PL248549B1 - Sposób otrzymywania przestrzennego przeszczepu kostnego o zdefiniowanym kształcie - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób otrzymywania przeszczepu przestrzennego o zdefiniowanym kształcie charakteryzujący się tym, że po etapie oczyszczania mechanicznego kości zbitej, gąbczastej lub zbito-gąbczastej, korzystnie pochodzenia ludzkiego z tkanek miękkich, dzielenia kości na fragmenty, myje się i odtłuszcza się kości w H₂O₂ o stężeniu od 1% do 40% przy pomocy ultradźwięków o częstotliwości od 20 do 1000 kHz, a następnie pakuje się przeszczep oraz sterylizuje radiacyjnie dawką 10 — 50 kGy. Przedmiotem zgłoszenia jest także przeszczep przestrzenny o zdefiniowanym kształcie.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania przestrzennego przeszczepu kostnego o zdefiniowanym kształcie oraz przeszczep kostny przestrzenny.

Rozwiązania według wynalazku znajdują zastosowanie w klinice człowieka np. ortopedii, stomatologii, chirurgii onkologicznej do wypełniania ubytków kostnych - cyst, nowotworów, przetok, a także w zabiegach endoprotezoplastyki stawu biodrowego.

Współczesna ortopedia odczuwa brak wystarczającej ilości dostępnych allogenicznych przeszczepów tkanki kostnej gąbczastej. Pobranie tkanki własnej chorego nie zawsze jest możliwe (np. u dzieci), a u dorosłych występuje konieczność pobrania podczas tej samej operacji i przeszczepienia jej, co wydłuża czas zabiegu oraz zwiększa ryzyko np. zakażenia ze względu na dwa pola operacyjne (miejsce pobrania i przeszczepienia).

Obecnie niewystarczająca liczba dawców tkanek ludzkich powoduje, że dostępne przeszczepy tkanki kostnej gąbczastej nie są w stanie zabezpieczyć wszystkich potencjalnych odbiorców, stąd poszukiwanie metod wytwarzania materiałów kościozastępczych lub stosowania przeszczepów ksenogenicznych od zwierząt, bądź pozyskiwania materiału tkankowego od chorego - przeszczepy autologiczne (bardzo często brak możliwości pobrania).

Żaden z tych materiałów i substytutów syntetycznych lub ksenoprzeszczepów nie jest jednak tak efektywny w działaniu jak natywna kość ludzka.

Tkanka kostna to rodzaj tkanki łącznej zbudowanej z komórek - osteoblastów, osteocytów, osteoklastów, które stanowią ok. 5% masy tkanki kostnej oraz istoty międzykomórkowej składającej się z części organicznej tzw. osteoidu ok. 25% i części nieorganicznej, która stanowi 60% - 70% całej masy tkanki kostnej. Osteoid w skład którego wchodzi kolagen, osteonektyna, osteokalcyna, proteoglikany i mukopolisacharydy, nadaje tkance kostnej sprężystość i wytrzymałość, natomiast składniki nieorganiczne, którymi są sole wapnia, magnezu i fosforu, odpowiedzialne są za jej twardość. Tkanka kostna ma charakterystyczną organizację przestrzenną tworząc kość.

Wyróżnia się tkankę kostną zbitą, która znajduje się w zewnętrznej części kości oraz tkankę kostną gąbczastą. Najwięcej tkanki kostnej gąbczastej, występuje przy nasadach kości długich.

Istnieje bogata literatura fachowa na temat transplantacji tkanek (np. Stacchi Cl i in.: Fresh Frozen Allogeneic Bone Block in Maxillary Sinus Floor Elevation: Histomorphometric Analysis of a Bone Specimen Retrieved 15 Years after Grafting Procedure, Appl. Sci. 2019, 9, 1119; doi:10.3390/app9061119; Schlee M. i Rothamel D. Ridge Augmentation Using Customized Allogenic Bone Blocks: Proof of Concept and Histological Findings. Implant Dentistry Volume 0 # Number 0). Publikacje te skupiają się na samym procesie transplantacji i wymogów dla tkanek do przeszczepu.

