty). W efekcie odbiałczania kości otrzymuje się produkt w postaci szkieletu kolagenowo-apatytowego, z którego wykonuje się kształtki nadające się do wszczepiania operacyjnego w miejsce ubytków kostnych. Obróbce i późniejszemu wszczepianiu podlega wyłącznie tak zwana kość gąbczasta.

Z dokumentacji zgłoszeniowej polskiego wynalazku P.403805 znany jest sposób odbiałczania kości zwierzęcych, zwłaszcza z cieląt lub młodych świń w wieku około jednego roku, pobranych korzystnie z miednicy, charakteryzujący się tym, że w pierwszym etapie oczyszcza się pobraną kość z przylegających tkanek zewnętrznych, w tym przede wszystkim z pozostałości mięsa, a następnie w dowolnej kolejności kość tnie się mechanicznie, korzystnie za pomocą piły diamentowej, na plastry o grubości od 1 do 10 cm oraz mechanicznie pozbawia się ją zewnętrznej kości korowej, korzystnie poprzez jej odcięcie za pomocą piły diamentowej, otrzymując plastry kości gąbczastej, natomiast w drugim, korzystnie równolegle prowadzonym etapie przygotowuje się od 1,0 N do 0,5 N roztwór NaOH lub KOH oraz wodny roztwór perhydrolu w proporcji od 1:1 do 1:5 do wody destylowanej, po czym z tak otrzymanych roztworów wykonuje się mieszaninę do odbiałczania kości, o proporcjach objętościowych 20-50%, korzystnie 35% NaOH lub KOH, 20-30%, korzystnie 25% wodnego roztworu perhydrolu i 20-60%, korzystnie 40% wody destylowanej, następnie w trzecim etapie, w naczyniach, korzystnie szklanych prowadzi się zasadniczy proces odbiałczania kości polegający na tym, że przygotowane w pierwszym etapie plastry kości gąbczastej zanurza się w przygotowanej w drugim etapie mieszaninie roztworów, po czym naczynia umieszcza się na podgrzewanych mieszadłach, korzystnie magnetycznych, w których mieszaninę roztworów z zanurzonymi w niej plastrami kości gąbczastej miesza się intensywnie i podgrzewa stopniowo od temperatury około 20°C do temperatury nie przekraczającej 60°C, w czasie niezbędnym do zupełnego odbiałczenia kości i otrzymania wyłącznie czystego szkieletu kolagenowo-apatytowego, przy czym czas ten kontroluje się poprzez obserwację odbiałczanej kości, prowadzoną korzystnie za pomocą lupy binokularnej lub mikroskopu skaningowego. Przed zanurzeniem plastrów kości gąbczastej w mieszaninie roztworów, zawiesza się je na uchwytach, korzystnie na hakach wykonanych z drutu miedzianego izolowanego poliuretanem lub PCV. Po zakończeniu zasadniczego procesu odbiałczania, plastry kości przemywa się kilkukrotnie, korzystnie pięciokrotnie wodą destylowaną i kilkukrotnie, korzystnie trzykrotnie spirytusem, zwłaszcza etanolem 99%.

Niedogodnością powyższego sposobu jest to, że następujące po sobie procesy prowadzone są z zastosowaniem agresywnych substancji chemicznych - KOH lub NaOH oraz silnego roztworu perhydrolu, a także wygrzewaniu w podwyższonej temperaturze aż do +60°C, co powoduje uszkodzenie i usunięcie wszystkich biologicznych substancji stymulujących przebudowę tkanki kostnej.

W ortopedii i stomatologii, w przypadku braku dostępności przeszczepów, stosowane są również syntetyczne substytuty kości.

Z dokumentacji zgłoszeniowej wynalazku P.295638 znana jest bioaktywna kompozycja szklista na implanty kości, włókna i inne wyroby z niej wykonane lub ją zawierające oraz sposób wyciągania tej kompozycji do postaci włókienek.

Ze zgłoszenia wynalazku P.310793 znany jest sposób i zestaw do wytwarzania porowatych namiastek kości. Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania porowatych namiastek kości wykazujących częściowo lub całkowicie współpołączony układ porów o przypadającym udziale objętościowym rzędu 5%-60% oraz zestawu do wytwarzania porowatej namiastki kości wykazującej częściowo lub całkowicie współpołączony układ porów o przypadającym udziale objętościowym rzędu 5%-60% złożonego z odrębnych jednostek opakowaniowych. Cechą sposobu jest to, że (a) 0%-48% wagowych stałego składnika, składającego się z drobnocząsteczkowego polimeru estrów kwasu akrylowego i/lub metakrylowego oraz ewentualnie dalszych dodatków, takich jak katalizatory polimeryzacji, środki kontrastowe do zdjęć rentgenowskich, napełniacze i barwniki, b) 2%-50% wagowych ciekłego składnika, składającego się z monomeru estru kwasu akrylowego i/lub metakrylowego oraz ewentualnie dalszych dodatków, takich jak przyspieszacze polimeryzacji i stabilizatory i c) 50%-98% wagowych grubo cząsteczkowego granulatu z biokompatybilnego materiału o średnicy największej cząstki 0,5-10 mm miesza się ze sobą, ewentualnie przeprowadza w żądaną postać i następnie utwardza się. Cechą zestawu jest to, że zawiera on jednostki opakowaniowe ww. składników (a), (b) i (c).

PL 232 494 B1

Z dokumentacji zgłoszeniowej wynalazku P.320083 znany jest sposób wytwarzania ubogiej w tlenek wapniowy ceramiki z istoty gąbczastej kości. Wynalazek ten polega na tym, że między mineralizacją materiału kostnego, a spiekaniem na ceramikę, prowadzi się proces wymywania zdemineralizowaną wodą, dzięki któremu usuwa się udziały tlenku wapniowego ze zmineralizowanej matrycy kostnej.

Ze zgłoszenia wynalazku P.323448 znana jest substancja zastępująca kość i sposób jej wytwarzania. Przedmiotem tego wynalazku jest m.in. sposób przekształcania osadu standardowego obojętnego bezpostaciowego fosforanu wapnia w silnie reaktywne bezpostaciowe ciało stałe, które można wykorzystać do reakcji z innymi stałymi fosforanami wapnia z wytworzeniem słabo krystalicznego syntetycznego hydroksyapatytu, wykazującego bioaktywność i strukturalną integralność. Tę nową substancję bezpostaciową można poddać reakcji z innymi fosforanami wapnia w temperaturze 37°C lub niższej z wytworzeniem podobnej do kości substancji, zawierającej słabo krystaliczny hydroksyapatyt.

W zgłoszeniu wynalazku P.328226 ujawniono sztyft z warstwy korowej trzonu kości długiej. Zawiera on wewnętrzny kanał szpikowy, który można wypełnić dowolnym z wielu materiałów kościotwórczych.

