BG108548A

BG108548A - Хетероциклични съединения и използването им като d-аланил-d-аланин лигазни инхибитори

Info

Publication number: BG108548A
Application number: BG108548A
Authority: BG
Inventors: Scott Moe; Paul Ala; Emanuele Perola; Carlos FAERMAN; Jacob Clement; Janid Ali; Paul Will; Salvatore Marchese; Andrew MAGEE; John GAZZANIGA; Christopher Farady; Manuel Navia; Patrick Connelly
Original assignee: Pliva D.D.
Priority date: 2001-06-28
Filing date: 2004-01-28
Publication date: 2005-05-31
Also published as: EE200400042A; IL159540A0; BR0211310A; HUP0700061A2; US20030181470A1; US20080090847A1; US7345048B2; EP1411949A4; EP1432713A2; HUP0700040A2; SK302004A3; EE200400043A; CA2451840A1; WO2003001887A3; WO2003001887A2; YU102503A; PL374589A1; IL159538A0; WO2003002064A3; EA200400094A1

Abstract

Изобретението се отнася до нов клас хетероциклични съединения, проявяващи антибактериални свойства. D-Ala-D-Ala лигазният ензим е ключов ензим по пътя на синтезата на бактериалната клетъчна стена. Съединенията могат да се свържат към и да инхибират ензимната D-Ala-D-Ala лигаза. Активността на новите съединения, комбинирана със способността им да препятстват синтезата на клетъчните мембрани, ги прави подходящи за използване като антибактериални лекарства или за други антибактериални приложения. а

Description

ХЕТЕРОЦИКЛИЧНИ СЪЕДИНЕНИЯ И ИЗПОЛЗВАНЕТО ИМ КАТО D-АЛАНИЛ- D-АЛАНИН ЛИГАЗНИ ИНХИБИТОРИ

Преглед на сродна патентна заявка с

Настоящата заявка претендира за ползата от U.S. временна заявка No 60/301 676, регистрирана на 28 юни 2001 г., която е включена тук в своята цялост.

Област на техниката

Изобретението се отнася до хетероциклични съединения и използването им например в профилактиката и или медицинското лечение на бактериални инфекции и използването им примерно като антисептици, стерилизанти или дезинфектанти.

©

Предшестващо състояние на техниката

Патогенните процеси, при които микроорганизми проявяват вредните си ефекти върху пациенти, обикновено са комплексни и изискват определена последователност от прояви, които включват множество микробни съставки. Ако останат без да се контролират, пролиферацията на микроорганизмите може да увреди пациента, в резултат на което се получават хронични инфекции или дори смърт. Често е необходимо да се подпомогнат механизмите на защита на приемника с екзогенни фактори като антибиотици за да се подпомогне изчистването на инфектиращия организъм от пациента.

Във времето, и частично благодарение на безразсъдното използване на съществуващите антибиотични режими на лечение, организмите са придобили увеличаваща се резистентност спрямо различните налични екзогенни фактори. Например, докладвана е резистентността на бактериите към флуорохинолони и бета-лактами и най-вероятно тя ще се засили през следващото десетилетие. Обстойно е описана и флуорохинолоновата резистентност на изолати от обичайна придобита пневмония в целия свят. Освен това има сериозно намаляване на чувствителността на щамове на Е. coli спрямо бета-лактами (например амоксицилин), благодарение на присъствието на R-TEM ензими към котримоксазол и триметоприм. Тези доклади илюстрират необходимостта и продължаващата нужда от откриване и разработване на тови антимикробиални лекарства с оглед да се осигури алтернативен и по-ефективен режими на лечение срещу увеличаващите се резистентни микроорганизми.

Техническа същност на изобретението

Изобретението се отнася до хетероциклични съединения, до състави включващи съединенията и методи за използване на съединенията и съставите от съединенията. Съединенията и съставите от съединенията са полезни за лечение на заболявания или симптоми на заболявания. Изобретението също осигурява методи за получаването на съединенията и методи за идентифициране на съединения с желаната биологическа активност.

Изобретението се базира на откритието, че някои хетероциклични съединения имат силна антибактериална активност и по-конкретно, активност срещу ензима Б-аланил-О-аланин лигаза (“D-Ala-D-Ala ligase”;

L.C. 6.3.2.4). Както е показано схематично по-долу, D-Ala-D-Ala лигазата се смята, че играе ключова роля в растежа на клетките чрез катализиране на групата D-аланил-О-аланин (“D-Ala-D-Ala”), един от изграждащите блокове, използвани за пептидогликановото напречно свързване, което е съществено за биосинтезата на стената на бактериалната клетката. Смята се, че ензимът осъществява пептидна връзка коята решително осигурява мястото на трансацилиране, когато пептидогликановата рамка е напречно свързана (Ellsworth et al., Chemistry & Biology, 3:37 - 44,1996). Без да имаме за цел да се обвързваме с каквато и да е теория по отношение на механизма на действие на новите съединения, смята се, че те се свързват към аденозин трифосфатното -(АТР-) свързващо място на D-Ala-D-Ala лигаза, а не към DА1а-свързващото място, правейки съединенията конкурентни по отношение С на АТР. В това отношение съединенията се различават от други D-Ala-D-Ala лигазни инхибитори като циклосерин и дипептидни фосфатни аналози, които са конкурентни инхибитори за D-аланин и се смята че свързват към Dаланиновото свързващо място на ензима.

Изобретението най-общо се отнася до съединения със следната обща структура:

и използването им.

По-специално, съгласно едно изпълнение, изобретението се отнася до съединение с формула:

R2 R3

в които А и В могат независимо да бъдат N или CR⁷, където R⁷означава водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислородсъдържаща функционална група (например водород или заместен или незаместен, провилинеен или с разклонена верига, или цикличен алкил, алкенил, алкинил, арил, аралкил или алкарилова група или производно на една или повече от тези групи в които хетероатоми могат да заместят един или повече въглерода и/или водородни атоми (например аминогрупи, алкиламино групи, хидроксилни и алкоксилни групи, тиолови групи, халогени, нитро групи, фенолни групи или други заместени ароматни или алифатни групи). R и R са еднакви или различни -NR R групи, където всяки R⁵ и R⁶ може независимо да означава водород или въглеродсъдържаща функционална група; R³ е водород или алкил, амино, хидрокси, алкокси или алкиламино група; R⁴ е въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислород-съдържаща функционална група, при условие, че (1) ако А и В и двата са азот и R⁵ и R⁶ и двата са водород, тогава R⁴ не е -NH₂, -И(Н)(метил), -И(Н)(бутил), -14(Н)(хексил), К(Н)(фенил), -М(Н)(бензил), -N(H)(NH₂), -N(H)(CH₂CH₂OH), N(CH₂CH₂OH)₂, фенил, N-пиперадинил или -S(eran);

(2) ако А е CH, В е азот и R⁵ и R⁶ и двата са водород, тогава R⁴не е метил, изобутил, фенил, 4-метилфенил, 4-хлорофенил, 4-бромофенил, 2(2,5-диметоксифенил)-етил или -СН(ОСНз)₂ и (3) ако А и В и двата са СН групи, тогава R⁴ е аминогрупа различна от -NH₂, (3,4-дихлорофенил)метиламино или (3,4дихлорофенил)метиленимино група.

В някои случаи и R⁵ и R⁶ и двата са водород.

R⁴ може да бъде примерно заместена или незаместена, линейна, разклонена или циклична алкилова, алкенилова, алкинилова, арилова, аралкилова или алкарилова група или производно на една или повече от тези групи. В някои случаи R⁴ включва най-малко една арилова група. Например, R⁴ може да бъде една от следните групи:

или

R10 о и където R могат независимо да бъдат водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислород-съдържаща функционална група (например линеен или разклонен алкил).

В друг пример, в който R⁴ включва арилова група, съединението може да има структурата:

η ι / в която R ' могат независимо да бъдат водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислород-съдържаща функционална група. Например R⁹ може да бъде водород или метил. В някои случаи съединението има структурата:

R12

R11 в която η означава 1, 2, 3 или 4 и R¹⁷ е -NR¹⁸R¹⁹, в която R¹⁸ и R¹⁹могат независимо да са водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислород-съдържаща функционална група. В някои случаи например R¹⁷ може да е една от следните групи:

R⁸ може алтернативно да бъде например -(CH2)_nNR^l8R¹⁹, където η означава 1, 2, 3 или 4 и R¹⁸ и R¹⁹ могат независимо да бъдат водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислород-съдържаща функционална

група.

R⁴ може алтернативно да бъде например -СН₂О-арил, -CH₂S-apnn, СН=СН-арил или -МН(СН₂-арил), където ариловата група може да бъде ароматен радикал, който съдържа само въглеродни и водородни атоми, (например фенил, нафтил, толуил) или включва и други атоми (например пиролил, пиридил, оксазолил, хлорофенил, бромонафтил).