Literatura patentowa na temat przeszczepiania tkanek kostnych również jest bardzo bogata. Wśród tej literatury szczególną uwagę zwraca opis europejskiego zgłoszenia patentowego EP1929862. W opisie tym przy pozyskiwaniu allogenicznych przeszczepów kostnych wykorzystuje się ultradźwiękowe oczyszczanie z wykorzystaniem 3% nadtlenku wodoru o odpowiedniej temperaturze w myjce ultradźwiękowej. Jednak, jak w większości opisów, nie stosuje się sterylizacji radiacyjnej, jako skomplikowanej, wymagającej specjalistycznego sprzętu i wątpliwości co do skuteczności sterylizacji w stosunku do uszkodzeń pobranej tkanki.

Sposób otrzymywania przeszczepu przestrzennego o zdefiniowanym kształcie według wynalazku, w którym kość zbitą, gąbczastą lub zbito-gąbczastą oczyszcza się z tkanek miękkich przy użyciu narzędzi chirurgicznych. Następnie z takiej kości przycina się za pomocą piły mechanicznej fragmenty o długości od 10 do 30 mm, szerokości od 1 do 20 mm i wysokości od 10 do 20 mm. Przy użyciu narzędzi tnących-skrawających uzyskuje się pożądany kształt - blaszki, bloki lub kształtki „U”, „L”, „I”. Tak przygotowane fragmenty płucze się wodą w pojemniku z sitem przy użyciu myjki wysokociśnieniowej ciśnieniem od 5 do 11 MPa. Wstępnie wypłukane przestrzenne fragmenty kostne, w celu końcowego efektywnego mycia i odtłuszczenia, umieszcza się w myjce ultradźwiękowej zalanej H2O2 o stężeniu od 1% do 40% i podgrzanej w zakresie 30°C do 40°C i oczyszcza się od 20-30 min przy pomocy ultradźwięków o częstotliwości od 20 do 1 000 kHz. Następnie wyłącza się ultradźwięki i ponownie płucze się wodą w pojemniku z sitem przy użyciu myjki wysokociśnieniowej ciśnieniem od 5 do 11 MPa. Następnie fragmenty zalewa się 3% H2O2 i pozostawia w temperaturze 2-8°C na okres od 24 do 36 godz. Po tym oczyszczone przestrzenne fragmenty kostne zalewa się 0,9% NaCl w ilości 100 ml na 15 minut na każdy fragment. Później odsącza się na papierze bezpyłowym i doczyszcza z pozostałych tkanek miękkich. Tak przygotowane przeszczepy pakuje się w szczelne pojemniki, zgrzewa, etykietuje i sterylizuje radiacyjnie w dawce 10-50 kGy i przechowuje w temperaturze poniżej - 60°C do 5 lat.

Korzystnie sposób otrzymywania przeszczepu przestrzennego o zdefiniowanym kształcie, w którym kość zbitą, gąbczastą lub zbito-gąbczastą oczyszcza się z tkanek miękkich przy użyciu narzędzi chirurgicznych, a następnie z takiej kości przycina się za pomocą piły mechanicznej fragmenty o długości od 10 do 30 mm, szerokości od 1 do 20 mm i wysokości od 10 do 20 mm; przy użyciu narzędzi tnących-skrawających uzyskuje się pożądany kształt - blaszki, bloki lub kształtki „U”, „L”, „I”. Tak przygotowane fragmenty płucze się wodą w pojemniku z sitem przy użyciu myjki wysokociśnieniowej ciśnieniem od 5 do 11 MPa. Wstępnie wypłukane przestrzenne fragmenty kostne, w celu końcowego efektywnego mycia i odtłuszczenia, umieszcza się w myjce ultradźwiękowej zalanej H2O2 o stężeniu od 1% do 40% i podgrzanej w zakresie 30°C do 40°C i oczyszcza się od 20-30 min przy pomocy ultradźwięków o częstotliwości od 20 do 1 000 kHz. Dalej wyłącza się ultradźwięki i ponownie płucze się wodą w pojemniku z sitem przy użyciu myjki wysokociśnieniowej ciśnieniem od 5 do 11 MPa. Następnie fragmenty zalewa się 3% H2O2 i pozostawia w temperaturze 2-8°C na okres od 24 do 36 godz. Po czym oczyszczone przestrzenne fragmenty kostne zalewa się 0,9% NaCl w ilości 100 ml na 15 minut na każdy fragment. Potem odsącza się na papierze bezpyłowym i doczyszcza z pozostałych tkanek miękkich. Tak przygotowane - przeszczepy mrozi się i poddaje liofilizacji przez okres 48-72 godz. w temp. -47 do -55°C i próżni od 0,016 do 0,090 mBar pakuje się w szczelne pojemniki, zgrzewa, etykietuje i sterylizuje radiacyjnie w dawce 10-50 kGy i przechowuje w temperaturze pokojowej.