Ze zgłoszenia wynalazku P.334303 znany jest sposób wytwarzania oczyszczonego, dimerycznego czynnika morfogenetycznego kości, który charakteryzuje się tym, że obejmuje poddawanie ciałek wtrętowych czynnika morfogenetycznego kości, wytworzonego technologią inżynierii genetycznej, następującym etapom: a) traktowanie ciałka wtrętowego czynnika morfogenetycznego kości czynnikiem denaturującym w celu otrzymania rozpuszczonego monomeru, b) traktowanie rozpuszczonego monomeru roztworem do ponownego fałdowania w celu otrzymania dimerycznego czynnika morfogenetycznego kości, c) poddanie dimerycznego czynnika morfogenetycznego kości ultrafiltracji i zastąpienie rozpuszczalnika, d) poddanie dimerycznego czynnika morfogenetycznego kości w zastępującym rozpuszczalniku precypitacji izoelektrycznej i e) poddanie tak precypitowanego dimerycznego czynnika morfogenetycznego kości chromatografii z odwróconymi fazami.

Ze zgłoszenia wynalazku P.335103 znany jest materiał zastępujący kość, na bazie porowatego materiału polimerowego, o powierzchni pokrytej peptydami o sekwencji aminokwasów RGD.

Z opisu patentowego PL 191497 znana jest wielowarstwowa membrana użyteczna do stosowania w rekonstrukcji kości lub tkanki chrzęstnej in vivo, sposób jej wytwarzania oraz jej zastosowanie. Membrana ta charakteryzuje się tym, że zawiera warstwę macierzową o otwartej, gąbczastej budowie zbudowaną głównie z kolagenu typu II oraz co najmniej jedną warstwę graniczną o zamkniętej, względnie nieprzepuszczalnej budowie zbudowaną głównie z kolagenu typu I i III i stanowi warstwę graniczną z naniesioną i liofilizowaną zawiesiną kolagenu typu II tworzącą warstwę macierzową o otwartej, gąbczastej budowie stabilnie przytwierdzoną do tej warstwy. Korzystnie membrana charakteryzuje się tym, że obejmuje pojedynczą warstwę graniczną. Korzystnie warstwa macierzowa umieszczona jest pomiędzy dwiema warstwami granicznymi i utworzona jest z materiału zawierającego kolagen typu II pochodzącego z naturalnej chrząstki. Materiał zawierający kolagen typu II pochodzi z chrząstki szklistej świń. Materiał zawierający kolagen typu II jest usieciowany. Warstwa graniczna lub warstwy graniczne pochodzą z błony otrzewnowej cieląt lub świń. Warstwa macierzowa jest impregnowana chondrocytami wyizolowanymi z chrząstki stawowej, okostnej, tkanki okołochrzęstnej lub mezenchymalnymi komórkami macierzystymi ze szpiku kostnego. Warstwa macierzowa i/lub warstwa graniczna lub warstwy graniczne są impregnowane glikozoaminoglikanem. Glikozoaminoglikan jest kwasem hialuronowym, chondroityno-6-siarczanem, siarczanem keratyny lub siarczanem dermatanu. Warstwa macierzowa i warstwa graniczna lub warstwy graniczne są zasadniczo wolne od proteoglikanów. Warstwa macierzowa i/lub warstwa graniczna lub warstwy graniczne zawierają ponadto chondronektynę, lamininę, fibronektynę, alginian wapnia, anchorynę typu II, czynniki wzrostowe lub czynniki morfogenetyczne kości.

Sposób wytwarzania określonej powyżej wielowarstwowej membrany charakteryzuje się tym, że zawiesinę kolagenu typu II nanosi się na powierzchnię warstwy granicznej, a następnie przeprowadza się liofilizację do uzyskania stabilnie przytwierdzonej warstwy macierzowej z kolagenu typu II o otwartej, gąbczastej strukturze.

Przedmiotem tego wynalazku jest również zastosowanie opisanej powyżej membrany, do wytwarzania wszczepu do kierowanej regeneracji tkanki.

Z opisu patentowego PL 208538 znany jest produkt zawierający ziarnisty materiał kostny oraz zastosowanie produktu mineralnego kości. Wynalazek dotyczy produktu zawierającego ziarnisty materiał kostny do naprawy złożonego urazu chrząstki i kości, który zawiera porowate cząstki minerału kostnego pochodzące z naturalnej kości, o strukturze zasadniczo identycznej ze strukturą naturalnej kości i zasadniczo pozbawione endogennej substancji organicznej, przy czym cząstki mają na powierzchni

PL 232 494 B1 możliwe do resorpcji, fizjologicznie zgodne włókna kolagenu II, przy czym stosunek wagowy włókien kolagenowych do porowatego minerału kostnego wynosi przynajmniej 1:40. Korzystnie cząstki mają przeciętną średnicę w zakresie od 0,1 do 5 mm. Korzystnie produkt dalej obejmuje przynajmniej jedną adsorbowaną substancję farmaceutycznie albo biologicznie czynną. Bardziej korzystnie substancja biologicznie czynna jest wybrana z grupy obejmującej taurolidynę, tauraltam i ich mieszaniny. Bardziej korzystnie substancja farmaceutycznie czynna jest wybrana z grupy obejmującej białka morfogenetyczne kości (BMP), inne cząsteczki macierzy kostnej i peptydy sygnałowe, a najkorzystniej z grupy obejmującej BMP-2-8. TGF-β, TGF-βΤ VEGF, IGF, PTHrH i PDGF. Bardziej korzystnie produkt dalej obejmuje komórki macierzyste chrząstki albo kości. Korzystnie produkt dalej obejmuje żelatynę w fazie żelowej, przy czym włókna kolagenu II występują w tej fazie żelowej, zaś faza żelowa obejmuje od 2% do 20% wagowych materiału kostnego. Korzystnie kolagen pochodzi z chrząstki. Korzystnie stosunek wagowy włókien kolagenu wynosi około 1:20. Korzystnie produkt ponadto zawiera żelatynę w fazie żelu, przy czym włókna kolagenu II są obecne w fazie żelowej, która zawiera 2-8% wagowych materiału kostnego. Korzystnie produkt obejmuje mezenchymalne komórki macierzyste o zdolności do różnicowania w komórki do regeneracji chrząstki lub kości.

