PL234373B1 - Platforma do badań substancji chemicznych oraz mikroorganizmów techniką wzmocnionej powierzchniowo spektroskopii Ramana i sposób jej otrzymywania - Google Patents
Platforma do badań substancji chemicznych oraz mikroorganizmów techniką wzmocnionej powierzchniowo spektroskopii Ramana i sposób jej otrzymywania Download PDFInfo
- Publication number
- PL234373B1 PL234373B1 PL409210A PL40921014A PL234373B1 PL 234373 B1 PL234373 B1 PL 234373B1 PL 409210 A PL409210 A PL 409210A PL 40921014 A PL40921014 A PL 40921014A PL 234373 B1 PL234373 B1 PL 234373B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- mat
- microorganisms
- gold
- polymer
- bacteria
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 111
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 27
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 title claims description 20
- 239000000126 substance Substances 0.000 title description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 54
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 53
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 35
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 33
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 19
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 16
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 15
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims description 14
- 238000009987 spinning Methods 0.000 claims description 14
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 11
- 238000004416 surface enhanced Raman spectroscopy Methods 0.000 claims description 11
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 10
- 238000000151 deposition Methods 0.000 claims description 9
- 229920005594 polymer fiber Polymers 0.000 claims description 8
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims description 7
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 6
- 238000005240 physical vapour deposition Methods 0.000 claims description 6
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 claims description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 5
- -1 polycaprolactan Polymers 0.000 claims description 5
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 claims description 5
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000002149 energy-dispersive X-ray emission spectroscopy Methods 0.000 claims description 4
- 229920001432 poly(L-lactide) Polymers 0.000 claims description 4
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 claims description 4
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 claims description 4
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 claims description 3
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 claims description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 2
- 229910001020 Au alloy Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 2
- 210000000476 body water Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 2
- 229910001092 metal group alloy Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 claims description 2
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 claims description 2
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 claims 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 239000002121 nanofiber Substances 0.000 description 20
- 238000001523 electrospinning Methods 0.000 description 14
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000000479 surface-enhanced Raman spectrum Methods 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 3
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 238000000609 electron-beam lithography Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000000054 nanosphere lithography Methods 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 description 2
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- OXBLVCZKDOZZOJ-UHFFFAOYSA-N 2,3-Dihydrothiophene Chemical compound C1CC=CS1 OXBLVCZKDOZZOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001552669 Adonis annua Species 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 229910004042 HAuCl4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000607149 Salmonella sp. Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000003486 chemical etching Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 229920000547 conjugated polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000000578 dry spinning Methods 0.000 description 1
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 1
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 1
- 238000007590 electrostatic spraying Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 150000002343 gold Chemical class 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000000608 laser ablation Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000028744 lysogeny Effects 0.000 description 1
- 238000001755 magnetron sputter deposition Methods 0.000 description 1
- 238000002074 melt spinning Methods 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000005442 molecular electronic Methods 0.000 description 1
- 239000002077 nanosphere Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N pyrrolidin-2-one Chemical compound O=C1CCCN1 HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000004408 titanium dioxide Substances 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002166 wet spinning Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest platforma do badań substancji chemicznych oraz mikroorganizmów techniką wzmocnionej powierzchniowo spektroskopii Ramana i sposób jej otrzymywania. Bardziej szczegółowo, wynalazek ujawnia nową powierzchnię do analizy wzmocnionej powierzchniowo spektroskopii Ramana (ang. Surface-enhanced Raman Spectroscopy, SERS) bazującą na warstwie nanowłókien polimerowych wykonanej techniką przędzenia przy wykorzystaniu siły odśrodkowej (Forcespinning™), o wysoce rozbudowanej powierzchni, pokrytej złotem. Obecne zgłoszenie patentowe ma na celu rozbudowanie już istniejącego zgłoszenia o dodatkowy sposób otrzymywania nanowłókien polimerowych.
Nanowłóknami nazywamy włókna, których średnica nie przekracza 100 nm. Oznacza to, że ich grubość jest w przybliżeniu 80 000 razy mniejsza od średnicy ludzkiego włosa. Cechują się one m.in. znaczną wytrzymałością, dużą powierzchnią w stosunku do objętości, a także dużą elastycznością i sprężystością. Znajdują one szereg zastosowań w elektronice molekularnej, optyce nieliniowej, w medycynie, w nano-biotechnologii, sensorach chemicznych, a także w wielu innych dziedzinach nauki i techniki (McEachin Z., Lozano K., Production and characterisation of polycaprolactone nanofibers via forcespinning™ Technology, Journal of Applied Polymer Science, 126: 473-479, 2012).
Znanych jest kilka sposobów wytwarzania włókien o grubości rzędu nanometrów. Jednym z nich jest elektroprzędzenie (ang. electrospinning). Jest to proces otrzymywania włókien ze stopionych polimerów (np. poliamidów, polistyrenu, polilaktydu, polikaprolaktonu, dekstranu, pochodnych celulozy, albuminy, kolagenu czy chitozanu) lub ich roztworów z zastosowaniem wysokiego napięcia. Metoda polega na prowadzeniu strumienia roztworu polimeru przez silne pole elektryczne, rzędu 10-20 kV (Shanmuganathan K., Sankhagowit R. K., Iyer P., Ellisno C. J., Thiol-ene chemistry: a greener approach to making chemically and thermally stable fibers, Chemistry of Materials, 23: 4726-4732, 2011). Po raz pierwszy proces elektoprzędzenia został przedstawiony w 1902 roku, niezależnie przez dwóch naukowców (Morton W. J, Methods of dispersing fluids., US 705,691; Cooley W. J., Apparatus for electrically dispersing fluids, US 692,631). Niestety, ze względu na ograniczenia technologiczne trudnym zadaniem było przedstawienie potencjalnych zalet otrzymywanych tym sposobem włókien. Dopiero w 1995 roku (Doshi J., Reneker D. H., Electrospinning process and application of electrospun fibers, Journal of Electrostatics, 35: 151-160, 1995) proces elektroprzędzenia został spopularyzowany i możliwe stało się ukazanie jego ewentualnych zastosowań. Obecnie nanowłókna mogą być stosowane w inżynierii tkankowej do otrzymywania sztucznej skóry, do kontrolowanego podawania leków, w produkcji implantów kostnych czy biodegradowalnych bandaży wewnętrznych. Nanocząstki oraz nanowłókna otrzymywane opisywaną techniką mogą być ponadto stosowane w terapii genowej (http://www.biomedlab.ichip.pw.edu.pI/content/view/13/8/lang, polish/) do transferu DNA do odpowiednich komórek. Mogą być one także wykorzystywane jako membrany przy wytwarzaniu ogniw paliwowych.