R⁴ може алтернативно да бъде например -N(CH3)R²¹, -N(CH2CH₃)R²¹, -N(CH(CH3)2)R²¹, -N(6eH3wi)R²¹, -CH2NH₂, -NHCH₂CH₂NR²²R²³ или CH₂NHC(=O)R , където R ' ’ могат независимо да бъдат водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислород-съдържаща функционална група. В отделни случаи R²² е водород и R²³ е -C(=O)R²⁴, където R²⁴ може да бъде водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислородсъдържаща функционална група.

В други случаи R⁴ може да бъде такъв, че съединението да има следната структура:

R² R3

в която R²⁰ може да бъде водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислород-съдържаща функционална група.

NR25R26

26 в която R и R могат независимо да бъдат водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислород-съдържаща функционална група. Например, R^2:> може да бъде водород, алкил, хидроксиалкил или аралкил и R²⁶ може да бъде халогеналкил, хидроксиалкил, -C(=O)NR²⁷R²⁸, -C(=O)OR²⁷или NR R , където R и R могат независимо да бъдет водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислород-съдържаща функционална група. R може алтернативно да бъде -С(Н)(арил)( R ), където R може да бъде водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислородсъдържаща функционална група. В някои случаи, R²⁹ може да включва наймалко една ацилна група (например карбоксилат, кетон, алдехид, естер, амид или тиоестерна група). В тези или други случаи, ариловата трупа може да бъде нафтил или бензотиофенилна група. R може да включва алфахидрокси карбоксилатна група (например групата -C(R )(OH)(COOR’), в която R и R’ могат да бъдат водород или въглерод-, азот-, сяра-, халогени/или кислород-съдържаща функционална група).

Съгласно друго изпълнение изобретението се отнася до съединение с формула:

5 6 в която R и R могат да са еднакви или различни -NR R групи и всеки R⁵ и R⁶ може независимо да бъде водород или въглерод-съдържаща функционална група и R⁴ е аминогрупа различна от -NH₂ или

Съгласно друго изпълнение, изобретението се отнася до метод за инхибиране на О-аланил-О-аланин (D-Ala-D-Ala) лигаза. Методът включва етапа на излагане на D-Ala-D-Ala лигаза на съединение с формула I или формула II:

7 в които А и В могат независимо да бъдат N или CR , където R означава водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислородсъдържаща функционална група. R и R са еднакви или различни -NR R групи, където всяки R⁵ и R⁶ може независимо да означава водород или въглерод-съдържаща функционална група; R³ и R⁴ са независимо водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислород-съдържаща функционална група, при условие, че R³ и R⁴ не са и двата водород.

Например R¹ и R² могат и двата да са NH₂.

В някои случаи R³ и R⁴ могат да са независимо разклонен или с права верига алкил, -О-алкил, -О-алкил-СООН, -O-anKwi-NR⁷R⁸, -О-алкил-ОН, NR⁷R⁸, -NR⁷-anKHH-NR⁷R⁸, -Ш⁷-алкил-СООН, -М<⁷-алкил-ОН, -CO-NR⁷R⁸, CO-NR⁷-anKwi-NR⁷R⁸, -СО-ЬЛйЛалкил-СООН, -СО-ЬП<⁷-алкил-ОН, -S-алкил,

-S-алкил-СООН, -S-anKnn-NR⁷R⁸, -S-алкил-ОН, -О-арил, -О-арил-СООН, -011 apim-NR⁷R⁸, -О-арил-ОН, -S-арил, -S-арил-СООН, -S-apnn-NR⁷R⁸, -S-арилOH, -NR⁷-apHn-NR⁸R⁹, -NR⁷-apnn-COOH, -ЬЖ⁷-арил-ОН; -СОЖ⁷-арилNR⁸R⁹, -СОЖ⁷-арил-СООН, -СОЖ⁷-арил-ОН или -CH2NR⁵C6H4COOH; при условие, че R³ и R⁴ не могат едновременно да са еднакви алкилови групи с прави или разклонени вериги; R¹ и R² могат да са независимо водород, - NH2 или -NR^HR¹², където най-малко единия от R¹ и R² е - NH2; R⁵ може да е нисш алкил (т.е. С^алкил), водород или -CH2NR¹⁰C6H4CONHR⁶; където R⁶ е алкил, -алкил-СООН, -алкил-ИН2 или -алкил-ОН; R⁷, R⁸, R¹⁰, R¹¹ и R¹² могат независимо да бъдат с права или разклонена верига алкил, арил или ацилови групи, евентуално заместени с един или повече кислорода, азота, сяри или халоген-базирани функционални групи и А може да бъде N или СН.

Инхибираната D-Ala-D-Ala лигаза може да включва например секвенция, която е най-малко 90 % идентична със секвенцията на D-Ala-DAla лигаза от вид, подбран например от групата състояща се от Escherichia coli, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Xylella fastidiosa, Bordetella pertussis, Thiobacillus ferrooxidans, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Buchnera aphidicola, D Bacillus halodurans, Geobacter sulfurreducens, Rickettsia prowazekii, Zymomonas mobilis, Aquifex aeolicus termophile, Thermotoga marirtima, Clostridium difficile, Enterococcus faecium, Streptomyces toyocaensis, Amycolatopsis orientalis, Enterococcus gallinarum, Enterococcus hirae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Deinococcus radiodurans, Synechocystis sp., Salmonella typhimurium, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium smeegmatis, Legionella pneumophila, Leuconostoc mesenteroides, Borrelia burgdorferiq Treponema pallidum, Vibrio cholerae и Heliobacter pilori.

Съгласно друго изпълнение, изобретението се отнася до метод за лечение на пациент. Методът включва етап на прилагане към пациента на ефективно количестгво от съединение с формула I или с формула II:

в които А, В и R¹ ⁴ имат посочените по-горе значения.

Изобретението се отнася също така и до формулировка, която включва едно от горните съединения заедно с пълнител, който е подходящ за прилагане към пациент.

Изобретението се отнася също до метод за лечение на пациент, имащ бактериална микробна инфекция. Методът включва прилагане към пациента на ефективно количество от описаната по-горе формулировка. Пациентът може да бъде например животно като бозайник (например човек, кон, овца, куче, котка, заек, мишка, плъх, крава, бик, свиня) птица (например пиле, патица, пуйка, гъска, птица), риба (например сьомга, североамериканска речна риба, пъстърва, златна рибка) и други селскостопански, домашни и декоративни животни.

Съгласно друго изпълнение, изобретението се отнася до метод за лечение на пациент. Методът включва етап на приложение към пациента на ефективно колечиства от някое от горните съединения, евентуално с подходящ носител.

В друг аспект изобретението се отнася до метод за инхибиране растежа на бактерии в нежива система (например стерилизация, дезинфекция, убиване на бактерии in vitro). Методът включва етап на контактуване на системата (например средата, медицинско устройство, повърхности на баня и кухня, място за опериране) с ефективно количество от някое от горните съединения за да се инхибира растежа на бактериите.

При подбора на съединения за използване съгласно новите методи могат да се използват няколко параметра. Параметрите включват, без да се ограничава до тях, in vitro антибактериална сила и спектър на активност; физикохимични свойства като липофилност и разтворимост. Фармакокинетичните прояви на съединенията от изобретениието, както и тяхната in vitro бактериална активност покава, че съединенията от изобретението са полезни както при профилактиката, така и при лечението на пациенти с бактериални инфекции, като антисептици, стерилизанти или дезинфектанти.

Терминът “халоген” се отнася до радикалите флуор, хлор, бром или йод.

Термините “алкил”, “алкенил” и “алкинил” се отнася до въглеводороди с права или разклонена верига, съдържащи определен брой въглеродни атоми. Ако е конкретизирано, например “Смо” или “Cl - С10” показва, че групата може да притежава от 1 до 10 (включително) въглеродни атоми или може да е циклична (например съдържаща един или повече пръстена). Термините “пръсетн” и “пръстенна система” се отнася до пръстен, съдържащ определения брой атоми, като тези атоми са въглеродни или, когато е казано, могат да съдържат хетероатом като азот, кислород или сяра (например включително хетероциклична група). Самият пръстен, както и всички негови заместители, могат да бъдат прикрепени към всеки атом, който позволява образуването на стабилно съединение.

Терминът “арил” се отнася до 6-въглеродна моноциклична или 10въглеродна бициклична ароматна пръстенова систева, в която 0, 1,2, или 3 атома от всеки пръстен могат да бъдат заместени със заместител. Примери на арилови групи включват фенил, нафтил и подобни както и хетероарилови групи.