W zakres wynalazku wchodzi również zastosowanie produktu mineralnego kości określonego powyżej, do wytwarzania wyrobu chirurgicznego do stosowania w sposobie leczenia ludzi lub osobnika zwierzęcego, u którego ten wyrób jest wszczepiany do połączonego ubytku chrząstki i kości u pacjenta. Korzystnie ubytek chrząstki i kości jest zlokalizowany na zakończeniu kości stawowej. Korzystnie obejmuje wprowadzenie wyrobu do ubytku kostnego, a następnie pokrycie produktu mineralnego i ubytku kostnego membraną kolagenową. Bardziej korzystnie membrana kolagenowa obejmuje warstwę kolagenu II. Korzystnie membrana obejmuje warstwę macierzy głównie z kolagenu II o otwartej, gąbczastej fakturze oraz przynajmniej jednej warstwie barierowej o zwartej, gładkiej powierzchni barierowej. Bardziej korzystnie warstwa barierowa jest głównie zbudowana z kolagenu I, kolagenu III albo ich mieszaniny. Korzystnie membrana obejmuje warstwę macierzy głównie z kolagenu II o otwartej, gąbczastej fakturze nałożonej na miękką, włóknistą warstwę błony kolagenu I/III o zwartej, gładkiej powierzchni barierowej przeciwległej do warstwy macierzy.

Ze zgłoszenia wynalazku P.358848 znany jest materiał do leczenia kości, obejmujący macierz niosącą hodowane komórki kościotwórcze, którymi mogą być osteocyty, osteoblasty, macierzyste komórki zrębu lub komórki macierzyste zdolne różnicowania w kościotwórcze osteoblasty. Macierz jest oczyszczonym materiałem macierzy kolagenu pochodzącym z naturalnej tkanki zwierzęcej zawierającej kolagen, porowatym materiałem mineralnej macierzy kości pochodzącym z naturalnej kości mającym strukturę krystaliczną zasadniczo taką jak naturalna kość i będącym zasadniczo wolnym od endogennego materiału organicznego lub kombinacją materiału oczyszczonej macierzy kolagenowej i porowatego materiału macierzy mineralnej.

Znany ze stanu techniki wynalazek PL 216995 rozwiązuje problem otrzymywania kompozytowych materiałów implantacyjnych o podwyższonej wytrzymałości. W jednym z rozwiązań sposób polega na tym, że wyjściowy proszek składający się z półwodnego siarczanu wapnia (CSH) w ilości 40%-100% masowych z dodatkiem wysokoreaktywnego hydroksyapatytu korzystnie modyfikowanego jonami Mg, Ti, CO3 w ilości 0%-60% masowych zarabia się 0,5%-2,0% roztworem chitozanu w wodnym roztworze kwasu octowego o stężeniu 0,2%-2,0% w ilości 0,4-0,7 ml/g mieszaniny, uzyskując pastę typu cementowego o konsystencji plastycznej masy wiążącej w miejscu implantacji.

Z dokumentacji zgłoszeniowej wynalazku P.401954 znany jest wielowarstwowy materiał medyczny przeznaczony na implant do wypełnień kości. Materiał stanowi co najmniej jeden układ trzech warstw, z których środkową jest warstwa nanowłókien, zaś zewnętrzne warstwy są warstwami włókniny igłowanej z włókien klasycznych połączonymi z warstwą nanowłókien techniką igłowania. Materiał zawiera co najmniej jeden spośród dodatków ceramicznych, węglowych i metalicznych oraz czynnik wzrostu lub lek. Dodatek ceramiczny, węglowy lub metaliczny, w postaci nanododatku, jest zawarty w strukturze warstwy nanowłókien, zaś czynnik wzrostu lub lek, enkapsulowany w mikrosferach z biopolimeru, jest osadzony na powierzchni warstwy nanowłókien. W odmianie wynalazku wielowarstwowy materiał medyczny przeznaczony na implant do wypełnień kości stanowi także co najmniej jeden układ trzech warstw, z których środkową jest warstwa porowata z polimeru biodegradowalnego, w postaci pianki lub w postaci membrany, zaś zewnętrzne warstwy są warstwami włókniny igłowanej z włókien klasycznych, połączonymi z membraną lub pianką techniką klejenia lub prasowania. Materiał zawiera co najmniej jeden spośród dodatków ceramicznych, węglowych i metalicznych oraz czynnik wzrostu lub lek. Dodatek ceramiczny, węglowy lub metaliczny, w postaci nanododatku, jest zawarty w strukturze pianki lub

PL 232 494 B1 membrany, zaś czynnik wzrostu lub lek, enkapsulowany w mikrosferach z biopolimeru, jest osadzony na powierzchni warstwy pianki lub membrany.

Ze zgłoszenia wynalazku P.284988 znany jest sposób wytwarzania hydroksyapatytowego materiału implantacyjnego, przeznaczonego zwłaszcza do wypełniania ubytków w kościach.

Celem twórców wynalazku było opracowanie nowej technologii otrzymywania przeszczepu do regeneracji tkanki kostnej przy założeniu, że technologia ta znajdzie zastosowanie przede wszystkim w przypadku kości korowo-gąbczastej, i pozwoli wyeliminować niedogodności dotychczas znanych sposobów otrzymywania takich przeszczepów, zwłaszcza konieczność stosowania agresywnych substancji chemicznych jak KOH lub NaOH oraz silnego roztworu perhydrolu i wysokich temperatur.

Powyższy cel osiągnięto, łącząc w innowacyjny sposób dostępne metody cięcia, odtłuszczania, płukania, liofilizowania i mielenia w specjalnych warunkach i pod szczególnymi, standaryzowanymi parametrami poszczególnych procesów.

Istotą sposobu otrzymywania przeszczepu gruzu korowo-gąbczastego do regeneracji tkanki kostnej według wynalazku jest to, że składa się z następujących po sobie etapów: oczyszczania mechanicznego kości, korzystnie talerza biodrowego pochodzenia ludzkiego z tkanek miękkich, dzielenia kości na fragmenty, zamrażania kości w temp. około -40°C, mielenia zamrożonych kości aż do uzyskania gruzu o wielkości ziarna od 0,5 mm do 15 mm, korzystnie 5 mm - 10 mm, rozmrażania uzyskanego po mieleniu gruzu w wodzie o temp. +15°C do +35°C, przepłukiwania rozmrożonego gruzu wodą pod ciśnieniem od 5 MPa do 11 MPa, korzystnie odłuszczania gruzu w C2H5OH o stężeniu od 60% do 96%, odtłuszczania gruzu w H2O2 o stężeniu od 1% do 40%, przepłukiwania gruzu NaCl o stężeniu od 0,1% do 10%, odsączania gruzu z NaCl, i sterylizacji radiacyjnej gruzu, korzystnie w dawce 35 kGy.

W odmianie wynalazku, pomiędzy etapem odsączania z resztek NaCl i etapem sterylizacji radiacyjnej gruzu, następuje etap zamrożenia gruzu w temp. około -40°C, a po nim etap liofilizacji zamrożonego gruzu przy parametrach temperatury od -52°C do -50°C, próżni od 0,016 mBara do 0,018 mBara, najkorzystniej przez okres 48 h.

