PL233362B1 - Chiralne, czwartorzędowe, N-spiro sole amoniowe i ich zastosowanie - Google Patents

Chiralne, czwartorzędowe, N-spiro sole amoniowe i ich zastosowanie

Info

Publication number
PL233362B1
PL233362B1 PL418047A PL41804716A PL233362B1 PL 233362 B1 PL233362 B1 PL 233362B1 PL 418047 A PL418047 A PL 418047A PL 41804716 A PL41804716 A PL 41804716A PL 233362 B1 PL233362 B1 PL 233362B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
mic
mbc
nmr
ome
compounds
Prior art date
Application number
PL418047A
Other languages
English (en)
Other versions
PL418047A1 (pl
Inventor
Anna Bielawska
Krzysztof Bielawski
Katarzyna Leszczyńska
Tamara Daniluk
Zbigniew Kałuża
Olga Michalak
Paweł Czerwiński
Original Assignee
Inst Chemii Organicznej Polskiej Akademii Nauk
Univ Medyczny W Bialymstoku
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inst Chemii Organicznej Polskiej Akademii Nauk, Univ Medyczny W Bialymstoku filed Critical Inst Chemii Organicznej Polskiej Akademii Nauk
Priority to PL418047A priority Critical patent/PL233362B1/pl
Publication of PL418047A1 publication Critical patent/PL418047A1/pl
Publication of PL233362B1 publication Critical patent/PL233362B1/pl

Links

Landscapes

  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia są nowe, chiralne czwartorzędowe, N-spiro sole amoniowe, zwłaszcza pochodne izochinolinowe, oraz ich zastosowanie do profilaktyki i/lub leczenia chorób bakteryjnych.