Терминът “хетероарил” се отнася до ароматна 5-8 членна моноциклична, 8-12 членна бициклична или 11-14 членна трициклична пръстенна система включваща 1-3 хетероатоми, ако е моноциклична, 1-6 хетероатоми ако е бициклична или 1 - 9 хетероатоми ако е трициклична, като тези хетероатоми са подбрани от Ο, N или S, където 0, 1, 2 или 3 атома от всеки пръстен могат да бъдат заместени със заместител. Примери на хетероарилови групи са пиридил, фурил или фуранил, имидазолил, бензимидазолил, пиримидинил, тиофенил или тиенил, хинолинил, индолил, тиазолил и подобни.

Терминът “хетероциклил” се отнася до неароматна 5-8 членна моноциклична, 8-12 членна бициклична или 11-14 членна трициклична пръстенова система, включваща 1-3 хетероатоми ако е моноциклична, 1-6 хетероатоми ако е бициклична или 1 - 9 хетероатоми, ако е трициклична, като тези хетероатоми са подбрани от Ο, N или S, където 0, 1, 2 или 3 атома от всеки пръстен могат да бъдат заместени със заместител. Примери на хетероцикличниии групи аса пиперизинил, пиролидинил, диоксанил, морфолинил, тетрахидрофуранил и подобни.

Комбинации от заместители и варианти, предвидени от изобретението са само тези, които водат до образуването на стабилни съединения. Терминът “стабилни”, изполван тук, се отнася до съединения, които притежават стабилност, която е достатъчна да позволи производството и запазването на цялостта на съединението за достатъчен период от време за да са приложими за целите описани тук (например лечебно или профилактично приложение към пациент или като антисептик, за импрегниране на рани, за стерилизация или като дезинфектанти).

Освен ако е казано друго, всички използвани тук технически и научни термини имат обичайно използваното значение, разбиращо се от специалист от областта към която принадлежи изобретението. При все че могат да се използват методи и материали подобни или еквивалентни на описаните тук в практиката или изпитването на настоящето изобретение, подходящи методи и матирали са описани по-долу. В случай на несъгласие, могат да се контролират от настоящето изобретение. В допълнение, материалите, методите и примерите са само с цел илюстрация, без да са ограничаващи.

Изобретението може да осигури няколко предимства в сравнение със съществуващите методи на лечение. Например, съединенията от изобретението могат да се свързват към ATP-свързващото място на D-Ala-DAla лигазния ензим с висока специфичност и са показали че са конкурентни с АТР при биохимични изпитания. Някои от описаните в изобретението съединения имат тяхни протеин-взаимодействащи функционални групи така поместени, че са способни дъ свързват също едно или двете от D-аланин свързващите места на D-Ala-D-Ala лигазата. Тези типове нови съединения (бисубстратни аналози) могат да имат също подобрена селективност и активност директно свързани със способността да свързват мостово АТРмястото и D-Ala мястото.

Някои от съединенията от изобретението могат да бъдат също така по-малко токсични от съществуващите антибиотици. Новите съединения свързват директно към D-Ala-D-Ala лигазата, един ензим намиращ се в бактериите, но не и в човек или други еукариотни клетки, така новите съединения най-общо не пречат на биологичните системи в пациентите. Тъй като пептидогликаните присъстват само в бактериите и отсъстват от бозайниковите клетки, специфичното инхибиране на D-Ala-D-Ala лигазата може да доведе до високоефективна антибактериална активност.

Нещо повече, някои от съединенията на изобретението могат да притежават няколко химически и фармакологически предимства пред съществуващите съединения, използвани за лечение на бактериални инфекции. Тези предимства могат да включват както химическа, така и фармакологическа стабилност, както и сила на активност, различни резистентни профили, различни профили на селективност и намалени странични ефекти. Активността и способността да въздействат като пречат на образуването на бактериалните клетъчни мембрани прави също новите съединения подходящи за използването им като антибиотични лекарства. Изобретението предвижда също ветеринарното им приложение за лечение на инфекции в риби, птици, домашни животни и други животни използвани за храна, за спорт и като домашни любимци.

Съединенията от изобретението са показали мощен широк спектър на активност срещу представителни групи от микроорганизми, включително Е. Coli, S. aurens, S. pneumoniae, H. Influenzae и други. За широка спектърна активност се заключава също от близката секвентна хомоложност в D-Ala-DAla лигазата на петдесет и един представителни, но еволюционно различни микроорганизми, представители на всички бактерии. Независимо от това, отделни съединения имат по-голяма активност срещу специфични бактерии, създавайки възможност за развитие също така на селективни и тесноспектърни средства.

Други предимства и характерни особености на изобретението ще станат явни от следващото подробно описание и от претенциите.

Изобретението се отнася до специфични описани тук съединения. Така едно изпълнение на изобретението са всички описани тук съединения, включващи съединенията изброени по-долу:

I

II γ

в които А и В на формули I и II са независимо или N-, -СН- или -CR -. R¹, R²’R³, R⁴ и R⁷ са независимо подбрани.

Съединенията от изобретението могат да се синтезират като се използват обичайни техники. С предимство, тези съединения се синтезират от готови достъпни изходни вещества. Най-общо, съединенията с описаните по-горе формули удобно се получават по методи, илюстрирани в схемите и примерите тук.

Така, едно изпълнение се отнася до метод за получаване на съединение с формулите описани тук, включващ синтезиране на едно или повече междинни съединения, илюстрирано в схемите за синтеза тук, и след това превръщане на това едно или повече междинни съединения в съединение с описаните тук формули. Друго изпълнение се отнася до метод за получаване на съединение с описаните тук формули, включващ синтезиране на едно или повече от илюстрираните в примерите междинни съединения и след това превръщане на това или тези междинни съединения в съединение с описаните тук формули при използване на една или повече от схемите на реакция, описани тук в схемите за синтез или примерите. Нукпеофилни средства са известни в областта и са описани в химическите текстове и монографиите, цитирани там. Използваните в горните методи химикали могат да включват например разтворители, реактиви, катализатори, реактиви за защитни групи и такива за премахване на защитата и подобни. Описаните по-горе методи могат също да включват етапи, било преди или след конкретните описани тук етапи, за прибавяне или отстраняване на подходящи защитни групи за осигуряване на синтезата на съединенията с описаните тук формули.

Както се подразбира от специалист от областта, схемите на синтез тук нямат за цел включването на всички средства с които могат да се синтезират описаните тук и предмет на претенциите съединения. В допълнение, различни синтетични етапи описани по-горе могат да се проведат в алтернативна последователност с оглед получаването на желаните съединения. Синтетични химически трансформациии и методологии за защитни групи (защита и премехване на защитата), полезни при синтезирането на описаните тук съединения са известни в областта и включват например тези публикувани от R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T. W. Green and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2^nd, Ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); Μ. B. Smith and J. March, March’s Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms, and Structure, 5 Ed., Wiley Interscience (2002); and L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995) и последващи тяхни издания.

В един характерен метод, съединенията могат да бъдат скринирани за антибактериална активност срещу множество различни бактериални щамове. Съединенията се изпитват за сила и ширина на спектъра на активност срещу няколко щама с оглед да се идентифицират водещите съединения. Съединенията могат да се скинират за бактериостатична активност (т.е. предпазване от бактериален растеж) и/или бактерицидна активност (т.е. убиване на бактериите). Водещите съединения могат да се оптимизират, например чрез вариране на заместителите за да се получат производни съединения. Производните могат да се получат едно по едно или да се добият като се използват успоредни или комбинативни синтетични методи. Във всеки от случайте, производните могат да се изпитат за получаване на данни за връзката структура- активност (SAR), която може да се използва за по-татъшно оптимизиране на водещите съединения.

Проектиране, синтези и биохимично оценяване на лигазни инхибитори

Проектирани са аналози като се използват различни подходи включващи традиционна медицинска химия, систематични аналози (например систематично изпитване на аналози с вариране на дължината на алкиловата верига, на изостеричните функционални групи, на различни ароматни заместители), при използване на рентгенов кристален структрен анализ на остатъците, молекулно моделиране и експерименти с компютърно вмъкване (docking) в активното място, компютърен анализ на разновидностите и интерактивно обратно захранване при използване на резултатите от биохимичните експерименти. Аналозите бяха синтезирани като се използват различни синтетични методологии, по-рано описани в литературата от специалисти в областта. Получените аналози след това се анализират като се използват описаните биохимични методи за да се получат данни за активност. Различни примери на някои от аналозите са описани поф долу.

Ние идентифицирахме различни заместители в 6-та и 7-ма позиция на хиназолини, птеридини, пиридопиримидини и пиримодинопиримидини, които имат силна лигазна инхибиторна активност. Таблица 1 по-долу показва разнообразни заместители в 6-та и 7-ма позиция, способни да инхибират лигазния ензим (водородни атоми, необходими за запълване на валентността на азота, кислорода и въглеродните атоми в съединенията не са показани, но специалст от областта подразбипа че присъстват).

