PL232885B1 - Sposób ochrony materiałów przeznaczonych do użytku w kontakcie z wodą oraz zastosowanie kwasu glikolowego do ochrony takich materiałów - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób ochrony materiałów, przeznaczonych do użytku w kontakcie z wodą, przed kolonizacją przez bakterie i/lub tworzeniem na ich powierzchni biofilmów bakteryjnych, w którym wymienione materiały traktowane są roztworem kwasu glikolowego_o stężeniu w zakresie około 0,5 - 15 mg/l w jałowej wodzie, korzystnie wodzie destylowanej. Zgłoszenie dotyczy także zastosowania kwasu glikolowego do ochrony takich materiałów.

Description

Opis wynalazku

Dziedzina techniki

Przedmiotem wynalazku jest sposób ochrony materiałów, przeznaczonych do użytku w kontakcie z wodą, przed kolonizacją przez bakterie i/lub tworzeniem na ich powierzchni biofilmów bakteryjnych. Wynalazek dotyczy także zastosowania kwasu glikolowego do ochrony takich materiałów.

Stan techniki

Bakterie heterotroficzne żyjące w środowiskach wodnych wykazują tendencje do osiadania na dostępnych powierzchniach i tworzenia przestrzennych struktur o grubości kilku - kilkuset gm zwanych biofilmami. Kolonizacja powierzchni przez bakterie zachodzi etapowo. Po kontakcie z powierzchnią i wstępnym do niej przytwierdzeniu bakterie syntetyzują zewnątrzkomórkową polisacharydową matrix, w której pozostają osadzone. Taka matrix (biofilm) zawiera liczne mikroorganizmy należące niejednokrotnie do różnych gatunków. Życie w biofilmie przynosi mikroorganizmom wiele korzyści, do których należą m.in.: ochrona przed czynnikami fizycznymi takimi jak np. promieniowanie UV; wyższa temperatura w biofilmie - wzrost tempa metabolizmu; bogactwo związków organicznych zarówno tych budujących kolonizowana cząstkę, jaki i tych zaadsorbowanych na powierzchni; horyzontalny transfer genów, częstsza koniugacja bakterii; ochrona przed związkami bakteriobójczymi (np. detergentami czy antybiotykami); ochrona przed presją pierwotniaków (głównie nanowiciowców), z drugiej strony zwiększa się ryzyko pożarcia przez większe pierwotniaki czy orzęski lub skorupiaki; immobilizacja fagów w matrix biofilmu; wytworzone hydrolazy pozostają w zasięgu ich producentów.

Z punktu widzenia przemysłowego i medycznego tworzenie biofilmów przez bakterie jest często zjawiskiem niepożądanym. Biofilmy mogą niszczyć strukturę skolonizowanej powierzchni (np. przęsła mostów, dna okrętów) czy stanowić zagrożenie zdrowia w przypadku zasiedlenia specjalistycznych urządzeń medycznych (np. implanty) czy odzieży, np. kolonizacja nurkowej odzieży, czy odzieży neoprenowej przez bakterie potencjalnie patogenne. Wdrożenie skutecznego sposobu zwalczania biofilmów jest problemem istotnym i wciąż nierozwiązanym w stopniu zadawalającym.

Obecnie stosowane są liczne środki bakteriobójcze i detergenty w celu usunięcia powstałych biofilmów. Należą do nich m.in. kationowe sole amoniowe, anionowe mydła i kwasy tłuszczowe, rozpuszczalniki organiczne np. alkohole, metale ciężkie, środki utleniające np. nadtlenek wodoru, alkilujące czy denaturujące białka.

Obok zwalczania powstałych już biofilmów równie ważne, o ile nawet nie ważniejsze, jest zapobieganie ich tworzeniu. Szczególnym przypadkiem jest ochrona przed wytwarzaniem biofilmów przez bakterie żyjące w środowiskach wodnych.

Nie ma obecnie preparatów wykorzystujących naturalne mechanizmy hamowania tworzenia biofilmów w strukturach odzieży piankowej. Dostępne rozwiązania wymagają na ogół namaczania i prania tego typu odzieży w różnorodnych preparatach. Przykład może stanowić tu preparat o nazwie handlowej MiraZyme™ oferowany przez M Essentials, oparty na preparatach enzymatycznych i detergentach. Jego działanie podobne jest do działania proszków do prania zawierających aktywne enzymy i nie umożliwia szybkiego zastosowania w warunkach terenowych bez możliwości uprania odzieży.

Istnieją także bakteriobójcze preparaty przemysłowe zawierające kwasy hydroksykarboksylowe w postaci soli metali lub estrów np. opisane w zgłoszeniu US20080317800A1 lub JP58067761A (Composition for forming coating film of hydrolysable resin). Nie zawierają one jednak czystego kwasu glikolowego w minimalnych stężeniach (jedynie wysokie stężenia jego pochodnych) i nie bazują na idei wykorzystania niewielkiego gradientu kwasu glikolowego. Nie służą ponadto ochronie odzieży neoprenowej, a jedynie urządzeń przemysłowych.

W warunkach naturalnych bakterie wodne dążą do kolonizacji nie tylko różnorodnych powierzchni nieożywionych, ale też komórek glonów i cyjanobakterii. Mikroorganizmy te bronią się przed kolonizacją. Modyfikują one np. strukturę powierzchni komórki oraz wytwarzają związki cytotoksyczne jak np. elatol lub florotaniny (Eom i wsp. 2012) lub zaburzają interakcję pomiędzy komórkami bakteryjnymi np. wpływając na mechanizm „quorum sensing” (Punyasl i Wright 2004).