Powstające metodą elektroprzędzenia włókna mają średnicę od kilku nanometrów do jednego milimetra. Praktycznie wszystkie polimery mogą być otrzymane w postaci włókien metodą elektroprzędzenia. Po rozpyleniu elektrostatycznym mogą one przybierać postać włókien lub kulistych cząstek. To, jaką postać przybiorą, zależy od ich masy cząsteczkowej, rodzaju zastosowanego rozpuszczalnika, oddziaływań pomiędzy łańcuchami polimeru, zastosowanego napięcia i geometrii układu i wielu innych czynników (Ciach T., Application of Electro Hydro Dynamie Atomization in Drug Delivery, Journal of Drug Delivery Science and Technology, Editions de Sante, 17: 367-375, 2007).
Technika elektroprzędzenia jest opisywana w ponad połowie artykułów traktujących o sposobach otrzymywania nanowłókien z różnego rodzaju polimerów (Polymer nanofibers, an overview of applications and current research into processing technique, http://www.azonano.com/article.aspx?ArticlelD=1280) i mimo opracowania kilku technik konkurencyjnych (technika szablonowa, rozdzielanie fazowe, przędzenie na mokro, na sucho i ze stopu), wydaje się, że elektroprzędzenie jest obecnie jedynym sposobem, który może być wykorzystany przy produkcji nanowłókien na skalę przemysłową.
Mimo wielu zalet jakie metoda to posiada, ma ona również swoje wady (sterowanie procesem poprzez dużą ilością parametrów, wykorzystanie rozpuszczalników organicznych, ograniczenie do pewnej grupy materiałów). Obecnie zmierza się do opracowania techniki pozwalającej na wyeliminowanie tych wad, czyli do rozszerzenia spektrum wykorzystywanych w owym procesie materiałów, poprawy wydajności procesu, a także do uzyskania niższych kosztów produkcji poprzez zastosowanie przyjaznego dla środowiska procesu.
PL 234 373 B1
Odpowiedzią na postawione wyżej problemy jest technika zwana Forcespinning™, tj. technika przędzenia przy wykorzystaniu siły odśrodkowej, opracowana przez amerykańską firmę FibeRio Technology Corporation (http://fiberiotech.com). Jest to metoda analogiczna do elektroprzędzenia, z tym, że silne pole elektryczne zostało zastąpione w tym przypadku przez siłę odśrodkową. Wyeliminowanie konieczności przyłożenia silnego pola elektrycznego sprawia, że możliwe staje się zwiększenie wyboru stosowanych w niniejszej technice materiałów, dzięki czemu do nanowłókien mogą być przekształcane zarówno roztwory nieprzewodzące jak i przewodzące. Ponadto, w przypadku techniki przędzenia przy wykorzystaniu siły odśrodkowej nanowłókna można również uzyskiwać z polimerów stałych, które to polimery uprzednio poddano stopieniu. Co istotne, nie ma potrzeby odzyskiwania rozpuszczalników, gdyż w tym przypadku nie angażujemy ich w opisany proces (Sarkar K., Gomez C., Zambrano S., Ramirez M., de Hoyos E., Vasquez H., Lozano K., Electrospinning to Forcespinning™, Materials Today, 13:12-14, 2010).
Kolejną zaletą metody przędzenia przy wykorzystaniu siły odśrodkowej w porównaniu z techniką elektroprzędzenia jest wydajność procesu. W przypadku techniki przędzenia przy wykorzystaniu siły odśrodkowej jesteśmy w stanie uzyskać ~1 gram nanowłókien w przeciągu jednej minuty, podczas gdy elektroprzędzenie umożliwia otrzymanie 0,1 grama nanowłókien w ciągu godziny (Padron S., Fuentes A., Caruntu D., Lozano K., Experimental study of nanofiber production through forcespinning, Journal of Applied Physics, 113, 024-318, 2013).
Ilość artykułów dotyczących metody techniki przędzenia przy wykorzystaniu siły odśrodkowej jest niewielka. Wśród kilkunastu publikacji część to prace przeglądowe opisujące samą technikę (Sarkar K., Gomez C., Zambrano S., Ramirez M., de Hoyos E., Vasquez H., Lozano K., Electrospinning to Forcespinning™, Materials Today, 13: 12-14, 2010; Recent advances in nanofibre fabrication techniques Nayak R., Padhye R., Kyratzis I. L., Truong Y. B., Arnold L., Textile Research Journal, 82: 129-147, 2011), a część traktuje o sposobie uzyskiwania nanowłókien z konkretnych polimerów przy wykorzystaniu tej techniki (Vazquez B., Vasquez H., Lozano K., Preparation and characterization of polyvinylidene fluoride nanofibrous membranes by forcespinning™, Polymer Engineering & Science, 52: 2260-2265, 2012; Padron S., Patlan R., Gutierrez J., Santos N., Eubanks T., Lozano K., Production and Characterization of Hybrid BEH-PPV/PEO Conjugated Polymer Nanofibers by Forcespinning, Journal of Applied Polymer Science, 125: 3610-3616, 2012).
Mimo mnogości zastosowań nanowłókien uzyskiwanych metodami electrospinning oraz Forcespinning™, żaden z artykułów nie opisuje możliwości ich wykorzystania jako podłoży intensyfikujących sygnał Ramana w metodzie wzmocnionej powierzchniowo spektroskopii Ramana (ang., surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS).