Таблица 1

структура	Ki (E.coli лигаза)/ МкМ
оО ϊ Хг⁰ /хг	73
N	31
-υάοφ	37

АХА.	1
	55
	20
	12
	20
	29
Λχ^ .	14
N Chiral ЛаДХА]	16
	3
	9

	13
N ”'Sx	12
N λΧα/υ N	2
Лгч °Ύ1 _l^Si^>Sr^,№^—^Νηρ\ ο α	12
111 _Ν ΓΊ) 0	92
-¼⁰	14
	0.59
	0.50
	2.9
	1.00

J.

У	0.50
0	8.7
Ν	0.13

N7 -заместване при използване на нисши алкилови групи

Различни аналози на N7 - азота (R1 в таблица 2 по-долу) могат да се получат за да се увеличи активността. Най-силните идентифицирани нисши алкилови и циклоалкилови заместители са метил, етил, алил и циклопропил метил. Заместване в алфа позицията (R2 в таблица 2) е позволено, в някои случаи СНз и С2Н5 драматично увеличават активността. Няма да е изненадващо, ако други заместители в позиция R2 също увеличат активността за лигазно инхибиране. Заместването на нафтиловия пръстен в

4-та позиция увеличава активността като се използват -Н, -СНз или халоген. Заменянето на нафтиловия пръстен с различни хетероцикли (например бензотиофен) е намерено, че дава аналози, които притежават силна in vitro ензимна активност. При тази серия аналози, R-алфа-метил стереоизомерите са значително по силноактивни от рацематите. S-алфа-метил стереоконфигурацията осигурява аналози с по-широк спектър на лигазна активност, за сметка на висока присъща активност срещу Е.coli лигаза.

Таблица 2

N-R1	R2	R2 хиралност	R3	Е. coli лигаза (мкМ)	Staph, лигаза (мкМ)
-СНз	СНз	R/S	Н	0.718	9.28
-СН₃	С₂н₅	R/S	Н	0.452	4.60
-СНз	СНз	R	Н	0.326	26.80
-СНз	СНз	R/S	СНз	0.277	12.25
-СНз	СНз	R/S	4,5- бутилен	0.240	12.00
-СНз	СНз	R/S	С1	0.201	4.90
СНз	СНз	R	F	0.104	27.00
-СН₂СН₃	СНз	R/S	F	0.257	19.00
-СН₂СНз	СНз	R/S	СНз	0.210	38.50
-СН₂СН₃	СНз	R	СНз	0.102	71.00
-СН₂СН=СН₂	СНз	R/S	Н	0.258	30.50
-СН₂СН(СН₂)₂	СНз	R/S	Н	0.345	17.00
-СН₂СН(СН₂)₂	СН₃	R/S	Вг	0.279	25.00
-СН₂СН(СН₂)₂	СНз	R/S	СНз	0.211	37.00
-СН₂СН(СН₂)₂	СНз	R/S	С1	0.179	29.00
-СН₂СН(СН₂)₂	СНз	R	СНз	0.174	62.00

Бета-аланин амидни аналози

Амиди, синтезирани при използване на бета-аланинов линкер, имат широкоспектърна активност. Най-силният широкоспектърен инхибитор, идентифициран от тази серия, е етилендиамин амидно производно (т.е. първото съединение в таблица 3 по-долу), което има Ki’s за Е. coli и Н. influenzae лигази по-малки от един микромоларни; S. aurens и S. pneumoniae лигазна активност са едноцифрени микромоларни количества (виж таблица 3). Мета-аминометилбензиламинови аналози (т.е.третото съединение от таблица 3) е намерено че има Ki’s по-малко от 1 мкМ срещу 3 от 4 лигази в панела. По подобен начин, последното съединение в таблица 3 е силно активно срещу три лигазни вида. Четвъртото съединение в таблица 3, при което първичният амин е заместен с амидин, показва активност подобна на тази на първото съединение.

Таблица 3

N	4оларна структура	E.coli лигаза Ki/OAT P (мкМ) средно	H.infl. лигаза Ki/OAT P (mkM) средно	Staph. лигаза Ki/OATP (mkM) средно	Strep, лигаза Ki/OA TP (mkM) средно
		£Н₃	0.7	1.0	4.7	1.9
nh₂	\ / \
		jvJH
ЬГ
η₂ν^ν^	Γ ^Ν —/ (
		Л

/ νη₂	V 0

Ν	Соларна структура	E.coli лигаза Ki/OAT P(mkM) средно	H.infl. лигаза Ki/OAT P(mkM) средно	Staph, лигаза Ki/OATP (mkM) средно	Strep, лигаза Ki/OA TP (mkM) средно
t ν' H₂hT^^xi'	\1Н₂ ч	d3 ’ ^kN^N-^Z ( Г~\	9.6	0.267	9.5	3.1
		N-^ H
r J н₂ьгЧ	JH₂ k k )	QH₃ A	5.3	0.4	0.9	0.9

Ν	1оларна структура	E.coli лигаза Ki/OAT Р(мкМ) средно	H.infl. лигаза Ki/OAT Р(мкМ) средно	Staph. лигаза Ki/OATP (мкМ) средно	Strep, лигаза Ki/OA ТР (мкМ) средно
		рн₃	1.0	0.6	6.3	1.4
νη₂	\ /~А
		°\ /А
A
Η,Μ^Ν^	А )=/
^Η%	r	А
H₂l·/
		0
		рн₃	1.9	1.3	3.8	4.1
νη₂	\ г~\
		⁰ \ /А
	ч
	A >—/ >Γ*>Ι---/ (
Ν		У\
		0

Моларна	структура	E.coli лигаза Ki/OAT Р (мкМ) средно	H.infl. лигаза Ki/OAT Р (мкМ) средно	Staph. лигаза Ki/OATP (мкМ) средно	Strep, лигаза Ki/OA ТР (мкМ) средно
	рн₃	8.7	1.8	1.2	1.6
nh₂	< гл
	/ X

H₂tT^N^	/ /
Н₂М—f
\=/	0

Карбоксилни киселини и алфа-хидрокси карбоксилни киселини

Първото съединение в таблица 4 е предоставено като пречистена чрез ВЕТХ смес на най-малко два стереоизомери. Анализът на кристалната структура на протеиновия лиганд на това съединение показва два стереоизомера, чиято стереохимия бе определена да е (2-R, 1 ’-S) и (2-S, 1 R). Номер 2 отговаря да е в алфа хидрокси позиция, номер 1 ’ отговаря да е в алфа-метил позиция. Двата наблюдавани изомера са енантиомерни, т.е. те са огледални изображения. Е. coli лигазната активност на последното съединение от таблица 4 е намерена че е 143 нМ. Съединението има относително широк спектър на активност срещу Н. Influenzae (566 нМ), Staph (4.1 мкМ) и Strep (2.6 мкМ).

Таблица 4

Модна структура	Е.соН лигаза K1/ATP (uMJcpex	Н. Influenzae лигаза Ю/АТР (иМ)сред	Staph лигаза Ю/АТР (иМ)сред	Strep I лигаза I Ю/АТР \| . (иМ)сред.

	0.611	-	7.8	-
Л&ь	S3	3.7	6.7	2.1
	42	5.7	10	14.6

	1Л	3.5	43	4.3

	0.143	0.565	4.1	2.5

К7-пъвичен бутиламин SAR

Максимална in vitro активност в тази серия имат съединенията с бутиламино верига при N7-азота (т.е. третото съединение в таблица 5). Алфа-метил-нафтил хиралният център може да бъде заменен с ахирален 2етоксинафтилен заместител (виж четвъртото съединение в таблица 5) и все още да запази силната си лигазна активност. Ахиралната молекула има поширок спектър на лигазна активност и бе намерено, че има Ki 102 нМ срещу лигаза, изолирана от Е. coli.

Таблица 5

Молна структура	E.coll лигаза КУАТР (UM) сред	н. Influenzae лигаза Ki/ATP (иМ)сред.	Staph лигаза Ю/АТР (иМ)сред.	Strep лигаза K1ZATP (иМ)сред.
	2	2.7	58	439
	0.457	5.5	45	81.2
	0.135	4.2	32	23.1
	0.105	0.52	15	4.5,
Η.				/

Допълнителни аналози

Общи синтетични методилогии, използвани при получаването на аналози

Синтеза на пиримидопиримидини

N R'

NH₂ R'

Пиримидопиримидинови съединения от изобретението могат да се получат като се използват различни синтетични подходи. Пиримидопиримидиновата пръстенова система можеда се синтезира в многоетапна поредица от реакции от подходящо заместен амидин (R7C=NHNH2) и К5-заместен алкоксиметиленмалонитрил. Полученият цианоаминопиримидин може да се кондензира с гуанидин за да образува пиримидопиримидинова пръстенова система. В случай когато R7 в цианоаминопиримидина е —Cl, Вг или S-нисш алкил, тези отцепващи се групи могат да бъдат заместени със заместени азотни или кислородни нуклеофили да за дадат R7-N(wih О)-заместени алкил или арил междинни съединения. Тези междинни съединения могат да се циклизират до съответните им пиримидопиримидини с подходящи, заместени в 7-ма позиция съединения.

