PL232520B1 - Platforma i jej zastosowanie do detekcji i/lub identyfikacji mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii, techniką powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana oraz sposób osadzania tych mikroorganizmów na wytworzonych platformach - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest platforma i jej zastosowanie do detekcji i/lub identyfikacji mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii, techniką powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana (SERS) oraz sposób osadzania tych mikroorganizmów na wytworzonych platformach. W szczególności wynalazek obejmuje sposób osadzania mikroorganizmów, szczególnie bakterii, zawieszonych w płynie/cieczy/roztworze, na materiałach polimerowych o rozmiarach nano - lub mikrometrów pokrytych metalem, oraz platforma do pomiarów powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana wykonana tym sposobem.

Stan techniki

Powierzchniowo wzmocniony efekt Ramana (Surface Enhanced Raman Spectroscopy - SERS) został odkryty w 1974 roku i polega na wzmacnianiu z natury słabych pasm ramanowskich, jeśli badana molekuła znajduje się w bezpośrednim sąsiedztwie powierzchni metalu (zazwyczaj złota lub srebra) pokrytej nierównościami w skali nano- lub mikrometrów. Wzmocnienie to zazwyczaj wynosi 10⁴-10⁶ razy choć odnotowano wzmocnienia rzędu 10¹⁰ razy. (Fleischm. M, Hendra P. J., McQuillan A. J., Raman-spectra of pyridine adsorbed at a silver electrode. Chem. Phys. Lett. 1974, 26 (2), 163-166; Harper M. M., McKeating K. S., Faulds K., Recent developments and future directions in SERS for bioanalysis. Phys. Chem. Chem. Phys. 2013, 15 (15), 5312-5328).

Wzmocnienie sygnału SERS zależy od wielu różnych czynników, między innymi od: częstości promieniowania wzbudzającego, efektywnego ramanowskiego przekroju czynnego, od rodzaju badanego związku chemicznego oraz struktury podłoża, na którym znajduje się badany związek. Powierzchnia ta powinna charakteryzować się obecnością nano- lub mikronierówności, będących zazwyczaj różnego rodzaju uskokami i pofałdowaniami. Jak już zaznaczono, najstabilniejszymi i dającymi największe wzmocnienie materiałami wykorzystywanymi w technice SERS są złoto lub srebro, a w mniejszym stopniu także miedź.

Nanostruktury zbudowane z tych trzech metali wykazują zlokalizowany powierzchniowy rezonans plazmonowy, LSPR (ang. localized surface plasmon), którego częstość pokrywa się z częstościami odpowiadającymi falom z zakresu światła widzialnego i bliskiej podczerwieni (Sharma B., Frontiera R. R., Henry A. I., Ringe E., Van Duyne R. P., SERS: Materials, applications, and the future. Mater. Today 2012, 15 (1-2), 16-25). Jest to duża zaleta tych materiałów, jako że podczas pomiarów ramanowskich najczęściej stosuje się lasery o długościach fal z tego właśnie zakresu. Jest wiele innych metali, które także mogą wzmacniać sygnał Ramana, jednak ich zastosowanie w technice SERS jest ograniczone ze względu na znaczną, w porównaniu ze złotem i srebrem, reaktywność.

Co jednak istotne, to fakt, że podłoże może być wykonane z zupełnie innego materiału niż ww. metale, a jego powierzchnia pokryta jest cienką warstwą złota lub srebra. Grubość tej warstwy to zazwyczaj kilkadziesiąt nanometrów.

Do uzyskiwania powierzchni aktywnych w pomiarach SERS wykorzystuje się szereg znan ych metod, zarówno top-bottom, jak i bottom-up: trawienie chemiczne, osadzanie koloidów metali, cykle utleniania i redukcji, elektronolitografia, elektrodepozycja, różne „metody szablonowe”, oraz wariacje metod CVD oraz PVD (Polavarapu L., Liz-Marzan L. M., Towards low-cost flexible substrates for nanoplasmonic sensing. Phys. Chem. Chem. Phys. 2013, 15 (15), 5288-5300; Bantz K. C., Meyer A. F., Wittenberg N. J., Im H., Kurtulus O., Lee S. H., Lindquist N. C, Oh S. H., Haynes C. L., Recent progress in SERS biosensing. Phys. Chem. Chem. Phys. 2011, 13 (24), 11551-11567).