Zjawisko Ramana polega na nieelastycznym rozproszeniu fotonów przez cząsteczki badanej substancji chemicznej. Związane jest to z faktem, iż promieniowanie rozproszone przez molekuły badanej substancji chemicznej składa się nie tylko z fotonów o częstości światła padającego, ale także z fotonów o częstości niższej lub wyższej od niego. Po raz pierwszy owe zjawisko zostało zaobserwowane w 1928 roku przez Chandrasekhara Venkata Raman'a. Od tego czasu ten rodzaj spektroskopii, nazwanej po odkrywcy spektroskopią Ramana, stał się szybko rozwijającą się dziedziną nauki, jako że pozwalał na otrzymanie charakterystycznego dla danego związku układu pasm wibracyjnych w widmie spektroskopowym, co z kolei dawało możliwość detekcji i identyfikacji różnych związków chemicznych. Przełom w spektroskopii ramanowskiej nadszedł w 1974 roku, gdy odkryto, że intensywność słabych pasm ramanowskich może wzrosnąć nawet o sześć rzędów wielkości, jeśli jako powierzchnię bezpośred nio stykającą się z próbką zastosuje się schropowaconą elektrochemicznie elektrodę srebrną (M. Fleischmann, P. J. Hendra, A. J. McQuillan, Chemical Physics Letters (1974) 26, 163). Nowa technika badawcza została nazwana wzmocnioną powierzchniowo spektroskopią Ramana (SERS).
Na wzmocnienie sygnału SERS składa się wiele czynników, w tym rodzaj badanego związku chemicznego, częstość promieniowania wzbudzającego czy efektywny ramanowski przekrój czynny. Co więcej, powierzchnia użyta w badaniu musi być zbudowana z odpowiedniego metalu, najlepiej złota, miedzi lub srebra, ponieważ w spektroskopii Ramana najczęściej wykorzystywane jest światło widzialne z zakresu bliskiej podczerwieni, zaś rezonansowe częstości plazmowe srebra, złota i miedzi leżą w zakresie długości fal światła widzialnego i bliskiej podczerwieni. Skutkuje to maksymalnym wzmocnieniem dla tego typu promieniowania elektromagnetycznego i w efekcie otrzymaniem pasm o znacznej intensywności. Rodzaj metalu wykorzystany do pomiaru nie jest jedynym warunkiem, jaki musi być spełniony w celu otrzymania platformy SERS. Użyty do eksperymentu metal musi ponadto posiadać na swej
PL 234 373 B1 powierzchni nanonierówności/nanoschropowacenia lub powinien występować pod postacią nanocząstek. W celu otrzymania takich powierzchni najczęściej stosuje się m.in.: procesy trawienia chemicznego, cykle utleniania i redukcji w roztworze elektrolitu, ablację laserową i koloidy metali. Przy wykorzystaniu tych metod rozwinięto różne techniki produkcji platform do badań SERS, w tym: litografię nanosferyczną (ang. Nanosphere lithography, NSL) (X. Zhang, C. R. Yonzon, M. A. Young, D. A. Stuart, R. P. Van Duyne, IEE Proceedings Nanobiotechnology (2005) 152, 195); elektronolitografię (ang. electron beam lithography, EBL) (M. Kahl, E. Voges, S. Kostrewa, C. Viets, W. Hill, Sensors and Actuators B (1998) 51, 285), metodę szablonową (ang. the template method) (C. M. Ruan, B. Gu, G. Eres, W. Wang, Z. Zhang, Langmuir (2007) 23, 5757) czy metodę hybrydową (ang., the hybrid method) (S. Chattopadhyay, C. H. Lo, C. H. Hsu, L. C. Chen, K. H. Chen, Chemistry of Materials (2005) 17, 553).
Należy ponadto wspomnieć o fakcie, że podłoże SERS może być także wykonane z zupełnie innego materiału niż złoto, srebro lub miedź, o ile na jego powierzchni znajdzie się cienka warstwa wyżej wymienionych metali. Grubość tej warstwy jest zazwyczaj rzędu kilkudziesięciu nanometrów.
Mimo obecności na rynku wielu rodzajów podłoży SERS, większość z nich nie może być wykorzystania przy badaniu mikroorganizmów takich jak bakterie. Problem ten częściowo zanika w przypadku, gdy chcemy uzyskać widmo SERS z próbki o wysokim stężeniu komórek bakteryjnych, ale jest nie do uniknięcia wówczas, gdy pragniemy otrzymać widmo z próbek pochodzących od pacjentów. W takiej sytuacji CFU/ml (CFU - colony forming unit) jest często bardzo niskie, zwłaszcza w początkowych stadiach choroby i prawdopodobieństwo związania się komórki bakteryjnej z podłożem SERS jest znikome, a skanowanie podłoża w celu odnalezienia tej komórki bardzo czasochłonne. Kolejnym utrudnieniem związanym z techniką SERS jest powtarzalność widm uzyskanych tą metodą. Widma SERS pochodzące z jednego podłoża powinny mieć tą samą intensywność i poziom szumu w obrębie odpowiadających sobie pasm. To samo tyczy się widm SERS tej samej substancji/tego samego gatunku bakterii, które badane były na różnych podłożach - jeśli ich charakter jest bardzo podobny to powtarzalność widma jest wysoka.
Detekcja i identyfikacja bakterii była przedmiotem wielu zgłoszeń patentowych. Patent US 7,267,948 B2 „SERS diagnostics platforms, methods and systems microarrays, biosensors and biochips” opisuje różne rodzaje podłoży bazujących na nanocząstkach, nanosferach i schropowaconych powierzchniach pokrytych odpowiednim metalem. Powierzchnie te otrzymywane są na wiele sposobów i są funkcjonalizowane różnego rodzaju receptorami w zależności od tego jaka substancja ma być związana z podłożem, np. DNA, enzym czy bakteria. Z tego jednak powodu nie są one uniwersalne.
W patencie CN 102115778 A „Method for identifying foodborne pathogenic bacteria by surface enhanced raman spectrometry” przedstawiona została metoda identyfikacji Salmonella sp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus czy Listerella monocytogene. Pomimo uzyskania zadowalających wyników, brakuje informacji odnośnie powtarzalności metody. Wadą wynalazku jest fakt, że badania wykonywane są z roztworu, co wymaga znacznego stężenia zarówno nanocząstek i bakterii, aby sygnał był wykrywalny.