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie środków do skutecznej ochrony materiałów, przeznaczonych do użytkowania w wodzie, przed kolonizacją przez bakterie. Twórca niniejszego wynalazku nieoczekiwanie stwierdził, że można wykorzystać jeden ze sposobów obrony fotosyntetyzujących glonów przed ich kolonizacją przez bakterie do ochrony materiałów zanurzonych w wodach naturalnych wykorzystując do ich ochrony kwas glikolowy w bardzo niskim stężeniu.

PL 232 885 B1

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób ochrony materiałów, przeznaczonych do użytku w kontakcie z wodą, przed kolonizacją przez bakterie i/lub tworzeniem na ich powierzchni biofilmów bakteryjnych w którym wymienione materiały traktowane są roztworem kwasu glikolowego o stężeniu w zakresie 0,5-15 mg/l w jałowej wodzie, korzystnie wodzie destylowanej.

Zakres 0,5-15 mg/l odpowiada 0,00005-0,0015% wagowych.

W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, kw as glikolowy jest w stężeniu 10 mg/l.

Wartość 10 mg/l odpowiada 0,001% wag.

W sposobie według wynalazku mogą być stosowane również inne stężenia kwasu glikolowego, w szczególności 0,5, 1,2 mg/l (odpowiednio 0,00005, 0,0001,0,0002% wag., a także np. około 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 mg/l (odpowiednio około 0,0003, 0,0004, 0,0005, 0,0006, 0,0007, 0,008, 0,0009% wag.) lub najkorzystniej 10 mg/l (czyli 0,001% wag.).

Wyższe wartości kwasu glikolowego tj. wartości przekraczające 15 mg/l przestają imitować naturalne mechanizmy i nie pozostają już całkiem obojętne dla środowiska naturalnego.

W przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, roztwór kwasu glikolowego zawiera dodatkowo składniki pomocnicze i/lub substancje zapachowe.

Korzystnie, roztwór kwasu glikolowego pakowany jest w atomizerze a traktowanie materiałów odbywa się przez ich spryskanie.

W przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, roztwór kwasu glikolowego nanosi się na powierzchnię materiału w ilości 0,5-2 ml/cm² materiału, korzystnie 1 ml/10 cm² materiału.

W przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, materiał, po kontakcie z wodą, jest przed traktowaniem roztworem kwasu glikolowego wstępnie suszony przez 15-20 minut.

Korzystnie, materiałem przeznaczonym do użytku w kontakcie z wodą jest odzież nurkowa, surfingowa i/lub windsurfingowa, korzystnie neoprenowa.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie kwasu glikolowego do ochrony materiałów, przeznaczonych do użytku w kontakcie z wodą, przed kolonizacją przez bakterie i/lub tworzeniem na ich powierzchni biofilmów bakteryjnych, przy czym kwas glikolowy stosowany jest na materiały w stężeniu w zakresie 0,5-15 mg/l, w postaci roztworu w jałowej wodzie, korzystnie wodzie destylowanej.

Zakres i 0,5-15 mg/l odpowiada 0,00005-0,0015-% wagowych.

W korzystnym przykładzie wykonania dla zastosowania według wynalazku, kwas glikolowy jest w stężeniu 10 mg/l.

Wartość 10 mg/l odpowiada 0,001% wag.

W zastosowaniu według wynalazku mogą być wykorzystywane również inne stężenia kwasu glikolowego, w szczególności 0,5, 1, 2 mg/l (odpowiednio 0,00005, 0,0001, 0,0002 % wag., a także np. około 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 mg/l (odpowiednio około 0,0003, 0,0004, 0,0005, 0,0006, 0,0007, 0,008, 0,0009 % wag.) lub najkorzystniej 10 mg/l (czyli 0,001% wag.).

W przykładzie wykonania dla zastosowania według wynalazku, roztwór kwasu glikolowego zawiera dodatkowo składniki pomocnicze i/lub substancje zapachowe.

Korzystnie, roztwór kwasu glikolowego pakowany jest w atomizerze a traktowanie materiałów odbywa się przez ich spryskanie.

W przykładzie wykonania dla zastosowania według wynalazku, roztwór kwasu glikolowego nanosi się na powierzchnię wymienionego materiału w ilości około 0,5-2 ml/cm² materiału, korzystnie 1 ml/10 cm² materiału.

W przykładzie wykonania dla zastosowania według wynalazku, materiał jest przed traktowaniem roztworem kwasu glikolowego wstępnie suszony przez około 15-20 minut.

Korzystnie, materiałem przeznaczonym do użytku w kontakcie z wodą jest odzież nurkowa, surfingowa i/lub windsurfingowa, korzystnie neoprenowa.

Rozwiązanie według wynalazku zakłada wykorzystanie niewielkich stężeń kwasu glikolowego dyfundującego z chronionej powierzchni. Zastosowanie kwasu glikolowego według wynalazku w szczególności ma na celu ochronę specjalistycznej odzieży przeznaczonej do kontaktu ze środowiskami wodnymi przed powstawaniem biofilmów tworzonych przez bakterie wodne na jej powierzchniach i wewnątrz struktury materiału, z którego jest wykonana. Biofilmy tworzone w porowatej strukturze materiału mogą być siedliskiem bakterii potencjalnie chorobotwórczych (np. Aeromonas hydrophila), jak również wpływać negatywnie na higienę i komfort użytkowania odzieży np. przez powstawanie nieprzyjemnego zapachu, będącego efektem bakteryjnego rozkładu związków organicznych. Choć opisywany preparat

PL 232 885 B1 może służyć w szczególności do ochrony odzieży przeznaczonej do kontaktu z wodą, takiej jak kombinezony neoprenowe, np. nurkowe, surfingowe, windsurfingowe, czapki neoprenowe, buty neoprenowe, rękawiczki neoprenowe itp.), to może być on wykorzystywany również do ochrony innych materiałów poddawanych cyklom zanurzania i wysychania. Takimi materiałami mogą być na przykład stroje kąpielowe, ręczniki, ale także różnego rodzaju materiały uszczelniające lub materiał powierzchni, przeznaczonych do użytkowania w wodzie lub z innych przyczyn poddawanych cyklom zanurzania w wodzie i wysychania.