Description

Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy nowych, chiralnych czwartorzędowych, N-spiro soli amoniowych, zwłaszcza pochodnych izochinolinowych, oraz ich zastosowania do profilaktyki i/lub leczenia chorób bakteryjnych.
Obserwowany w ostatnich latach gwałtowny wzrost liczby szczepów bakteryjnych opornych na stosowane obecnie antybiotyki, stanowi realne zagrożenie epidemiologiczne dla społeczeństwa. Z tego powodu, podejmowane są intensywne badania nad poszukiwaniem nowych leków, skutecznie zwalczających infekcje bakteryjne. Czwartorzędowe sole amoniowe, zarówno pochodzenia naturalnego (np. berberyna), jak i syntetyczne, posiadają bakteriobójcze lub grzybobójcze własności i są stosowane od wielu lat w medycynie, głównie jako środki antyseptyczne (Jennings, M. C.; Minbiole, K. P. C.; Wuest, W. M. ACS Infect. Dis. 2015, 1,288-303).
Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowych związków, które mogą być stosowane w leczeniu infekcji drobnoustrojowych oraz jako środki antyseptyczne. Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze ogólnym A:
OMe
gdzie
Ri oznacza podstawnik metylowy, p-metoksy-fenylowy, p-bromo-fenylowy lub cyklo-heksylowy; R2 oznacza atom wodoru, -OCH2O- lub -OMe;
X' oznacza anion halogenkowy, korzystnie Br;
lub jego dopuszczalna farmaceutycznie sól lub stereoizomer.
Korzystnie, związkiem według wynalazku jest związek o wzorze:
R
OMe
1a: R = H Ib; R = OMe 1c; R = OCH2O
2a; R = H 2b R = OMe 2c; R = OCH2O
3a; R = H
3b; R = OMe
3c; R = OCH2O
4a; R = H 4b, R = OMe 4c; R = OCH2O lub jego dopuszczalna farmaceutycznie sól lub stereoizomer.
Przedmiotem wynalazku jest również związek określony powyżej, do stosowania jako związek bakteriobójczy w leczeniu i zapobieganiu zakażeń bakteryjnych.
Związki według wynalazku otrzymano zgodnie ze sposobem przedstawionym na Schemacie 1:
PL 233 362 Β1
Schemat 1
Sposób syntezy odpowiednich substratów opisano szczegółowo w następujących publikacjach:
Z. Kałuża, D. Mostowicz, G. Dołęga, K. Mroczko i R. Wójcik. Tetrahedron 62, 2006, 943-53 oraz Z Kałuża, D. Mostowicz, G. Dołęga, R. Wójcik. Tetrahedron. 64, 2008, 2321-2328.
Przykłady
W poniższych przykładach przedstawiono otrzymywanie ujawnionych związków.
1. Otrzymywanie aminoalkoholi 10-13
Kwas __ (L)-Winowy
1. NaOMa/MeOH
2. NatO, HjO/MeCN
NaOH HjO/THF
6; R = p-metoksyfenyl
10; R = Me
11; R = 4-metoksyfenyl 12; R = 4-bromofenyl
13; R = cykloheksyl
PL 233 362 B1
1.1. Otrzymywanie (1S,2R,10bS)-1,2-diacetoksy-8,9-dimetoksy-3-okso-1 Ob-podstawionych-1,2,3,5,6,10b-heksahydropirolo[2,1 -a]izochinolin 5-8
Związki 5 i 8 otrzymano zgodnie z literaturą (Kałuża, Z.; Mostowicz, D.; Dołęga, G.; Mroczko, K.; Wójcik, R. Tetrahedron, 2006, 62, 943-953). Tę samą literaturową procedurę zastosowano do syntezy pochodnych 6 i 7.
P r z y k ł a d 1: Synteza (1S,2R,10bS)-1,2-diacetoksy-8,9-dimetoksy-3-okso-10b-(4-metoksyfenylo)-1,2,3,5,6,10b-heksahydropirolo[2,1-a]izochinoliny 6
Wydajność 56%, bezpostaciowe ciało stałe. Oczyszczano na żelu krzemionkowym. Eluent octan etylu: heksan = 6:4.
1H-NMR (CDCI3): 1.89 (s, 3H), 2.12 (s, 3H), 2.51 (m, 1H), 2.83 (m, 1H), 3.37 (m, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.84 (m, 1H), 3.88 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 5.72 (d, 1H, J= 6.6 Hz), 5.95 (d, 1H, J= 6.6 Hz), 6.64 (s, 1H), 6.83 (d, 1H, J= 8.8 Hz), 6.98 (d, 1H, J= 8.8 Hz), 7.08, (s, 1H). 13C-NMR (CDCI3): 20.29, 26.23, 37.37, 55.27, 55.93, 56.16, 67.46, 77.65, 78.36, 109.02, 111.63, 113.59, 126.51, 128,77, 130.32, 131.16, 147.69, 148.57, 159.24, 166.04, 169.90, 170.22
P r z y k ł a d 2: Synteza(1 S,2R,10bS)-1,2-diacetoksy-8,9-dimetoksy-3-okso-10b-(4-bromofenylo)-1,2,3,5,6,10b-heksahydropirolo[2,1-a]izochinoliny 7
Wydajność 87%, bezpostaciowe ciało stałe. Oczyszczano na żelu krzemionkowym. Eluent octan etylu: heksan= 6:4.
1H-NMR (CDCI3): 1.91 (s, 1H), 2.13 (s, 1H), 2,46 (m, 1H), 2,83 (dt, J= 6.1, 15.9 Hz); 3.34 (m, 1H), 3.85 (m,1H), 3.88 i 3.90 (2x s, 2x 3H), 5.68 (d, 1H, J= 6.9), 5.99 (d, J= 6.99), 6.65 (s, 1H), 6.96 (d, 2H, J= 6.96 Hz), 7.1 (s, 1H), 7.44, (d, 1H, J= 6.96 Hz). 13C-NMR (CDCI3): 20.66, 26.16, 55.95, 56.19, 74.41, 78.07, 108.85, 111.70, 122.39, 126.57, 127.41,128.32, 129.23, 130.46, 131.46, 137.79, 147.86, 148.84, 166.11, 169.74, 170.17.
P r z y k ł a d 3: Synteza(1 S,2R,10bS)-1,2-diacetoksy-8,9-dimetoksy-3-okso-10b-(cykloheksylo)-1,2,3,5,6,10b-heksahydropirolo[2,1-a]izochinoliny 9
Do roztworu związku 8 (6,36 mmol; 2,8 g) w MeOH (150 ml) dodano 300 mg Pd/C (20%). Redukowano wodorem pod ciśnieniem 50 atm. w temperaturze 80°C. Po zaniku substratu (ok 24 h) mieszaninę przesączono pod ciśnieniem 50 atm. w temperaturze 80°C. Po zaniku substratu (ok 24 h) mieszaninę przesączono przez celit, przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Oczyszczano na żelu krzemionkowym. Eluent octan etylu: heksan= 7 : 3. Wydajność: 2.61 g (92%), bezpostaciowe ciało stałe.
1H-NMR (CDCI3): 1.05-1.42 (m, 6H), 1.7 (m, 2H), 1.90 (m, 2H), 2.00 (m, 1H), 2.08 (s, 3H), 2.22 (s, 3H), 2.67 (dd, 1H, J= 16.1 Hz), 2.92 ( m, 1H), 3.26 (dt, J= 4.7, 12.3 Hz), 3.78 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 13C-NMR (CDCI3): 20.67, 20.97, 26.23, 26.54, 27.44, 27.51,28.70, 30.11,26.90, 45.83, 55.84, 56.00, 65.84, 74.75, 80.70, 106.98, 111.58, 125.00, 130.49, 148.34, 148.38, 166.32, 169.62, 170.50.
1.2 Synteza aminoalkoholi 10-13
Związek 10 otrzymano zgodnie z literaturą (Kałuża, Z.; Mostowicz, D.; Dołęga, G.; Wójcik, R. Tetrahedron, 2008, 64, 2321-2328). Tę samą ogólną procedurę zastosowano do syntezy pochodnych 11, 12 i 13.
Ogólna procedura otrzymywania aminoalkoholi
Etap I: Do roztworu dioctanu 5-9 (5 mmol) w bezwodnym metanolu (50 ml) w temperaturze pokojowej dodano MeONa (5 mmol). Mieszano do zaniku substratu (ok. 0,5 h) dodano niewielką ilość stałego CO2 i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Surową mieszaninę rozpuszczono w CH2CI2, odsączono wytrącony osad, przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem.
Etap II: Surowy diol rozpuszczono w 25 ml CH3CN, dodano roztwór NalO4 (4,28 g, 20 mmol) w 38 ml H2O i mieszano w temperaturze pokojowej do zaniku substratu (ok. 4-6 dni; kontrola TLC). Wytrącony osad odsączono i przemyto octanem etylu. Przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do około połowy objętości i ekstrahowano octanem etylu (4 x 50 ml). Połączone warstwy organiczne osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono. Surowy produkt bez dalszego oczyszczania poddano kolejnej reakcji.
Etap III: Otrzymany powyżej produkt rozpuszczono w tetrahydrofuranie (30 ml) i podczas intensywnego mieszania dodano w jednej porcji NaOH (1,20 g, 30 mmol) rozpuszczony w wodzie (30 ml). Mieszanie kontynuowano do zaniku substratu, (0,5-2 h) roztwór rozcieńczono wodą (50 ml) i ekstrahowano chlorkiem metylenu (3 x 50 ml). Połączone ekstrakty osuszono (MgSO4) i zatężono pod próżnią. Surowy produkt oczyszczano chromatograficznie lub też poprzez krystalizację. Łączna wydajność na trzy etapy -40-60%.
PL 233 362 B1
P r z y k ł a d 4: Synteza (S)-6,7-dimetoksy-1-hydroksymetylo-1-(4-metoksyfenyl)-1,2,3,4-tetrahydro-izochinoliny 11
Procedura ogólna. Oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej. Eluent: DCM: MeOH: NH3aqua = (95:5:0,5 90:10:0,5). Wydajność 44%, bezpostaciowe ciało stałe. [o,]d22 = -26.7 (c=1,
MeOH).