Podobnie przedstawia się sytuacja w przypadku patentu US 20080268493 A1 „Identification method based on surface-enhanced Raman scattering”, w którym autorzy mieszają roztwór zawierający bakterie z roztworem srebrnych lub złotych nanocząstek i tak otrzymaną próbkę podają badaniom spektroskopowym.
Patent US 2008/0096005 A1 „Nanostructured substrate for surface enhanced Raman scattering” ukazuje platformy SERS otrzymywane z tlenku glinu, dwutlenku krzemu lub dwutlenku tytanu pokryte nanocząstkami złota, srebra lub miedzi. Dla bakterii Escherichia coli zaadsorbowanych na jednej z przykładowych powierzchni uzyskano współczynnik wzmocnienia 2x104. W patencie nie można jednak znaleźć informacji na temat powtarzalności uzyskiwanych widm.
Powyżej wymieniono zaledwie kilka patentów opisujących sposoby uzyskiwania podłoży SERS. W tych, które dotyczą identyfikacji i/lub detekcji bakterii przy pomocy techniki SERS, brakuje informacji o optymalnym nakładaniu bakterii na platformę SERS. Co więcej, żadna z opisanych technik, poza opisaną w patencie „Platforma i jej zastosowanie do detekcji i/lub identyfikacji mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii, techniką powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana oraz sposób osadzania tych mikroorganizmów na wytworzonych platformach” (numer P-406900) nie umożliwia pozbycia się nadmiaru roztworu (sól fizjologiczna, osocze, krew, mocz itd.), w którym zawieszone są bakterie. Przez to trudne staje się zwiększenie gęstości bakterii w tym miejscu platformy, w którym dokonywany jest pomiar sygnału SERS. Jest to istotny czynnik, gdyż uniemożliwia on uzyskanie sygnału z roztworu, w którym ilość komórek bakteryjnych jest bardzo niewielka, a przez to wydłuża czasu pomiaru).
PL 234 373 B1
Z tego powodu, głównym celem naszego projektu było stworzenie podłoży, które:
1) będą umożliwiały otrzymywanie wysokiego wzmocnienia sygnału Ramana,
2) pozwolą na pozbycie się roztworu, w którym zawieszone są bakterie, a który to roztwór nie jest interesujący z punktu widzenia pomiarów SERS,
3) będą umożliwiały bezpośrednie osadzanie bakterii z cieczy, tak by gęstość bakterii na powierzchni podłoża była wysoka.
Wówczas podłoża uzyskane metodą według wynalazku mogłyby posłużyć jako tak zwane platformy do pomiarów powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana bakterii.
Obecny wynalazek ma na celu ukazanie platformy do pomiarów patogenów, a szczególnie bakterii, przy pomocy techniki SERS oraz sposobu otrzymywania tejże platformy. Patogeny te idealnie byłoby wykrywać z płynów takich jak krew, moczu i płyn mózgowo-rdzeniowy, dzięki czemu podłoża będące przedmiotem patentu mogłyby znaleźć zastosowanie w biologii, weterynarii i medycynie. CFU/ml w wymienionych wyżej płynach jest często niewielkie, zwłaszcza w początkowych stadiach zakażenia, a zatem należałoby opracować sposób osadzania bakterii na platformie SERS, równocześnie zwiększając koncentrację bakterii na określonym obszarze tej platformy. Poza tym podłoże umożliwiałoby uzyskanie wzmocnienia sygnału ramanowskiego, a ponadto pozwalałoby na odseparowanie bakterii od cieczy, w której się znajdują (czyli na zwiększenie koncentracji bakterii na powierzchni platformy).
Zgodnie z obecnym wynalazkiem, sposób osadzania mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii, na podłożu polimerowym, charakteryzuje się tym, że obejmuje następujące kroki:
a) najpierw przygotowuje się podłoże w postaci maty z włókien polimerowych wykonanych w technologii przędzenia przy wykorzystaniu siły odśrodkowej, którą pokrywa się warstwą metalu;
b) tak przygotowaną matę układa się na porowatej strukturze i prowadzi się proces oddzielenia mikroorganizmów od cieczy, w której są one zawieszone, z uzyskaniem zatrzymania mikroorganizmów bezpośrednio na powierzchni maty polimerowej i odpływu cieczy przez pory w macie polimerowej za pomocą podłączonego źródła podciśnienia lub próżni, albo za pomocą nadciśnienia lub siły odśrodkowej, otrzymując matę polimerową pokrytą metalem z osadzonymi na jej powierzchni mikroorganizmami jako platformę SERS.
W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się matę składającą się z włókien polimerowych o rozmiarach od 5 nm do 100 gm, korzystnie między 50 nm a 50 gm, a najkorzystniej między 100 nm a 5 gm.
Jeszcze korzystniej w sposobie według wynalazku stosuje się matę wykonaną z polimerów, wybranych z grupy obejmującej: poliamid (np. nylon), polifluorek winylidenu (PVDF), poli-L-laktyd (PLLA), poli(alkohol winylowy) PVA, poli(winylo pirolidon) (PVP), polimetakrylan metylu) (PMMA), poliwęglan (PC), polikaprolaktan, agaroza.
Korzystnie, matę pokrywa się warstwą metalu techniką fizycznego osadzania z fazy gazowej (PVD).
Korzystnie, w sposobie według wynalazku, jako metal stosuje się złoto, srebro lub miedź, korzystnie złoto, albo stopy metali, korzystnie srebro ze złotem, albo stosuje się je w postaci warstwowej, korzystnie warstwa srebra, a na niej warstwa złota.
Korzystnie, w sposobie według wynalazku, stosuje się matę pokrytą warstwą złota, srebra albo miedzi o grubości pomiędzy 10 a 200 nm, korzystnie pomiędzy 30 nm a 150 nm, a najkorzystniej pomiędzy 80 a 100 nm, ewentualnie na warstwie miedzi stosuje się redukowane złoto z wodnego roztworu HAuCI4 lub innego roztworu zawierającego jony złota.
Korzystnie, w sposobie według wynalazku, w etapie b) jako ciecz stosuje się płyn lub roztwór, obejmujący korzystnie wodę, płyn ustrojowy, krew, osocze, płyn mózgowo-rdzeniowy i mocz, pochodzenia ludzkiego jak i zwierzęcego.