Pojęcie kształtu ‘blaszka’ jest równoważne z ICCBBAT1732 Bone Strip.

Poniższe przykłady wykonania nie zawężają szukanej ochrony patentowej.

Przykład 1

Kość udową, kość piszczelową, kość strzałkową, kość ramienną, łokciową, promieniową, kość czaszki, kość piętową, kość biodrową lub talerz biodrowy pochodzący ze zwłok oczyszcza się z tkanek miękkich przy użyciu narzędzi chirurgicznych. Następnie z odpowiednio wybranych części wyżej wymienionych tkanek przycina się za pomocą piły mechanicznej fragmenty o długości od 10 do 30 mm, szerokości od 1 do 20 mm i wysokości od 10 do 20 mm. Przy użyciu narzędzi tnących-skrawających uzyskuje się pożądany kształt np. „U”, „L” lub „I”. Tak przygotowane kształtki zbudowane z kości gąbczastej, zbitej lub zbito-gąbczastej płucze się wodą w pojemniku z sitem przy użyciu myjki wysokociśnieniowej ciśnieniem od 5 do 11 MPa. Wstępnie wypłukane kształtki kostne w celu końcowego efektywnego mycia i odtłuszczenia umieszcza się w myjce ultradźwiękowej zalanej 1200 ml 3% H2O2 podgrzanej w zakresie 30°C do 40°C i oczyszcza się od 20-30 min przy 40 kHz. Po tym czasie wyłącza się ultradźwięki i ponownie płucze się wodą w pojemniku z sitem przy użyciu myjki wysokociśnieniowej ciśnieniem od 5 do 11 MPa. Następnie kształtki zalewa się 3% H2O2 i pozostawia w temperaturze 28°C na okres od 24 do 36 godz. Po upływie tego czasu oczyszczone kształtki kostne zalewa się 0,9% NaCl w ilości 100 ml na 15 minut na każdy fragment. Następnie odsącza się kształtki kostne na papierze bezpyłowym i doczyszcza z pozostałych tkanek miękkich. Tak przygotowane kształtki - przeszczepy pakuje się w szczelne pojemniki, zgrzewa, etykietuje i sterylizuje radiacyjnie w dawce 35 kGy i przechowuje w temperaturze poniżej - 60°C do 5 lat.

P rz y kła d 2

Kość udową, kość piszczelową, kość strzałkową, kość ramienną, łokciową, promieniową, kość czaszki, kość piętową, kość biodrową lub talerz biodrowy pochodzący ze zwłok oczyszcza się z tkanek miękkich przy użyciu narzędzi chirurgicznych. Następnie z odpowiednio wybranych części wyżej wymienionych tkanek przycina się za pomocą piły mechanicznej fragmenty o długości od 10 do 30 mm, szerokości od 1 do 20 mm i wysokości od 10 do 20 mm. Przy użyciu narzędzi tnących-skrawających uzyskuje się pożądany blok kostny z tkanki kostnej zbitej, zbito-gąbczastej i gąbczastej. Tak przygotowane bloki kostne zbudowane z kości gąbczastej, zbitej lub zbito- gąbczastej płucze się wodą w pojemniku z sitem przy użyciu myjki wysokociśnieniowej ciśnieniem od 5 do 11 MPa. Wstępnie wypłukane bloki kostne w celu końcowego efektywnego mycia i odtłuszczenia umieszcza się w myjce ultradźwiękowej zalanej 1200 ml 3% H2O2 podgrzanej w zakresie 30°C do 40°C i oczyszcza się od 20-30 min przy 40 kHz. Po tym czasie wyłącza się ultradźwięki i ponownie płucze się wodą w pojemniku z sitem przy użyciu myjki wysokociśnieniowej ciśnieniem od 5 do 11 MPa. Następnie kształtki zalewa się 3% H2O2 i pozostawia w temperaturze 2-8°C na okres od 24 do 36 godz. Po upływie tego czasu oczyszczone bloki kostne zalewa się 0,9% NaCl w ilości 100 ml na 15 minut na każdy fragment. Następnie odsącza się bloki kostne na papierze bezpyłowym i doczyszcza z pozostałych tkanek miękkich. Tak przygotowane bloki - przeszczepy pakuje się w szczelne pojemniki, zgrzewa, etykietuje i sterylizuje radiacyjnie w dawce 35 kGy i przechowuje w temperaturze poniżej - 60°C do 5 lat.