Nie wszystkie opisane w literaturze naukowej sposoby otrzymywania powierzchni służących do wzmocnienia sygnału Ramana można wykorzystać w przypadku detekcji i/lub identyfikacji mikroorganizmów, takich jak bakterie. Jest to szczególnie trudne, gdy metalem bezpośrednio stykającym się ze ścianą komórkową bakterii jest srebro. Jony srebra powodują bowiem zaburzenie działania łańcucha oddechowego bakterii, co w konsekwencji prowadzi do ich obumarcia (Percival S. L., Bowler P. G., Russell D., Bacterial resistance to silver in wound care. J. Hosp. Infect. 2005, 60 (1), 1-7). Z tego powodu metalem najlepiej nadającym się do detekcji i identyfikacji bakterii techniką SERS jest złoto.

Kolejnym problemem związanym z pomiarami metodą SERS jest powtarzalność uzyskanych widm. Oczekuje się, iż widma SERS pochodzące z jednego podłoża będą miały ten sam charakter (intensywność, poziom szumu, częstotliwość odpowiadających sobie pasm). Podobnie jest z widmami SERS tej samej substancji/bakterii pochodzącymi z różnych podłoży uzyskanych tą samą techniką: jeśli ich charakter jest bardzo podobny to powtarzalność widma jest wysoka.

Detekcja i identyfikacja bakterii była przedmiotem wielu zgłoszeń patentowych.

PL 232 520 B1

Patent US 2008/0096005 A1 „Nanostructured substrate for surface enhanced Raman scattering” dotyczy otrzymywania powierzchni z dwutlenku krzemu, tlenku glinu lub dwutlenku tytanu pokrytej nanocząstkami Ag, Au lub Cu o rozmiarach od 20 do 140 nm. Dla bakterii Escherichia coli zaadsorbowanych na jednej z przykładowych powierzchni uzyskano współczynnik wzmocnienia 2x10⁴. Autorzy patentu nie umieścili informacji o powtarzalności uzyskiwanych widm.

Z kolei patent US 7879625 B1 „Preparation of SERS substrates on silica-coated magnetic microspheres” obejmuje podłoża SERS złożone z mikrocząstek magnetycznych skompleksowanych z metalicznymi cząstkami koloidalnymi. Autorzy patentu dodają, że podłoża mogą być stosowane w przypadku detekcji między innymi grzybów, wirusów i bakterii, jednak są one pojedynczego użytku.

W patencie KR 2009030767 A „Detection of pathogenic bacteria and SNP with surface-enhanced Raman scattering using unmodified gold nanoparticles” autorzy prezentują wynalazek związany miedzy innymi z detekcją bakterii patogennych oraz kwasów nukleinowych przy pomocy techniki SERS. Jako materiał wzmacniający sygnał zostały wykorzystane niezmodyfikowane nanocząstki złota. Opisany sposób detekcji może opierać się ponadto na wykorzystaniu procesu hybrydyzacji. Mimo, że metoda wykorzystuje złoto, to autorzy nie podają uzyskanego przez nich wzmocnienia sygnału Ramana.

Opis patentowy US 20080268493 A1 „Identification method based on surface-enhanced Raman scattering” ukazuje wykorzystanie srebrnych lub złotych nanocząstek do identyfikacji bakterii przy pomocy techniki SERS. W pracy tej badacze mieszają roztwór zawierający bakterie z roztworem koloidalnym nanocząstek, a następnie na próbkę nakierowują wiązkę laserową o długości 830 nm. Wadą metody jest fakt, iż mamy tu do czynienia z roztworem i jedynie odpowiednio wysokie stężenie nanocząstek i bakterii umożliwia uzyskanie pożądanego sygnału. Zmniejszenie ilości bakterii lub nanocząstek mogłoby sprawić, że otrzymane wyniki mogą nie być homogenne, zaś wzmocnienie sygnału jest słabe.

Patent CN 102115778 A „Method for identifying foodborne pathogenic bacteria by surface enhanced Raman spectrometry” przedstawia metodę identyfikacji bakterii pokarmowych, takich jak: Salmonella sp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus czy Listerella monocytogenes poprzez zmieszanie próbki zawierającej komórki prokariotyczne z roztworem bogatym w nanocząstki złota bądź srebra. Autorzy informują, że metoda charakteryzuje się łatwością wykonania, szybkim czasem detekcji oraz dużą czułością, jednak w patencie brak informacji o powtarzalności metody.