Korzystnie do oczyszczania mechanicznego kości, stosuje się tnące narzędzia chirurgiczne.

Korzystnie kości dzieli się na fragmenty za pomocą piły ręcznej lub mechanicznej.

Korzystnie fragmenty kości wynoszą max. 5 cm na 5 cm.

Korzystnie zamrażanie kości albo gruzu prowadzi się w temp. od -80°C do -20°C, najkorzystniej przez okres od 24 h do 72 h, najlepiej w zamrażarce.

Korzystnie mielenie kości prowadzi się młynkiem ręcznym, przy zastosowaniu obrotowych wkładów tnących.

Korzystnie do rozmrażania uzyskanego po mieleniu gruzu stosuje się wodę dejonizowaną o temp. + 25°C, zachowując proporcje 2:1 (2 ml wody na 1 g kości), a rozmrażanie prowadzi się w czasie od 10 min do 60 min, najkorzystniej 15 min.

Korzystnie w czasie rozmrażania gruzu, co najmniej raz wytrząsa się go na wytrząsarce, najlepiej orbitralnej, przez 15 min przy obrotach 160 obr./min.

Korzystnie do przepłukiwania rozmrożonego gruzu stosuje się wodę pod ciśnieniem 8 MPa, a przepłukiwanie prowadzi się w czasie od 2 min do 5 min, najkorzystniej 3 min.

Korzystnie odłuszczanie gruzu w C2H5OH prowadzi się stosując C2H5OH o stężeniu 70%, zachowując proporcje 4:1 (4 ml C2H5OH na 1 g kości), przez okres 24 h, w temp. pokojowej.

Korzystnie odtłuszczanie gruzu w H2O2 prowadzi się stosując H2O2 o stężeniu 3%, zachowując proporcje 3:1 (3 ml H2O2 na 1 g kości).

Korzystnie w czasie odtłuszczania gruzu w H2O2, co najmniej raz wytrząsa się go na wytrząsarce, najlepiej orbitralnej, przez 15 min przy obrotach 160 obr./min.

Korzystnie w czasie odtłuszczania gruzu jedynie w H2O2, co najmniej raz wytrząsa się go na wytrząsarce, najlepiej orbitralnej, przez 15 min przy obrotach 160 obr./min, po czym H2O2, w którym następowało wytrząsanie odlewa się, a gruz zalewa się nową, nieprzereagowaną porcją H2O2, i odstawia na 24 h w temp. +2°C do +8°C, dogodnie w chłodziarce.

Korzystnie przepłukiwanie gruzu NaCl prowadzi się stosując NaCl o stężeniu 0,9%, zachowując proporcje 3:1 (3 ml NaCl na 1 g kości), w czasie od 5 min do 30 min, najkorzystniej 15 min.

Korzystnie odsączanie gruzu z NaCl, prowadzi się na papierze bezpyłowym.

Istotą przeszczepu do regeneracji tkanki kostnej według wynalazku jest to, że stanowi go tkanka kostna korowo-gąbczasta, korzystnie talerza biodrowego pochodzenia ludzkiego, w postaci gruzu o wielkości ziarna od 0,5 mm do 15 mm, korzystnie 5 mm - 10 mm, oczyszczona mechanicznie z tkanek miękkich, podzielona na fragmenty, zamrożona w temp. ok. -40°C, mielona w stanie zamrożenia aż do

PL 232 494 B1 uzyskania gruzu o pożądanej wielkości ziarna, rozmrożona po mieleniu w wodzie o temp. +15°C do +35°C, przepłukiwana po rozmrożeniu wodą pod ciśnieniem od 5 MPa do 11 MPa, korzystnie odłuszczona w C2H5OH o stężeniu od 60% do 96%, odtłuszczona w H2O2 o stężeniu od 1% do 40%, przepłukana NaCl o stężeniu od 0,1% do 10%, pozbawiona resztek NaCI, H2O2, korzystnie również C2H5OH, sterylizowana radiacyjnie w dawce 35 kGy.

W odmianie wynalazku przeszczep stanowi tkanka, poddana po odsączaniu z resztek NaCl przed sterylizacją radiacyjną, zamrożeniu w temp. około -40°C, a po nim liofilizacji przy parametrach temp. od -52°C do -50°C, próżni od 0,016 mBara do 0,018 mBara, najkorzystniej przez okres 48 h.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę oczyszczoną mechanicznie, za pomocą tnących narzędzi chirurgicznych.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę podzieloną na fragmenty za pomocą piły ręcznej lub mechanicznej, najlepiej na fragmenty o wielkości max. 5 cm na 5 cm.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę zamrożoną w temp. od -80°C do -20°C, najkorzystniej przez okres od 24 h do 72 h, najlepiej w zamrażarce.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę mieloną młynkiem ręcznym, przy zastosowaniu obrotowych wkładów tnących.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę rozmrożoną wodą dejonizowaną o temp. +25°C, zachowując proporcje 2:1 (2 ml wody na 1 g kości), w czasie od 10 min do 60 min, najkorzystniej 15 min.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę co najmniej raz wytrząsaną w czasie rozmrażania na wytrząsarce, najlepiej orbitralnej, przez 15 min przy obrotach 160 obr./min.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę przepłukaną wodą, pod ciśnieniem 8 MPa, w czasie od min do 5 min, najkorzystniej 3 min.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę odłuszczoną w C2H5OH o stężeniu 70% z zachowaniem proporcji 4:1 (4 ml C2H5OH na 1 g kości), przez okres 24 h, w temp. pokojowej.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę odłuszczoną w H2O2 o stężeniu 3% z zachowaniem proporcji 3:1 (3 ml H2O2 na 1 g kości).

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę co najmniej raz wytrząsaną w czasie odtłuszczania w H2O2 na wytrząsarce, najlepiej orbitralnej, przez 15 min przy obrotach 160 obr./min.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę, którą w czasie odtłuszczania jedynie w H2O2, co najmniej raz wytrząsano na wytrząsarce, najlepiej orbitralnej, przez 15 min przy obrotach 160 obr./min, po czym zalano nową, nieprzereagowaną porcją H2O2, i odstawiono na 24 h w temp. +2°C do +8°C, dogodnie w chłodziarce.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę przepłukaną NaCl o stężeniu 0,9%, zachowując proporcje 3:1 (3 ml NaCl na 1 g kości), w czasie od 5 min do 30 min, najkorzystniej 15 min.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę odsączoną z NaCl na papierze bezpyłowym.