Nowatorskim aspektem rozwiązania według wynalazku jest to, iż w założeniu naśladuje ono mechanizmy występujące w przyrodzie z użyciem związków chemicznych wytwarzanych naturalnie przez mikroorganizmy bytujące w ekosystemach wodnych. Na podkreślenie zasługuje fakt, że kwas glikolowy w niewielkich stężeniach jest nietoksyczny również dla organizmów wodnych, w tym bakterii. Nie zabija bakterii, a jedynie hamuje ich naturalną tendencję do kolonizacji powierzchni. Dzięki temu na materiałach przeznaczonych do użytku w wodzie (np. korzystnie piankach neoprenowych) nie będą formowane trwałe i trudne w usunięciu biofilmy bakteryjne. Jest to rozwiązanie odmienne w porównaniu z większością używanych współcześnie środków anty-biofilmowych, które zapobiegają rozwojowi bakterii w oparciu o zahamowanie ich aktywności metabolicznej. Są to często środki bakteriobójcze, nieobojętne dla funkcjonowania środowiska naturalnego. Środki tego typu, powodując śmierć mikroorganizmów, mogą prowadzić do uwolnienia wewnątrzkomórkowych toksyn, np. hepatotoksyn, mikrocystyn czy dermatotoksyn z komórek cyjanobakterii. W przypadku proponowanego tu rozwiązania ten problem nie występuje. Kwas glikolowy w proponowanym stężeniu jest nietoksyczny dla człowieka, a jego skuteczne działanie nie wymaga płukania odzieży piankowej po zastosowaniu preparatu jak ma to miejsce w przypadku innych preparatów do konserwacji pianek. Sposób ochrony materiałów i zastosowanie kwasu glikolowego według wynalazku, w dodatku w bardzo niskich stężeniach, do ochrony materiałów zanurzanych w wodzie, w szczególności odzieży przeznaczonej do kontaktu z wodą, umożliwiając skuteczne zabezpieczenie takich materiałów przed kolonizacją i tworzeniem bioflimów przez bakterie, równocześnie nie zaburza równowagi ekologicznej ekosystemu wodnego i przyczynia się do ochrony środowiska naturalnego zbiorników wodnych.

Sposób użycia preparatu kwasu glikolowego według wynalazku umożliwia jego łatwą aplikację, nawet w terenie bez konieczności dostępu do bieżącej czystej wody. Polega ona korzystnie na spryskaniu preparatem - roztworem kwasu glikolowego w jałowej wodzie w stężeniu w zakresie około 0,5-15 mg/l, materiału, w szczególności odzieży, na przykład neoprenowej, korzystnie poprzez spryskanie preparatem roztworem kwasu glikolowego w stężeniu w zakresie około 0,5-15 mg/l, w jałowej wodzie przy pomocy atomizera. W przykładzie wykonania zastosowania preparatu roztworu kwasu glikolowego, materiał (np. odzież) po użyciu (np. po zanurzeniu w wodzie) należy lekko podsuszyć, na przykład przez ok. 15-20 min, a następnie należy spryskać równomiernie materiał cienką warstwą (korzystnie około 1 ml/10 cm² materiału) roztworu kwasu glikolowego w stężeniu w zakresie około 0,5-15 mg/l, w jałowej wodzie, korzystnie wodzie destylowanej, a następnie i pozostawić materiał do wyschnięcia. Nasączony w ten sposób materiał po adsorpcji roztworu kwasu glikolowego chroniony jest przed tworzeniem biofilmów przez bakterie obecne w wodzie uwięzionej w strukturze materiału, aż do jego całkowitego wyschnięcia. Ponieważ kwas glikolowy w niewielkich stężeniach nie stanowi zagrożenia dla środowiska naturalnego i człowieka (stosuje się go m.in. w licznych kosmetykach i jest dopuszczony do kontaktu ze skórą w stężeniach wyższych niż w rozwiązaniach według niniejszego wynalazku), nie wymagane jest przepłukanie materiału przed ponownym użyciem.

Preparat obejmujący roztwór kwasu glikolowego w jałowej wodzie stosowany w sposobie ochrony materiałów i wykorzystywany w takim zastosowaniu może opcjonalnie zawierać także dodatkowe składniki pomocnicze i/lub substancje zapachowe. Środkami pomocniczymi mogą być na przykład znane w tanie techniki środki dyspergujące, enzymy, na przykład takie jak stosowane w preparatach przeciwbakteryjnych lub czyszczących, substancje buforujące, składniki kosmetyczne itp. Korzystnie, preparat obejmujący roztwór kwasu glikolowego, przeznaczony do stosowania w szczególności do materiałów mających mieć kontakt ze skórą, takich jak odzież narażona na kontakt z wodą, może zawierać dodatkowe składniki pomocnicze stosowane w znanych w stanie techniki preparatach kosmetycznych, w tym w szczególności składniki pochodzenia roślinnego. Korzystnie, preparat obejmujący roztwór kwasu glikolowego w jałowej wodzie stosowany w sposobie ochrony materiałów i wykorzystywany w takim zastosowaniu może być pakowany w pojemnikach z atomizerem (spryskiwaczem), na przykład w objętości 0,5 I. Korzystnie pojemnik z atomizerem może mieć wydajność około 1 ml płynu na 1 przyciśniecie przycisku spryskiwacza.