W patentach oraz publikacjach naukowych brak jest informacji o optymalnym sposobie nakładania bakterii na podłoże wykorzystywane w pomiarach SERS. Nakładanie lub osadzanie bakterii na takie podłoże powinno zapewnić dużą gęstość bakterii na powierzchni podłoża, dzięki czemu uzyskany sygnał charakteryzowałby się dużym wzmocnieniem, zaś pomiar byłby ułatwiony (większa gęstość powierzchniowa bakterii oznacza większe prawdopodobieństwo wykrycia obecności bakterii przy użyciu padającej wiązki laserowej).

Z tego powodu, głównym celem naszego projektu było stworzenie podłoży, które:

1) nie będą powodowały obumierania bakterii,

2) będą umożliwiały otrzymywanie wysokich współczynników wzmocnienia (EF) sygnału Ramana,

3) będą umożliwiały bezpośrednie osadzanie bakterii z cieczy, tak by nie istniała konieczność przenoszenia bakterii z filtra na podłoże SERS,

4) będą umożliwiały takie osadzanie na podłożu, by ilość bakterii przypadająca na jednostkę powierzchni podłoża była wysoka - umożliwiły ich zagęszczanie.

Wówczas podłoża uzyskane metodą według wynalazku mogłyby posłużyć jako tak zwane platformy do pomiarów powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana, zwłaszcza dla bakterii.

Istota wynalazku

Celem wynalazku było opracowanie platformy do pomiarów mikroorganizmów, a szczególnie bakterii, przy pomocy techniki SERS. Mikroorganizmy znajdujące się w płynach ustrojowych, pochodzenia ludzkiego i zwierzęcego (we krwi, limfie, płynie mózgowo-rdzeniowym), a także w moczu i wodzie, idealnie byłoby wykrywać bezpośrednio z tych płynów, bez konieczności wykonywania wielu złożonych czynności poprzedzających sam pomiar ramanowski. Stężenie bakterii w takich płynach jest zazwyczaj niewielkie (zwłaszcza w początkowych stadiach zakażenia), zatem należało opracować sposób osadzania bakterii na podłożu SERS, umożliwiający zwiększenie koncentracji bakterii na określonym obszarze platformy SERS.

Co za tym idzie, należało opracować innowacyjną platformę, która z jednej strony zapewniałaby wymagane wzmocnienie sygnału ramanowskiego, a z drugiej umożliwiłaby odseparowanie bakterii od cieczy, w której się znajdują oraz zwiększenie koncentracji bakterii na powierzchni takiej platformy, by zwiększyć prawdopodobieństwo wykrycia bakterii w próbce pochodzącej od pacjenta.

PL 232 520 B1

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, sposób osadzania mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii, na podłożu polimerowym, charakteryzuje się tym, że obejmuje następujące kroki:

a) najpierw przygotowuje się podłoże w postaci maty z włókien polimerowych, którą pokrywa się warstwą metalu;

b) tak przygotowaną matę układa się na porowatej strukturze i prowadzi się proces oddzielenia mikroorganizmów od cieczy, w której są one zawieszone, z uzyskaniem zatrzymania mikroorganizmów bezpośrednio na powierzchni maty polimerowej i odpływu cieczy przez pory w macie polimerowej za pomocą podłączonego źródła podciśnienia lub próżni, albo za pomocą nadciśnienia lub siły odśrodkowej, otrzymując matę polimerową pokrytą metalem z osadzonymi na jej powierzchni mikroorganizmami jako platformę SERS.

W sposobie według wynalazku, korzystnie stosuje się matę składającą się z włókien polimerowych o rozmiarach od 5 nm do 100 μm, korzystnie między 50 nm a 50 μm, a najkorzystniej między 100 nm a 5 μm.

W sposobie według wynalazku, korzystnie stosuje się matę polimerową wykonaną metodą elektroprzędzenia (ang. electrospinning).

Korzystnie, włókna polimerowe w tej macie są ułożone równolegle względem siebie bądź też w sposób przypadkowy.

W sposobie według wynalazku, korzystnie stosuje się matę wykonaną z polimerów, wybranych z grupy obejmującej poliamid (np. nylon), polifluorek winylidenu (PVDF), poli-L-laktyd (PLLA), polialkohol winylowy) PVA, poliwinylopirolidon (PVP), poliakrylonitryl (PAN) i polianilina (PANI).

W sposobie według wynalazku, korzystnie matę pokrywa się warstwą metalu techniką fizycznego osadzania z fazy gazowej (PVD).

