PL232662B1 - Ester kwasu betulonowego i sposób jego otrzymywania - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest ester kwasu betulonowego o wzorze 1 przedstawionym na rysunku.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania tego estru. Wynalazek może znaleźć zastosowanie w przemyśle kosmetycznym i farmaceutycznym.

Kwas betulonowy jest otrzymywany na drodze chemicznego utlenienia z betuliny, wtórnego metabolitu występującego m.in. w korze brzozowej. Kwas betulonowy posiada aktywność cytotoksyczną wobec linii komórkowych czerniaka Mel 1-4 (Chatterjee S.A. et al.; Appl Environ Microbiol 2000, 66, 3850-3855), linii czerniaka A375, linii raka żołądka MGC-803, linii raka piersi Bcap-37 i MCF-7 (Yang S.J. et al.; Eur J Med Chem 2015, 96, 58-65). Kwas betulonowy wykazuje aktywność przeciwwirusową (Flekhter O.B. et al.; Russ J Bioorg Chem 2004, 30, 80-88) i efekt przeciwzapalny (Govdi A.l. et al.; Chem Sust Dev 2010, 18, 397-402; Vasilevsky S.F. et al.; Bioorg Med Chem 2009, 17, 5164-5169).

Kwas cytrynowy jest kwasem organicznym występującym m.in. jako produkt pośredni jest elementem cyklu kwasów trójkarboksylowych (cyklu Krebsa). Jest stosowany jako konserwant i regulator kwasowości w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym (Goldberg I. et al.; J Chem Tech Biotech 2006, 81, 1601 -1611).

Dotąd nie został otrzymany ester kwasu betulonowego z kwasem cytrynowym.

Istotą wynalazku jest ester kwasu betulonowego.

Istotą sposobu według wynalazku jest to, że kwas betulinowy 33-hydroksylup-20(29)-en-28-owy poddaje się utlenieniu kompleksem trójtlenku chromu z pirydyną z dodatkiem octanu sodu w środowisku chlorku metylenu w celu otrzymania kwasu betulonowego 3-oksolup-20(29)-en-28-owego. Następnie kwas betulonowy przeprowadza się w chlorek kwasowy za pomocą odczynnika chlorującego. Kwas (DL)-cytrynowy (kwas 2-hydroksypropano-1,2,3-trikarboksylowy) przeprowadza się w ester metylowy za pomocą metanolu z dodatkiem H2SO4 w środowisku benzenu. Chlorek kwasu betulonowego i cytrynian trimetylu poddaje się estryfikacji w chlorku metylenu. Następnie otrzymany ester kwasu betulonowego poddaje się selektywnej hydrolizie za pomocą lipazy w etanolu, po czym otrzymuje się ester kwasu betulonowego z kwasem cytrynowym.

Korzystnie jest, gdy czynnikiem chlorującym jest chlorek oksalilu.

Korzystnie jest, gdy w etapie estryfikacji stosuje się dwukrotny nadmiar cytrynianu trimetylu.

Korzystnie jest, gdy do selektywnej hydrolizy wiązań estrowych we fragmencie kwasu cytrynowego stosuje się enzym lipazy immobilizowany z Mucor miehei, w środowisku etanolu.

Sposób, według wynalazku, przedstawiony jest dokładniej w przykładzie wykonania. P r z y k ł a d: Do 500 mg kwasu betulinowego 33-hydroksylup-20(29)-en-28-owego (1,096 mmol) rozpuszczonego w 50 cm3 chlorku metylenu dodaje się kompleksu trójtlenku chromu (VI) z pirydyną (849 mg, 3,289 mmol) oraz bezwodnego octanu sodu (54 mg, 0,658 mmol). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie z mieszaniny reakcyjnej odparowuje się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt ekstrahuje się z pozostałości heksanem (3 x 50 cm3), następnie ekstrakt przefiltrowuje się przez sączek na lejku. Ekstrakt przenosi się do rozdzielacza i przemywa się 1M HCI. Frakcję organiczną osusza się MgSO4 i odparowuje się heksan. Surowy produkt oczyszcza się za pomocą chromatografii kolumnowej (żel krzemionkowy, heksan -aceton 5:1), otrzymując 473 mg kwasu betulonowego 3-oksolup-20(29)-en-28-owego (wydajność 95%).

