PL232660B1

PL232660B1 - Ester kwasu betulonowego i sposób jego otrzymywania

Info

Publication number: PL232660B1
Application number: PL421385A
Authority: PL
Inventors: Barbara Barycza
Original assignee: Univ Przyrodniczy We Wroclawiu
Priority date: 2017-04-24
Filing date: 2017-04-24
Publication date: 2019-07-31
Also published as: PL421385A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest ester kwasu betulonowego o wzorze 1 przedstawionym na rysunku.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania tego estru. Wynalazek może znaleźć zastosowanie w przemyśle kosmetycznym i farmaceutycznym.

Kwas betulonowy jest otrzymywany na drodze chemicznego utlenienia z betuliny, wtórnego metabolitu występującego m. in. w korze brzozowej. Kwas betulonowy posiada aktywność cytotoksyczną wobec linii komórkowych czerniaka Mel 1-4 (Chatterjee S.A. et al.; Appl Environ Microbiol 2000, 66, 3850-3855), linii czerniaka A375, linii raka żołądka MGC-803, linii raka piersi Bcap-37 i MCF-7 (Yang S.J. et al.; Eur J Med Chem 2015, 96, 58-65). Kwas betulonowy wykazuje aktywność przeciwwirusową (Flekhter O.B. et al.; Russ J Bioorg Chem 2004, 30, 80-88) i efekt przeciwzapalny (Govdi A.l. et al.; Chem Sust Dev 2010, 18, 397-402; Vasilevsky S.F. et al.; Bioorg Med Chem 2009, 17, 5164-5169).

Kwas jabłkowy jest kwasem organicznym występującym m. in. w rabarbarze i jabłkach. Mieszanina racemiczna jest otrzymywana syntetycznie, zaś L-izomer występuje naturalnie. Jako produkt pośredni jest elementem cyklu kwasów trójkarboksylowych (cyklu Krebsa). Jest stosowany jako konserwant i regulator kwasowości w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym (Goldberg I. et al.; J Chem Tech Biotech 2006, 81, 1601 -1611).

Dotąd nie został otrzymany ester kwasu betulonowego z kwasem jabłkowym.

Istotą wynalazku jest ester kwasu betulonowego.

Istotą sposobu według wynalazku jest to, że kwas betulinowy 33-hydroksylup-20(29)-en-28-owy poddaje się utlenieniu kompleksem trójtlenku chromu z pirydyną z dodatkiem octanu sodu w środowisku chlorku metylenu w celu otrzymania kwasu betulonowego 3-oksolup-20(29)-en-28-owego. Następnie kwas betulonowy przeprowadza się w chlorek kwasowy za pomocą odczynnika chlorującego. Kwas (DL)-jabłkowy (DL)-2-hydroksybutanodiowy przeprowadza się w ester metylowy za pomocą metanolu z dodatkiem H2SO4 w środowisku benzenu. Chlorek kwasu betulonowego i (DL)-jabłczan dimetylu poddaje się estryfikacji w chlorku metylenu. Następnie otrzymany ester kwasu betulonowego poddaje się selektywnej hydrolizie za pomocą lipazy w etanolu, po czym otrzymuje się ester kwasu betulonowego z kwasem (DL)-jabłkowym.

Korzystnie jest, gdy czynnikiem chlorującym jest chlorek oksalilu.

Korzystnie także jest, gdy w etapie estryfikacji stosuje się dwukrotny nadmiar (DL)-jabłczanu di-metylu.

Korzystnie jest, gdy do selektywnej hydrolizy wiązań estrowych we fragmencie jabłczanu stosuje się enzym lipazy immobilizowany z Mucor miehei, w środowisku etanolu.

Sposób, według wynalazku, przedstawiony jest dokładniej w przykładzie wykonania.

Przykład: Do 500 mg kwasu betulinowego 33-hydroksylup-20(29)-en-28-owego (1,096 mmol) rozpuszczonego w 50 cm3 chlorku metylenu dodaje się kompleksu trójtlenku chromu (VI) z pirydyną (849 mg, 3,289 mmol) oraz bezwodnego octanu sodu (54 mg, 0,658 mmol). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie z mieszaniny reakcyjnej odparowuje się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt ekstrahuje się z pozostałości heksanem (3 x 50 cm3), następnie ekstrakt przefiltrowuje się przez sączek na lejku. Ekstrakt przenosi się do rozdzielacza i przemywa się 1M HCI. Frakcję organiczną osusza się MgSO4 i odparowuje się heksan. Surowy produkt oczyszcza się za pomocą chromatografii kolumnowej (żel krzemionkowy, heksan-ace-ton 5:1), otrzymując 473 mg kwasu betulonowego 3-oksolup-20(29)-en-28-owego (wydajność 95%).