1H-NMR (CDCI3): 2.72 (m, 2H), 2.88 (m, 1H), 2.96 (m, 1H), 3.05 (m, 1H), 3.73 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 3.96 (d, 1H, J= 11,2 Hz), 4.17 (d, 1H, J= 11.2 Hz), 6.46 (s, 1H), 6.64 (s, 1H), 6.82 (d, 1H, J= 8.8 Hz), 7.25 (d, 1H, J= 8.8 Hz). 13C-NMR (CDCI3): 29.13, 38.61, 55.22, 55,80, 56.04, 63.24, 67.47, 110.31, 111.80, 113.62, 128.54, 129.10, 129.52, 136.92, 147.46, 148.01, 158.74.
P r z y k ł a d 5: Synteza (S)-1-(4-bromofenylo)-6,7-dimetoksy-1-hydroksymetylo-1,2,3,4-tetrahydro-izochinoliny 12
Procedura ogólna. Oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej. Eluent DCM: MeOH: NH3aqua (95:5:0,5 > 90:10:0,5). Wydajność 45%, bezpostaciowe ciało stałe.
[a]D2t = +33.6 (c=1,MeOH); IR (film): 3322, 3057, 2999, 2934, 2833, 1609, 1515, 1464 cm-1. 1H-NMR (CDCI3): 2.55 (bm, 2H), 2.72 (dt, 1H, J= 16.6, 5.1 Hz), 2.85 (m, 1H), 2.94 (m, 1H), 3.04 (m, 1H), 3.74 (s, 3H), 3.88 (s, 3H), 3.95 (d, 1H, J= 11.2 Hz), 4.11 (d, 1H, J= 11.2 Hz), 6.41 (s, 1H), 6.65 (s, 1H), 7.23 (d, 2H, 8.6 Hz), 7.41 (d, 2H, 8.6 Hz). 13C-NMR (CDCI3): 29.19, 38.71, 55.81, 63.16, 67.25, 110.16, 111.97, 121.44, 128.69, 128.97, 129.79, 131.40, 144.21,147.54, 148.18.MS (El, HR) m/z: (M+) obliczono dla C18H21NO3Br: 378.0705, zmierzono: 378. 0695.
P r z y k ł a d 6: Synteza (S)-1-cykloheksylo-6,7-dimetoksy-1-hydroksymetylo-1,2,3,4-tetrahydro-izochinolina 13.
Procedura ogólna. Oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej. Eluent DCM:MeOH: NH3aqua (95:5: 0,5 > 90:10:0,5). Wydajność 45%, bezpostaciowe ciało stałe.
[a]D23 = -62.9(c1,MeOH)
Widma 1H i 13C-NMR octanu aminoalkoholu 13:
1H-NMR (CDCI3): 0.9-1.94 (m, 11H), 2.01 (s, 3H), 2.71 (m, 1H), 2.84, (m, 1H), 3.23 (m, 1H), 3.32 (m, 1H), 3.80 (d, 1H, J= 11.8 Hz), 3.85 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 4.08, (d, 1H, J= 11.8 Hz), 6.58 (s, 1H), 6.63 (s, 1H), 6.82 (bs. 2H). 13C-NMR (CDCI3): 25.51,28.86, 29.28, 29.50, 29.91,30.23, 30.78, 42.40, 49.31, 58.46, 58.83, 66.66, 68.76, 111.15, 114.13, 129.98, 150.47, 150.68, 180.24.
MS (EI, HR) m/z: (M+H+) obliczono dla C18H28NO3: 306.2065, zmierzono: 306.2069.
1.3 Otrzymywanie czwartorzędowych soli amoniowych 1-4 (a-c)
Ogólna procedura otrzymywania spiro-soli amoniowych
Do roztworu aminoalkoholu (0,4 mmol) w rozpuszczalniku (MeCN lub DCM) (2 ml) dodano odpowiedni dibromek (0,5 mmol), a następnie DIPEA (0,5 mmol). Reakcję mieszano 24 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie całość zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej lub krystalizowano.
Opisy widm NMR związków z objętościowo dużymi podstawnik ami na atomie C-1' (arylowe, cykloheksylowy 2-4a-c) zawierają jedynie wybrane dane ze względu na znaczenie poszerzenie sygnałów.
P r z y k ł a d 7: Synteza bromku (S)-1'-(hydroksymetylo)-6',7'-dimetoksy-1'-metylo-3',4'-dihydro-1'H-spiro[izoindolino-2,2'-izochinolin]-2-iowego 1a [a]D20 = +15.8 (c 1,MeOH), IR (film): 3230, 3010, 2936, 1611, 1523, 1493, 1408, 1362 cm-1. 1H-NMR (CD3OD): 1.85 (s, 3H), 3.25 (m, 1H), 3.41 (m, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.89 (m. 1H), 3.98 (d, 1H, J= 13.7 Hz), 4.21 (d, 1H, J= 13.7 Hz), 4.39 (m, 1H), 4.82 (d, 1H, J= 15.5 Hz), 5.00 (d, 1H, J= 15.5 Hz), 5.87 (d, 1H, J= 15.6 Hz), 5.87 (s, 1H), 5.92 (s, 1H), 7.34 (d, 1H, J= 7.1Hz), 7.41 (m, 3H). 13C-NMR (CD3OD): 18.13,23.48, 55.07, 55.43, 55.78, 63.76, 65.98, 67.09, 74.91, 109.82, 111.48, 122.48, 122.62, 123.61, 125.41,128.75, 128.85, 132.11, 133.33, 148.51, 149.84.MS (El, HR) m/z: (M+) obliczono dla C21H26NO3: 340.1913, zmierzono: 340.1910.
P r z y k ł a d 8: Synteza bromku (S)-1'-(hydroksymetylo)-5,6,6',7'-tetrametoksy-1'-metylo-3',4'-dihydro-1 'H-spiro[izoindolino-2,2'-izochinolin]-2-iowego 1 b [a]D21 = +14.5 (c 1,MeOH). IR (film):2989, 2978, 2039, 2898, 2771, 2664, 1608, 1512, 1467, 1445 cm-1. 1H-NMR (CDsOD):1.84 (s, 3H), 3.41 (m, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.84 (s, 9H), 3.91 (m, 1H), 3.95 (d, 1H, J= 13.7 Hz), 4.19 (d, 1H, J= 13.7 Hz), 4.39 (m, 1H), 4.72 (dd, 2H, J= 7.9, 15.2 Hz), 4.89 (d, 1H, J= 14.4 Hz), 5.78 (d, 1H, J= 15.4), 6.86 (s, 1H), 6.90 (s. 1H), 6.91 (s, 1H), 7.0 (s, 1H). 13C-NMR (CD3OD): 17.90, 23.51, 42.42, 54.46, 55.29, 55.31, 55.98, 64.07, 66.33, 67.12, 74.83, 105.62, 105.74, 109.81,
PL 233 362 B1
111.48, 123.68, 123.70, 124.96, 125.49, 148.49, 149.84, 150.39, 150.49. MS (El, HR) m/z: (M+) obliczono dla C23H30NO5: 400.2124, zmierzono: 400.2123.
P r z y k ł a d 9: Synteza bromku (S)-1'-(hydroksymetylo)-6',7'-dimetoksy-1'-metylo-3',4',5,7-tetrahydro-1'H-spiro[[1,3]dioksolo[4,5-f]izoindolino-6,2'-izochinolin]-2’-iowego 1c [a]D21 = +14.2 (c 1,MeOH), IR (film): 3227, 2963, 2939, 2834, 1611, 1520, 1481 cm-1. 1H-NMR (CD3OD): 1.85 (s, 3H), 3.28 (m, 1H), 3.41 (m, 1H), 3.85 (s, 6H). 3.92 (m, 2H), 3.96 (d, 1H. J=13.6 Hz), 4.19 (d, 1H, J=13.6 Hz), 4.38 (m, 1H), 4.68 (d, 2H, J= 15.1 Hz), 5.73 (d, 1H, J= 13.3 Hz ), 6.01 (dd, 2H. J= 0.9, 3.5 Hz), 6.77 (s, 1H), 6.86 (s, 1H), 6.87 (s, 1H), 6.92 (s, 1H). 13C-NMR (CD3OD): 17.96, 23.83, 55.07, 55.42, 55.93, 63.32, 63.90, 67.07, 74.97, 101.97, 103.74, 102.83, 109.83, 111.48, 123.65, 124.71, 125.38, 125.99, 148.51, 148.98, 149.07, 149.86.MS (El, HR) m/z: (M+) obliczono dla C22H26NO5: 384.1811, zmierzono: 384.1811.
P r z y k ł a d 10: Synteza bromku (S)-1 '-(hydroksymetylo)-6',7'-dimetoksy-1'-(4-metoksyfenylo)-3',4,-dihydro-1'H-spiro[izoindolino-2,2'-izochinolin]-2-iowego 2a [a]D21 = -0.85 (c 0.7,MeOH).IR (film): 3227, 2963, 2939, 2834, 1611, 1520, 1481 cm-1·
1H-NMR (CD3OD): 3.33-3.38 (m, 2H), 3.67 (s, 3H), 3.71-3.75 (m, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 4.044.09 (m, 1H), 4.38 (d, 14.4 Hz, 1H), 4.58 (d, 13.6 Hz, 1H), 4.90 (d, 15.0 Hz, 1H), 5.14 (d, 13.6 Hz, 1H), 5.52 (d, 14.4 Hz, 1H), 5.70 (d, 15.0 Hz, 1H), 6.58 (s, 1H), 6.94-6.97 (m, 3H), 7.25-7.28 (m, 1H), 7.327.36 (m, 3H), 7.40-7.57 (m, 2H). 13C-NMR (CD3OD) wybrane sygnały: 23.9, 54.5, 54.7, 55.1,55.2, 63.0,
65.3, 65.6, 78.9, 111.0, 111.4, 113.6, 148.4, 149.8, 161.0.MS (El, HR) m/z: (M+) obliczono dla
C27H30NO4: 432.2175, zmierzono: 432.2173.
P r z y k ł a d 11: Synteza bromku (S)-1'-(hydroksymetylo)-5,6,6',7'-tetrametoksy-(4-metoksyfenylo)-3',4'-1'H-spiro[izoindolino-2,2'-izochinolin]-2-iowego 2b [a]D21 = -2.33 (c 1,MeOH/DCM 8/2); IR (film): 3402, 3244, 2979, 2942, 2689, 1725, 1607, 1515, 1466 cm-1. 1H-NMR (CDCI3): 3.11-3.18 (m, 1H), 3.29-3.35 (br, 2H), 3.69 (s, 3H), 3.70-3.78 (m, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 3.84 (s. 3H), 4.18-4.27 (br, 1H), 4.65 (d, 13.6 Hz, 1H), 4.72-4.88 (br, 1H), 4.94 (d, 13.9 Hz, 1H), 5.19-5.34 (br, 1H), 5.42-5.51 (br, 1H), 6.22 (br, 1H), 6.37 (br, 1H), 6.70 (s, 1H), 6.73 (s, 1H), 6.84 (s, 1H), 6.86-6.70 (br, 1H). 13C NMR (CDCI3) wybrane sygnały: 24.5, 53.7, 54.1, 55.4, 56.1,
56.2, 56.3, 56.3, 64.9, 67.9, 72.8, 106.0, 106.7, 110.9, 111.6, 114.1, 148.1, 149.7, 150.0, 150.3, 160.8. MS (El, HR) m/z: (M+) obliczono dla C29H34NO6: 492.2386, zmierzono 492.2386.
P r z y k ł a d 12: Synteza bromku (S)-1'-(hydroksymetylo)-3',4',5,7-tetrahydro-1'H-spiro[[1,3]dioksolo[4,5-f]izoindolino-6,2'-izochinolin]-2'-iowego 2c [a]D22 = -0.31 (c 1,0 MeOH/DCM 9/1); IR (film): 3402, 3244, 2979, 2942, 2689, 1725, 1607, 1515, 1482 cm-1. 1H-NMR (CDCI3) wybrane sygnały: 3.24-3.41 (m, 1H), 3.69 (s, 3H). 3.83 (s, 3H), 3.91 (s, 3H), 4.14 (br, 1H), 4.67 (br, 1H), 4.92 (br, 1H), 5.17 (br, 1H), 5.47 (br, 1H), 5.93-6.00 (m, 2H), 6.38 (s, 1H), 6.61 (s, 1H), 6.71-6.76 (m, 2H), 6.84-7.01 (br, 2H). 13C NMR (CDCI3) wybrane sygnały: 24.4, 53.8,