W sposobie według wynalazku, jako metal stosuje się złoto, srebro lub miedź, korzystnie złoto, albo stopy metali, korzystnie srebro ze złotem, albo stosuje się je w postaci warstwowej, korzystnie warstwa srebra, a na niej warstwa złota.

W sposobie według wynalazku, stosuje się matę pokrytą warstwą złota, srebra albo miedzi, o grubości pomiędzy 10 a 200 nm, korzystnie pomiędzy 30 nm a 150 nm, a najkorzystniej pomiędzy 80 a 100 nm, ewentualnie na warstwie miedzi stosuje się redukowane złoto z wodnego roztworu HAuCI4 lub innego roztworu zawierającego jony złota.

W sposobie według wynalazku, korzystnie etapie b) jako ciecz stosuje się płyn lub roztwór, obejmujący korzystnie wodę, płyn ustrojowy, krew, osocze, płyn mózgowo-rdzeniowy i mocz, pochodzenia ludzkiego jak i zwierzęcego.

W sposobie według wynalazku, korzystnie w etapie b) stosuje się krok zwiększania gęstości mikroorganizmów poprzez dodawanie kolejnych kropli cieczy do zassania, korzystnie co najmniej dwukrotne, w tym samym obszarze maty polimerowej, w zależności od wymiarów mikroorganizmów.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, jako źródło podciśnienia stosuje się pompkę wodną lub pompę próżniową.

Najkorzystniej, mikroorganizmy osadza się na pokrytej złotem macie polimerowej przy pomocy podciśnienia, w ten sposób, że matę umieszcza się na lejku Schotta lub lejku Buchnera, a ten z kolei na kolbie ssawkowej, do której podłączana jest próżnia, powodująca przejście roztworu do kolb y, podczas gdy bakterie lub inne mikroorganizmy zostają zatrzymane na macie polimerowej.

Ponadto, obecny wynalazek obejmuje platformę do pomiarów detekcji i/lub identyfikacji mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii, techniką powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana (SERS), charakteryzującą się tym, że obejmuje matę polimerową pokrytą metalem z osadzonymi na jej powierzchni mikroorganizmami, wytworzoną sposobem według wynalazku.

Również wynalazek obejmuje zastosowanie platformy SERS, według wynalazku, do bezpośrednich pomiarów detekcji i/lub identyfikacji mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii, techniką powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana (SERS).

Wynalazek bazuje na macie składającej się z włókien polimerowych o średnicy od kilkudziesięciu nanometrów do kilkudziesięciu mikrometrów. Mata taka może być wytwarzana przy pomocy elektroprzędzenia. Co istotne, metoda ta zapewnia gęste ułożenie włókien polimerowych, jednak pomiędzy nimi znajdują się wolne przestrzenie, dzięki którym możliwe jest odseparowanie bakterii od cieczy, w której są zawieszone.

Mata polimerowa składająca się z włókien polimerowych po pokryciu warstwą złota nabiera cech platformy SERS, tj. wzmacnia sygnał ramanowski.

PL 232 520 B1

W celu odseparowania bakterii od cieczy zastosowano podciśnienie. W tym celu matę polimerową położono na porowatej strukturze, w tym przypadku lejku Schotta, który włożono do k olby ssawkowej. Kolbę podłączono do dowolnego źródła podciśnienia, np. pompki wodnej lub pompy próżniowej. Podciśnienie powoduje zassanie cieczy poprzez porowatą strukturę maty polimerowej oraz lejka. Bakterie jednak, ze względu na swoje wymiary, pozostają na powierzchni maty. Zwiększanie koncentracji bakterii uzyskuje się poprzez wielokrotne, korzystnie przynajmniej dwukrotne, najkorzystniej dwu- lub trzykrotne, umieszczanie kropli w tym samym obszarze maty polimerowej.

Co istotne, w zaproponowanym przez n as wynalazku, pokryta złotem mata polimerowa pełni równocześnie dwie funkcje: filtru, na którym osadza się bakterie oraz podłoża SERS do pomiarów ramanowskich. Dzięki temu rozwiązaniu nie jest konieczne przenoszenie bakterii z filtru na dedykowane podłoże SERS: efektywne przeprowadzenie tego procesu wydaje się być niemożliwe, lub co najmniej bardzo kłopotliwe (wydłużałoby to czas pomiędzy filtracją a pomiarem i mogłoby doprowadzić do kontaminacji próbki). W naszym przypadku po osadzeniu bakterii na macie można ją natychmiast zastosować do wykonania pomiaru. Dodatkowo, dzięki temu, że krople nakładamy w tym samym miejscu maty polimerowej, możemy tamże zwiększać gęstość bakterii, co ma wpływ na jakość sygnału ramanowskiego.