Zaletą wynalazku jest to, że w wyniku nowej technologii uzyskano przeszczep do regeneracji tkanki kostnej, o niespotykanych dotąd właściwościach, który może być stosowany do zaopatrywania ubytków tkanki kostnej.

Zastosowanie w sposobie według wynalazku łagodnych substancji chemicznych jak C2H5OH, H2O2 i NaCl oraz wyeliminowanie konieczności wygrzewania kości w podwyższonej temp., dochodzącej do +60°C umożliwiło zachowanie w przeszczepie biologicznych substancji stymulujących budowę tkanki kostnej. Dzięki temu przeszczep jest biologicznie zgodny, oczyszczony z komórek szpiku o silnych właściwościach immunogennych.

Dzięki starannie dobranym czynnościom i parametrom przygotowania, przeszczep jest bezpieczny dla potencjalnego biorcy, i może być stosowany do zaopatrywania ubytków tkanki kostnej u ludzi.

P r z y k ł a d 1

Talerz biodrowy, korzystnie pochodzenia ludzkiego, przebadany pod kątem chorób zakaźnych, oczyszcza się z tkanek miękkich przy użyciu tnących narzędzi chirurgicznych. Następnie, przy użyciu piły ręcznej bądź mechanicznej, przycina się na fragmenty o rozmiarach max. 5 cm na 5 cm. Oczyszczone z tkanek miękkich fragmenty, zamraża się w temp. od -20°C do -80°C, korzystnie około -40°C, najlepiej na okres od 24 h do 72 h (czas potrzebny do właściwego zamrożenia materiału przed procesem mielenia). Zamrożony preparat mieli się następnie młynkiem ręcznym, przy zastosowaniu obrotowych wkładów tnących, dobranych stosownie do zamierzonej granulacji końcowej, która może wynosić od 0,5 mm do 15 mm, korzystnie od 5 mm do 10 mm. Powstały po mieleniu gruz kostny, waży się na wadze laboratoryjnej i umieszcza w zlewce o pojemności 1000 ml. Odważone 100 g gruzu zalewa się wodą,

PL 232 494 B1 korzystnie wodą dejonizowaną, o temp. od +15°C do +35°C, korzystnie +25°C, w ilości ok. 200 ml, zachowując proporcje 2:1 (2 ml wody na 1 g kości), przez 10 min do 60 min, korzystnie 15 min, celem ostatecznego rozmrożenia preparatu. Preparat wytrząsa się następnie na wytrząsarce orbitalnej, przez 15 min przy obrotach 160 rpm. Czynność wytrząsania powtarza się dwukrotnie. Po wytrząsaniu wodę odlewa się, a preparat przepłukuje się wodą w pojemniku z sitem o pojemności 500 ml, przy użyciu myjki ciśnieniowej, stosując ciśnienie od 5 MPa do 11 MPa, korzystnie 8 MPa przez 2 min do 5 min, korzystnie 3 min. Tak przygotowany gruz kostny odtłuszcza się za pomocą alkoholu etylowego C2H5OH o stężeniu 70%, zachowując proporcje 4:1 (4 ml C2H5OH na 1 g kości) i odstawia na 24 h w temp. pokojowej. Dopuszcza się również stosowanie C2H5OH o stężeniu od 60% do 96%. Po tym czasie C2H5OH odlewa się, a gruz kostny zalewa się w celu pozbycia się pozostałość komórek szpiku czerwonego i żółtego, nadtlenkiem wodoru H2O2 o stężeniu 3% w ilości ok. 300 ml, zachowując proporcje 3:1 (3 ml H2O2 na 1 g kości) i wytrząsa na wytrząsarce orbitalnej przez 15 min przy obrotach 160 rpm. Dopuszcza się również stosowanie H2O2 o stężeniu od 1% do 40%. Wytrząsanie w H2O2 powtarza się dwukrotnie. Po zakończeniu odtłuszczania H2O2 odlewa się, i aby pozbyć się jego pozostałości, gruz zalewa się chlorkiem sodu NaCl o stężeniu 0,9% w ilości 300 ml, zachowując proporcje 3:1 (3 ml NaCl na 1 g kości) i odstawia na okres od 5 min do 30 min, korzystnie 15 min. Można również stosować NaCl o stężeniu od 0,1% do 10%. Po upływie wskazanego czasu NaCl odlewa się, a jego resztki odsącza się na papierze bezpyłowym. Następnie przy pomocy strzykawki, najlepiej o pojemności 30 cm³, preparat dzieli się na porcje o objętości 10 cm³ oraz 20 cm³, poporcjowany preparat pakuje się w szczelnie zamknięte pojemniki, które okleja się etykietą identyfikacyjną, a następnie sterylizuje radiacyjnie w dawce 35 kGy. Po kontroli całego procesu kwalifikacji, przetwarzania, pakowania i sterylizacji, przeszczep gruzu kostnego dopuszczany jest do użytku klinicznego. Przeszczep przechowuje się w temp. poniżej - 40°C, korzystnie w temp. od -80°C do -40°C.