55.4, 56.1,56.2, 67.8, 101.9, 103.5, 104.4, 110.9, 160.8.MS (El, HR) m/z: (M+) obliczono dla C29H30NO6: 476.2073, zmierzono:476.2078.
P r z y k ł a d 13: Synteza bromku(S)-1'-(4-bromofenylo)-hydroksymetylo)-6',7'-dimetoksy-3',4'-dihydro-1'H- spiro[izoindolino-2,2'-izochinolin]-2-iowego 3a [α]υ22 = -1.44 (c 1,MeOH/DCM 9/1); IR (film): 3213, 2925, 2854, 2685, 2517, 2490, 1736, 1612, 1586, 1520, 1489, 1465 cm-1. 1H-NMR (CD3OD) wybrane sygnały: 3.33 (br, 1H), 3.38-3.43 (m, 1H), 3.67 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 4.02 (br. 1H). 4.40 (br, 1H), 4.60 (d, 13.5 Hz, 1H), 4.93 (d, 15.1 Hz, 1H), 5.14 (d, 13.5 Hz, 1H), 5.63 (br, 1H), 5.73 (d, 15.1 Hz, 1H), 6.56 (s, 1H), 6.96 (s, 1H). 13C NMR (CD3OD) wybrane sygnały: 23.8, 55.1,63.1,65.4, 66.1,78.1, 111.0, 111.1, 148.6, 150.0. MS (El, HR) m/z: (M+) obliczono dla C26H27NO3Br: 480.1174, zmierzono: 480.1174.
P r z y k ł a d 14: Synteza bromku (S)-1 ’-(4-bromofenylo)-1 ’-(hydroksymetylo)-5,6,6',7’-tetrametoksy-3',4'-dihydro-1'H-spiro[izoindolino-2,2’-izochinolin]-2-iowego 3b [α]υ22 =+1.41, (c 1, MeOH/DCM 9/1); IR (film): 3202, 3004, 2962, 2939, 2836, 1722, 1612, 1586,1512, 1466 cm-1. 1H-NMR (CD3OD), T=50°C, wybrane sygnały: 3.34-3.39 (m, 1H), 3.67 (s, 3H), 3.71-3.75 (m, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 4.12 (br, 1H), 4.34 (br, 1H), 4.81 (d, 14.8 Hz, 1H), 5.07 (d, 13.4 Hz, 1H), 5.48 (br, 1H), 5.64 (d, 14.8 Hz, 1H), 6.56 (s, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.56 (s, 1H), 6.88 6.56 (s, 1H), 6.95 6.56 (s, 1H). 13C NMR (CD3OD), T=50°C, wybrane sygnały: 24.0, 55.7, 63.8, 65.7, 66.3, 78.9, 106.7, 106.7, 111.5, 111.8, 148.7, 150.3, 150.5, 150.5.MS (El, HR) m/z: (M+) obliczono dla C28H31NOsBr: 540,1386, zmierzono: 540,1385.
P r z y k ł a d 15: Synteza bromku (S)-1'-(4-bromofenylo)-1'-(hydroksymetylo)-6',7'-dimetoksy-3',4',5,7-tetrahydro-1'H-spiro[[1,3]dioksolo[4,5-f]izoindolo-6,2'-izochinolin]-2'-iowego 3c
PL 233 362 B1 [α]υ21 =+1,57(c 1,MeOH); IR (film): 3218, 2972, 2942, 2684, 2518, 2492, 1612, 1520, 1482, 1396, 1353, 1298 cm-1. 1H-NMR (CDCI3) wybrane sygnały: 3.36 (br, 1H), 3.70 (s, 3H), 3.77 (br, 1H), 3.91 (s, 3H), 4.23 (br, 1H), 4.71 (br, 1H), 4.88 (br, 1H), 5.07 (br, 1H), 5.57 (br, 1H).13C NMR (CDCI3) wybrane sygnały: 24.5, 49.4, 54.1,54.4, 56.1,56.3, 64.6, 67.5, 72.8, 101.9, 103.6, 104.3. MS (El, HR) m/z: (M+) obliczono dla C27H27NO5Br: 524.1073, zmierzono: 524.1074.
P r z y k ł a d 16: Synteza bromku (S)-1 '-cykloheksylo-1 '-(hydroksymetylo)-6',7'-dimetoksy-3',4'-dihydro-1 'H-spiro[izoindolino-2,2'-izochinolin]-2-iowego 4a [a]D24 = -13.9(c 0.8,MeOH); IR (film): 3547, 3464, 3408, 3186, 3009, 2934, 2855, 1609, 1520, 1453, cm-1. 1H-NMR (CDCI3) wybrane sygnały: 0.99-1.23 (m, 4H), 1.29-1.41 (m, 1H), 1.85-1.94 (m, 1H), 2.05-2.14 (m, 1H), 2.20-2.27 (m, 1H), 3.21-3.40 (m, 2H), 3.73-3.82 (m, 1H), 3.89 (s, 3H), 3.97 (s, 3H), 4.20 (d, 14.7 Hz, 1H), 4.75 (m, 1H), 4.83 (d, 14.1 Hz, 1H), 5.86-5.93 (m, 2H), 6.70 (s, 1H), 7.03 (s, 1H).
13C NMR (CDCI3) wybrane sygnały: 24.3, 25.7, 27.0, 27.4, 29.5, 31.2, 45.9, 55.0, 56.0, 57.0, 58.9,
67.3, 68.9, 80.6, 111.3, 111.6, 147.9, 149.4.MS (El, HR) m/z: (M+) obliczono dla C26H34NO3 408.2539, znaleziono: 408.2529.
P r z y k ł a d 17: Synteza bromku (S)-1'-cykloheksylo-1'-(hydroksymetylo)-5,6,6',7'-tetrametoksy-3',4'-dihydro-1'H-spiro[izoindolino-2,2'-izochinolin]-2-iowego 4b [a]D24 = -13.9 (c 0.8,MeOH); IR (film): 3230, 2928, 2854, 1737, 1612, 1514, 1465, 1454, 1350, 1363, 1226 cm-1. 1H-NMR (CDCI3) wybrane sygnały: 0.85-0.92 (m, 1H), 1.02-1.15 (m, 3H). 1.56-1.71 (m, 4H), 1.84-1.96 (m, 3H), 3.18-3.43 (m, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 4.15 (d, 14.3 Hz, 1H), 4.67-4.84 (m, 3H), 5.83 (d, 14.3 Hz, 1H), 5.91 (d, 13.6 Hz, 1H), 6.63 (s, 1H), 6.70 (s, 1H), 6.96 (s, 1H), 7.04 (s, 1H). 13C-NMR (CDCI3) wybrane sygnały: 24.4, 25.3, 25.7, 27.5, 29.7, 46.0,
55.2, 55.9, 56.2, 56.3, 56.9, 65.6, 67.7, 69.1, 80.6, 105.5, 106.3, 111.4, 111.6, 148.0, 149.5, 150.2, 150.3MS (El, HR) m/z: (M+) obliczono dla C28H38NO5: 468.2750, zmierzono: 468.2740.
P r z y k ł a d 18: Synteza bromku (S)-1'-cykloheksylo-1'-(hydroksymetylo)-6',7'-dimetoksy-3',4'-5,7-tetrahydro-1'H-spiro[[1,3]dioksolo[4,5-f]izoindolo-6,2'-izochinolin]-2'-iowego 4c [a]D23 = -1.90(c=1,MeOH), IR (film): 3243, 2935, 2855, 2691, 1715, 1611, 1521, 1483, 1365 cm-1. 1H-NMR (CD3OD) wybrane sygnały: 1.03 (br, 1H), 1.11-1.23 (br, 3H). 1.41-1.69 (br, 4H). 1.88 (br, 1H), 2.15-2.26 (m, 2H), 3.32-3.44 (m, 2H), 3.85 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 4.03-4.11 (br, 1H). 4.34 (d, 14.6 Hz, 1H), 4.50-4.70 (m, 3H), 5.51 (d, 14.5 Hz, 1H), 5.66 (d, 14.5 Hz, 1H), 5.95-6.02 (m, 2H), 6.67 (s, 1H), 6.87 (s, 1H), 6.91 (s, 1H), 6.94 (s, 1H). 13C NMR (CD3OD) wybrane sygnały: 23.5, 25.6, 26.4, 27.0, 28.9,
31.3, 42.5, 45.3, 54.5, 56.5, 66.8, 67.8, 80.3, 111.6, 112.1, 147.4, 148.7. MS (El, HR) m/z: (M+) obliczono dla C27H34NO5: 452.2437, zmierzono 452.2429.
Pomiar aktywności biologicznej
Fibroblasty skóry ludzkiej
Fibroblasty skóry ludzkiej hodowano w podłożu DMEM (Dulbecco’s minimal essential medium) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mmol/dm3 glutaminy, 50 U/cm3 penicyliny i 50 pg/cm3 streptomycyny w temperaturze 37°C, w atmosferze zawierającej 5% CO2. Stosując bezwapniowy bufor fosforanowy z dodatkiem 0,05% trypsyny i 0,02% EDTA przenoszono komórki z butelek „Costar do 6-studzienkowych płytek „Nunc” (Wiesbaden, Niemcy). Policzone w hemocytometrze komórki nanoszono w ilości 1 x 105 komórek w 1 ml pożywki hodowlanej na każdą studzienkę. Co 48 godzin dokonywano wymiany pożywki na świeżą. Pomiędzy czwartym a szóstym dniem wzrostu fibroblasty osiągały stan inhibicji kontaktowej. Tak przygotowane komórki inkubowano przez 24 godziny z badanymi związkami i używano do dalszych doświadczeń.
Pomiar cytotoksyczności związków
Pomiar cytotoksyczności badanych związków wykonano metodą Carmichael'a, określając żywotność komórek przy użyciu soli tetrazolinowej (MTT). W żywych komórkach, pod wpływem mitochondrialnych dehydrogenaz, zastosowany barwnik ulega przemianie do purpurowego formazanu. Przemiana ta nie zachodzi w martwych komórkach.
Komórki inkubowano przez 24 i 48 godzin w inkubatorze zapewniającym odpowiednie warunki, tj. obecność CO2 i temperatura 37°C wraz z pożywką zawierającą różne stężenia badanych związków. Podłoże usuwano a komórki płukano trzy razy (3 x 1 ml) PBS. Następnie, dodano 1 ml PBS oraz 50 pl MTT o stężeniu 5 mg/cm3 i kontynuowano inkubację przez 4 godziny. Po upływie wymaganego czasu, podłoże usunięto a do komórek dodano 1 ml 0,1 M kwasu solnego w absolutnym izopropanolu i pozostawiono na 10 minut. W tak przygotowanym lizacie komórek mierzono absorbancję przy 570 nm. Wynik
PL 233 362 Β1 absorbancji uzyskany w hodowlach komórek kontrolnych przyjęto za 100%. Natomiast żywotność komórek inkubowanych w obecności badanych leków przedstawiono jako procent wartości kontrolnych.
Pomiar biosyntezy DNA
