PL233143B1 - Pochodna 1-(piperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu funkcjonalizowana aminokwasem - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy nowej pochodnej 1-(piperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu sfunkcjonalizowanej wybranym aminokwasem.

Wynalazek rozwiązuje zagadnienie opracowania nowych środków o aktywności przeciwnowotworowej opartych na bazie 9,10-antrachinonu.

Choroby nowotworowe stały się główną przyczyną umieralności, szczególnie w XXI wieku głównie dlatego, że są one bardzo trudne do zdiagnozowania i wyleczenia. Związki posiadające w swej strukturze szkielet 9,10-antrachinonu zaliczane są do najliczniejszej grupy antybiotyków nazywanych antracyklinami, bądź antybiotykami antrachinonowymi. Wśród stosowanych pochodnych antrachinonów można wyróżnić antracykliny (doksorubicyna, daunorubicyna, idarubicyna, epirubicyna, aklarubicyna, mitoksantron i ich syntetyczne pochodne). Leki te stosowane są głównie w terapii w leczeniu ostrych białaczek, chłoniaków i różnych guzów litych, w tym raka piersi, płuc, tarczycy, jajnika oraz raka tkanek miękkich (Zajca A., Gorczyca M. Chemia leków. PZWL, Warszawa, 1999.).

Antybiotyki antracyklinowe są najliczniejszą grupą antybiotyków cytostatycznych hamujących podział komórek stosowanych najczęściej w terapii przeciwnowotworowej. Zaproponowano kilka różnych mechanizmów wyjaśniających biologiczne działanie tych antybiotyków. Pierwszy z nich oparty jest na interkalacji, czyli wtłaczaniu chemioterapeutyku pomiędzy dwie sąsiadujące ze sobą pary zasad w DNA. Interkalacja w helisę DNA może spowodować jej wydłużenie lub pęknięcie oraz zmianę właściwości biochemicznych, co w konsekwencji prowadzi do zahamowania zdolności do replikacji i transkrypcji (F. Gieseler, H. Biersack, T. Brieden, J. Manderscheid, V. Nubler, Annals of Hematology, 1994, 69, 13-17).

Cytostatyki oparte na strukturze 9,10-antrachinonu są inhibitorami topoizomeraz, enzymów biorącymi udział w procesie replikacji DNA. Hamowanie aktywności enzymów potrzebnych do replikacji DNA przez ich inhibitory prowadzi do stabilizacji kompleksu trójskładnikowego DNA-enzym-inhibitor. W procesie mitozy kompleks ten powoduje trwałe przerwanie nici prowadzące do apoptozy komórki (Y-H. Hsiang, L. Liu, Cancer Res. 1988, 48, 1722-1726).

Dodatkowo związki te związanie z błoną komórkową mogą mieć istotny wpływ na płynność błon komórkowych, transport jonów, a także zakłócają równowagę procesów biochemicznych w komórce. Właściwości redoks antybiotyków antracyklinowych mogą doprowadzić do wytworzenia wolnych rodników lub rodników hydroksylowych, które powodują uszkodzenie DNA, co w konsekwencji prowadzi do zablokowania procesu transkrypcji (Frederick C. A., Williams L. D., Ughetto G., Marel G. A., Boom J. H., Rich A., Wang A. H. Biochemistry, 1990, 29, 2538-2549).

Bardzo istotne jest prowadzenie prac badawczych nad nowymi pochodnymi antybiotyków antracyklinowych, w celu opracowania serii nowych związków chemicznych charakteryzujących się wysoką aktywnością przeciwnowotworową przy jednocześnie niskiej toksyczności. Ważne jest również ograniczenie kardiotoksyczność nowych potencjalnych leków. Jednym ze sposobów ograniczenia kardiotoksyczności jest synteza nowych pochodnych opartych na szkielecie 9,10-antrachinonu modyfikowanych aminokwasami lub peptydami. Wprowadzenie do badanych molekuł aminokwasów może dodatkowo zwiększyć ich aktywność. (Gatto B., Zagotto G., Sissi C., Cera C., Uriarte E., Palu G., Capranico G., Palumbo M., Journal of Medicinal Chemistry, 1996, 39, 3114-3122).

Badania literaturowe wyraźnie sugerują, iż cząsteczki zawierające aminokwasy bądź peptydy są biologicznie aktywne i mogą być stosowane, jako chemioterapeutyki. Za pośrednictwem aminokwasów lub peptydów można swobodnie wpływać na aktywność całej molekuły w wyniku wprowadzenia do układu dodatkowego ładunku, układu heterocyklicznego lub aktywnego fragmentu peptydowego wykazującego aktywność przeciwnowotworową (Varvaresou A., Iakovou K., Gikas E., Fichtner I., Fiebig H.H., Kelland L.R., Double J.A., Bibby M.C., Hendriks H.R., Anticancer Research, 2004, 24, 907-920).

Ponadto dołączenie peptydu do antracyklin ułatwia wychwytywanie proleku przez komórki nowotworowe, co więcej takie koniugaty mogą być inhibitorami topoizomerazy I i topoizomerazy II. Topoizomerazy są więc ważnym celem komórkowym w projektowaniu nowych, skutecznych leków przeciwnowotworowych.