Korzystnie, w sposobie według wynalazku, w etapie b) stosuje się krok zwiększania gęstości mikroorganizmów poprzez dodawanie kolejnych kropli cieczy do zassania, korzystnie co najmniej dwukrotne, w tym samym obszarze maty polimerowej, w zależności od wymiarów mikroorganizmów.
Korzystnie, w sposobie według wynalazku, jako źródło podciśnienia stosuje się pompkę wodną lub pompę próżniową.
Korzystnie, w sposobie według wynalazku, mikroorganizmy osadza się na pokrytej złotem macie polimerowej przy pomocy podciśnienia, w ten sposób, że matę umieszcza się na lejku Schotta lub lejku Buchnera, a ten z kolei na kolbie ssawkowej, do której podłączana jest próżnia, powodująca
PL 234 373 B1 przejście roztworu do kolby, podczas gdy bakterie lub inne mikroorganizmy zostają zatrzymane na macie polimerowej.
Obecny wynalazek ponadto obejmuje platformę do pomiarów detekcji i/lub identyfikacji mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii z wykorzystaniem techniki powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana (SERS), która charakteryzuje się tym, że obejmuje matę polimerową pokrytą metalem z osadzonymi na jej powierzchni mikroorganizmami, wytworzoną sposobem według wynalazku.
Obecny wynalazek również obejmuje zastosowanie platformy SERS, według wynalazku, do bezpośrednich pomiarów detekcji i/lub identyfikacji mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii, techniką powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana (SERS).
Wynalazek ukazuje matę składającą się z włókien polimerowych o średnicy od kilkudziesięciu nanometrów do kilkudziesięciu mikrometrów. Mata ta może być wytwarzana przy pomocy techniki przędzenia przy wykorzystaniu siły odśrodkowej. Metoda ta zapewnia otrzymanie podłoży, przez które przenikać mogą różnego rodzaju ciecze, z powodu występowania w macie niewielkich wolnych przestrzeni między dość ciasno upakowanymi włóknami polimerowymi. Ponadto sama metoda nie wymaga użycia rozpuszczalników organicznych, zatem wytworzone włókna są wolne od ewentualnych zanieczyszczeń.
Co istotne, mata polimerowa po pokryciu warstwą złota nabiera cech platformy SERS, tj. wzmacnia sygnał Ramana. Dlatego też mata uzyskana metodą według wynalazku może jednocześnie służyć jako filtr, na którym osadza się bakterie oraz platforma SERS - możliwe staje się odseparowanie bakterii od cieczy, w której bakterie te są zawieszone, a następnie natychmiastowe przeprowadzenie pomiaru SERS tych komórek. Dzięki temu rozwiązaniu nie jest konieczne przenoszenie bakterii z filtru na dedykowane podłoże SERS: proces taki byłby bardzo kłopotliwy, wydłużałby czas pomiędzy filtracją a pomiarem mógłby doprowadzić do kontaminacji próbki. Dodatkowo, dzięki temu, że kolejne krople nakładane są w tym samym miejscu maty polimerowej, możliwe jest zwiększanie gęstość bakterii w tym miejscu, co ma w dalszej kolejności wpływ na jakość sygnału ramanowskiego.
Aby umożliwić przejście roztworu przez matę polimerową i odseparować tym samym bakterie od cieczy (w naszym przypadku osocza), zastosowano podciśnienie. W tym celu matę polimerową wytworzoną w technologii przędzenia przy wykorzystaniu siły odśrodkowej położono na porowatej strukturze, w tym przypadku lejku Schotta, który zmontowano z kolbą ssawkową. Kolbę podłączono następnie do pompy próżniowej, choć możliwe jest przyłączenie jej do dowolnego innego źródła podciśnienia, np. pompki wodnej. Podciśnienie powoduje zassanie cieczy poprzez porowatą strukturę maty polimerowej oraz lejka. Bakterie jednak, ze względu na swoje rozmiary, pozostają na powierzchni maty. Zwiększanie koncentracji bakterii uzyskuje się poprzez wielokrotne umieszczanie kropli w tym samym obszarze maty polimerowej.
Wynalazek zostanie teraz bliżej przedstawiony w korzystnym przykładzie wykonania, z odniesieniem do załączonych rysunków, na których:
Fig. 1 przedstawia matę nylonową wykonaną przy pomocy technologii przędzenia przy wykorzystaniu siły odśrodkowej napyloną złotem o grubości 90 nm w powiększeniu: x1 000 i x50 000 razy.
Fig. 2 przedstawia matę nylonową wykonaną przy pomocy technologii przędzenia przy wykorzystaniu siły odśrodkowej napyloną złotem o grubości 90 nm w powiększeniu x457 razy. Widoczna jest struktura maty tj. grube włókna na spodzie pełniące funkcję podłoża oraz nanowłókna na ich powierzchni.
Fig. 3 przedstawia histogram rozkładu wielkości nanowłókien (na podstawie materiałów dostarczonych przez producenta maty, firmę FibeRio® Technology Corporation). Średnia średnica włókien z nylonu wykorzystywana w naszych badaniach to 261.6 nm.
Fig. 4 przedstawia sposób osadzania bakterii na macie polimerowej pokrytej złotem wykonaną przy pomocy technologii przędzenia przy wykorzystaniu siły odśrodkowej. Zestaw do osadzania bakterii składa się ze kolby ssawkowej, lejka Schotta oraz pompy próżniowej. Na lejku kładzie się niewielki, ok. 10 x 10 mm, kawałek maty polimerowej pokrytej złotem, a następnie osadza się tam kroplę roztworu zawierającego bakterie lub inne patogeny. Po włączeniu próżni ciecz przechodzi przez pory w macie polimerowej, podczas gdy bakterie zatrzymują się na jej powierzchni.
Fig. 5 przedstawia zestaw opisany na Fig. 4. Na lejku Schotta widać matę polimerową pokrytą złotem oraz krople krwi z bakteriami S. aureus.
Fig. 6 przedstawia zbliżenie układu z Fig. 4, widoczna mata polimerowa, na której umieszczono kroplę krwi z bakteriami S. aureus.