Komórki inkubowano w 24-studzienkowych płytkach Falcon'a umieszczając w każdym otworze 1 x 105 komórek fibroblastów w 1 ml pożywki i hodowano podobnie jak w płytkach 6-studzienkowych. Badane związki dodawano do podłoża hodowlanego i inkubowano przez 24 i 48 godzin. Po tym czasie, do podłoża dodawano 0,5 pCi [3H]-tymidyny (aktywność właściwa 6,7 Ci/mmol) i dalej inkubowano komórki przez 4 godziny, w inkubatorze w atmosferze zawierającej 5% CO2 i w temperaturze 37°C. Po tym czasie, pożywkę usuwano a powierzchnię komórek przemywano trzy razy (3 x 1 ml) 0,05 M TrisHCI o pH 7,4, zawierającym 0,11 M NaCI. Następnie komórki przemywano dwa razy (2x1 ml) 5% roztworem kwasu trichlorooctowego (TCA) i rozpuszczono w 1 ml 0,1 M NaOH zawierającym 1% SDS. Po 5 minutach, uzyskany lizat komórkowy przeniesiono do fiolek scyntylacyjnych zawierających 4 ml płynu scyntylacyjnego i mierzono radioaktywność. Intensywność biosyntezy DNA w komórkach kontrolnych, wyrażoną w dpm radioaktywnej tymidyny wbudowanej do DNA badanych komórek, w przeliczeniu na 1 χ 105 komórek, przyjmowano za 100%. Wartości z prób badanych wyrażano jako procent wartości kontrolnej.
A) Materiał biologiczny: Szczepy testowe bakterii
Szczepy wzorcowe o znanych i stałych cechach pochodziły z Amerykańskiej Kolekcji Czystych Kultur (ATCC; American Type Culture Collection). Szczepy wzorcowe były przechowywane zgodnie z międzynarodowymi standardami, w postaci zamrożonej. Stosowano Cryobank (Mast Diagnostics) zawierający sterylne fiolki wypełnione koralikami o mikroporowatej strukturze, wypełnione hipertonicznym roztworem gwarantującym długoterminową przeżywalność mikroorganizmów (również tych o wysokich wymaganiach odżywczych). Postępowano zgodnie z procedurą, zawieszając w roztworze namnożone na podłożach stałych szczepy bakterii, następnie po wymieszaniu zawartości fiolki i dokładnym odsączeniu z probówek płynu, umieszczano je w niskotemperaturowej zamrażarce w -80°C. Przed każdym eksperymentem szczepy aktywowano w podłożu płynnym Trypticase Soy Broth (Bulion sojowy Trypticase - TSB; BD, USA), które jest uniwersalnym podłożem do hodowli drobnoustrojów, zawierającym substancje odżywcze zapewniające wzrost wielu gatunkom mikroorganizmów, w tym szeroko rozpowszechnionych tlenowców, fakultatywnych beztlenowców oraz grzybów. Następnie z aktywnych komórek bakteryjnych, z 24-godzinnej hodowli przygotowywano zawiesinę zaszczepiającą o inokulum wynoszącym 108 jtk/ml.
W celu określenia przeciwbakteryjnej aktywności badanych preparatów zastosowano:
I. Szczepy referencyjne z kolekcji ATCC:
Staphylococcus aureus ATCC 25923 ziaren kowiec Gram-dodatni
Streptococcus pyogenes ATCC 19615 ziarenkowiec Gram-dodatni
Streptococcus mutans ATCC 35668 ziarenkowiec Gram-dodatni
Streptococcus sativarius ATCC 13419 ziarenkowiec Gram-dodatni
Enterococcus faecalis ATCC 29212 ziarenkowiec Gram-dodatni
Moraxella catarrhaiis ATCC 25238 ziarenkowiec Gram-ujemny
Escherichia coli ATCC 25922 pałeczki Gram-ujemne
Campytobacter jejuni ATCC 33560 pałeczki Gram-ujemne, mikroaerofilne
II. Izolaty ze środowiska:
Bacillus subtilis - Gram-dodatnie laseczki
B) Metodyka:
Ocena wrażliwości bakterii na działanie badanych związków
Zastosowano ilościową metodę mikrorozcieńczeń w podłożu płynnym (bulionie) wykonywaną na płytkach titracyjnych. Metoda ma na celu określenie najmniejszego stężenia hamującego wzrost bakterii (MIC w mg/l) lub najmniejszego stężenia bakteriobójczego (MBC w mg/l),w wyznaczonym czasie, w warunkach
PL 233 362 B1 in vitro. Buliony zawierające badany związek o znanych malejących stężeniach zaszczepiano określoną liczbą komórek bakteryjnych. Odczyt polegał na obserwacji zmętnienia podłoża po określonym czasie.
I. Ocena efektu bakteriostatycznego związku
Do oznaczenia wrażliwości bakterii o małych wymaganiach odżywczych użyto bulion MuellerHinton (MHB, Emapol), zaś dla szczepów wybrednych bulion Mueller-Hinton uzupełniony 5% odwłóknioną krwią końską i 20 mg/l β-NAD (MH-F), na płytkach titracyjnych zgodnie z wymogami European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST; European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing). Breakpoints tables for interpretation of MICs and zones diameters. Version 5.0, 2015; J. M. Andrews. Determination of minimum inhibitory concentrations. J. Antimicrob. Chemother. (2001) 48 (suppl. 1): 5-16). Badane związki rozcieńczono etanolem do wyjściowego stężenia 400 mg/l. W celu oznaczenia działania bakteriostatycznego preparatu (MIC), z roztworu wyjściowego przygotowano szereg rozcieńczeń od 200 do 0,195 mg/l w odpowiednim podłożu bulionowym, następnie dodawano zawiesinę bakterii uzyskując ostatecznie inokulum 105 jtk/ml. Hodowle inkubowano w temperaturze 35°C przez 24 godziny, następnie odczytywano najmniejsze stężenie związku hamujące wzrost drobnoustroju. Najwyższe rozcieńczenie preparatu, w którym nie wystąpił wzrost bakterii, przyjm owano za wartość MIC. Wszystkie oznaczenia przeprowadzono w trzech powtórzeniach.
II. Ocena efektu bakteriobójczego związku
W metodzie określano minimalne stężenie związku (MBC), przy którym ginie 99,9% komórek bakteryjnych, przy określonym inokulum i w określonym czasie, w warunkach in vitro.
Wartość bakteriobójczą preparatu ustalano po określeniu MIC, wysiewając ilościowo zawiesinę z poszczególnych rozcieńczeń na podłoża z agarem (Columbia Agar and Sheepblood, Oxoid, UK). Hodowle inkubowano w temperaturze 35°C przez 24 godziny, następnie dokonywano odczytu. Za wartość MBC przyjmowano najniższe stężenie związku, przy którym po 24 godzinach inkubacji przeżywało nie więcej niż 0,1% wyjściowego inokulum drobnoustrojów.
Ponieważ MBC jest wielokrotnością wartości MIC, w celu oceny efektu bakteriobójczego badanych preparatów wobec szczepów referencyjnych określono wskaźnik MBC/MIC. Związek wykazuje dużą aktywność bakteriobójczą, jeżeli stosunek MBC/MIC ma wartość < 4 (wartość MBC jest zbliżona do MIC). Wszystkie oznaczenia przeprowadzono w trzech powtórzeniach.
III. Kontrole
W badaniach uwzględniono następujące kontrole:
Kontrola A - w celu oceny wzrostu szczepów bakteryjnych w zastosowanych podłożach bulionowych (bez dodatku badanych związków),
Kontrola B -- w celu oceny jałowości stosowanych podłóż płynnych (bulionów),
Kontrola C - zastosowano Norfloksacynę (NOR, lek przeciwbakteryjny) w celu określenia jej działania bakteriostatycznego (MIC) wobec szczepów bakteryjnych w warunkach in vitro, postępowano zgodnie z opisaną metodyką i oznaczenia prowadzono równocześnie z badanymi związkami.
C) Wyniki:
Wyniki zestawiono w tabelach:
PL 233 362 Β1
Tabela 1. Proliferacja fibroblastów skóry ludzkiej
Związek cytotoksyczność (MTT) ΙΟ» Wbudowywanie fH]-tymidyny ΙΟ»
1a >300 mg/L >300mg/L
1b >300 mg/L >300mg/L
1c >300 mg/L >300mg/L
2a >300 mg/L >300 mg/L
2b >300 mg/L >300 mg/L
2c >300 mg/L >300 mg/L
3a >300 mg/L >300 mg/L
3b >300 mg/L >300 mg/L
3c >300 mg/L >300 mg/L
4a >300 mg/L >300 mg/L
4b >300 mg/L >300 mg/L
4c >300 mg/L >300 mg/L
Przeprowadzone badania wykazały brak cytotoksyczności na komórkach prawidłowych fibroblastów skóry ludzkiej. Daje to możliwość wykorzystania badanych związków w różnych postaciach preparatów leczniczych, np. maściach, tabletkach, syropach, czopkach, płukankach.
Tabela 2A. Najmniejsze stężenia związków 1 a, 1 b, 1 c, 2a, 2b, 2c hamujące wzrost szczepów bakteryjnych (MIC w mg/l)
Badany szczep la MIC mg/L 1b MIC nng/L 1c MIC mg/L 2a MIC nng/L 2b MIC mg/L 2c MIC mg/L NOR MIC mg/L
Staphyłococcus aur&us >200 >200 >200 25 200 50 1
Escherichia coli 200 200 200 >200 200 200 0,125
Bacillus subtilis >200 >200 >200 50 >200 100 100
Moraxella catarrhalis 25 200 50 12,5 100 25 1
Streptococcus pyogenes 200 200 100 100 100 100 25
Streptococcus mutans 200 100 100 25 200 50 50