за синтезиране на пиримидопиримидини е нуклеофилна атака на амини

7-аминозаместени върху 6-амино-2бромопиримидин-5-карбонитрил (хлоро или тиометил или тиоетил могат също да се използват като отцепващи се групи във 2-ра позиция) и последващо циклизиране на получения, подходящо заместен цианоаминопиримидин с гуанидин.

Ако въздействащия подходящо заместен нуклеофилен цианоаминопиримидин не е търговски достъпен, тогава той може да се получи като се използват стандартни методи от органичната химия. Един такъв стандартен метод, който може да се използва за получаване на съединенията от настоящото описание, е чрез редуктивно аминиране.

*

В този добре известен метод, алдехид или кетон се кондензира с подходящо заместен амин в присъствието на меко редуциращо средство като натриев цианоборохидрид или цинков цианоборохидрид.

Бета-аланин амиди и алфа-хидрокси-бета-аланин амиди

NH₂

ОН

Амидите могат да се синтезират чрез взаимодействие на тяхните

съответни карбоксилни киселини с различни първични и вторични амини. Прибавянето на различни реактиви, орисани в литературата, са полезни за улесняване на амидния купелуващ процес. Включени в тези реактиви са карбонилдиимидазол (CDI), дициклохексилкарбодиимид (DCC), HBTU, диетилфосфороцинидат и ВгоР.

Бутиламинови аналози

N

^R

Бутиламиновите аналози се синтезират като се използва многоетапен път на синтеза. Най-общо, моно-Ьос защитен бутандиамин взаимодейства при условия на редуктивно аминиране за да даде подходящо заместен моноЬос защитен нафтилметиламин. Вторичният амин взаимодейства с 6-амино35

5-циано-2-халопиримидин и полученото междинно съединение се циклизира с гуанидин, последвано от Ьос-отцепване при кисели условия за да се получат незащитени бутан диаминови аналози.

Методи на директно хетероциклично заместване

Н₂

NH₂ R⁵

R7

Съединения от изобретението могат също да се получат чрез ароматно нуклеофилно разместване на отцепващите се групи в 7-ма позиция на 2,4-диаминопиримидопиримидина. Тези отцепващи се групи [LG] включват, без да се ограничава до тях: -Cl, -Br. -SCH₃, -SC₂H₅ и -N(CH₃)₃. Използваните при разместващата реакция нуклеофили могат да бъдат -Nалкил, -N-арил или заместени алкил или арил амини или -О-алкил, -О-арил или заместени алкохоли или феноли.

Синтез на птеринови аналози

Най-общо 6- или 7-заместени птеринови аналози могат да се получат чрез взаимодействие на активиран реактив като 6- или 7-хлорометил птерин с нуклеофили като амини и чрез различни други методи, описани в литературата или функционални групи в 6- или 7-ма позиция на птерин като бромометил, йодометил, хидроксиметил, активиран хидроксиметил, карбонил, активиран карбонил, хидрокси, хлоро, бромо или метил могат да се използват като синтетични реактиви за получаването на 6- или 7заместени аналози.

HNRR'

-------->.

NRR

Горният общ начин на синтез може да се използва за синтезиране на широк спектър от 7-заместени птеридинови аналози. В общия метод, 7хлорометил и подходящия амин взаимодействат в подходящ разтворител като диметилформамид или 2-метоксиетанол толкова продължително, колкото е необходимо за протичане на реакцията, което се определя чрез анализ на реакционната смес с ВЕТХ, ТСХ или ЯМР. След това

разтворителят се отстранява и продуктът се пречиства по подходящ метод, обикновено чрез утайване, прекристализиране, отново утаяване на сол чрез база или чрез хроматографиране.

Форулировки, солеви форми и пролекарства

Както се използва тук, съединенията от настоящето изобретение, включително съединенията с описаните тук формули, могат да включват фармацевтични приемливи производни или тяхни пролекарства. “Фармацевтично приемливо производни или пролекарство” означава всяка фармацевтично приемлива сол, естер, сол на естер или друго производно на съединение от изобретението, което след приложение върху реципиент, е способно да осигури (директно или индиректно) съединение от това изобретение. Особено предпочитани производни и пролекарства са тези, които повишават биодостъпността на съединенията от изобретението, когато те се приложат към бозайник (например чрез позволяване на орално приложено съединение по-лесно да се абсорбира в кръвта) или ускорява отдаването на изходното съединение в биологическата част (например мозъкът или лимфната система) в сравнение с изходния вид. Предпочитани пролекарства включват производни, където група, която подобрява водната разтворимост или активния транспорт през чревната мембрана зависи от структурата на описаните тук формули. По-специално, могат да се получат класически примери на естерни пролекарства, които да подпомагат абсорбцията и проникването през клетъчната мембрана на аналози, съдържащи свободни карбоксилни киселинни функционални групи.

Съединенията от изобретението могат да се модифицират чрез подходящи функционалности за да се подобрят селективни биологични свойства. Такива модификации са известни в областта и включват такива, които увеличават биологичното проникване в дадена биологична част (например кръв, лимфна система, централна нервна система), увеличават оралната достъпност, увеличават разтворимостта за да могат да се прилагат чрез инжектиране, променят метаболизма и променят скоростта на екскретиране.

Фармацевтично приемливи соли на съединенията от настоящето изобретение включват такива, получени от фармацевтично приемливи неорганични и органични киселини и бази. Примери на подходящи киселинни соли са ацетат, адипат, алгинат, аспартат, бензоат, бензенсулфонат, бисулфат, бутират, цитрат, камфорат, камфорсулфонат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсулфати, етансулфонат, формиат, фумарат, глюкохептанат, глицерофосфат, гликолат, хемисулфат, хептанат, хексанат, хидрохлорид, хидробромид, хидройодид, 2-хидроксиетансулфонат, лактат, малеат, малонат, метансулфонат, 2-нафталенсулфонат, никотинат, нитрат, палмат, пектинат, персулфат, 3-фенолпропионат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, салицилат, сукцинат, сулфат, тартарат, тиоцианат, тозилат и ундеканат. Други киселини като оксалова, въпреки че те самите не са фармацевтично приемливи, могат да бъдат използвани при получаването на соли, които са полезни като междинни съединение при получаването на съединенията от изобретението и тяхни фармацевтично присъединителни с киселина соли.

Соли, получени от подходящи бази включват алкалнометални (например натриева) на алкалоземните метали (например магнезиева), амониева и Ь^алкил)/ соли. Изобретението има предвид също кватернизирането на всяка основна азотсъдържаща група и включените в нея съединения. При такова кватернизиране могат да се получат разтворими във вода или масло продукти.

Изпитания за инхибиране на D-Ala-D-Ala лигаза

Инхибиране на D-Ala-D-Ala лигазата може да се проведе чрез използване на пируват киназа/лактатно дехидрогеназно (PK/LDH) изпитание, описано в пример 2 и както е описано в литературата (например от Sarathy et al., Anal, Biochem., 254: 288 - 290, 1997). В синтезния процес на бактериалната клетъчна стена, лигазата катализира превръщането на аденозин трифосфат (АТР) в аденозин дифосфат (ADP) конкурентно с лигирането на двата D-аланинови остатъка за да образува D-аланил-Оаланин. След това РН регенерира АТР от ADP, симултанно създаден с конверсията на фосфопирувата в пируват. LDH катализира редукцията на пировата до лактат чрез превръщане NADH в NAD⁺. Чрез наблюдаване на скоростта на получаване на NAD⁺ (например при използване на UV/Vis спектроскопия , може да се потвърди D-Ala-D-Ala лигазната активност.

Съединенията могат да се скринират за % на инхибиране, както е описано в пример 3.

Константата на инхибиране Ki и начина на действие могат да се получат както е описано в пример 4.

Протеиновата секвенция за ензимната D-Ala-D-Ala лигаза се определя при различни бактериални видове, като се използва стандартна техника от биохимията (виж таблица 5). Протеиновата секвенция от всичките видове може да се свръхекспресира в подходящ приемников организъм като Е. coli при използване на стандартни молекулярни биологични техники. Лигазният ензим може да се отдели, да се пречисти и да се използва в гореописаното изпитание за определяне на инхибиторната активност.

In vitro изпитания за антибактериални активност

Съединенията могат да бъдат скринирани за антибактериална активност като се използват стандартни методи. При един пример, илюстриран в пример 5 по-долу, се използват техники на микроразреждане на бульон за измерване на in vitro активността на съединенията срещу дадена бактериална култура и да се получат данни за минимална инхибираща концентрация (MIC).