Przykład 3

Kość udową, kość piszczelową, kość strzałkową, kość ramienną, łokciową, promieniową, kość czaszki, kość piętową, kość biodrową lub talerz biodrowy pochodzący ze zwłok oczyszcza się z tkanek miękkich przy użyciu narzędzi chirurgicznych. Następnie z odpowiednio wybranych części wyżej wymienionych tkanek przycina się za pomocą piły mechanicznej fragmenty o długości od 10 do 30 mm, szerokości od 1 do 20 mm i wysokości od 10 do 20 mm. Przy użyciu narzędzi tnących-skrawających uzyskuje się pożądany kształt np. „U”, „L” lub „I”. Tak przygotowane kształtki zbudowane z kości gąbczastej, zbitej lub zbito-gąbczastej płucze się wodą w pojemniku z sitem przy użyciu myjki wysokociśnieniowej ciśnieniem od 5 do 11 MPa. Wstępnie wypłukane kształtki kostne w celu końcowego efektywnego mycia i odtłuszczenia umieszcza się w myjce ultradźwiękowej zalanej 1200 ml 3% H2O2 podgrzanej do 40°C i oczyszcza się od 20-30 min przy 40 kHz. Po tym czasie wyłącza się ultradźwięki, i ponownie płucze się wodą w pojemniku z sitem przy użyciu myjki wysokociśnieniowej ciśnieniem od 5 do 11 MPa. Następnie kształtki zalewa się 3% H2O2 i pozostawia w temperaturze 2-8°C na okres od 24 do 36 godz. Po upływie tego czasu oczyszczone kształtki kostne zalewa się 0,9% NaCl w ilości 100 ml na 15 minut na każdy fragment. Następnie odsącza się kształtki kostne na papierze bezpyłowym i doczyszcza z pozostałych tkanek miękkich. Zamrożone przeszczepy liofilizuje się przez okres od 48 do 72 h przy temperaturze -47°C do -55°C przy próżni 0,016 do 0,090 mBara. Po liofilizacji przeszczepy pakuje się w szczelne pojemniki i sterylizuje radiacyjnie w dawce 35 kGy. Tak przygotowane kształtki przeszczepy przechowuje się w temperaturze 16°C do 30°C do 18 miesięcy.

P rz y kła d 4

Kość udową, kość piszczelową, kość strzałkową, kość ramienną, łokciową, promieniową, kość czaszki, kość piętową, kość biodrową lub talerz biodrowy pochodzący ze zwłok oczyszcza się z tkanek miękkich przy użyciu narzędzi chirurgicznych. Następnie z odpowiednio wybranych części wyżej wymienionych tkanek przycina się za pomocą piły mechanicznej fragmenty o długości od 10 do 30 mm, szerokości od 1 do 20 mm i wysokości od 10 do 20 mm. Przy użyciu narzędzi tnących-skrawających uzyskuje się pożądany blok kostny z tkanki kostnej zbitej, zbito-gąbczastej i gąbczastej. Tak przygotowane bloki kostne zbudowane z kości gąbczastej, zbitej lub zbito-gąbczastej płucze się wodą w pojemniku z sitem przy użyciu myjki wysokociśnieniowej ciśnieniem od 5 do 11 MPa. Wstępnie wypłukane bloki kostne w celu końcowego efektywnego mycia i odtłuszczenia umieszcza się w myjce ultradźwiękowej zalanej 1200 ml 3% H2O2 podgrzanej do 40°C i oczyszcza się od 20-30 min przy 40 kHz. Po tym czasie wyłącza się ultradźwięki, i ponownie płucze się wodą w pojemniku z sitem przy użyciu myjki wysokociśnieniowej ciśnieniem od 5 do 11 MPa. Następnie bloki kostne zalewa się 3% H2O2 i pozostawia w temperaturze 2-8°C na okres od 24 do 36 godz. Po upływie tego czasu oczyszczone bloki kostne zalewa się 0,9% NaCl w ilości 100 ml na 15 minut na każdy fragment. Następnie odsącza się bloki kostne na papierze bezpyłowym i doczyszcza z pozostałych tkanek miękkich. Zamrożone przeszczepy liofilizuje się przez okres od 48 do 72 h przy temperaturze -47°C do -55°C przy próżni 0,016 do 0,090 mBara. Po liofilizacji przeszczepy pakuje się w szczelne pojemniki i sterylizuje radiacyjnie w dawce 35 kGy. Tak przygotowane bloki - przeszczepy pakuje się w szczelne pojemniki, zgrzewa, etykietuje i sterylizuje radiacyjnie w dawce 35 kGy i przechowuje w temperaturze 16°C do 30°C do 18 miesięcy.