P r z y k ł a d 2

Talerz biodrowy, korzystnie pochodzenia ludzkiego, przebadany pod kątem chorób zakaźnych, oczyszcza się z tkanek miękkich przy użyciu tnących narzędzi chirurgicznych. Następnie, przy użyciu piły ręcznej bądź mechanicznej, przycina się na fragmenty o rozmiarach max. 5 cm na 5 cm. Oczyszczone z tkanek miękkich fragmenty, zamraża się w temp. od -20°C do -80°C, korzystnie około -40°C, najlepiej na okres od 24 h do 72 h (czas potrzebny do właściwego zamrożenia materiału przed procesem mielenia). Zamrożony preparat mieli się następnie młynkiem ręcznym, przy zastosowaniu obrotowych wkładów tnących, dobranych stosownie do zamierzonej granulacji końcowej, która może wynosić od 0,5 mm do 15 mm, korzystnie od 5 mm do 10 mm. Powstały po mieleniu gruz kostny, waży się na wadze laboratoryjnej i umieszcza w zlewce o pojemności 1000 ml. Odważone 100 g gruzu zalewa się wodą, korzystnie wodą dejonizowaną, o temp. +15°C do +35°C, korzystnie +25°C, w ilości ok. 200 ml, zachowując proporcje 2:1 (2 ml wody na 1 g kości), przez 10 min do 60 min, korzystnie 15 min, celem ostatecznego rozmrożenia preparatu. Preparat wytrząsa się następnie na wytrząsarce orbitalnej, przez 15 min przy obrotach 160 rpm. Czynność wytrząsania powtarza się dwukrotnie. Po wytrząsaniu wodę odlewa się, a preparat przepłukuje się wodą w pojemniku z sitem o pojemności 500 ml, przy użyciu myjki ciśnieniowej, stosując ciśnienie od 5 MPa do 11 MPa, korzystnie 8 MPa, przez 2 min do 5 min, korzystnie 3 min. Tak przygotowany gruz kostny zalewa się, w celu pozbycia się pozostałość komórek szpiku czerwonego i żółtego, nadtlenkiem wodoru H2O2 stężeniu 3% w ilości ok. 300 ml, zachowując proporcje 3:1 (3 ml H2O2 na 1 g kości) wytrząsa na wytrząsarce orbitalnej przez 15 min przy obrotach 160 rpm. Dopuszcza się również stosowanie H2O2 o stężeniu od 1% do 40%. Po zakończeniu wytrząsania odlewa się H2O2, ponownie zalewa świeżym H2O2, zachowując proporcje 3:1 i odstawia na 24 h do chłodziarki o temp. +2°C do +8°C. Po tym czasie odlewa się H2O2 i aby pozbyć się jego pozostałości, gruz zalewa się chlorkiem sodu NaCl o stężeniu 0,9% w ilości 300 ml, zachowując proporcje 3:1 (3 ml NaCl na 1 g tkanki) i odstawia na okres od 5 min do 30 min, korzystnie 15 min. Można również stosować NaCl o stężeniu od 0,1% do 10%. Po upływie wskazanego czasu NaCl odlewa się, a jego resztki odsącza się na papierze bezpyłowym. Następnie przy pomocy strzykawki, najlepiej o pojemności 30 cm³, preparat dzieli się na porcje o objętości 10 cm oraz 20 cm³, poporcjowany preparat pakuje się w szczelnie zamknięte pojemniki, które okleja się etykietą identyfikacyjną, a następnie sterylizuje radiacyjnie w dawce 35 kGy. Po kontroli całego procesu kwalifikacji, przetwarzania, pakowania i sterylizacji, przeszczep gruzu kostnego dopuszczany jest do użytku klinicznego. Przeszczep przechowuje się w temp. poniżej -40°C, korzystnie w temp. od -80°C do -40°C.

PL 232 494 B1

P r z y k ł a d 3

Talerz biodrowy, korzystnie pochodzenia ludzkiego, przebadany pod kątem chorób zakaźnych, oczyszcza się z tkanek miękkich przy użyciu tnących narzędzi chirurgicznych. Następnie, przy użyciu piły ręcznej bądź mechanicznej, przycina się na fragmenty o rozmiarach max. 5 cm na 5 cm. Oczyszczone z tkanek miękkich fragmenty, zamraża się w temp. od -20°C do -80°C, korzystnie około -40°C, najlepiej na okres od 24 h do 72 h (czas potrzebny do właściwego zamrożenia materiału przed procesem mielenia). Zamrożony preparat mieli się następnie młynkiem ręcznym przy zastosowaniu obrotowych wkładów tnących, dobranych stosownie do zamierzonej granulacji końcowej, która może wynosić od 0,5 mm do 15 mm, korzystnie od 5 mm do 10 mm. Powstały po mieleniu gruz kostny, waży się na wadze laboratoryjnej i umieszcza w zlewce o pojemności 1000 ml. Odważone 100 g gruzu zalewa się wodą, korzystnie wodą dejonizowaną, o temp. od +15°C do +35°C, korzystnie +25°C, w ilości ok. 200 ml, zachowując proporcje 2:1 (2 ml wody na 1 g kości), przez 10 do 60 min, korzystnie 15 min, celem ostatecznego rozmrożenia preparatu. Preparat wytrząsa się następnie na wytrząsarce orbitalnej, przez 15 min przy obrotach 160 rpm. Czynność wytrząsania powtarza się dwukrotnie. Po wytrząsaniu wodę odlewa się, a preparat przepłukuje się wodą w pojemniku z sitem o pojemności 500 ml, przy użyciu myjki ciśnieniowej, stosując ciśnienie od 5 MPa do 11 MPa, korzystnie 8 MPa, przez 2 min do 5 min, korzystnie 3 min. Tak przygotowany gruz kostny zalewa się, w celu pozbycia się pozostałości komórek szpiku czerwonego i żółtego, nadtlenkiem wodoru H2O2 stężeniu 3% w ilości ok. 300 ml, zachowując proporcje 3:1 (3 ml H2O2 na 1 g kości) i wytrząsa na wytrząsarce orbitalnej przez 15 min przy obrotach 160 rpm. Dopuszcza się również stosowanie H2O2 o stężeniu od 1% do 40%. Po zakończeniu wytrząsania odlewa się H2O2, ponownie zalewa świeżym H2O2, zachowując proporcje 3:1 i odstawia na 24 h do chłodziarki o temp. +2°C do +8°C. Po tym czasie odlewa się H2O2 i aby pozbyć się jego pozostałości, gruz zalewa się chlorkiem sodu NaCl o stężeniu 0,9% w ilości 300 ml, zachowując proporcje 3:1 (3 ml NaCl na 1 g kości) i odstawia na okres od 5 min do 30 min, korzystnie 15 min. Można również stosować NaCl o stężeniu od 0,1% do 10%. Po upływie wskazanego czasu NaCl odlewa się, a jego resztki odsącza się na papierze bezpyłowym. Uzyskany gruz kostny zamraża się w temperaturze od -20°C do -80°C, korzystnie około -40°C, najlepiej na okres od 24 h do 72 h (czas potrzebny do właściwego zamrożenia materiału), a następnie liofilizuje się, przy parametrach temperatury od -52°C do -50°C, próżni od 0,016 mBara do 0,018 mBara, przez okres 48 h. Po liofilizacji, przy pomocy strzykawki, najlepiej pojemności 30 cm³, gruz dzieli się na porcje o objętości 10 cm oraz 20 cm , poporcjowany gruz pakuje się w szczelnie zamknięte pojemniki, które okleja się etykietą identyfikacyjną, a następnie sterylizuje radiacyjnie w dawce 35 kGy. Po kontroli całego procesu kwalifikacji, przetwarzania, pakowania i sterylizacji, przeszczep gruzu kostnego dopuszczany jest do użytku klinicznego i przechowuje się go w temperaturze pokojowej.