Изпитание чрез микроразреждане за антимикробна чувствителност

Изходни разтвори от изпитваните съединения се получават в Ν,Νдиметилформамид в концентрация 5 мг/мл. След това от изходните разтвори се изготвят работни разтвори от изпитваните съединения в бульон на Mueller - Hinton (МНВ) с начална концентрация 64 мкг/мл.

Бактериален инокулум се получава от култура от една нощ (т.е. пресна колония от агарова паничка в 5 мл МНВ; Н. Influenzae се отглежда в МНВ с прибавяне на дрожден екстракт, хематин и NAD), центрофугира се 2 х 5 мин /3000 об/мин (за S. pneumoniae r Н. Influenzae, 2 х 10 мин /3000 об/мин) и се диспергира в 5 мл пресен МНВ всеки път, така че бактериалната суспензия се разрежда за да се получат 100 колонии, образуващи единици (cfu) в микроплочно кладенче (100 мкл общ обем).

Кладенчетата в микроплаката се запълват с двукратни разреждания на изпитваното съединение (50 мкл), като се започне с 64 мкг/мл. Кладенчетата след това се пълнят с 50 мкл бактериален инокулум (краен обем: 100 мкл/кладенче). Плочките се инкубират при 37° С 18-24 часа (S. pneumoniae расте в обогатена с СО₂ атмосфера).

Оптичната плътност на всяко кладенче се измерва след това при 590 нм (OD₅₉o) с TECAN SpectroFluor Plus®, и се определя минималната инхибираща концентрация (MIC) като концентрация, която показва 90 % инхибиране на растежа. В един пример, показан в пример 5, техниките на микроразреждане на бульона се използват за измерване на активността in vitro на съединенията по отношение на дадена бактериална култура, за да се получат данни за минимална инхибираща концентрация (MIC).

Антимикробиален агар-разреждащ тест

Това оценяване по същество се провежда както е описано в известната литература [виж например NCCLS. Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria; Approved Standart-Fourth Edition. NCCLS document Μ 11-A4. NCCLS: Wayne, Pennsylvania; 1997].

Агарова среда: Brucella кръв се допълва с хемин (5 мкг/мл), 5 % овча кръв и витамин Κι (1 мкг/мл).

Антимикробни средства: Стандартен антимикробен прах (например азитромицин, хлорамфеникол, нитрофурантоин, пиперацилин, клиндамицин, пеницилин, имипенем) и изпитваното съединение се приготвят като изходни разтвори (5120 мкг/мл в диметилформамид) и се разреждат както е показано на таблица 3 от NCCLS Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria; Approved Standart-Fourth Edition 1997; M11-A4, Vol. 17, No 22.

Получаване на инокулума: Изпитваните анаеробни щамове се подбират от агар с обогатена Brucella кръв. Части от пет колонии директно се суспендират в Brucella бульонна среда за да се постигне помътняване еквивалентно на 0.5 McFarland стандарт.

Начин на работа: Средата се получава съгласно указанията на производителя и се разпределя в епруветки със винтови запушалки. В деня на изпитанието, се прибавя кръвна добавка и 2 мл от всека концентрация на антимикробно средство към съответната епруветка на охладен (50° С) агар. Сместа от среда и антимикробно средство се излива върху стандарни 15 х 100 мм) кръгли петриеви панички и се оставят да се втвърди. Нагласена по мътност култура от всеки анаеробен щам се инокулира към всяка паничка чрез реплициращо устройство (приблизително 2 мкл за петно). Инокулираните панички се инкубират при 35° С в анаеробен съд. Резултатите се отчитат след 48 часа инкубиране и се изразяват като стойност на минимална инхибираща концентрация.

In vivo изпитания за антибактериална активност

Съединенията могат също така да се изпитат за антибактериална ефективност при лабораторни животни. Тези изследвания in vivo включват, без да се ограничава до тях, системнии външни модели на инфектиране, модели с инфекции на пикочопроводните пътища, сепсис, колит с посредник антибиотик и обработка на рани. Съединенията от изобретението могат също да се оценят при животни за да се преценят фармакологичните им профили като оралната биодостъпност, оралната абсорбция, химическия полу-живот, идентификация на метаболитите, серумни нива в различни времена и примерно скорост на екскретиране.

Животински модели със системна бактериална инфекция

В литературата са описани системни модели с инфекция. Могат да се използват следните условия за изпитване на съединенията и тяхното приложение. Бактериите се отглеждат в Mueller - Hinton среда при 37° С в продължение на 24 часа. За всеки експеримент се приготвя бактериална суспензия чрез инокулиране 4-5 бактериални колонии в Mueller - Hinton бульон (МНВ) и чрез инкубиране при 37° С 24 часа за да се получат приблизително 10⁹ CFU/мл. BalbC женски мишки се доставят от Charles River. Животните се инфектират чрез едно единствено приложение на LDioo

Λ доза от бактериална културална суспензия (1x10 CFU/100 мкл за животно) във вената на опашката. Внимателно клинично проверяване се прави няколко пъти на ден и се отчитат явните клинични симптоми и смъртност. Преживяемостта на животните се наблюдава за период от 6 дни. Азитромицин се разтваря в 0.5 % метоцел във физиологичен разтвор и се прилага орално. Изпитваните съединения се микронизират на хаван с пестик и след това се разтварят в метозелов физиологичен разтвор с 3 % диметилформамид. Първата доза се прилага 30 минути след инфектирането с последващи дози на всеки 12 часа в продължение на 3 дни.

Изпитания за биохимични и хизико-химични свойства

Хетероцикличните съединения от настоящето изобретения могат да бъдат оптимизирани за тяхната in vitro “антибактериална” активност съгласно резултатите от два типа методи, структурна методология и физикохимична методология. Химическата структура може да се модифицира като се използват комбинации от заместители за да се получат съединения, които задоволяват някои или всички от следващите критерии: 1) съединение, при което изчислената или експериментално определена липофилност (logP) е в границите на 0 до 2 logP единици; 2) съединение, което е субстрат за D-AlaD-Ala лигазен ензим; 3) съединение, в което водната разтворимост е поголяма от 1 мкг/мл. Тези физико-химични и биохимични свойства са фактори при антимикробните ефекти, наблюдавани при пациентите (например животни).

Клинично използване на хетероцикличните съединения

Съединенията, съгласно претенциите на настоящето изобретение, могат да се използват лечебно или профилактично за лечение или предпазване от бактериални инфекции и/или заболявания.

Изобретението се отнася също така до методи, например за нарушаване на вътрешната регулация на микробния растеж в пациент, включващ етапа на прилагане към пациента на съединение с някоя от формулите описани тук или на състав, включващ съединение с някоя от формулите описани тук. Съгласно едно изпълнение, изобретението се отнася до метод за инхибиране на микробната или бактериална активност в пациент, включващ етап на прилагане на съединение към пациента или на състав включващ съединение с някоя от описаните тук формули. С предпочитание, пациентът е човек или животно.

Съгласно алтернативно изпълнение, изобретението се отнася до метод за лечение на заболяване или болестни симптоми в пациент, включващ етап на прилагане към пациента на съединение или състав включващ съединение с всяка от формулите описани тук. Предпочита се пациентът да е човек или животно.

Инфекции и инфекциозни заболявания се причиняват от различни микроорганизми. Съединенията от изобретението могат да намерят приложение при медицинско лечение на инфекциозни заболявания от бактериални източници.

Съединения, които убиват или ограничават растежа на микроорганизми могат да намерят приложение при лечението на инфекции или инфекциозни заболявания. Специфични бактериални микроорганизми е известно че са свързани с тип инфекция или инфекциозно заболяване. Някои примери на бактериални инфекции и тяхни най-чести патогенни причинители са дадени по-долу.

Инфекции на горния и долен дихателен път включват, без да се ограничава до тях: бронхит, синузит, пневмония, болно гърло, хронични стрептококови инфекции, дифтерит, акутен епиглотит, инфлуенца, хроничен бронхит, възпаления на средното ухо (otitis media), пневмония, бронхопневмония, легионерска болест, атипична пневмония, магарешка кашлица и туберкулоза.

Бактериални микроорганизми, причиняващи инфекции на дихателния път, включват, без да са ограничени до тях: S. pneumoniae, S. aurens, Η. influenzae, M. catarrlialis, N. meningitidis, B. pertussis, Enterobacteriaceae, anaerobes, Nocardia, Pseudomonas, C. psittaci и C. diphtheriae.

Инфекции на пикочопроводните пътища включват, без да се ограничава до тях: уреит, цистит, пиелонефрит, (възпаление на бъбреците), асимптоматична бактеруриа, интерститален цистит, акутен уретрален синдром и повтарящи се инфекции на пикочопроводния път.