Wynalazek zostanie teraz bliżej przedstawiony w korzystnym przykładzie wykonania, z odniesieniem do załączonych rysunków na których:

Fig. 1 przedstawia maty polimerowe napylone złotem o grubości 90 nm. Maty wykonane są z następujących polimerów: (a) PVDF (polifluorek winylidenu), (b) PLLA-a (poli-L-laktyd a), (c) PLLA-b (poli-L-laktyd b), (d) nylon. Powiększenie dla każdego zdjęcia to x1 000.

Fig. 2 przestawia maty polimerowe napylone złotem o grubości 90 nm. Maty wykonane są z następujących polimerów: (a) PVDF, (b) PLLA-a, (c) PLLA-b, (d) nylon. Powiększenie dla każdego zdjęcia to x25 000.

Fig. 3 przedstawia zestaw do osadzania bakterii na macie polimerowej pokrytej złotem. Zestaw ten składa się z kolby ssawkowej, lejka Schotta oraz pompy próżniowej. Na lejku kładzie się niewielki, ok. 10x10 mm, kawałek maty polimerowej pokrytej złotem, a następnie osadza się tam kroplę roztworu zawierającego bakterie lub inne mikroorganizmy. Po włączeniu próżni ciecz przechodzi przez pory w macie polimerowej, podczas gdy mikroorganizmy zatrzymują się na jej powierzchni.

Fig. 4 przedstawia widma SERS zarejestrowane dla bakterii S. aureus dla czterech różnych mat polimerowych pokrytych złotem. Wykres (a) PVDF, (b) PLLA-a, (c) PLLA-b, (d) nylon.

Fig. 5 przedstawia widma SERS zarejestrowane dla bakterii E. coli dla jednej maty polimerowej PLLA-b. Widma zostały zrejestrowane w obrębie jednej maty w obszarze, gdzie zdeponowano kroplę cieczy zwierającej bakterie E. coli. Widma te dostarczają informacji o powtarzalności pomiaru w obrębie jednej platformy SERS wykonanej na sposób wynalazku.

Fig. 6 przedstawia widma SERS dla maty PLLA-b pokrytej złotem. Wyniki zestawiają ze sobą widmo bakterii E. coli oraz S. aureus.

Fig. 7 przedstawia widma SERS zarejestrowane dla bakterii S. aureus dla jednej maty polimerowej PVDF. Widma te zostały zrejestrowane w obrębie jednej maty w obszarze, gdzie zdeponowano kroplę cieczy zwierającej bakterie S. aureus. Widma te dostarczają informacji o powtarzalności pomiaru w obrębie jednej platformy SERS wykonanej na sposób wynalazku.

Korzystne przykłady realizacji wynalazku

Sposób przedstawiony w niniejszym zgłoszeniu polega na otrzymaniu platformy SERS w postaci maty polimerowej pokrytej złotem, która dzięki swojej strukturze pozwala na osadzenie na jej powierzchni mikroorganizmów, szczególnie bakterii. Sposób ten polega na zastosowaniu maty polimerowej jako filtra w taki sposób, by podciśnienie lub próżnia spowodowały przepływ cieczy (wody, płynu fizjologicznego, krwi, osocza, moczu, płynu mózgowo-rdzeniowego) przez matę, a gęsto upakowane włókna polimerowe zatrzymywały mikroorganizmy na powierzchni maty.

Korzystnie, maty polimerowe wykorzystane w pomiarach składają się z włókien polimerowych i mogą być wykonane z polimerów, takich jak nylon, polifluorek winylidenu (PVDF) czy poli-L-laktyd (PLLA). Materiał do wytworzenia platform wycięto z większego fragmentu maty polimerowej wykonanej metodą elektroprzędzenia. W każdym przypadku wycięto kwadraty o wymiarach ok. 10x10 mm. Każdy z kwadratów pokryto złotem. W przypadku polimeru PLLA wykorzystano matę, w której włókna ułożone są w sposób przypadkowy (PLLA-a) oraz matę, w której włókna ułożone są równolegle do siebie (PLLA-b).