Streptococcus salivarius 200 200 100 100 200 200 50
Enterococcus faacalis 200 200 200 100 200 200 4
Campylobacter jejuni 100 100 12,5 100 12.5 12,5 25
PL 233 362 Β1
Tabela 2B. Najmniejsze stężenia badanych związków 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c hamujące wzrost szczepów bakteryjnych (MIC w mg/l)
Badany szczep 3a MIC mg/L 3b MIC rmg/L 3c MIC mg/L 4a MIC mg/L 4b MIC mg/L 4c MIC mg/L NOR MIC mg/L
Staphylococcus aureus 100 100 50 200 200 100 1
Escherichia coli 100 100 50 200 200 200 0,125
Bacillus subtitis 100 200 50 200 >200 200 100
Moraxeiia catarrhalis 25 50 50 25 25 100 1
Streptococcus pyogenes 100 200 200 100 200 200 25
Streptococcus mutans 50 100 50 200 200 50 50
Streptococcus salivarius 200 200 100 100 200 200 50
Enterococcus faecalis 200 200 200 200 200 200 4
Campyiobacter jejuni 100 100 25 200 200 12,5 25
W powyższych tabelach przedstawiono wartości MIC nowych pochodnych czwartorzędowych soli amonowych wobec zróżnicowanych pod względem budowy ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich, różnych fenotypowo gatunków ziarenkowców, pałeczek i laseczek. Jako kontrolę zastosowano Norfloksacynę - przeciwbakteryjny syntetyczny związek o szerokim spektrum działania, należący do drugiej generacji fluorochinolonów powszechnie stosowanych w lecznictwie szpitalnym i ambulatoryjnym. Wykazują one działanie bakteriobójcze, efekt przeciwbakteryjny zależy od ich stężenia w ognisku zakażenia a mechanizm działania bakteriobójczego polega na blokowaniu replikacji DNA przez wiązanie z gyrazą DNA. Spektrum przeciwbakteryjne obejmuje tlenowe pałeczki Gram-ujemne z rodziny Enterobacteriaceae, Vibrio, Haemophilus influenzae, w tym także szczepy β-laktamazododatnie oraz inne Haemophilus, Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis, Moraxella catarrhalis, Campylobacter, Helicobacter pylori, niefermentujące pałeczki Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter, Mycoplasma, Brucella, Chlamydia, Legionella, Mycobacterium, enterokoki; gronkowce, w tym szczepy oporne na metycylinę, paciorkowce (jednak aktywność wobec np. Streptococcus pneumoniae jest niewystarczająca do osiągnięcia efektu terapeutycznego). Dobrano więc preparat o szerokim spektrum działania, aby scharakteryzować badane szczepy pod względem ich wrażliwości/oporności na stosowany powszechnie lek przeciwbakteryjny, w przypadku którego określona wartość MIC umożliwia interpretację wyniku w oparciu o wartość graniczną i kwalifikację szczepu do kategorii: wrażliwy, średnio wrażliwy lub oporny (za szczep oporny klinicznie na fluorochinolony II generacji uważa się bakterie, dla których określono MIC > 1 mg/l, przekroczenie tej wartości wiąże się ze wzrostem cytotoksyczności preparatów). Jest to istotne w celu stwierdzenia z jakimi izolatami mamy do czynienia.
PL 233 362 Β1
Poniżej przedstawiono 2 tabele uwzględniające wartość MBC dla badanych pochodnych z uwzględnieniem norfloksacyny jako leku kontrolnego oraz 2 tabele uwzględniające współczynnik MBC/MIC również dla norfloksacyny.
Tabela 3A. Najmniejsze stężenia badanych związków 1 a, 1 b, 1 c, 2a, 2b, 2c działające bakteriobójczo wobec szczepów bakteryjnych (MBC w mg/l)
Badany szczep 1a MBC mg/L 1b MBC mg/L 1c MBC mg/L 2a MBC mg/L 2b MBC mg/L 2c MBC mg/L NOR MBC mg/L
Staphylococcus aureus >200 >200 >200 50 200 100 1
Escherichia coli 200 200 200 >200 200 200 0,25
Bacillus subtilis >200 >200 >200 100 >200 200 100
Moraxella catarrhaiis 50 200 100 12,5 100 50 1
Streptococcus pyogenes 200 200 100 100 100 100 75
Streptococcus mutans 200 100 100 25 200 50 100
Streptococcus salhrarius 200 200 100 100 200 200 150
Enterococcus faecalis 200 200 200 200 200 200 12
Campyfobacter jejum 100 100 12,5 100 12,5 12,5 100
Tabela 3B. Najmniejsze stężenia badanych związków 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c działające bakteriobójczo wobec badanych szczepów bakteryjnych (MBC w mg/l)
Badany szczep 3a MBC mg/L 3b MBC mg/L 3c MBC mg/L 4a MBC mg/L 4b MBC mg/L 4c MBC mg/L NOR MBC mg/L
Staphyiococcus aureus 200 200 100 200 200 200 1
Escherichia coli 200 100 100 200 200 200 0,25
Bacillus subt/Hs 200 200 50 200 >200 400 100
Moraxel/a catarrhaiis 50 50 50 25 25 100 1
Streptococcus pyogenes 100 200 200 100 200 400 75
Streptococcus mutans 50 100 50 200 200 50 100
Streptococcus salivarius 200 200 100 100 200 200 150
Enterococcus faecalis 200 200 200 200 200 200 12
Campylobacter jejuni 100 100 25 200 200 12,5 100
PL 233 362 Β1
Tabela 4A. Ocena efektu bakteriobójczego badanych związków 1a, 1 b, 1 c, 2a, 2b, 2c uwzględniając wartość MBC/MIC
Badany szczep la MBC/MIC ib MBC/MIC 1c MBC/MIC 2a MBC/MIC 2b MBC/MIC 2c MBC/ MIC NOR MBC/ MIC
Staphytococcus aureus X X X 2 1 2 1
Escherichia coli 1 1 1 X 1 1 2
Bacillus subtilis X X X 2 X 2 1
Moraxella catarrtialis 2 1 2 1 1 2 1
Streptococcus pyogenes 1 1 1 1 1 1 3
Streptococcus mutans 1 1 1 1 1 1 2
Streptococcus salivarius 1 1 1 1 1 1 3
Enterococcus faecatis 1 1 1 2 1 1 3
Campylobacter jejuni 1 1 1 1 1 1 4
X - nie oznaczono
Tabela 4B. Ocena efektu bakteriobójczego badanych związków {3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c z uwzględnieniem wartości MBC/MIC)
Badany szczep 3a MBC/MIC 3b MBC/MIC 3c MBC/MIC 4a MBC/MIC 2b MBC/MIC 2c MBC/ MIC NOR MBC/ MIC
Staphyfococcus aureus 2 2 2 1 1 2 1
Escherichia coli 2 1 2 1 1 1 2
Baciiius subtilis 2 1 1 1 X 2 1
Moraxetla catantiaiis 2 1 1 1 1 1 1
Streptococcus pyogenes 1 1 1 1 1 2 3
Streptococcus mutans 1 1 1 1 1 1 2
Streptococcus salivarius 1 1 1 1 1 1 3
Enterococcus faecalis 1 1 1 1 1 1 3
Campylobacter jejuni 1 1 1 1 1 1 4
PL 233 362 Β1
Na podstawie przeprowadzonych badań można zatem stwierdzić, że wśród nowych związków będących pochodnymi czwartorzędowych soli amoniowych 91% działało bakteriostatycznie na wzrost szczepów bakteryjnych w zakresie stężeń od 12,5 mg/l do 200 mg/l. Stwierdzono wysoką aktywność bakteriobójczą badanych związków wobec szczepów bakteryjnych. W 91% wartość MBC/MIC kształtowała się w zakresie od 1 do 2. Zwrócono uwagę na wybiórcze działanie niektórych pochodnych na zahamowanie wzrostu określonych gatunków bakterii. Związki 2a, 3a, 3b, 4a, 4b w najniższych stężeniach hamowały wzrost szczepu Moraxella catarrhalis (wartości MIC w zakresie 12,5-50 mg/l; śr. 27,5 mg/l), zaś związki 1c, 2b, 2c, 3c, 4c w najniższych stężeniach hamowały wzrost Campylobacter jejuni (wartości MIC w zakresie 12,5-25 mg/l; śr. 15 mg/l). Wybiórczość jest ważną cechą, jeżeli dąży się do eradykacji tylko określonych drobnoustrojów (np. w terapii celowanej zaleca się antybiotyki/chemioterapeutyki o wąskim spektrum działania, ukierunkowane na czynnik patogenny), bez oddziaływania na florę współwystępującą.
D) Wnioski
1. Badane związki 1a-4c nie wykazują cytotoksyczności na komórki prawidłowe fibroblastów skóry ludzkiej.
2. Badane związki w 91% działały bakteriostatycznie na wzrost szczepów bakteryjnych w zakresie stężeń od 12,5 mg/l do 200 mg/l.
3. Związki 2a, 3a, 3b, 4a, 4b w najniższych stężeniach hamowały wzrost szczepu Moraxella catarrhalis (wartości MIC w zakresie 12,5-50 mg/l; śr. 27,5 mg/l).
4. Związki 1c, 2b, 2c, 3c, 4c w najniższych stężeniach hamowały wzrost Campylobacter jejuni (wartości MIC w zakresie 12,5-25 mg/l; śr. 15 mg/l).
5. Stwierdzono wysoką aktywność bakteriobójczą badanych związków wobec szczepów bakteryjnych. W 91% wartość MBC/MIC kształtowała się w zakresie od 1 do 2.