P r z y k ł a d 4

Talerz biodrowy, korzystnie pochodzenia ludzkiego, przebadany pod kątem chorób zakaźnych, oczyszcza się z tkanek miękkich przy użyciu tnących narzędzi chirurgicznych. Następnie, przy użyciu piły ręcznej bądź mechanicznej, przycina się na fragmenty o rozmiarach max. 5 cm na 5 cm. Oczyszczone z tkanek miękkich fragmenty, zamraża się w temp. od -20°C do -80°C, korzystnie około -40°C, najlepiej na okres od 24 h do 72 h (czas potrzebny do właściwego zamrożenia materiału przed procesem mielenia). Zamrożony preparat mieli się następnie młynkiem ręcznym, przy zastosowaniu obrotowych wkładów tnących, dobranych stosownie do zamierzonej granulacji końcowej, która może wynosić od 0,5 mm do 15 mm, korzystnie od 5 mm do 10 mm. Powstały po mieleniu gruz kostny, waży się na wadze laboratoryjnej i umieszcza w zlewce o pojemności 1000 ml. Odważone 100 g gruzu zalewa się wodą, korzystnie wodą dejonizowaną, o temp. od +15°C do +35°C, korzystnie +25°C w ilości ok. 200 ml, zachowując proporcje 2:1 (2 ml wody na 1 g kości), przez 10 min do 60 min, korzystnie 15 min, celem ostatecznego rozmrożenia preparatu. Preparat wytrząsa się następnie na wytrząsarce orbitalnej, przez 15 min przy obrotach 160 rpm. Czynność wytrząsania powtarza się dwukrotnie. Po wytrząsaniu wodę odlewa się, a preparat przepłukuje się wodą w pojemniku z sitem, o pojemności 500 ml, przy użyciu myjki ciśnieniowej, stosując ciśnienie od 5 MPa do 11 MPa, korzystnie 8 MPa, przez 2 min do 5 min, korzystnie 3 min. Tak przygotowany gruz kostny odtłuszcza się za pomocą alkoholu etylowego C2H5OH o stężeniu 70%, zachowując proporcje 4:1 (4 ml C2H5OH na 1 g kości) i odstawia na 24 h w temperaturze pokojowej. Dopuszcza się również stosowanie C2H5OH o stężeniu od 60% do 96%. Po tym czasie C2H5OH odlewa się, a gruz kostny zalewa się, w celu pozbycia się pozostałości komórek szpiku czerwonego i żółtego, nadtlenkiem wodoru H2O2 o stężeniu 3% w ilości ok. 300 ml, zachowując proporcje 3:1 (3 ml H2O2 na 1 g kości) i wytrząsa na wytrząsarce orbitalnej przez 15 min przy obrotach 160 rpm.

PL 232 494 B1

Dopuszcza się również stosowanie H2O2 o stężeniu od 1% do 40%. Wytrząsanie w H2O2 powtarza się dwukrotnie. Po zakończeniu odtłuszczania H2O2 odlewa się, i aby pozbyć się jego pozostałości, gruz zalewa się chlorkiem sodu NaCl o stężeniu 0,9% w ilości 300 ml, zachowując proporcje 3:1 (3 ml NaCl na 1 g tkanki) i odstawia na okres od 5 min do 30 min, korzystnie 15 min. Można również stosować NaCl o stężeniu od 0,1% do 10%. Po upływie wskazanego czasu NaCl odlewa się, a jego resztki odsącza się na papierze bezpyłowym. Uzyskany gruz kostny zamraża się w tem p. od -20°C do -80°C, korzystnie około -40°C, najlepiej na okres od 24 h do 72 h (czas potrzebny do właściwego zamrożenia materiału), a następnie liofilizuje się przy parametrach temp. od -52°C do -50°C, próżni od 0,016 mBara do 0,018 mBara, przez okres 48 h.

Po liofilizacji, przy pomocy strzykawki, najlepiej o pojemności 30 cm³, gruz dzieli się na porcje o objętości 10 cm³ oraz 20 cm³, poporcjowany gruz pakuje się w szczelnie zamknięte pojemniki, które okleja się etykietą identyfikacyjną, a następnie sterylizuje radiacyjnie w dawce 35 kGy. Po kontroli całego procesu kwalifikacji, przetwarzania, pakowania i sterylizacji, przeszczep gruzu kostnego dopuszczany jest do użytku klinicznego i przechowuje się go w temp. pokojowej.

W wyniku powyżej opisanych sposobów postępowania, otrzymuje się przeszczep w postaci korowo-gąbczastego gruzu z talerza biodrowego mrożony lub liofilizowany, zwłaszcza ludzki, który jest biologicznie zgodny, oczyszczony z komórek szpiku o silnych właściwościach immunogennych.

Dzięki starannie dobranym czynnościom i parametrom przygotowania, przeszczep jest niezwykle bezpieczny dla potencjalnego biorcy, i może być stosowany do zaopatrywania ubytków tkanki kostnej u ludzi.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób otrzymywania przeszczepu gruzu korowo-gąbczastego do regeneracji tkanki kostnej, znamienny tym, że składa się z następujących po sobie etapów: oczyszczania mechanicznego kości, korzystnie talerza biodrowego pochodzenia ludzkiego z tkanek miękkich, dzielenia kości na fragmenty, zamrażania kości w temp. około -40°C, mielenia zamrożonych kości aż do uzyskania gruzu o wielkości ziarna od 0,5 mm do 15 mm, korzystnie 5 mm - 10 mm, rozmrażania uzyskanego po mieleniu gruzu w wodzie o temp. +15°C do +35°C, przepłukiwania rozmrożonego gruzu wodą pod ciśnieniem od 5 MPa do 11 MPa, korzystnie odłuszczania gruzu w C2H5OH o stężeniu od 60% do 96%, odtłuszczania gruzu w H2O2 o stężeniu od 1% do 40%, przepłukiwania gruzu NaCl o stężeniu od 0,1% do 10%, odsączania gruzu z NaCl, i sterylizacji radiacyjnej gruzu, korzystnie w dawce 35 kGy.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w odmianie wynalazku, pomiędzy etapem odsączania z resztek NaCl i etapem sterylizacji radiacyjnej gruzu, następuje etap zamrożenia gruzu w temp. około -40°C, a po nim etap liofilizacji zamrożonego gruzu przy parametrach temp. od -52°C do -50°C, próżni od 0,016 mBara do 0,018 mBara, najkorzystniej przez okres 48 h.
3. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że do oczyszczania mechanicznego kości, stosuje się tnące narzędzia chirurgiczne.
4. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że kości dzieli się na fragmenty za pomocą piły ręcznej lub mechanicznej.
5. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że fragmenty kości wynoszą max. 5 cm na 5 cm.
6. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że zamrażanie kości albo gruzu prowadzi się w temp. od -80°C do -20°C, najkorzystniej przez okres od 24 h do 72 h, najlepiej w zamrażarce.
7. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że mielenie kości prowadzi się młynkiem ręcznym, przy zastosowaniu obrotowych wkładów tnących.
8. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że do rozmrażania uzyskanego po mieleniu gruzu stosuje się wodę dejonizowaną o temp. +25°C, zachowując proporcje 2:1 (2 ml wody na 1 g kości), a rozmrażanie prowadzi się w czasie od 10 min do 60 min, najkorzystniej 15 min.