Do roztworu kwasu (DL)-jabłkowego (DL)-2-hydroksybutanodiowy (2 g, 14,9 mmol) w bezwodnym metanolu (6,05 cm3, 0,1492 mol) wkrapla się 0,37 cm3 (6,57 mmol) H2SO4 o stężeniu 95%. Do mieszaniny dodaje się 20 cm3 bezwodnego benzenu i całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze wrzenia mieszaniny przez 2 godziny. Po tym czasie mieszaninę reakcyjną ochładza się do temperatury pokojowej, przenosi się do rozdzielacza i rozcieńcza się octanem etylu (50 cm3). Frakcję organiczną przemywa się wodą destylowaną (25 cm3), 5% NaHCO3 (25 cm3), solanką (25 cm3), a następnie osusza się za pomocą MgSO4. Rozpuszczalnik odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymuje się 1,096 g produktu w postaci (DL)-jabłczanu dimetylu z wydajnością 75%. Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektroskopowymi: 1H NMR (600 MHz, CDCI3) δ: 2,80 (dd, J = 16,2 i 6,0 Hz, 1H, jeden z CH2-3); 2,87 (dd, J = 16,2 i 4,2 Hz, 1H, jeden z CH2-3); 3,23 (d, J = 5,4 Hz, 1H, -OH); 3,71 (s, 3H, CH3O-1”); 3,81 (s, 3H, CH3O-1’); 4,50 (dd, J = 10,2 i 5,4 Hz, 1H, H-2). 13C NMR (150 MHz, CDCI3) δ: 38,41 (C-3); 52,02 (C-1”); 52,85 (C-1'); 67,23 (C-2); 170,98 (C-1); 173,70 (C-4). IR (film, cm-1): 3482 (s), 3005 (w), 2957 (s), 2852 (w), 1728 (s), 1439 (s), 1369 (m), 1172 (m), 1109 (m).

Do 200 mg (0,440 mmol) kwasu betulonowego rozpuszczonego w 10 cm3 chlorku metylenu do-daje się chlorku oksalilu (75 μ!, 0,880 mmol) i miesza się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie dodaje się (DL)-jabłczan dimetylu (116 0,880 mmol) i miesza się przez 24 godziny. Po tym czasie mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się 10 cm3 chlorku metylenu i przemywa się 5% NaHCO3 (10 cm3) oraz solanką (10 cm3). Frakcję organiczną osusza się za pomocą MgSO4, a potem odparowuje się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszcza się stosując chromatografię kolumnową (żel krzemionkowym, eluent - chlorek metylenu). Otrzymuje się 224 mg estru kwasu betulonowego z (DL)-jabłczanem dimetylu z wydajnością 85%. Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektroskopowymi:

Ester kwasu betulonowego z (DL)-jabłczanem dimetylu 1H NMR (600 MHz, CDCI3) δ: 0,88, 0,93, 0,95, 0,97 i 1,02 (pięć s, 15H, CH3- w kwasie betulono-wym); 1,09-1,62 (m, 17H, CH2, CH); 1,64 (s, 3H, CH3-30); 1,79-2,06 (m, 3H); 2,09-2,33 (m, 2H, CH2-1); 2,34-2,51 (m, 2H, CH2-2); 2,72-2,88 (m, 2H, CH2-3'); 2,96 (m, 1H, H-19); 3,67 (s, 3H, CH3O-1'”); 3,77 (s, 3H, CH3O-1”); 4,56 i 4,69 (dwa m, 2H, CH2-29); 5,41 (m, 1H, H-2'). 13C NMR (150 MHz, CDCI3) δ; 14,46 (C-27); 15,57 i 15,62 (C-26); 15,84 (C-25); 19,25 (C-30); 19,53 (C-6); 20,89 (C-24); 21,26 (C-11); 25,43 (C-12); 26,51 (C-23); 29,32 i 29,56 (C-21); 30,27 i 30,43 (C-15); 31,67 i 31,76 (C-16); 33,48 (C-7); 34,00 (C-2); 35,83 (C-10); 36,79 (C-22); 38,35 (C-13); (C-1); 40,51 i 40,57 (C-8); 42,37 (C-14); 46,61 i 46,68 (C-18); 47,20 (C-4); 49,08 (C-19); 49,73 i 49,80 (C-9); 51,90 i 51,99 (C-1”); 52,47 i 52,71 (C-1'”); 54,80 i 54,84 (C-5); 56,20 i 56,37 (C-17); 67,15 i 67,77 (C-2'); 109,54 i 109,60 (C-29); 150,23 i 150,26 (C-20); 169,38 i 169,42 (C-1'); (C-4'); 174,69 i 174,80 (C-28); 218,09 i 218,13 (C-3). IR (film, cm-1): 3072 (w), 2951 (s), 2870 (s), 1743 (s), 1642 (w), 1439 (m), 1375 (m), 1279 (m), 1172 (m), 1049 (w), 996 (w).