PL 232 885 B1

Rozwiązanie według wynalazku może być wykorzystywane na przykład do odzieży narażonej na kontakt z wodą zasiedlaną przez mikroorganizmy (np. strojów nurkowych, windsurfingowych). Taka odzież po użyciu do momentu całkowitego wyschnięcia narażona jest na kolonizacje porowatych powierzchni przez drobnoustroje żyjące w wodzie (także chorobotwórcze). To właśnie w tym momencie, gdy odzież pozostawiona jest bez przepływu wody, często nie w pełni wysuszona, transportowana z miejsca użycia do miejsca przechowywania, procesy kolonizacyjne odzieży przez bakterie mogą być najwydajniejsze. Prowadzi to do zasiedlenia odzieży przez bakterie i w konsekwencji do obniżania higieny jej użycia. Rozwiązania według wynalazku przeciwdziałają temu negatywnemu zjawisku.

Rozwiązania według niniejszego wynalazku wykorzystują naturalne mechanizmy inhibicji tworzenia biofilmów przez bakterie, roztwór kwasu glikolowego w proponowanych niskich stężeniach nie zabija mikroorganizmów, przez co nie istnieje ryzyko uwolnienia toksycznych związków z rozpadających się martwych bakterii i cyjanobakterii.

Kwas glikolowy w proponowanych niskich stężeniach jest nietoksyczny dla środowiska i ludzi.

Jest to niedrogi sposób ochrony materiałów, przeznaczonych do użytku w kontakcie z wodą, gdyż koszt wytwarzania preparatu stosowanego w sposobie zastosowania według wynalazku jest stosunkowo niewielki.

Preparat kwasu glikolowego stosowany według wynalazku pozwala chronić materiał przeznaczony do użytkowania w kontakcie z wodą, korzystnie odzież, w kluczowym momencie - niedługo po użyciu, w szczególności gdy w terenie nie jest możliwe dokładne, natychmiastowe upranie i/lub wysuszenie. Użycie preparatu kwasu glikolowego może chronić materiały, korzystnie odzież, w transporcie przed trwałym zasiedleniem przez bakterie pochodzące z wody, w której materiał był używany.

Krótki opis figur

Fig. 1 to zdjęcia mikroskopowe porównujące obraz mikroorganizmów kolonizujących powierzchnię emitującą kwas glikolowy (A) i nieemitującą kwasu glikolowego (B).

Fig. 2 przedstawia względną liczebność bakterii obecnych na powierzchni woreczka dializacyjnego o długości 10 cm po ich odczepieniu w procesie sonikacji (w obj. 20 ml), osadzeniu 3 ml na filtrze poliwęglanowym i obserwacji w polu widzenia o powierzchni 5519,02 gm², dla powierzchni, z której emitowane są wzrastające stężenia kwasu glikolowego.

Fig. 3 przedstawia aktywność potencjalną maksymalną aminopeptydazy związanej z obecnością bakterii kolonizujących powierzchnię filtrów emitujących wzrastające stężenia kwasu glikolowego.

Fig. 4 to porównanie obrazów mikroskopowych powierzchni pianki neoprenowej pokrytej włóknami polipropylenowymi poddawanej działaniu preparatu zgodnie ze sposobem użycia i nie poddanej działaniu preparatu, (pow. 400x, barwione DAPI).

Fig. 5 to porównanie liczebności bakterii (średnia z 15 pól widzenia o pow. 5519,02 gm²) zwizualizowanych na powierzchni pianki poddanej działaniu preparatu i nie poddanej działaniu preparatu w czasie trwania eksperymentu.

Fig. 6 przedstawia liczebność bakterii obecnych na powierzchni filtrów zamykających zbiorniki z wodą w wariantach z dodatkiem: azydku sodu (0,3% - inhibicja aktywnej kolonizacji filtra), ekstraktu glonowego X5 (Ext. Glon. X5 - pięciokrotnie zagęszczony w przesączu wody jeziorowej przez filtr 0,2 gm ekstrakt glonów z J. Mikołajskiego), kontrolny (brak jakiegokolwiek wzbogacenia), z podłożem LB (wzbogacenie w podłoże LB, 5 mg/l), z kwasem glikolowym (wzbogacenie w kwas glikolowy, 5 mg/l), z glukozą (wzbogacenie glukozą, 5 mg/l), po 48 godz. inkubacji.

Fig. 7 przedstawia zmiany struktury taksonomicznej bakterii odnajdowanych na powierzchni filtrów zamykających naczynia z wodą, dla poszczególnych wariantów z Fig. 6.

Przykłady

P r z y k ł a d 1

Wpływ zmian stężeń gradientu kwasu glikolowego na kolonizacje powierzchni - hamowanie kolonizacji powierzchni woreczków dializacyjnych zawierających wzrastające stężenia kwasu glikolowego.