Korzystnie, do naniesienia warstw złota wykorzystano metodę PVD (ang. Physical Vapor Deposition - fizyczne osadzanie z fazy gazowej). Zastosowano urządzenie firmy Leica, model EM MED020

PL 232 520 B1 wraz z układem pomiaru grubości warstwy Leica EM QSG100. Urządzenie EM MED020 wykorzystuje zjawisko osadzania jonów w polu magnetycznym (ang. magnetron sputtering). Próbki włożono do komory roboczej, po czym odpompowano powietrze do ciśnienia 10^-5 mbar i wypełniono komorę argonem do ciśnienia 2x10^-2 mbar. Prąd zastosowany do napylania złota to 25 mA. Po napyleniu 90 nm złota komorę wypełniono azotem, wyjęto próbki i umieszczono w szczelnych pojemnikach. Uzyskane w ten sposób maty przedstawione są na Fig. 1 (powiększenie x1000) oraz Fig. 2 (powiększenie x25 000).

W celu namnożenia komórek bakteryjnych pewna ich ilość została zawieszona w 10 ml pożywki LB (ang. lysogeny broth). Następnie kolba zawierająca pożywkę wraz z bakteriami została umieszczona w wytrząsarce (150 rpm) na 24 h w temperaturze 30°C. W dalszej kolejności pożywkę z bakteriami poddano wirowaniu w czasie 5 min przy prędkości 4000 rpm, zlano supernatant, a pelet zawieszono w 0,85% roztworze NaCI. Procedurę odwirowywania supernatantu powtórzono kilkukrotnie w warunkach jałowych w celu zapewnienia dużej czystości roztworu, w którym znajdowały się bakterie. Tak otrzymana zawiesina służyła następnie do osadzania bakterii na macie polimerowej.

Proces osadzania bakterii na macie polimerowej pokrytej złotem przedstawia schematycznie

Fig. 3.

Korzystnie, układ składa sie z kolby ssawkowej podłączonej do dowolnego źródła podciśnienia lub próżni, w naszym przypadku była to membranowa pompa próżniowa firmy Buchi, typ V-700 ze sterownikiem V-855. Do kolby włożony został lejek Schotta, na powierzchni spieku umieszczono matę polimerową o wymiarach ok. 10x10 mm. Na środek maty przy pomocy mikropipety położono kroplę roztworu zawierającego roztwór bakterii (E. coli lub S. aureus), następnie włączono podciśnienie powodujące przesączenie cieczy do kolby ssawkowej oraz zatrzymanie bakterii na macie polimerowej. Tak uzyskana próbka była od razu przenoszona pod mikroskop w celu dokonania analizy SERS.

W celu wykonania pomiaru ramanowskiego wykorzystano spektrometr ramanowski Renishaw InVia Raman wyposażony w diodę laserową o mocy 300 mW o długości fali 785 nm. Analiza energii wiązki rozproszonej odbywa się w spektrometrze przy pomocy siatki dyfrakcyjnej, a intensywność dla poszczególnych energii rejestrowana jest w czułym detektorze CCD typ RenCam o rozdzielczości 1024x256 px. Powiększenie obiektywu ogniskującego promień lasera na próbce wynosiło 50x (apertura 0,75). Przestrzenna zdolność rozdzielcza była lepsza niż 1 μm, spektralna zdolność rozdzielcza około 1 cm^-1. Typowe widmo było rejestrowane przez czas 4 s z mocą lasera wynoszącą 5 mW.

Widma bakterii S. aureus na czterech różnych matach polimerowych (przedstawionych na Fig. 1 oraz Fig. 2) zademonstrowano na Fig. 4.

Na Fig. 5 zademonstrowano powtarzalność widma bakterii E. coli dla podłoża SERS na bazie maty wykonanej z polimeru PLLA-b. Trzy widma pochodzą z trzech różnych obszarów podłoża, dzięki czemu widać, że platforma SERS uzyskana na sposób wynalazku daje powtarzalne wyniki na całej swej powierzchni.

Fig. 6 demonstruje wyniki uzyskane przy pomocy podłoża SERS na bazie maty wykonanej z polimeru PLLA-b dla bakterii E. coli oraz S. aureus.

Fig. 7 demonstruje powtarzalność widma bakterii S. aureus dla podłoża SERS na bazie maty wykonanej z polimeru PVDF. Trzy widma pochodzą z trzech różnych obszarów podłoża, dzięki czemu widać, że platforma SERS uzyskana na sposób wynalazku daje powtarzalne wyniki na całej swej powierzchni.