Бактериални микроорганизми, причиняващи инфекции на пикочопроводния път, включват, без да са ограничени до тях: Е. Coli,

Proteus, Providentia, Pseudomonas, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Coag. neg. Staphylococci и C. trachomatis.

Кожни и инфекции на рани включват, без да се ограничава до тях: еритразма, панариций, импетиго, фоликулит, еризипел, целулит и некротизиращ фасциит.

Бактериални микроорганизми, причиняващи инфекции на кожата и раните, включват, без да се ограничава до тях: Streptococci, Staphylococci, Р. aeruginosa, Р. Acnes, Clostridia, anaerobes и B. fragilis.

Бактериални микроорганизми, причиняващи системни инфекции (бактеримия) включват, без да се ограничава до тях: Streptococci, Staphylococci, Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Bacteroidea s., Neisseria, H. influenzae, Brucella, Listeria и S. typhi.

Полово преносими заболявания от бактериален произход включват, без да са ограничени до тях: аднексит, цервицит, ханхроид, уретрит, баланит, гонореа, лимфогрануломо венереум, сифилис и гранулома ингуинале.

Бактериални микроорганизми, причиняващи полово преносими инфекции включват, без да се ограничава до тях: Chlamydia, N. gonorrhoeae, U. urealyticum, Т. pallidium, G. vaginalis, H. ducreyi, C. granulomatis, Streptococci, Staphylococci и Enterobacteriae.

Стомашночревни инфекции c бактериален произход включват, без да са ограничени до тях: предизвикани от храна инфекции, колит, ентерит, стомашнии язви, язви на дванадесетопръсника, панкреатит, възпаления на жлъчния мехур, холера и тифус.

Бактериални микроорганизми, причиняващи инфекции на стомашночревния път включват, без да се ограничава до тях: Н. pylori, С.

duodeni, S. typhi, S. paratyphi, V. cholerae, anaerobes, Enterobacteriaceae,

Streptococci и Staphylococci.

Методи за лечение на пациентите

Хетероцикличните съединения с описаните тук формули могат да се прилагат към пациент например с оглед лечението на инфекция като бактериална инфекция. Хетероцикличните съединения могат, примерно, да се прилагат във фармацевтично приемлив носител като физиологичен разтвор, в комбинация с други лекарства и/или заедно с подходящи пълнители. Хетероцикличните съединения с формулите тук могат, примерно, да бъдат прилагани чрез инжекции, венозно, артериално, субдермално, интраперитонеално, мускулно или подкожно; или орално, в устата, в носа, в лигавицата, външно в препарат за очи или ухо, или чрез инхалиране, в доза в границите на около 0.001 до около 100 мг/кг телесно тегло, за предпочитане в дози между 10 мг и 5000 мг/доза, на всеки 4 до 120 часа или съгласно изискването на конкретното лекарство.

Както е ясно на специалистите, може да са необходими по-малки или по-голями дози от цитираните по-горе. Конкретните дозировки и режими на лечение за всеки конкретен пациент ще зависят от различни фактори, включително активността на специфичното използвано съединение, възраст, телесно тегло, общото здравословно състояние, пола, хранителния режим, времето на приложение, скоростта на екскретиране, комбинацията от лекарства, сериозността и хода на заболяването, предразположението на пациента към заболяването, състоянието или симптомите и преценката на лекуващия лекар.

При подобряване на състоянието на пациента, може да се прилага при нужда поддържаща доза от съединение, състав или комбинация съгласно изобретението. След това, дозата или честотата на приложение или и двете могат да се намалят, като функция от симптомите или нивото на което се запазва подобреното състояние, когато симптомите се облекчат до желаното ниво, лечението може да се прекрати. Пациентите могат обаче да изискват продължително с прекъсване лечение с оглед отново появяване на болестните симптоми.

Съгласно алтернативно изпълнение, изобретението подобрява методите за лечение, предпазване или облекчаване на симптомите на заболяване в бозайник включващо етап на прилагане към бозайника на някои фармацевтични състави и комбинации описани по-горе. С предпочитание, бозайникът е човек. Ако фармацевтичният състав включва само съединение от настоящето изобретение като активна съставка, такива методи могат допълнително да съдържат етап на прилагане към бозайника на допълнително лечебно средство като например макролиден антибиотик (например кларитромицин), протонни инхибитори (например омепразол), рифамицини (например рифампин), аминоглукозиди (например стрептомицин, гентамицин, тобрамицин), пеницилини (например пеницилин G, пеницилин V, тикарцилин), β-лактамазни инхибитори, цефалоспорини (например цефазолин, цефаклор, цефтазидим) и антимикробни средства (например изониазид, етамбутол). Други подходящи средства са дадени в текстове и публикации за инфекциозни болести, включващи например Principles and Practice of Infectious Diseases, G. L. Mandell et al., eds., 3^rd ed., Churchhill Livingstone, New York, (1990). Такова или такива допълнителни средства могат да се прилагат към бозайника преди, успоредно или след прилагането на състава със съединение с всяка от формулите тук.

Фармацевтичните състави от изобретението включват съединение с формулите описани тук или тяхна фармацевтично приемлива сол и допълнително средство подбрано от противораково средство, противовирусно средство, противогъбично средство, антибиотик и всякакви фармацевтично приемливи носители, добавки или пълнители. Алтернативни състави от настоящето изобретение включват съединение с описаните тук формули или негова фармацевтично приемлива сол и фармацевтично приемливи носители, добавки или пълнители. Такива състави могат евентуално да включват допълнителни лечебни средства, включително например допълнително средство подбрано от противораково средство, антимикробно средство, антивирусно средство, протонен инхибитор или антибиотик. Описаните тук състави включват съединенията с формулите описани тук, както и евентуално допълнителни лечебни средства, в количества, ефективни за постигане на промяна в микробните или бактериални нива.

Терминът “фармацевтично приемлив носители или добавка” се отнася до носител или добавка, които могат да се прилагат към пациент заедно със съединението от настоящето изобретение и които не нарушават тяхната фармакологичната активност и не са токсични, когато се прилагат в дози достатъчни за отдаване на лечебното количество от съединението.

Фармацевтично приемливи носители, добавки и пълнители, които могат да се използват във фармацевтичните състави на изобретението включват, без да е ограничено до тях, йонни обменители, двуалуминиев триоксид, алуминиев стеарат, лецитин, самоемулгиращи се отдаващи лекарството системи като d-а-токоферол, полиетиленгликол 1000 сукцинат, повърхностноактивни вещества използвани във фармацевтични дозиращи форми като твин или други подобни полимерни отдаваци матрици, серумни протеини като човешки серумен албумин, буферни вещества като фосфати, глицин, сорбинова киселина, калиев сорбат, частични глицеридни смеси на наситени растителни мастни киселини, вода, соли или електролити, като протамин сулфат, динатриев хидроген фосфат, калиев хидроген фосфат, натриев хлорид, цинкови соли, колоидален силициев диоксид, магнезиев трисиликат, поливинил пиролидон, вещества на база целулоза, полиетиленгликол и ланолин. Циклодекстрини като α-, β- и γ-циклодекстрин или тяхни химически модифицирани производни като хидроксиалкилциклодекстрини, включително 2- и З-хидроксипропил-βцикподекстрини или други солюбилизирани производни могат също да се използват с предимство за да се подобри отдаването на съединенията с описаните тук формули.

Фармацевтичните състави от изобретението могат да се прилагат орално, парентерално, чрез инхалационен спрей, външно, ректално, назално, букално, вагинално или чрез имплантиран резервоар, за предпочитане чрез орално приложение или инжекционно. Съставите могат да се получат от кристални или некристални форми на съединенията Фармацевтичните състави от изобретението могат да съдържат всякакви обичайни нетоксични фармацевтично приемливи носители, добавки или пълнители. В някои случай, pH на формулировката може да се нагласи с фармацевтично приемливи киселини, бази или буфери за подобряване стабилността на формулираното съединение или неговата отдаваща форма. Терминът “парентерано” използван тук включва подкожно, интракутанно, венозно, мускулно, интраартикуларно, интраартериално, интрасиновиално, интрастернално, интралезионално и интракраниално инжектиране или чрез инфузионни техники.