Znane i opisane rozwiązania środków o aktywności przeciwnowotworowej i sposobów ich otrzymywania wykazują następujące wady. Wadą antybiotyków antracyklinowych jest ich kardiotoksyczność oraz rozwój oporności w komórkach nowotworowych występująca obok innych działań niepożądanych. Zaburzenia w krążeniu przypisuje się produktom powstającym podczas biotransformacji antracyklin, szczególnie przy redukcji ugrupowań chinonowych do hydrochinonowych. Powstające rodniki tlenowe oraz rodniki hydroksylowe powodują tworzenie struktur nadtlenkowych w lipidach, a ich stopniowy rozkład prowadzi do związków działających uszkadzająco na mięsień sercowy.

PL233 143 Β1

Dlatego też, oczywistą potrzebą współczesnej medycyny jest poszukiwanie nowych związków, potencjalnych chemoterapeutyków przeciwnowotworowych.

Wynalazek rozwiązuje zagadnienie opracowania nowego związku o aktywności przeciwnowotworowej opartego na bazie 9,10-antrachinonu. W wynalazku oparto się na otrzymaniu aminokwasowej pochodnej 1-(piperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu podstawionej w pozycji 4- pierścienia piperazynowego aminokwasem kwasowym.

Nowa pochodna 1-(piperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu funkcjonalizowana kwasowymi aminokwasami charakterystyczna tym według wynalazku, że stanowi ją kwas 1-(4-L-asparaginylopiperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinon o wzorze

OH NHSposób otrzymywania nowej pochodnej 1-(piperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu polega na tym, że w celu otrzymania kwasu 1-(4-L-asparaginylopiperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonowego przeprowadza się reakcję w dichlorometanie w czasie około 24 godzin, przez rozpuszczenie w dichlorometanie - DCM i ochłodzenie do temperatury 0°C 1-(piperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu, rozpuszczenie w drugim naczyniu technologicznym w dichlorometanie - DCM Estru 4-tert-butylowego kwasu -(9-fluorenylometoksykarbonylo)-L-asparaginowego - Fmoc-Asp(OtBu)-OH dodanie środka sprzęgającego w postaci N,N'Dicykloheksylokarbodiimidu - DIC, a następnie przez umieszczenie naczynia technologicznego na czas około 20 minut w temperaturze około -10°C, po czym po jego upływie miesza się będącą mieszaniną reakcyjną zawartość obu naczyń najkorzystniej w mieszalniku zwłaszcza w mieszadle magnetycznym przez czas około 24 godziny i kontroluje przebieg reakcji na płytkach cienkowarstwowej chromatografii cieczowej (ang. Thin Layer Chromatography) TLC, stosując jako układu rozwijający DCM : MeOH w stosunku objętościowym 5 :1, a następnie po upływie około 24 godzin odsącza się powstałe produkty stałe i odparowuje się rozpuszczalnik organiczny najkorzystniej na wyparce próżniowej, a następnie „zdejmuje się” grupy ochronne, znajdujące się zarówno w łańcuchu głównym jak i bocznym L-aminokwasu, stosując odpowiednią znaną kolejność oraz odpowiednie znane preparatywne procedury ich usuwania, przy czym w przypadku zastosowanej do syntezy chronionego kwasu L-asparaginowego Fmoc-Asp(OtBu)-OH - ester 4-tert-butylowy kwasu-(9-fluorenylometoksykarbonylo)-L-asparaginowego), grupa a aminowa w łańcuchu głównym chroniona jest przez grupę -Fmoc - grupa 9-fluorenylometoksy-karbonylowa, natomiast grupa karboksylowa w łańcuchu bocznym przez grupę -tBu - grupa tert-butylowa i w pierwszej kolejności usuwa się osłonę -tBu (grupę tert-butylową), a otrzymany tak osad rozpuszcza się w małej ilości DCM (dichlorometanu) i dodaje się TFA - kwas trifluorooctowy w celu zdjęcia osłony -tBu (grupa tert-butylowa), reakcję prowadza się przez co najmniej 1 godzinę, po czym ponownie odparowuje się rozpuszczalnik organiczny najkorzystniej na wyparce próżniowej, a powstały osad przemywa się eterem dietylowym, a następnie rozpuszcza się w małej ilości DCM - dichlorometanu i dodaje się 10 ml piperydyny w celu zdjęcia osłony -Fmoc - grupa 9-fluorenylometoksy-karbonylowa, prowadząc ten proces przez około 1 godzinę, po upływie której odparowuje się rozpuszczalnik organiczny na wyparce korzystnie próżniowej, a do oczyszczania powstałego produktu wykorzystuje się najlepiej wysokosprawną chromatografię cieczową w układzie faz odwróconych w skali preparatywnej (RP-HPLC), stosując zwłaszcza kolumnę preparatywną Macherey Nagel z wypełnieniem Nucleosil 100-7 C18 i eluentem ACN - acetonitryl i H2O w liniowym gradiencie acetonitrylu 35-85-35%, w czasie 0-20-25 min, stosując przepływ o dynamice około 10 ml/min i detekcję UV przy długości fali około 254 nm.