Do 10 mL 96% etanolu dodaje się 200 mg (0,334 mmol) betulonianu (DL)-jabłczanu dimetylu oraz 333 mg (10 U) enzymu Lipozyme® (lipaza immobilizowana z Mucormiehei, aktywność >30 U/g, Sigma-Aldrich). Reakcję prowadzi się przez 24 godziny w temperaturze 37°C. Następnie mieszaninę reakcyjną przesącza się przez lejek Schotta, enzym przemywa się metanolem, a potem odparowuje się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Mieszaninę reakcyjną rozdziela się stosując chromatografię kolumnową (żel krzemionkowy, eluent: chlorek metylenu:metanol w gradiencie objętościowym od 100:0 do 0:100). Następnie czyste frakcje z produktem przeprowadza się w formę protonową z udziałem żywicy jonowymiennej DOWEX (H+). Otrzymuje się 141 mg betulonianu kwasu (DL)-jabłkowego z wydajnością 74%. Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektroskopowymi:

Ester kwasu betulonowego z kwasem (DL)-jabłkowym 1H NMR (600 MHz, CDCI3) δ: 0,78 (m, 1H, H-5); 0,81 (s, 3H, CH3-24); 0,82 (s, 3H, CH3-25); 0,84 (s, 3H, CH3-23); 0,94 (s, 3H, CH3-26); 0,95 (s, 3H, CH3-27); 1,68 (s, 3H, CH3-30); 2,22 (m, 2H, CH2-1); 2,45 (m, 2H, CH2-2); 2,89 (m, 2H, CH2-3'); 2,97 (m, 1H, H-19); 4,59 i 4,72 (dwa m, 2H, CH2-29); 5,44 (m, 1 H, H-2'); 11,04 (bs, 2H, 2 x COOH). 13C NMR (150 MHz, CDCI3) δ: 14,60 (C-27); 15,87 i 15,93 (C-26); 16,18 (C-24); 16,46 (C-25); 18,17 (C-6); 19,32 i 19,36 (C-30); 21,31 (C-11); 23,68 (C-12); 34,19 (C-2); 27,92 (C-23); 29,33 i 29,44 (C-21); 30,38 (C-15); 31,81 i 31,91 (C-16); 34,23 i 34,27 (C-7); 35,96 (C-3'); 36,73 i 36,91 (C-22); 37,09 (C-10); 37,78 (C-13); 39,05 i 39,16 (C-1); 40,70 i 40,74 (C-8); 42,39 i 42,44 (C-14); 46,76 i 46,84 (C-18); 47,39 (C-4); 49,25 (C-19); 50,47 (C-9); 55,41 (C-5); 56,51 (C-17); 67,85 i 67,90 (C-2'); 109,62 i 109,67 (C-29); 150,41 i 150,46 (C-20); 170,56 i 169,61 (C-4'); 171,01 (C-1'); 174,82 i 174,95 (C-28); 218,16 (C-3). IR (film, cm-1): 2949 (s), 2871 (m), 1737 (s), 1705 (s), 1438 (m), 1368 (m), 1247 (s), 1169 (w), 1126 (w), 1026 (w), 979 (w).

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Ester kwasu betulonowego o wzorze 1 przedstawionym na rysunku.

2. Sposób otrzymania estru kwasu betulonowego, znamienny tym, że kwas betulinowy 33-hy-droksylup-20(29)-en-28-owy utleniony do kwasu betulonowego 3-oksolup-20(29)-en-28-owe-go, przeprowadza się w chlorek kwasowy w obecności odczynnika chlorującego, a następnie poddaje się estryfikacji z (DL)-jabłczanem dimetylu, po czym w drodze selektywnej hydrolizy odblokowuje się grupy karboksylowe we fragmencie jabłczanu metodą enzymatyczną, w wyniku czego otrzymuje się betulonian kwasu jabłkowego.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako odczynnik chlorujący stosuje się chlorek oksalilu.

4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w etapie estryfikacji stosuje się dwukrotny nadmiar (DL)-jabłczanu dimetylu.

5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że do selektywnej hydrolizy wiązań estrowych we fragmencie jabłczanu stosuje się enzym lipazy immobilizowany z Mucormiehei, w środowisku etanolu.