P rz y kła d 5

Tkankę kostną pochodzącą ze zwłok oczyszcza się z tkanek miękkich przy użyciu narzędzi chirurgicznych. Następnie z odpowiednio wybranych fragmentów kostnych przycina się za pomocą obrabiarki typu CNC fragmenty o długości od 5 do 500 mm, szerokości od 5 do 200 mm i wysokości od 5 do 200 mm. Przy użyciu narzędzi tnących-skrawających obrabiarki CNC uzyskuje się pożądany kształt np. „U”, „L” lub „I”. Tak przygotowane kształtki zbudowane z kości gąbczastej, zbitej lub zbito-gąbczastej płucze się wodą w pojemniku z sitem przy użyciu myjki wysokociśnieniowej ciśnieniem od 5 do 11 MPa. Wstępnie wypłukane bloki kostne w celu końcowego efektywnego mycia i odtłuszczenia umieszcza się w myjce ultradźwiękowej zalanej 1200 ml 3% H2O2 podgrzanej do 40°C i oczyszcza się od 20-30 min przy 40 kHz. Po tym czasie wyłącza się ultradźwięki, i ponownie płucze się wodą w pojemniku z sitem przy użyciu myjki wysokociśnieniowej ciśnieniem od 5 do 11 MPa. Następnie bloki kostne zalewa się 3% H2O2 i pozostawia w temperaturze 2-8°C na okres od 24 do 36 godz. Po upływie tego czasu oczyszczone bloki kostne zalewa się 0,9% NaCl w ilości 100 ml na 15 minut na każdy fragment. Następnie odsącza się bloki kostne na papierze bezpyłowym i doczyszcza z pozostałych tkanek miękkich. Zamrożone przeszczepy liofilizuje się przez okres od 48 do 72 h przy temperaturze -47°C do -55°C przy próżni 0,016 do 0,090 mBara. Po liofilizacji przeszczepy pakuje się w szczelne pojemniki i sterylizuje radiacyjnie w dawce 35 kGy. Tak przygotowane bloki - przeszczepy pakuje się w szczelne pojemniki, zgrzewa, etykietuje i sterylizuje radiacyjnie w dawce 35 kGy i przechowuje w temperaturze 16°C do 30°C do 18 miesięcy.

Przedmiot wynalazku rozwiązuje problem dopasowania przeszczepu do łoża kostnego biorcy. Przeszczepy przygotowywane tradycyjnymi metodami nie zawsze są dopasowane w taki sposób, aby możliwa była szybka regeneracji i przebudowa tkanki kostnej. Często lekarz-operator musi ręcznie na bloku operacyjnym dopasowywać przeszczep do ubytku kostnego, co naraża chorego na dłuższy pobyt na sali operacyjnej i dłuższy powrót do zdrowia.

Stosowane obecnie metody czyszczenia i odtłuszczania przeszczepów nie uwzględniają wykorzystania zjawiska kawitacji przy oczyszczaniu i odtłuszczaniu. Przedmiot wynalazku jest doczyszczany i myty przy użyciu myjki ultradźwiękowej, która wypełniona jest 3% nadtlenkiem wodoru (wodą utlenioną).

Woda utleniona rozkłada się przy kontakcie ze szpikiem kostnym, degraduje ona lipidy budujące otoczki komórek, czyli błony komórkowe. Kiedy komórka zostaje uszkodzona, na zewnątrz uwalniany jest ich skład, czyli m.in. katalaza, która następnie reaguje z nadtlenkiem wodoru gwałtownie wydzielając tlen, a towarzyszy temu silne spienianie. 3% H2O2 pozwala na wyczyszczenie i oddzielenie ukrytych zanieczyszczeń oraz mikroorganizmów z struktury tkanki kostnej.

Połączeniu procesu fizycznego, zjawiska kawitacji jakim jest - proces mycia ultradźwiękowego z właściwościami 3% H2O2 powoduje precyzyjne oczyszczenie i odtłuszczenie pozostawiając jedynie natywna tkankę kostną, pozbawioną zanieczyszczeń tkanek miękkich, krwi, szpiku kostnego i itp. a wraz ze sterylizacją radiacyjną pozwala na przygotowanie sterylnego przeszczepu dopasowanego do ubytku tkanki u biorcy. Co ma znaczący wpływ na przebudowę przeszczepu w organizmie biorcy.