Związek według wynalazku scharakteryzowano technikami spektroskopowymi i masowymi. Wykonano analizę wykorzystując zestaw analityczny HPLC firmy Schimadzu, używając kolumny (firmy Phenomenex Luna C8(2), 150 x 3 mm, o średnicy ziaren sorbentu 5 μπι i wielkości porów 100 A), w linowym gradiencie rozpuszczalników 0-100% A (A = H2O + 0,1% TFA, B = ACN - acetonitryl + 0,1% TFA - kwas trifluorooctowy, w czasie 15 minut, przy zastosowaniu przepływu 1 ml/min i długości fali 254 nm.

PL233 143 Β1

Nowa pochodna 9,10-antrachinonu została przebadana pod kątem aktywności cytostatycznej również wobec komórek prawidłowych morfologicznie, gdzie do badań zostały użyte komórki prawidłowe mysich fibroblastów BALB/3T3.

Do oceny aktywności cytotoksycznej testowanego związku wobec komórek linii B16, Hs 294T, LoVo, LoVo/DX oraz Balb/3T3 użyto testu SRB mierzącego zahamowanie proliferacji komórek docelowych w 96-godzinnej hodowli in vitro [Skehan et al., J. Natl. Cancer Inst., 82:1107-1112, 1990], W każdym doświadczeniu próbki zawierające określone stężenie preparatu nanoszono w trzech powtórzeniach. Doświadczenia powtarzano co najmniej trzy razy. Dla badanego związku zostało wyznaczone stężenie związku powodujące zahamowanie proliferacji komórek w 50% (IC50).

Z przeprowadzonych badań wynika, że związek według wynalazku wykazuje wysoką aktywność antyproliferacyjną i nie wykazuje lekooporności. Ponadto wykazuje stosunkowo niską toksyczność wobec komórek prawidłowych mysich fibroblastów BALB/3T3, a jednocześnie dość silne działanie w stosunku do badanych linii komórkowych.

Wynalazek jest szczegółowo opisany na przykładzie wykonania.

Przykład

W celu otrzymania kwasu 1-(4-L-asparaginylopiperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonowego przeprowadza się reakcję w dichlorometanie w czasie około 24 godzin, przez rozpuszczenie w DCM - dichlorometan i ochłodzenie do temperatury 0°C 1-(piperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu, oraz równocześnie rozpuszczenie w drugim naczyniu technologicznym w DCM Fmoc-Asp(OtBu)-OH, dodanie środka sprzęgającego w postaci DIC, a następnie przez umieszczenie naczynia technologicznego na 20 minut w temperaturze około -10°C. Po jego upływie miesza się będącą mieszaniną reakcyjną zawartość obu naczyń w mieszadle magnetycznym przez 24 godziny i kontroluje przebieg reakcji na płytkach TLC, stosując jako układ rozwijający DCM : MeOH w stosunku objętościowym 5 : 1. Po upływie 24 godzin odsącza się powstałe produkty stałe i odparowuje się rozpuszczalnik organiczny na wyparce próżniowej, a następnie „zdejmuje się” grupy ochronne, znajdujące się zarówno w łańcuchu głównym jak i bocznym L-aminokwasu, stosując odpowiednią znaną kolejność oraz odpowiednie znane preparatywne procedury ich usuwania. W przypadku zastosowanej do syntezy chronionego kwasu L-asparaginowego (Fmoc-Asp(OtBu)-OH), grupa α-aminowa w łańcuchu głównym jest chroniona przez ugrupowanie -Fmoc, natomiast grupa karboksylowa w łańcuchu bocznym przez grupę -tBu. W pierwszej kolejności usuwa się osłonę -tBu, a otrzymany tak osad rozpuszcza się w małej ilości DCM i dodaje się TFA w celu zdjęcia osłony -tBu, reakcję prowadzi się przez nie mniej jak 1 godzinę, po czym ponownie odparowuje się rozpuszczalnik organiczny na wyparce próżniowej, a powstały osad przemywa się eterem dietylowym, a następnie rozpuszcza się w małej ilości DCM i dodaje się 10 ml piperydyny w celu zdjęcia osłony -Fmoc, prowadząc ten proces przez 1 godzinę. Po upływie tego czasu odparowuje się rozpuszczalnik organiczny na wyparce próżniowej, a do oczyszczania powstałego produktu wykorzystuje się wysokosprawną chromatografię cieczową w układzie faz odwróconych w skali preparatywnej (RP-HPLC), stosując kolumnę preparatywną Macherey Nagel z wypełnieniem Nucleosil 100-7 C18 i eluentem ACN i H2O w liniowym gradiencie acetonitrylu 35-85-35%, w czasie od 0-20-25 min, stosując przepływ o dynamice około 10 ml/min i detekcję UV przy długości fali około 254 nm.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   1. Pochodna 1-(piperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu funkcjonalizowana aminokwasem, znamienna tym, że stanowi ją kwas 1(4-L-asparaginylopiperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonowy o wzorze:

   oh nh₂