Woreczki dializacyjne wypełniono przesączoną przez filtr poliwęglanowy (Millipore) o średnicy porów 0,2 gm, zautoklawowaną woda jeziorową (J. Mikołajskie, okres letniej wegetacji, Lipiec 2014 r.) zawierającą następujące wzrastające stężenia jałowego kwasu glikolowego - 0, 0,25, 0,5 i 1 mg/l. Tak przygotowane woreczki w 3 powtórzeniach zawieszono w strefie epilimnionu J. Mikołajskiego i pozostawiono na okres 5 dni. Po tym okresie powierzchnię (2 cm²) woreczków utrwalono w oparach formaliny, wybarwiono DAPI o stężeniu 1 gg/ml i wysuszono. Powierzchnię woreczków obserwowano pod mikroskopem epifluorescencyjnym Nikon Eclipse 400. Fotografie wykonano przy powiększeniu 1000x z użyciem kamery Nikon DXM1200F i oprogramowania Nikon NIS Element (Nikon Corporation).

PL 232 885 B1

W celu dokładnej ilościowej oceny liczebności bakterii na powierzchni woreczka, 10 cm fragmenty woreczków dializacyjnych umieszczono w 5 ml roztworu pirofosforanu sodu w wodzie dejonizowanej (finalne stężenie pirofosforanu sodu w próbkach: 50 mmol I^-1) w celu zmniejszenia napięcia powierzchniowego na powierzchni woreczka. Tak przygotowane próbki umieszczano w lodzie i po 20 min poddano łagodnej sonikacji na najniższym zakresie mocy sonikatora typu UDM-10. (6 pięciosekundowych impulsów, moc 300 W, 22 μm, przerwa pomiędzy impulsami 40 s). Pozwoliło to na odczepienie bakterii osiadłych, nie prowadząc do dezintegracji komórek bakteryjnych. Liczbę bakterii po sonikacji określano wg Porter i Feig (1980) metodą bezpośredniego liczenia pod mikroskopem epifluorescencyjnym (Nikon E400) po osadzeniu odczepionych bakterii na filtrach poliwęglanowych (0,2 μm Nuclepore, black) i wybarwieniu DAPI (4’,6’- diamidino-2-phenylindole, końcowe stężenie w próbce 1 μg/ml).

Na podstawie przeprowadzonego eksperymentu określono efektywne stężenie kwasu glikolowego zapobiegające intensywnej kolonizacji powierzchni przez bakterie.

Wyniki

Przeprowadzone badania wykazały, iż obecność kwasu glikolowego (w stężeniach od kilku do kilkunastu mg na litr) na eksperymentalnych powierzchniach modelowych znacznie obniża kolonizację tych powierzchni przez bakterie wodne. Na Figurach 1A i 1B przedstawiono mikrofotografie obrazujące porównanie gęstości kolonizacji zanurzonej w wodach jeziorowych (przez okres 5 dni) powierzchni woreczka dializacyjnego, z której wydzielany był kwas glikolowy (Fot. 1A, gradient stężenia od 1 mg/l) z powierzchnią, z której nie był on wydzielany (Fig. 1B). Szczegółowa analiza kolonizacji powierzchni wykazała, iż liczebność kolonizujących ją bakterii malała wraz ze wzrostem stężenia emitowanego przez powierzchnię kwasu glikolowego (Fig. 2).

P r z y k ł a d 2

Wpływ obecności gradientu kwasu glikolowego na aktywność proteolityczna bakterii kolonizujących powierzchnie.

Autoklawowaną, przesączoną przez filtr 0,2 μm wodę jeziorową (sierpień 2015, J. Mikołajskie) zawierającą wzrastające stężenia jałowego kwasu glikolowego (0, 0,5, 1 i 2 mg/l) wypełniono szereg naczyń typu Falkon 50 ml (w 3 powtórzeniach) i zamknięto je filtrem poliwęglanowym o średnicy porów 0,02 μm. Naczynia umieszczono mezokosmie 10 l zawierającym wodę pobraną z powierzchniowej warstwy J. Mikołajskiego (Sierpień 2015 r.). Układy inkubowano w temp 20-24°C przez okres 72 h. Po tym okresie filtry pocięto i umieszczono w 3,9 ml jałowej, sączonej przez filtr 0,2 μm wody jeziorowej. Następnie do tak przygotowanej próby dodano 0,1 ml substratu (L-leucine-4-methyl-coumarinylamide hydrochloride, LMCA) uzyskując końcowe stężenie substratu 15 μM. Natychmiast po dodaniu LMCA mierzono fluorescencję próbek przy ekscytacji 380 nm i emisji 440 nm (Kiersztyn i wsp. 2007). Uzyskane w czasie t = 0 wyniki stanowiły próbę ślepą dla badanych próbek. Próbki inkubowano w temp 20-24°C przez 60 minut w zależności od spodziewanego tempa hydrolizy LMCA, po czym mierzono fluorescencję ponownie. Tempo przyrostu stężenia produktu, AMC (aminomethylcumarine) w badanych próbkach wyliczono na podstawie różnicy fluorescencji próbki zmierzonej w czasie t = 0 i po inkubacji, na podstawie przygotowanej uprzednio krzywej wzorcowej. Krzywą wzorcową sporządzono mierząc fluorescencję 8 roztworów kalibracyjnych zawierających AMC, które sporządzono dodając do 3,9 ml wody destylowanej 0,1 ml odpowiednio stężonych roztworów AMC w etanolu tak, by ostatecznie uzyskać stężenia 0,1; 0,5; 1,0; 2,5; 5; 10; 20 i 50 nmol I^-1. Pomiary fluorescencji próbek wykonano na spektrofluorymetrze Shimadzu RF 1501. Uzyskano tempo rozkładu substratu przez bakteryjne aminopeptydazy leucynowe wyrażone w nMol/godz.