PL 234 373 B1
Fig. 7 przedstawia analizę EDX dla maty polimerowej wykonanej metodą przędzenia przy wykorzystaniu siły odśrodkowej pokrytej 90 nm złota. Wyniki świadczą o dobrym pokryciu złotem, tj. EDX nie zarejestrował sygnału od podłoża z nylonu.
Fig. 8 przedstawia widmo SERS dla czystego osocza, oraz osocza z bakteriami S. aureus, które następnie przefiltrowano przez matę polimerową wykonaną przy pomocy technologii przędzenia przy wykorzystaniu siły odśrodkowej pokrytej 90 nm złota.
Korzystne przykłady realizacji wynalazku
Sposób przedstawiony w niniejszym zgłoszeniu polega na otrzymaniu platformy SERS w postaci maty polimerowej pokrytej złotem, która dzięki swojej strukturze pozwala na osadzenie na jej powierzchni patogenów z roztworów, szczególnie bakterii. Sposób ten polega na umieszczeniu maty polimerowej na lejku Schotta w taki sposób, aby podciśnienie lub próżnia spowodowały przepływ cieczy (m. in. wody, osocza, moczu, płynu mózgowo-rdzeniowego), a gęsto umieszczone włókna polimerowe zatrzymywały bakterie na powierzchni maty.
Maty polimerowe wykorzystane w pomiarach składają się z włókien polimerowych i mogą być wykonane m.in. z nylonu. Materiał do wytworzenia platform wycięto przy pomocy nożyczek z większego fragmentu maty polimerowej wykonanej metodą przędzenia przy wykorzystaniu siły odśrodkowej. W każdym przypadku wycięto kwadraty ok. 10 x 10 mm, mimo że powierzchnia, na którą nanoszono krople roztworu z bakteriami była znacznie mniejsza (ok. 5 x 5 mm). Każdy z kwadratów pokryto złotem.
Do naniesienia warstw złota wykorzystano metodę PVD (ang. Physical Vapor Deposition - fizyczne osadzanie z fazy gazowej). Zastosowano urządzenie firmy Leica, model EM MED020 wraz z układem pomiaru grubości warstwy Leica EM QSG100. Urządzenie EM MED020 wykorzystuje zjawisko osadzania jonów w polu magnetycznym (ang. magnetron sputtering). Próbki włożono do komory roboczej, po czym odpompowano powietrze do ciśnienia 10-5 mbar i wypełniono komorę argonem do ciśnienia 2 x 10-2 mbar. Prąd zastosowany do napylania złota to 25 mA. Po napyleniu 90 nm złota komorę wypełniono azotem, wyjęto próbki i umieszczono w szczelnych pojemnikach. Maty po napyleniu przedstawione są na Fig. 1 oraz Fig. 2.
W celu namnożenia komórek bakteryjnych pewna ich ilość została zawieszona w 10 ml pożywki LB (ang. lysogeny broth). Następnie kolba zawierająca pożywkę oraz bakterie została umieszczona w wytrząsarce (150 rpm) na 24 h w temperaturze 30°C. W dalszej kolejności pożywkę z bakteriami poddano wirowaniu w czasie 5 min przy prędkości 4000 rpm, zlano supernatant, a pelet zawieszono w 0,85% roztworze NaCI. Procedurę odwirowywania supernatantu powtórzono kilkukrotnie w warunkach jałowych w celu zapewnienia dużej czystości roztworu, w którym znajdowany się bakterie. Tak otrzymana zawiesina służyła następnie do osadzania bakterii na macie polimerowej.
Proces osadzania bakterii na macie polimerowej pokrytej złotem przedstawia schematycznie Fig. 4, natomiast Fig. 5 przestawia realizację praktyczną układu. Układ składa się z kolby ssawkowej podłączonej do dowolnego źródła podciśnienia lub próżni, w naszym przypadku była to pompa próżniowa membranowa firmy Buchi, typ V-700 ze sterownikiem V-855. Na kolbę nałożony został lejek Schotta. Na powierzchni spieku umieszczono matę polimerową o wymiarach ok. 10 x 10 mm. Na środek maty, na powierzchnię ok. 5 x 5 mm, przy pomocy mikropipety położono kroplę roztworu zawierającego roztwór bakterii (S. aureus), a następnie włączono podciśnienie powodujące przesączenie cieczy do kolby ssawkowej oraz zatrzymanie bakterii na macie polimerowej. Tak uzyskana próbka była od razu przenoszona pod mikroskop ramanowski w celu dokonania analizy SERS.
W celu przeprowadzenia pomiarów SERS wykorzystano spektrometr ramanowski Renishaw In Via Raman wyposażony w diodę laserową o mocy 300 mW o długości fali 785 nm. Analiza energii wiązki rozproszonej odbywa się w spektrometrze przy pomocy siatki dyfrakcyjnej, a intensywność dla poszczególnych energii rejestrowana jest w czułym detektorze CCD typ RenCam o rozdzielczości 1024x256 px. Powiększenie obiektywu ogniskującego promień lasera na próbce wynosiło x50 (apertura 0.75). Przestrzenna zdolność rozdzielcza była lepsza niż 1 gm, spektralna zdolność rozdzielcza około 1 cm 1. Typowe widmo było rejestrowane przez czas 4 sekund z mocą lasera wynoszącą 5 mW.
Maty polimerowe wykonane w technologii Forcespinning™ z włóknami o średnicy 261.6±96 nm (Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3) zostały wykorzystane do przeprowadzenia eksperymentów pokazanych na Fig. 4, Fig. 5 i Fig. 6.
Fig. 7 prezentuje wyniki pomiarów składu chemicznego powierzchni EDX, według których główny zarejestrowany sygnał pochodzi od złota. Oznacza to, że na wynik pomiaru nie miał wypływu skład chemiczny włókien.
PL 234 373 B1
Fig. 8 prezentuje zarejestrowane widma SERS, dla czystego osocza oraz dla osocza, w którym umieszczone były bakterie S. aureus. Po zastosowaniu procedury przedstawionej schematycznie na Fig. 4 oraz na Fig. 5 zarejestrowano widmo bakterii S. aureus. Potwierdza to, że metoda może służyć do detekcji i identyfikacji bakterii z płynów np. krwi czy osocza przy wykorzystaniu platformy SERS na bazie maty polimerowej wykonanej w technologii przędzenia przy wykorzystaniu siły odśrodkowej.