Claims (4)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. . Związek o wzorze ogólnym A:
    OMe
    gdzie
    Ri oznacza podstawnik metylowy, p-metoksy-fenylowy, p-bromo-fenylowy lub cyklo-heksylowy; R2 oznacza atom wodoru, -OCH2O- lub -OMe;
    X oznacza anion halogenkowy, korzystnie Br;
    lub jego dopuszczalna farmaceutycznie sól lub stereoizomer.
    PL 233 362 Β1
  2. 2. Związek według zastrz. 1 o wzorze
    1a;R = H Ib; R = OMe 1c; R = OCH2O
    2a; R = H 2b; R = OMe 2c; R = OCH2O
  3. 3a; R = H 3b; R = OMe 3c; R = OCH2O
  4. 4a;R = H 4b; R = OMe 4c; R = OCH2O
    3. Związek określony w zastrz. 1-2, do stosowania jako związek bakteriobójczy w leczeniu i zapobieganiu zakażeń bakteryjnych.
PL418047A 2016-07-21 2016-07-21 Chiralne, czwartorzędowe, N-spiro sole amoniowe i ich zastosowanie PL233362B1 (pl)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL418047A PL233362B1 (pl) 2016-07-21 2016-07-21 Chiralne, czwartorzędowe, N-spiro sole amoniowe i ich zastosowanie