Claims (14)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób osadzania mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii, na podłożu polimerowym, znamienny tym, że obejmuje następujące kroki:

   a) najpierw przygotowuje się podłoże w postaci maty z włókien polimerowych, którą pokrywa się warstwą metalu;

   b) tak przygotowaną matę układa się na porowatej strukturze i prowadzi się proces oddzielenia mikroorganizmów od cieczy, w której są one zawieszone, z uzyskaniem zatrzymania mikroorganizmów bezpośrednio na powierzchni maty polimerowej i odpływu cieczy przez pory w macie polimerowej za pomocą podłączonego źródła podciśnienia lub próżni, albo za pomocą nadciśnienia lub siły odśrodkowej, otrzymując matę polimerową pokrytą metalem z osadzonymi na jej powierzchni mikroorganizmami jako platformę SERS.

   PL 232 520 B1
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się matę składającą się z włókien polimerowych o rozmiarach od 5 nm do 100 μm, korzystnie między 50 nm a 50 μm, a najkorzystniej między 100 nm a 5 μm.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się matę polimerową wykonaną metodą elektroprzędzenia (ang. electrospinning).
4. 4. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-3, znamienny tym, że włókna polimerowe w macie są ułożone równolegle względem siebie bądź też w sposób przypadkowy.
5. 5. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-4, znamienny tym, że stosuje się matę wykonaną z polimerów, wybranych z grupy obejmującej poliamid (np. nylon), polifluorek winylidenu (PVDF), poli-L-laktyd (PLLA), poli(alkohol winylowy) PVA, poliwinylopirolidon (PVP), poliakrylonitryl (PAN) i polianilina (PANI).
6. 6. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-5, znamienny tym, że matę pokrywa się warstwą metalu techniką fizycznego osadzania z fazy gazowej (PVD).
7. 7. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-6, znamienny tym, że jako metal stosuje się złoto, srebro lub miedź, korzystnie złoto, albo stopy metali, korzystnie srebro ze złotem, albo stosuje się je w postaci warstwowej, korzystnie warstwa srebra, a na niej warstwa złota.
8. 8. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-7, znamienny tym, że stosuje się matę pokrytą warstwą złota, srebra albo miedzi o grubości pomiędzy 10 a 200 nm, korzystnie pomiędzy 30 nm a 150 nm, a najkorzystniej pomiędzy 80 a 100 nm, ewentualnie na warstwie miedzi stosuje się redukowane złoto z wodnego roztworu HAuCL lub innego roztworu zawierającego jony złota.
9. 9. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-8, znamienny tym, że w etapie b) jako ciecz stosuje się płyn lub roztwór, obejmujący korzystnie wodę, płyn ustrojowy, krew, osocze, płyn mózgowo-rdzeniowy i mocz, pochodzenia ludzkiego jak i zwierzęcego.
10. 10. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-9, znamienny tym, że w etapie b) stosuje się krok zwiększania gęstości mikroorganizmów poprzez dodawanie kolejnych kropli cieczy do zassania, korzystnie co najmniej dwukrotne, w tym samym obszarze maty polimerowej, w zależności od wymiarów mikroorganizmów.
11. 11. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-10, znamienny tym, że jako źródło podciśnienia stosuje się pompkę wodną lub pompę próżniową.
12. 12. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-11, znamienny tym, że mikroorganizmy osadza się na pokrytej złotem macie polimerowej przy pomocy podciśnienia, w ten sposób, że matę umieszcza się na lejku Schotta lub lejku Buchnera, a ten z kolei na kolbie ssawkowej, do której podłączana jest próżnia, powodująca przejście roztworu do kolby, podczas gdy bakterie lub inne mikroorganizmy zostają zatrzymane na macie polimerowej.
13. 13. Platforma do pomiarów detekcji i/lub identyfikacji mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii z wykorzystaniem techniki powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana (SERS), znamienna tym, że obejmuje matę polimerową pokrytą metalem z osadzonymi na jej powierzchni mikroorganizmami, wytworzoną sposobem według któregokolwiek z zastrz. 1-12.
14. 14. Zastosowanie platformy SERS, jak określono w zastrz. 13, do bezpośrednich pomiarów detekcji i/lub identyfikacji mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii, techniką powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana (SERS).