Podziękowanie
Opłaty związane z ochroną wynalazku sfinansowano ze środków projektu NanOtechnology, Biomaterials and aLternative Energy Source for ERA integration FP7-REGPOT-CT-2011-285949-NOBLESSE.
Praca naukowa (T. Szymborski) finansowana ze środków budżetowych na naukę w latach 20122013 (projekt luventus Plus IP2011 047871).
Claims (12)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób osadzania mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii, na podłożu polimerowym, znamienny tym, że obejmuje następujące kroki:a) najpierw przygotowuje się podłoże w postaci maty z włókien polimerowych wykonanych w technologii przędzenia przy wykorzystaniu siły odśrodkowej, którą pokrywa się warstwą metalu;b) tak przygotowaną matę układa się na porowatej strukturze i prowadzi się proces oddzielenia mikroorganizmów od cieczy, w której są one zawieszone, z uzyskaniem zatrzymania mikroorganizmów bezpośrednio na powierzchni maty polimerowej i odpływu cieczy przez pory w macie polimerowej za pomocą podłączonego źródła podciśnienia lub próżni, albo za pomocą nadciśnienia lub siły odśrodkowej, otrzymując matę polimerową pokrytą metalem z osadzonymi na jej powierzchni mikroorganizmami jako platformę SERS.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się matę składającą się z włókien polimerowych o rozmiarach od 5 nm do 100 μm, korzystnie między 50 nm a 50 μm, a najkorzystniej między 100 nm a 5 μm.
- 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się matę wykonaną z polimerów, wybranych z grupy obejmującej: poliamid (np. nylon), polifluorek winylidenu (PVDF), poli-L-laktyd (PLLA), poli(alkohol winylowy) PVA, poli(winylo pirolidon) (PVP), polimetakrylan metylu) (PMMA), poliwęglan (PC), polikaprolaktan, agaroza, i inne.
- 4. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-3, znamienny tym, że matę pokrywa się warstwą metalu techniką fizycznego osadzania z fazy gazowej (PVD).
- 5. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-4, znamienny tym, że jako metal stosuje się złoto, srebro lub miedź, korzystnie złoto, albo stopy metali, korzystnie srebro ze złotem, albo stosuje się je w postaci warstwowej, korzystnie warstwa srebra, a na niej warstwa złota.
- 6. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-5, znamienny tym, że stosuje się matę pokrytą warstwą złota, srebra albo miedzi o grubości pomiędzy 10 a 200 nm, korzystnie pomiędzy 30 nm a 150 nm, a najkorzystniej pomiędzy 80 a 100 nm, ewentualnie na warstwie miedzi stosuje się redukowane złoto z wodnego roztworu HAuCL lub innego roztworu zawierającego jony złota.
- 7. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-6, znamienny tym, że w etapie b) jako ciecz stosuje się płyn lub roztwór, obejmujący korzystnie wodę, płyn ustrojowy, krew, osocze, płyn mózgowo-rdzeniowy i mocz, pochodzenia ludzkiego jak i zwierzęcego.
- 8. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-7, znamienny tym, że w etapie b) stosuje się krok zwiększania gęstości mikroorganizmów poprzez dodawanie kolejnych kropli cieczy do zassania, korzystnie co najmniej dwukrotne, w tym samym obszarze maty polimerowej, w zależności od wymiarów mikroorganizmów.
- 9. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-8, znamienny tym, że jako źródło podciśnienia stosuje się pompkę wodną lub pompę próżniową.
- 10. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-9, znamienny tym, że mikroorganizmy osadza się na pokrytej złotem macie polimerowej przy pomocy podciśnienia, w ten sposób, że matę umieszcza się na lejku Schotta lub lejku Buchnera, a ten z kolei na kolbie ssawkowej, do którejPL 234 373 Β1 podłączana jest próżnia, powodująca przejście roztworu do kolby, podczas gdy bakterie lub inne mikroorganizmy zostają zatrzymane na macie polimerowej.
- 11. Platforma do pomiarów detekcji i/lub identyfikacji mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii z wykorzystaniem techniki powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana (SERS), znamienna tym, że obejmuje matę polimerową pokrytą metalem z osadzonymi na jej powierzchni mikroorganizmami, wytworzoną sposobem jak zdefiniowano w zastrz. 1.