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL418047A PL233362B1 (pl) 2016-07-21 2016-07-21 Chiralne, czwartorzędowe, N-spiro sole amoniowe i ich zastosowanie

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL418047A1 PL418047A1 (pl) 2018-01-29
PL233362B1 true PL233362B1 (pl) 2019-10-31

Family

ID=61006983

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL418047A PL233362B1 (pl) 2016-07-21 2016-07-21 Chiralne, czwartorzędowe, N-spiro sole amoniowe i ich zastosowanie

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL233362B1 (pl)

Also Published As

Publication number Publication date
PL418047A1 (pl) 2018-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Teng et al. Facilely accessible quinoline derivatives as potent antibacterial agents
Chugunova et al. Synthesis and biological evaluation of novel structural hybrids of benzofuroxan derivatives and fluoroquinolones
EP2663562B1 (en) Solid forms of gyrase inhibitor (r)-1-ethyl-3-[6-fluoro-5-[2-(1-hydroxy-1-methyl-ethyl) pyrimidin-5-yl]-7-(tetrahydrofuran-2-yl)-1h-benzimidazol-2-yl]urea
WO2002009758A2 (en) Inhibitors of cellular efflux pumps of microbes
AU2012205416B2 (en) Solid forms of gyrase inhibitor (R)-1-ethyl-3-(5-(2-{1-hydroxy-1-methyl-ethyl}pyrimidin-5-yl)-7-(tetrahydrofuran-2-yl}-1H-benzimidazol-2-yl)urea
BG108548A (bg) Хетероциклични съединения и използването им като d-аланил-d-аланин лигазни инхибитори
Aridoss et al. Synthesis, crystal and antibacterial studies of diversely functionalized tetrahydropyridin-4-ol
EP2922843A1 (en) Indole compounds and their use as antimicrobials
Tian et al. New diketopiperazine alkaloid and polyketides from marine-derived fungus Penicillium sp. TW58-16 with antibacterial activity against Helicobacter pylori
Yang et al. Synthesis and in vitro antibacterial activity of N-acylarylhydrazone-ciprofloxacin hybrids as novel fluoroquinolone derivatives
KR20180054650A (ko) 히드록시알킬 티아디아졸 유도체
Bielawski et al. Synthesis and antimicrobial activity of chiral quaternary N-spiro ammonium bromides with 3′, 4′-dihydro-1′ H-spiro [isoindoline-2, 2′-isoquinoline] skeleton
PL233362B1 (pl) Chiralne, czwartorzędowe, N-spiro sole amoniowe i ich zastosowanie
CN111116707B (zh) 一种Rakicidins氨基甲酸酯类衍生物及其制备方法与应用
RU2757741C1 (ru) Производное ципрофлоксацина, обладающее антибактериальной активностью в отношении антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов
KR20090036544A (ko) 신규한 항균성 화합물
CN107951878A (zh) 螺缩酮多炔类化合物在制备抗外泵耐药金葡菌增敏药物中的用途
Barker et al. A Mycobacterium marinum zone of inhibition assay as a method for screening potential antimycobacterial compounds from marine extracts
CN113372296A (zh) 用于抑制多重耐药的金黄色葡萄球菌的硒啉类化合物及用途
Nandini et al. Synthetic Process Study and Pharmacological Evaluation of Antispasmodic Drug as Potential Antimicrobial Agent
CN106588581A (zh) 芪类衍生物及其应用
Turan-Zitouni et al. Studies on some new pyrazolo [3, 4-c] pyridine derivatives as antimicrobial agents
Zhang The Antibacterial Activity of Tricyclic Gyrase (GyrB/ParE) Inhibitor: A New Class of Antibacterial Agents
EA038989B1 (ru) Антибиотические соединения арилоксазолидинона
CN120987845A (zh) 一种季铵盐类化合物及其制备方法与应用