Wyniki

Wykazano, że aktywność enzymatyczna bakterii stwierdzonych na powierzchniach filtrów poliwęglanowych, malała wraz ze wzrostem stężenia emitowanego przez te powierzchnie kwasu glikolowego (Fig. 3).

P r z y k ł a d 3

Ocena skuteczności aplikacji preparatu w postaci aerozolu w celu ochrony materiału neoprenowego poddawanego cyklicznie działaniu wody jeziorowej przed tworzeniem na nim biofilmów bakteryjnych.

Do eksperymentu wykorzystano fragmenty odzieży windsurfingowej, 10 cm² fragmenty pianki neoprenowej o grubości 1,5 mm pokrytej włóknami polietylenowymi. Fragmenty pianki umieszczano w 5 litrowych mikrokosmach zawierających wodę pochodzącą z powierzchniowej warstwy (gł. 1,5 m ) eutroficznego J. Mikołajskiego (sierpień 2016). Wodę wymieniano raz na dobę o godzinie 10:00 codziennie w czasie trwania eksperymentu od 03.08.2016 do 09.08.2016. Fragmenty pianki poddawanej działaniu preparatu (P) oraz kontrolny (K) umieszczano w wodzie pobranej z jeziora 3 razy

PL 232 885 B1 na dobę na okres 2-3 godzin. Po upływie czasu obecności w wodzie fragmenty były wyjmowane z wody i pozostawione w temperaturze pokojowej do lekkiego podeschnięcia przez okres 15 min w temp. ok. 20°C. Po tym czasie fragment P spryskiwano aerozolem (1 spryskanie na 10 cm² - 0,5 ml płynu) zawierającym kwas glikolowy o stężeniu 10 mg/l w jałowej wodzie destylowanej. Fragmentu kontrolnego K nie spryskiwano. Fragmentom pozwalano schnąć do kolejnego umieszczenia w wodzie jeziorowej. Po 3, 5 i 6 dniach trwania procedury eksperymentalnej wycinano 1 cm skrawki pianki, suszono i barwiono poprzez naniesienie na podsuszony fragment preparatu DAPI (2 μg/ml). Po 10 min fragmenty pianki obserwowano i fotografowano pod mikroskopem epifluorescencyjnym Nicon Eclipse 400 wyposażonym w kamerę cyfrową. Zdjęcia wykonano przy powiększeniu 400x. Obraz mikroskopowy przeanalizowano z użyciem oprogramowania Nikon NIS-Elements AR. Dokonano analizy liczebności mikroorganizmów obecnych na powierzchni chronionej preparatem i powierzchni fragmentów kontrolnych.

Wyniki

Fig. 4 przedstawia serię fotografii powierzchni pianki Kontrolnej (K) oraz fragmenty poddane działaniu preparatu (P) w okresie trwania testu. W wariancie nie poddanym działaniu preparatu już po 4 dniach cyklicznej ekspozycji na mikroorganizmy żyjące w wodzie jeziorowej zaobserwowano powstawanie licznych struktur o charakterze bakteryjnych biofilmów. Zjawisko takie nie wystąpiło w wariancie z materiałem zabezpieczanym preparatem. Po 6 dniach na powierzchni materiału kontrolnego zaobserwowano obecność licznych, często dużych bakterii (długość komórek >4 μm). Włókna materiału zabezpieczanego zawierały jedynie nieliczne, drobne mikroorganizmy. Analiza liczebności bakterii obserwowanych na jednostronnej powierzchni włókna wykazała jednoznacznie wielokrotnie wyższą (ponad 17-krotnie czwartego dnia ekspozycji na bakterie wodne) liczebność bakterii na włóknach niezabezpieczonych preparatem niż fragmentach zabezpieczonych preparatem (Fig. 5).

Eksperyment dowiódł, że zastosowanie preparatu według wynalazku skutecznie zabezpieczało materiał pianki neoprenowej przed kolonizacją przez bakterie w czasie jej symulowanej intensywnej eksploatacji.

P r z y k ł a d 4

Porównanie wpływu emisji kwasu glikolowego z emisją innych związków chemicznych na kolonizację powierzchni przez bakterie.

Próby pobrano w lipcu 2015 r. ze strefy fotycznej J. Mikołajskiego. Przygotowano 50 ml, jałowe naczynka typu Falcon, zawierające sączoną przez filtr 0,2 μm wodę ze strefy powierzchniowej J. Mikołajskiego. Wodę w naczynkach wzbogacono dodatkami wymienionym poniżej lub pozostawiono bez wzbogacenia, po czym szczelnie zamknięto filtrem poliwęglanowym (Millipore, 0,2 μm). Przygotowano następujące warianty: Azydek sodu (0,3% - inhibicja aktywnej kolonizacji filtra), Ekstrakt glonowy X5 (Ext. Glon. X5 - pięciokrotnie zagęszczony w przesączu wody jeziorowej przez filtr 0,2 μm ekstrakt glonów z J. Mikołajskiego), Kontrola (brak jakiegokolwiek wzbogacenia). Podłoże LB (wzbogacenie w podłoże LB, 5 mg/l), Kwas glikolowy (wzbogacenie w kwas glikolowy, 5 mg/l), Glukoza (wzbogacenie glukozą, 5 mg/l). Tak przygotowane pojemniki umieszczono w wodzie J. Mikołajskiego pozbawionej uprzednio biofilmów przez sączenie przez filtr poliwęglanowy o średnicy porów 3,0 μm. Z powierzchni filtrów emitowane były związki chemiczne, w które wzbogacono poszczególne warianty. Po 48 godz. inkubacji policzono bakterie na powierzchni filtrów zamykających zbiorniki. Filtry wybarwiono DAPI o stężeniu 1 μg/ml i wysuszono. Powierzchnię filtrów obserwowano pod mikroskopem epifluorescencyjnym Nikon Eclipse 400. Fotografie wykonano przy powiększeniu 1000x z użyciem kamery Nikon DXM1200F i oprogramowania Nikon NIS Element (Nikon Corporation).