- 12. Zastosowanie platformy SERS, jak zdefiniowano w zastrz. 11, do bezpośrednich pomiarów detekcji i/lub identyfikacji mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii, techniką powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana (SERS).Rysunki
Ϊ4» 1 .HV Spot φ i.mw 2.0 1 dweu | mas $ j___ 40 pm---------------------1 | 20US : | Ί'ΟΟΟχ ί Τίόνβ ΝβήΟδΕΜ iChF PAh | Fig. 1PL 234 373 Β1; HV ! mag Si i WO ’ 2.00łcV ί 457 x I C&mm i HFW i spot i1.^:1-------1Q3 jm--------lwa NanoSEM łCfiF PANFig. 2Fig. 3PL 234 373 Β1Fig. 5PL 234 373 Β1Fig. 6PL 234 373 Β11.00 2.00 3.00 4,00 5.00 6.00 7,00 8.00 9.00 keVEDAX ZAF Quantification (Standardless) Element Normalized SEC Table : DefaultElement Wt % At % K- -Ratio Z A F C K 2.94 27.62 0 .0113 1.5456 0.2490 1.0000 N K 1.62 13.03 0 .0063 1.5241 0.2535 1.0000 0 K 0.59 4.17 0 .0026 1.5037 0.2969 1.0000 A1K 0.25 1.06 0 .0027 1.4440 0.7487 1.0000 AuM 94.59 54.12 0 .9114 0.9540 1.0100 1.0000 Total 100.00 100.00 Element Net Inte. Bkqd Inte. Inte. Error P/B C K 85.99 21. 95 1.33 3.92 N K 32.35 29 . 22 2.95 1.11 0 K 20.04 39. 15 4.95 0.51 A1K 15.83 117. 53 10.01 0.13 AuM 1673.45 90. 82 0.26 18.43 Fig. 7PL 234 373 B1 intensity (a.u.) plasma + S. aureus700900 1100 1300 1500 1700Raman shift (cm’1)Fig. 8
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL409210A PL234373B1 (pl) | 2014-01-22 | 2014-08-19 | Platforma do badań substancji chemicznych oraz mikroorganizmów techniką wzmocnionej powierzchniowo spektroskopii Ramana i sposób jej otrzymywania |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL406900A PL232520B1 (pl) | 2014-01-22 | 2014-01-22 | Platforma i jej zastosowanie do detekcji i/lub identyfikacji mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii, techniką powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana oraz sposób osadzania tych mikroorganizmów na wytworzonych platformach |
| PLP-406900 | 2014-01-22 | ||
| PL409210A PL234373B1 (pl) | 2014-01-22 | 2014-08-19 | Platforma do badań substancji chemicznych oraz mikroorganizmów techniką wzmocnionej powierzchniowo spektroskopii Ramana i sposób jej otrzymywania |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL409210A1 PL409210A1 (pl) | 2015-08-03 |
| PL234373B1 true PL234373B1 (pl) | 2020-02-28 |
Family
ID=53723546
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL406900A PL232520B1 (pl) | 2014-01-22 | 2014-01-22 | Platforma i jej zastosowanie do detekcji i/lub identyfikacji mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii, techniką powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana oraz sposób osadzania tych mikroorganizmów na wytworzonych platformach |
| PL409210A PL234373B1 (pl) | 2014-01-22 | 2014-08-19 | Platforma do badań substancji chemicznych oraz mikroorganizmów techniką wzmocnionej powierzchniowo spektroskopii Ramana i sposób jej otrzymywania |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL406900A PL232520B1 (pl) | 2014-01-22 | 2014-01-22 | Platforma i jej zastosowanie do detekcji i/lub identyfikacji mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii, techniką powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana oraz sposób osadzania tych mikroorganizmów na wytworzonych platformach |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (2) | PL232520B1 (pl) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL241747B1 (pl) * | 2018-01-05 | 2022-11-28 | Inst Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk | Platforma do detekcji i/lub identyfikacji mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii, z wykorzystaniem techniki powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana (SERS), sposób jej przygotowania, jej zastosowanie oraz sposób detekcji i/lub identyfikacji mikroorganizmów z użyciem takiej platformy |
-
2014
- 2014-01-22 PL PL406900A patent/PL232520B1/pl unknown
- 2014-08-19 PL PL409210A patent/PL234373B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL232520B1 (pl) | 2019-06-28 |
| PL409210A1 (pl) | 2015-08-03 |
| PL406900A1 (pl) | 2015-08-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chiappini et al. | Tutorial: using nanoneedles for intracellular delivery | |
| Li et al. | Towards practical and sustainable SERS: a review of recent developments in the construction of multifunctional enhancing substrates | |
| Yang et al. | Fabrication of a flexible gold nanorod polymer metafilm via a phase transfer method as a SERS substrate for detecting food contaminants | |
| Taskin et al. | Bioactive electrospun fibers: fabrication strategies and a critical review of surface-sensitive characterization and quantification | |
| Tang et al. | Efficient enrichment and self-assembly of hybrid nanoparticles into removable and magnetic SERS substrates for sensitive detection of environmental pollutants | |
| Chen et al. | Trace analysis and chemical identification on cellulose nanofibers-textured SERS substrates using the “coffee ring” effect | |
| KR101598757B1 (ko) | 표면―증강 라만 산란에 기초한 고속 및 고감도 미량 분석용 유무기 나노섬유 복합체 기판 및 이를 이용한 분석방법 | |
| Yang et al. | Electrostatic assemblies of well-dispersed AgNPs on the surface of electrospun nanofibers as highly active SERS substrates for wide-range pH sensing | |
| Keshavarz et al. | Label-free SERS quantum semiconductor probe for molecular-level and in vitro cellular detection: a noble-metal-free methodology | |
| Park et al. | Ultra-sensitive, on-site pesticide detection for environmental and food safety monitoring using flexible cellulose nano fiber/Au nanorod@ Ag SERS sensor | |
| Witkowska et al. | Polymer mat prepared via Forcespinning™ as a SERS platform for immobilization and detection of bacteria from blood plasma | |
| Chen et al. | Ta@ Ag porous array with high stability and biocompatibility for SERS sensing of bacteria | |
| US11892406B2 (en) | Method and device for assaying the interaction and dynamics of permeation of a molecule and a lipid bilayer | |
| JP2016508601A (ja) | 外面に表面増感分光法要素を有する装置 | |
| Ambroziak et al. | Immobilization of cubic silver plasmonic nanoparticles on TiO2 nanotubes, reducing the coffee ring effect in surface-enhanced raman spectroscopy applications | |
| Saveleva et al. | Polycaprolactone-based, porous CaCO3 and Ag nanoparticle modified scaffolds as a SERS platform with molecule-specific adsorption | |
| CN103344625A (zh) | 一种表面增强拉曼基底及其制造方法 | |
| Prikhozhdenko et al. | New post-processing method of preparing nanofibrous SERS substrates with a high density of silver nanoparticles | |
| Carreón et al. | A scalable synthesis of Ag nanoporous film as an efficient SERS-substrates for sensitive detection of nanoplastics | |
| Chowdhury et al. | SERS-active 3D interconnected nanocarbon web toward nonplasmonic in vitro sensing of HeLa cells and fibroblasts | |
| Podlipec et al. | High-resolution correlative microscopy approach for nanobio interface studies of nanoparticle-induced lung epithelial cell damage | |
| Jia et al. | Fixed Escherichia coli bacterial templates enable the production of sensitive SERS-based gold nanostructures | |
| PL234373B1 (pl) | Platforma do badań substancji chemicznych oraz mikroorganizmów techniką wzmocnionej powierzchniowo spektroskopii Ramana i sposób jej otrzymywania | |
| Xu et al. | Fabrication of highly sensitive and uniform Ag/PS/PDMS SERS substrate and its application for in-situ detection | |
| DE102019122079B4 (de) | Verfahren zur bestimmung von nanopolymerpartikeln |