Monohydrat kwasu cytrynowego (2,1875 g, 10,4 mmol) odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze łaźni wodnej 80°C do uzyskania stałej masy (2 g, 10,4 mmol). Do roztworu bezwodnego kwasu cytrynowego (kwas 2-hydroksypropano-1,2,3-trikarboksylowy) (2 g, 10,4 mmol) w bezwodnym metanolu (6,05 cm3, 0,1492 mol) wkrapla się 0,37 cm3 (6,57 mmol) H2SO4 o stężeniu 95%. Do mieszaniny dodaje się 20 cm3 bezwodnego benzenu i całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze wrzenia mieszaniny przez 2 godziny. Po tym czasie mieszaninę reakcyjną ochładza się do temperatury pokojowej, przenosi się do rozdzielacza i rozcieńcza się octanem etylu (50 cm3). Frakcję organiczną przemywa się wodą destylowaną (25 cm3), 5% NaHCO3 (25 cm3), solanką (25 cm3), a następnie osusza się za pomocą MgSO4. Rozpuszczalnik odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymuje się 2,1206 g produktu w postaci cytrynianu trimetylu z wydajnością 87%. Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektroskopowymi: 1H NMR (600 MHz, CDCI3) δ: 2,80 (d, J = 15,6 Hz, 2H, CH2-2); 2,89 (d, J = 15,6 Hz, 2H, CH2-4); 3,68 (s, 6H, 2x CH3O-); 3,82 (s, 3H, CH3O-); 4,10 (s, 1H, -OH). 13C NMR (150 MHz, CDCI3) δ: 43,03 (C-2 i C-4); 51,97 (2x CH3O-); 53,17 (CH3O-); 73,23 (C-3); 170,18 (C-1 i C-5); 173,79 (C-6). IR (KBr, cm-1): 3518 (m), 3024 (s), 2956 (s), 1746 (s), 1439 (m), 1216 (s), 1081 (w).

Do 200 mg (0,440 mmol) kwasu betulonowego rozpuszczonego w 10 cm3 chlorku metylenu do-daje się chlorku oksalilu (75 μ!, 0,880 mmol) i miesza się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie dodaje się cytrynianu trimetylu (116 μ^ 0,880 mmol) i miesza się przez 24 godziny. Po tym czasie mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się 10 cm3 chlorku metylenu i przemywa się 5% NaHCO3 (10 cm3) oraz solanką (10 cm3). Frakcję organiczną osusza się za pomocą MgSO4, a potem odparowuje się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszcza się stosując chromatografię kolumnową (żel krzemionkowy, eluent - chlorek metylenu). Otrzymuje się 213 mg estru kwasu betulonowego z cytrynianem trimetylu z wydajnością 72%.

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektroskopowymi:

Ester kwasu betulonowego z cytrynianem trimetylu: 1H NMR (600 MHz, CDCI3) δ: 0,83, 0,84, 0,85, 0,91 i 0,96 (pięć s, 15H, CH3- w kwasie betulono-wym); 1,22-1,64 (m, 18H, CH2, CH); 1,69 (s, 3H, CH3-30); 2,27-2,45 (m, 4H, CH2-1 i CH2-2); 2,81-2,90 (m, 4H, CH2-2' i CH2-4'); 3,00 (m, 1H, H-19); 3,67 (s, 6H, 2x CH3O-); 3,80 (s, 3H, CH3O-); 4,47 (m, 1H, H-3); 4,60 i 4,74 (dwa m, 2H, CH2-29). 13C NMR (150 MHz, CDCI3) δ: 14,40 (C-27); 15,70 (C-26); 15,87 (C-25); 19,30 (C-30); 19,61 (C-6); 20,99 (C-24); 21,28 (C-11); 25,47 (C-12); 26,54 (C-23); 29,55 (C-21); 30,32 (C-15); 31,75 (C-16); 33.71 (C-7); 33,99 (C-2); 36,72 (C-10); 37,01 (C-22); 38,22 (C-13); 39,60 (C-1); 40,63 (C-8); 42,39 (C-14); 43,11 (C-2' i C-4'); 47,01 (C-18); 47,32 (C-4); 49,25 (C-19); 49,87 (C-9); 52,03 (2x CH3O-); 53,44 (CH3O-); 55,03 (C-5); 56,25 (C-17); 61,15 (C-3'); 109,47 (C-29); 150,45 (C-20); 169,99 (C-1' i C-5'); 173,66 (C-6'); 174,99 (C-28); 218,11 (C-3). IR (KBr, cm-1): 2930 (s), 1727 (s), 1706 (s), 1635 (w), 1456 (m), 1257 (m), 1094 (w), 885 (m).