PL 232 494 B1
9. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że w czasie rozmrażania gruzu, co najmniej raz wytrząsa się go na wytrząsarce, najlepiej orbitralnej, przez 15 min przy obrotach 160 obr./min.
10. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że do przepłukiwania rozmrożonego gruzu stosuje się wodę pod ciśnieniem 8 MPa, a przepłukiwanie prowadzi się w czasie od 2 min do 5 min, najkorzystniej 3 min.
11. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że odłuszczanie gruzu w C2H5OH prowadzi się stosując C2H5OH o stężeniu 70%, zachowując proporcje 4:1 (4 ml C2H5OH na 1 g kości), przez okres 24 h, w temp. pokojowej.
12. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że odtłuszczanie gruzu w H2O2 prowadzi się stosując H2O2 o stężeniu 3%, zachowując proporcje 3:1 (3 ml H2O2 na 1 g kości).
13. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że w czasie odtłuszczania gruzu w H2O2, co najmniej raz wytrząsa się go na wytrząsarce, najlepiej orbitralnej, przez 15 min przy obrotach 160 obr./min.
14. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że w czasie odtłuszczania gruzu jedynie w H2O2, co najmniej raz wytrząsa się go na wytrząsarce, najlepiej orbitralnej, przez 15 min przy obrotach 160 obr./min, po czym H2O2, w którym następowało wytrząsanie odlewa się, a gruz zalewa się nową, nieprzereagowaną porcją H2O2, i odstawia na 24 h w temp. +2°C do +8°C, dogodnie w chłodziarce.
15. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że przepłukiwanie gruzu NaCl prowadzi się stosując NaCl o stężeniu 0,9%, zachowując proporcje 3:1 (3 ml NaCl na 1 g kości), w czasie od 5 min do 30 min, najkorzystniej 15 min.
16. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że odsączanie gruzu z NaCl, prowadzi się na papierze bezpyłowym.
17. Przeszczep do regeneracji tkanki kostnej, znamienny tym, że stanowi go tkanka kostna korowo-gąbczasta, korzystnie talerza biodrowego pochodzenia ludzkiego, w postaci gruzu o wielkości ziarna od 0,5 mm do 15 mm, korzystnie 5 mm - 10 mm, oczyszczona mechanicznie z tkanek miękkich, podzielona na fragmenty, zamrożona w temp. ok. -40°C, mielona w stanie zamrożenia aż do uzyskania gruzu o pożądanej wielkości ziarna, rozmrożona po mieleniu w wodzie o temp. +15°C do +35°C, przepłukiwana po rozmrożeniu wodą pod ciśnieniem od 5 MPa do 11 MPa, korzystnie odłuszczoną w C2H5OH o stężeniu od 60% do 96%, odtłuszczona w H2O2 o stężeniu od 1% do 40%, przepłukana NaCl o stężeniu od 0,1% do 10%, pozbawiona resztek NaCl, H2O2, korzystnie również C2H5OH, sterylizowana radiacyjnie w dawce 35 kGy.
18. Przeszczep według zastrz. 17, znamienny tym, że w odmianie wynalazku, stanowi go tkanka, poddana po odsączaniu z resztek NaCl i przed sterylizacją radiacyjną, zamrożeniu w temp. ok. -40°C, a po nim liofilizacji przy parametrach temperatury od -52°C do -50°C, próżni od 0,016 mBara do 0,018 mBara, najkorzystniej przez okres 48 h.
19. Przeszczep według zastrz. 17 lub 18, znamienny tym, że zawiera tkankę oczyszczoną mechanicznie, za pomocą tnących narzędzi chirurgicznych.
20. Przeszczep według zastrz. 17 lub 18, znamienny tym, że zawiera tkankę podzieloną na fragmenty za pomocą piły ręcznej lub mechanicznej, najlepiej na fragmenty o wielkości max. 5 cm na 5 cm.
21. Przeszczep według zastrz. 17 lub 18, znamienny tym, że zawiera tkankę zamrożoną w temperaturze od -80°C do -20°C, najkorzystniej przez okres od 24 h do 72 h, najlepiej w zamrażarce.
22. Przeszczep według zastrz. 17 lub 18, znamienny tym, że zawiera tkankę mieloną młynkiem ręcznym, przy zastosowaniu obrotowych wkładów tnących.
23. Przeszczep według zastrz. 17 lub 18, znamienny tym, że zawiera tkankę rozmrożoną wodą dejonizowaną o temp. +25°C, zachowując proporcje 2:1 (2 ml wody na 1 g kości), w czasie od 10 min do 60 min, najkorzystniej 15 min.
24. Przeszczep według zastrz. 17 lub 18, znamienny tym, że zawiera tkankę co najmniej raz wytrząsaną w czasie rozmrażania na wytrząsarce, najlepiej orbitralnej, przez 15 min przy obrotach 160 obr./min.
25. Przeszczep według zastrz. 17 lub 18, znamienny tym, że zawiera tkankę przepłukaną wodą, pod ciśnieniem 8 MPa, w czasie od 2 min do 5 min, najkorzystniej 3 min.

PL 232 494 B1
26. Przeszczep według zastrz. 17 lub 18, znamienny tym, że zawiera tkankę odłuszczoną W2H5OH o stężeniu 70% z zachowaniem proporcji 4:1 (4 ml C2H5OH na 1 g kości), przez okres 24 h, w temp. pokojowej.
27. Przeszczep według zastrz. 17 lub 18, znamienny tym, że zawiera tkankę odłuszczoną w H2O2 o stężeniu 3% z zachowaniem proporcji 3:1 (3 ml H2O2 na 1 g kości).
28. Przeszczep według zastrz. 17 lub 18, znamienny tym, że zawiera tkankę co najmniej raz wytrząsaną w czasie odtłuszczania w H2O2 na wytrząsarce, najlepiej orbitralnej, przez 15 min przy obrotach 160 obr./min.
29. Przeszczep według zastrz. 17 lub 18, znamienny tym, że zawiera tkankę, którą w czasie odtłuszczania jedynie w H2O2, co najmniej raz wytrząsano na wytrząsarce, najlepiej orbitralnej, przez 15 min przy obrotach 160 obr./min, po czym zalano nową, nieprzereagowaną porcją H2O2, i odstawiono na 24 h w temp. +2°C do +8°C, dogodnie w chłodziarce.
30. Przeszczep według zastrz. 17 lub 18, znamienny tym, że zawiera tkankę przepłukaną NaCl o stężeniu 0,9%, zachowując proporcje 3:1 (3 ml NaCl na 1 g kości), w czasie od 5 min do 30 min, najkorzystniej 15 min.
31. Przeszczep według zastrz. 17 lub 18, znamienny tym, że zawiera tkankę odsączoną z NaCl na papierze bezpyłowym.