Claims (3)

1. Sposób otrzymywania przeszczepu przestrzennego o zdefiniowanym kształcie, w którym kość zbitą, gąbczastą lub zbito-gąbczastą oczyszcza się z tkanek miękkich przy użyciu narzędzi chirurgicznych, a następnie z takiej kości przycina się za pomocą piły mechanicznej fragmenty o długości od 10 do 30 mm, szerokości od 1 do 20 mm i wysokości od 10 do 20 mm; przy użyciu narzędzi tnących-skrawających uzyskuje się pożądany kształt - blaszki, bloki lub kształtki „U”, „L”, „I”; tak przygotowane fragmenty płucze się wodą w pojemniku z sitem przy użyciu myjki wysokociśnieniowej ciśnieniem od 5 do 11 MPa, a wstępnie wypłukane przestrzenne fragmenty kostne w celu końcowego efektywnego mycia i odtłuszczenia umieszcza się w myjce ultradźwiękowej zalanej H2O2 o stężeniu od 1% do 40% i podgrzanej w zakresie 30°C do 40°C i oczyszcza się od 20-30 min przy pomocy ultradźwięków o częstotliwości od 20 do 1 000 kHz; po czym wyłącza się ultradźwięki i ponownie płucze się wodą w pojemniku z sitem przy użyciu myjki wysokociśnieniowej ciśnieniem od 5 do 11 MPa; następnie fragmenty zalewa się 3% H2O2 i pozostawia w temperaturze 2-8°C na okres od 24 do 36 godz.; następnie oczyszczone przestrzenne fragmenty kostne zalewa się 0,9% NaCl w ilości 100 ml na 15 minut na każdy fragment; następnie odsącza się na papierze bezpyłowym i doczyszcza z pozostałych tkanek miękkich; tak przygotowane - przeszczepy pakuje się w szczelne pojemniki, zgrzewa, etykietuje i sterylizuje radiacyjnie w dawce 10-50 kGy i przechowuje w temperaturze poniżej - 60°C.

2. Sposób otrzymywania przeszczepu przestrzennego o zdefiniowanym kształcie wg zastrzeżenia 1, w którym kość zbitą, gąbczastą lub zbito-gąbczastą oczyszcza się z tkanek miękkich przy użyciu narzędzi chirurgicznych, a następnie z takiej kości przycina się za pomocą piły mechanicznej fragmenty o długości od 10 do 30 mm, szerokości od 1 do 20 mm i wysokości od 10 do 20 mm; przy użyciu narzędzi tnących-skrawających uzyskuje się pożądany kształt blaszki, bloki lub kształtki „U”, „L”, „I”; tak przygotowane fragmenty płucze się wodą w pojemniku z sitem przy użyciu myjki wysokociśnieniowej ciśnieniem od 5 do 11 MPa, a wstępnie wypłukane przestrzenne fragmenty kostne w celu końcowego efektywnego mycia i odtłusz czenia umieszcza się w myjce ultradźwiękowej zalanej H2O2 o stężeniu od 1% do 40% i podgrzanej w zakresie 30°C do 40°C i oczyszcza się od 20-30 min przy pomocy ultradźwięków o częstotliwości od 20 do 1 000 kHz; po czym wyłącza się ultradźwięki i ponownie płucze się wodą w pojemniku z sitem przy użyciu myjki wysokociśnieniowej ciśnieniem od 5 do 11 MPa; następnie fragmenty zalewa się

3% H2O2 i pozostawia w temperaturze 2-8°C na okres od 24 do 36 godz.; następnie oczyszczone przestrzenne fragmenty kostne zalewa się 0,9% NaCl w ilości 100 ml na 15 minut na każdy fragment; następnie odsącza się na papierze bezpyłowym i doczyszcza z pozostałych tkanek miękkich; tak przygotowane - przeszczepy mrozi się i poddaje liofilizacji przez okres 48-72 godz. w temp. -47 do -55°C i próżni od 0,016 do 0,090 mBar pakuje się w szczelne pojemniki, zgrzewa, etykietuje i sterylizuje radiacyjnie w dawce 10-50 kGy i przechowuje w temperaturze pokojowej.