Do 10 ml 96% etanolu dodaje się 200 mg (0,298 mmol) betulonianu cytrynianu trimetylu oraz 333 mg (10 U) enzymu Lipozyme® (lipaza immobilizowana z Mucormiehei, aktywność >30 U/g, Sigma-Aldrich). Reakcję prowadzi się przez 24 godziny w temperaturze 37°C. Następnie mieszaninę reakcyjną przesącza się przez lejek Schotta, enzym przemywa się metanolem, a potem odparowuje się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Mieszaninę reakcyjną rozdziela się stosując chromatografię kolumnową (żel krzemionkowy, eluent: chlorek metylenu: metanol w gradiencie objętościowym od 100:0 do 0:100). Następnie czyste frakcje z produktem przeprowadza się w formę protonową z udziałem żywicy jonowymiennej DOWEX (H+). Otrzymuje się 161 mg betulonianu kwasu cytrynowego z wydajnością 86%. Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektroskopowymi:

Ester kwasu betulonowego z kwasem cytrynowym: 1H NMR (600 MHz, CDCI3) δ: 0,82, 0,85, 0,86, 0,89 i 0,97 (pięć s, 15H, CH3- w kwasie betulono-wym); 1,30-1,65 (m, 18H, CH2, CH); 1,70 (s, 3H, CH3-30); 2,25-2,43 (m, 4H, CH2-1 i CH2-2); 2,80-2,92 (m, 4H, CH2-2' i CH2-4'); 3,02 (m, 1H, H-19); 4,48 (m, 1H, H-3); 4,61 i 4,73 (dwa m, 2H, CH2-29); 12,45 (bs, 3H, 3 x COOH). 13C NMR (150 MHz, CDCI3) δ: 14,39 (C-27); 15,77 (C-26); 15,85 (C-25); 19,31 (C-30); 19,65 (C-6); 20,98 (C-24); 21,27 (C-11); 25,46 (C-12); 26,55 (C-23); 29,56 (C-21); 30,31 (C-15); 31,76 (C-16); 33.72 (C-7); 33,98 (C-2); 36,73 (C-10); 37,02 (C-22); 38,20 (C-13); 39,61 (C-1); 40,64 (C-8); 42,37 (C-14); 43,13 (C-2' i C-4'); 47,04 (C-18); 47,30 (C-4); 49,26 (C-19); 49,89 (C-9); 55,11 (C-5); 56,23 (C-17); 61,14 (C-3'); 109,40 (C-29); 150,46 (C-20); 174,99 (C-28); 176,55 (C-1' i C-5'); 177,23 (C-6'); 218,11 (C-3). IR (KBr, cm-1): 2920 (s), 2860-2500 (bs), 1742 (s), 1725 (s), 1696 (s), 1435 (m), 1389 (m), 1256 (m), 882 (w).

Claims (5)

Zastrzeżenia patentowe

1. Ester kwasu betulonowego o wzorze 1 przedstawionym na rysunku.

2. Sposób otrzymania estru kwasu betulonowego, znamienny tym, że kwas betulinowy 33-hy-droksylup-20(29)-en-28-owy utleniony do kwasu betulonowego 3-oksolup-20(29)-en-28--owego, przeprowadza się w chlorek kwasowy w obecności odczynnika chlorującego, a następnie poddaje się estryfikacji z cytrynianem trimetylu (ester trimetylowy kwasu 2-hydroksy-propano-1,2,3-trikarboksylowego), po czym w drodze selektywnej hydrolizy odblokowuje się grupy karboksylowe we fragmencie kwasu cytrynowego metodą enzymatyczną w wyniku czego otrzymuje się betulonian kwasu cytrynowego.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako odczynnik chlorujący stosuje się chlorek oksalilu.

4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w etapie estryfikacji stosuje się dwukrotny nadmiar cytrynianu trimetylu.

5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że do selektywnej hydrolizy wiązań estrowych we fragmencie kwasu cytrynowego stosuje się enzym lipazy immobilizowany z Mucor miehei, w środowisku etanolu.