Wyizolowano także DNA mikroorganizmów kolonizujących filtry w każdym z badanych wariantów z wykorzystaniem kitów do ekstrakcji DNA bakteryjnego firmy EURx zgodnie z procedurą producenta.

Dokonano analizy sekwencji kodującej 16sRNA mikroorganizmów kolonizujących filtry umożliwiającą ich klasyfikacje filogenetyczną. Analiza metagenomiczna genu kodującego 16S rRNA została przeprowadzona na bazie hiperzmiennego regionu V3-V4 genu 16S rRNA. Do amplifikacji wybranego regionu i przygotowania biblioteki zostały użyte specyficzne sekwencje komercyjnie dostępnych starterów 341F oraz 785R (Illumina, http://support.illumina.com/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf; Klindworth A, et al. (2013) Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencingbased diversity studies. Nucleic Acids Res 41(1)). Reakcję PCR przeprowadzono z użyciem Q5 Hotstart High-FidelityDNA Polymerase (NEBNext), warunki reakcji zgodnie z zaleceniami producenta.

PL 232 885 B1

Sekwencjonowanie odbyło się na sekwenatorze MiSeq, w technologii paired-end (PE), 2x250nt, z użyciem kitu v2 Illumina. Analiza danych została przeprowadzona na aparacie MiSeq z użyciem oprogramowania MiSeq Reporter (MSR) v2.4; protokół 16S Metagenomics. Analiza składała się z trzech etapów:

1) automatyczne demultipleksowanie próbek,

2) generowanie plików fastq, zawierających surowe odczyty,

3) klasyfikacja odczytów typu paired-end, w poszczególnych kategoriach taksonomicznych.

Protokół 16S Metagenomics zapewnia klasyfikację odczytów do poziomu gatunku w obrębie uzyskanych 247 rodzin (1333 przeanalizowane gatunki), opierając się na bazie danych sekwencji referencyjnych Greengenes v13_5, zmodyfikowanej przez llluminę.

Przygotowanie referencyjnej bazy danych sekwencji referencyjnych obejmowało:

1) odfiltrowanie sekwencji o długości krótszej niż 1250 par zasad (pz),

2) odfiltrowanie sekwencji zawierających więcej niż 50 zasad zdegenerowanych (M, R, W, S, Y, K, V, H, D, B, N),

3) odfiltrowanie sekwencji niepełnie sklasyfikowanych (brak klasyfikacji do poziomu rodzaju lub gatunku).

Analizy aglomeracyjne i porównania średnich przeprowadzono w programie Statistica (StatSoft corp.). Do analizy aglomeracyjnej użyto algorytmu odległości Manhattan i wiązania metodą Ward na podstawie udziału poszczególnych gatunków sklasyfikowanych analizą Illumina w oparciu o bazy GreenGenes.

Wyniki

Wykazano, że kwas glikolowy emitowany z powierzchni znacząco zmniejszał średnią liczebność bakterii kolonizującą powierzchnie w porównaniu z kontrolą i innymi wariantami emitującymi różnorodne związki organiczne (Fig. 6). Różnice te były istotne statystycznie (Test t-studenta, p<0,05). W wariancie z kwasem glikolowym liczebność bakterii była jedynie nieznacznie wyższa niż na powierzchni emitującej silnie toksyczny, nieorganiczny związek - azydek sodu, bakteriobójczy środek konserwujący. Kwas glikolowy o stężeniu 5 mg/l emitowany z powierzchni nie tylko skutecznie ograniczał kolonizację w porównaniu do innych badanych związków organicznych, ale też wpływał na zmianę struktury taksonomicznej odnajdowanych na powierzchni bakterii (Fig. 7). Np. w wariancie z kwasem glikolowym odnajdowano na powierzchni kolonizowanej mniejszy udział bakterii należących do, zawierającej liczne mikroorganizmy patogenne, typowej dla tworzenia biofilmów, rodziny Flavobacteriaceae (2,3% odczytów), niż w innych wariantach (Ekstrakt glonowy X5 - 31,5%, Kontrola - 7,93%, Podłoże LB - 4 %, Glukoza - 7,77%). Udział ten był jedynie nieznacznie większy niż w wariancie, w którym emitowany był toksyczny dla bakterii azydek sodu (1,68%) i nie zachodził proces intensywnej, aktywnej kolonizacji powierzchni. Podobnie sytuacja wygląda w przypadku rodziny Legionellaceae, zawierającej potencjalnie patogenne bakterie będące przyczyną gorączki Pontiac oraz niebezpiecznej dla życia legionellozy. W wariancie z emisją kwasu glikolowego oraz azydku sodu nie stwierdzono na powierzchni występowania przedstawicieli tej rodziny (0,0%) podczas gdy w pozostałych wariantach byli oni obecni (Ekstrakt glonowy X5 - 0,17%, Kontrola - 0,15%, Podłoże LB - 0,9%, Glukoza - 0,22%). Z kolei znaczną różnicę zaobserwowano w udziale klasy Alfapnoteobacteria, której przedstawiciele występowali liczniej w wariancie z kwasem glikolowym (16,35%) niż w pozostałych wariantach (Ekstrakt glonowy X5 - 11,2%, Kontrola - 6,4%, Podłoże LB - 8,43%, Glukoza - 7,69%), podobnie zaś dla wariantu z hamującym tworzenie biofilmów, silnie toksycznym azydkiem sodu (15,46%). Przykład 4 dowiódł, że emisja niewielkich stężeń kwasu glikolowego, nie tylko, co wykazano we wszystkich przedstawionych przykładach, efektywnie ogranicza kolonizację powierzchni przez bakterie, ale też zmienia strukturę filogenetyczną nielicznych bakterii obecnych na tej powierzchni. Wydaje się, że obecność bakterii na powierzchni emitującej kwas glikolowy może być głównie skutkiem biernej adsorpcji unoszących się w toni wodnej bakterii, a nie, szczególnie niepożądanej, aktywnej kolonizacji przez bakterie tworzące biofilmy.

PL 232 885 B1

Bibliografia

Eom SH1, Kim YM, Kim SK. (2012). Antimicrobial effect of phlorotannins from marine brown algae. 50: 3251-5.

Kiersztyn B, Siuda W, Chróst RJ (2012). Persistence of bacterial proteolytic enzymes in Lake ecosystems. FEMS Micro. Eco. 80: 124-134.

Porter KG, Feig YS. 1980. The use of DAPI for identifying and counting aquatic microflora. Limnol. Oceanogr. 25: 943-948.

Punyasl B., Wright PC. (2004) Exploitation of marine algae: biogenic compounds for potential antifouling applications. Planta 219: 561-578.

Stabenau H. and Winkler U. (2005) Antimicrobial effect of phlorotannins from marine brown algae. Phy. Plant. 123: 235-245. 2005.

Claims (14)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób ochrony materiałów, przeznaczonych do użytku w kontakcie z wodą, przed kolonizacją przez bakterie i/lub tworzeniem na ich powierzchni biofilmów bakteryjnych, znamienny tym, że wymienione materiały traktowane są roztworem kwasu glikolowego o stężeniu w zakresie 0,5-15 mg/l w jałowej wodzie, korzystnie wodzie destylowanej.
2. 2. Sposób ochrony materiałów według zastrz. 1, znamienny tym, że kwas glikolowy jest w stężeniu 10 mg/l.
3. 3. Sposób ochrony materiałów według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że roztwór kwasu glikolowego zawiera dodatkowo składniki pomocnicze i/lub substancje zapachowe.
4. 4. Sposób ochrony materiałów według zastrz. 1-3, znamienny tym, że roztwór kwasu glikolowego pakowany jest w atomizerze a traktowanie materiałów odbywa się przez ich spryskanie.
5. 5. Sposób ochrony materiałów według zastrz. 1-4, znamienny tym, że roztwór kwasu glikolowego nanosi się na powierzchnię wymienionego materiału w ilości 0,5-2 ml/cm² materiału, korzystnie 1 ml/10 cm² materiału.
6. 6. Sposób ochrony materiałów według zastrz. 1-5, znamienny tym, że materiał po kontakcie z wodą jest przed traktowaniem roztworem kwasu glikolowego wstępnie suszony przez 15-20 minut.
7. 7. Sposób ochrony materiałów według zastrz. 1-6, znamienny tym, że materiałem przeznaczonym do użytku w kontakcie z wodą jest odzież nurkowa, surfingowa i/lub windsurfingowa, korzystnie neoprenowa.
8. 8. Zastosowanie kwasu glikolowego do ochrony materiałów, przeznaczonych do użytku w kontakcie z wodą, przed kolonizacją przez bakterie i/lub tworzeniem na ich powierzchni biofilmów bakteryjnych, przy czym kwas glikolowy stosowany jest w stężeniu 0,5-15 mg/l, w postaci roztworu w jałowej wodzie, korzystnie wodzie destylowanej.
9. 9. Zastosowanie kwasu glikolowego do ochrony materiałów według zastrz. 8, znamienne tym, że kwas glikolowy jest w stężeniu 10 mg/l.
10. 10. Zastosowanie kwasu glikolowego do ochrony materiałów według zastrz. 8 albo 9, znamienne tym, że roztwór kwasu glikolowego zawiera dodatkowo składniki pomocnicze i/lub substancje zapachowe.
11. 11. Zastosowanie kwasu glikolowego do ochrony materiałów według zastrz. 8-10, znamienne tym, że roztwór kwasu glikolowego pakowany jest w atomizerze.
12. 12. Zastosowanie kwasu glikolowego do ochrony materiałów według zastrz. 8-11, znamienne tym, że roztwór kwasu glikolowego nanosi się na powierzchnię wymienionego materiału w ilości 0,5-2 ml/cm² materiału, korzystnie 1 ml/10 cm² materiału.
13. 13. Zastosowanie kwasu glikolowego do ochrony materiałów według zastrz. 8-12, znamienne tym, że wymieniony materiał jest przed traktowaniem roztworem kwasu glikolowego wstępnie suszony przez 15-20 minut.
14. 14. Zastosowanie kwasu glikolowego do ochrony materiałów według z zastrz. 8-13, znamienne tym, że materiałem przeznaczonym do użytku w kontakcie z wodą jest odzież nurkowa, surfingowa i/lub windsurfingowa, korzystnie neoprenowa.