Фармацевтичните състави могат да бъда под формата на стерилни инжекционни препарати, например като стерилна инжекционна водна или маслена суспензия. Тази суспензия може да бъде формулирана съгласно известни техники при използването на подходящи диспергиращи или умокрящи средства (като например твин 80) и суспендиращи средства. Стерилните инжекционни препарати могат също да бъдет стерилен инжекционен разтвор или суспензия в нетоксичен парентерално приемлив разредител или разтворител, например, като разтвор в 1,3-бутандиол. Между приемливите носители и разтворители, които могат да се използват са манитол, вода, разтвор на Ringer и изотоничен разтвор на натриев хлорид. В допълнение, стерилни, фиксирани масла често се използват като разтворител или суспендираща среда. За целта може да се използва недразнещо нелетливо масло, включително синтетични моно- или диглицериди. Мастни киселини, като олеинова киселина и нейни глицеридни производни са полезни при получаването на инжекционни формулировки, каквито са естествени, фармацевтично приемливи масла като маслинено или рициново, особено тяхните полиоксиетилирани форми. Тези маслени разтвори или суспензии могат да съдържат също дълговерижен алкохолен разредител или диспергант или карбоксиметилцелулоза или подобни диспергиращи средства, каквито обичайно се използват при формулирането на фармацевтично приемливи дозиращи форми като емулсии или суспензии. За целите на формулирането могат да се използват и други обичайни повърхностноактивни вещества като туин или спан и/или подобни емулгиращи средства или биодостъпни подобрители, каквито обичайно се използват при производството на фармацевтично приемливи твърди, течни или други дозиращи форми за целите на формулирането.

Фармацевтичните състави от настоящето изобетение могат да се прилагат орално във всяка оралноприемлива дозираща форма включително, без да се ограничава до тях, капсули, таблетки, емулсии и водни суспензии, дисперсии и разтвори. В случаи на таблетки за орално приложение, обичайно използваните носители са лактоза и царевично нишесте. Обикновено се прибавят и смазващи вещества като магнезиев стеарат. При капсулираната форма за орално приложение, полезни разредители са лактоза и сушено царевично нишесте. Когато водни суспензии и/или емулсии се прилагат орално, активната съставка може да е суспендирана или разтворена в маслена фаза, която е комбинирана с емулгиращи и/или суспендиращи средства. При желание, могат да се прибавят подслаждащи и/или ароматизиращи и/или оцветяващи средства.

Фармацевтичните състави от изобретението могат също да се използват под формата на супозитории за ректално приложение. Тези състави могат да се получат чрез смесване на съединение от изобретението с подходящ недразнещ пълнител, който е твърд при стайна температура, но се втечнява при ректалната температура и поради това се стапя в ректума за да освободи активните съставки. Такива материали включват, без да се ограничава до тях, какаово масло, пчелен восък и полиетиленгликоли.

Външното приложение на фармацевтичните състави от изобретението са особено полезни когато желаното лечение включва площи или органи, леснодостъпни чрез външно приложение. За външно приложение върху кожата, фармацевтичните състави трябва да бъдат формулирани с подходящо мазило, съдържащо активното съединение суспендирано или разтворено в носител. Носители за външно приложение на съединенията от изобретението включват, без да са ограничени до тях, минерално масло, течен парафин, бяли масла, пропиленгликол, полиоксиетилен полиоксипропиленово съединение, емулгиращ восък и вода. Алтернативно, фармацевтичните състави могат да се формулират с подходящ лосион или крем съдържащи активното съединение суспендирано или разтворено в носител с подходящи емулгиращи средства. Подходящи носители включват, без да е ограничено до тях, минерално масло, сорбитан моностеарат, полисорбат 60, цетилестернен восък, цетеарилов алкохол, 2-октидодеканол, бензилов алкохол и вода. Фармацевтичните състави от изобретението могат също да се прилагат външно към долния стамошночревен път чрез ректална супозиторийна формулировка или подходяща клизмена формулировка. Трансдермални лепенки за външно приложение са също включени в изобретението.

Фармацевтичните състави от изобретението могат също да се прилагат чрез назален аерозол или инхалиране. Такива състави се получават съгласно добреизвестни техники в областта на фармацевтичното формулиране и могат да се получат като разтвори във физиологичен разтвор, при използване на бензилов алкохол или други подходящи консерванти, абсорбционни промотери за увеличаване на биодостъпността, флуоровъглеводороди и/или солюбилизиращи или диспергиращи средства, известни в областта. Съединенията и съставите от изобретението са полезни като стерилизанти, антисептици, добавки и за обработка на рани (например превързочни) средства както и като добавки в средства за почистване на рани (за забърсване, промиване и т.н.).

Дозировъчни нива между около 0.01 и около 100 мг/кг телесно тегло дневно, алтернативно между около 0.5 и около 75 мг/кг телесно тегло дневно (например между около 10 мг и 5000 мг/доза) от антимикробното съединение описано тук са подходящи при монотерапия и/или комбинирана терапия за предпазване и лечение на заболявания с микробен посредник. Обикновено, фармацевтичните състави от изобретениетои се прилагат от около 1 до около 6 пъти на ден или алтернативно като непрекъсната инфузия. Такова приложение може да се използва като хронично или акутно лечение. Количеството на активна съставка, което може да се комбинира с носещи материали за получаване на единична дозираща форма ще варира в зависимост от лекувания пациент и от конкретния начин на приложение. Типична формулировка ще съдържа от около 5 % до около 95 % активна съставка (т/т). Алтернативно, такива формулировки съдържат от около 20 % до около 80 % активно съединение. Когато съставите от изобретението съдържат комбинация от съединение с формули описани тук и едно или повече допълнителни лечебни или профилактични средства, тогава както съединението, така и допълнителното средство трябва да присъстват в дозировъчни нива между около 10 и 100 % и по-предпочитано между около 10 до 80 % от дозата, която нормално се прилага в монотерапевтичен режим. Допълнителните средства могат да се прилагат отделно като част от множествен дозиращ режим, от съединенията от изобретението. Алтернативно, тези средства могат да бъдат част от единична дозираща форма, смесени заедно със съединенията от изобретението в един състав.

Други приложения

В алтернативно изпълнение, инхибиращите съединения описани тук могат да се използват като платформи или скелети, които могат да се използват в комбинативни химически техники за получаване на производни и/или химически библиотеки от съединения. Такива производни и библиотеки от съединения имат антимикробна активност и са полезни за идентифициране и проектиране на съединения, притежаващи антимикробна активност. Комбинативни техники, подходящи за използване на съединенията описани тук са известни в областта, примери за каквито са дадени от Obrecht, D. And Villalgrodo, J. M., Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries, Pergamon-Elsevier Science Limited (1998), и включват синтезни техники като такива на “разцепване и събиране” или “паралелни”, техники в твърда фаза и във фаза на разтвор и кодиращи техники (виж например Czamik, A. W., Curr. Opin. Chem. Bio., (1997) 1, 60). Така едно изпълнение се отнася до метод за използване на съединенията с описаните тук формули за получаване на производни или химически библиотеки включващи: 1) осигуряване на тело включващо множество кладенчета; 2) осигуряване на едно или повече съединения с описаните тук формули във всеко кладенче; 3) осигуряване на допълнителни един или повече химикали във всеко кладенче; 4) изолиране на получените един или повече продукта от всеко кладенче. Алтернативно изпълнение се отнася до метод за използване на описаните с формули съединения за получаване на производни или химически библиотеки включващи: 1) осигуряване на едно или повече съединения с описаните тук формули прикрепени към твърда подложка; 2) третиране едно или повече съединения с формулите описани тук прикрепени към твърда подложка с един или повече допълнителни химикала; 3) изолиране на получените един или повече продукта от твърдата подложка. При описаните тук методи “етикети” или идентификатори или бележещи групи могат да се прикрепят към и/или откачат от съединенията с формулите тук или тяхни производни, за да се улесни проследяването, идонтифицирането или изолирането на желаните продукти или тяхни междинни съединения. Такива части са известни в областта. Използваните химикали в горните методи могат да включват например разтворители, реактиви, катализатори, защитни групи и реактиви за премахване на защитните групи и подобни. Примери на такива химикали са тези, които се появяват в различните химически текстове и монографии за синтетични и защитни групи.

Съединенията от изобретението могат да съдържат един или повече асиметрични центрове и така да се явяват като рацемати и рацемични смеси, © единични енантиомери, отделни диастереомери и диастереомерни смеси.

Всички тези изомерни форми на съединенията са изрично включени в настоящето изобретение. Съединенията от изобретението могат също да се представят в множество тавтомерни форми; при такива случаи, изобретението изрично включва всички тавтомерни форми на съединенията описани тук (например алкилиране на пръстенова система може да доведе до алкилиране на множество места, изобретението изрично включва всички тези реакционни продукти). Съединенията могат също да се появяват в цисили транс- или Е- или Z- двойна връзка изомерни форми. Всички тези н изомерни форми на такива съединения са изрично включени в настоящето изобретение. Всички кристални форми на съединенията, описани тук, са включени в настоящето изобретение.

Изобретението ще бъде по-нататък описано със следващите примери.

Трябва да се подразбира, че примерите са само илюстративни, без да се смятат за ограничаващи изобретението по какъвто и да е начин.

Примери за изпълнение на изобретението

Данни от течна хроматография се получават като се използва HewletPackard (HP) 1090 Series Liquid Chromatograph свързан към Diode Array

Detector [Restek Allure C18-Column; размер на частичките 5 мкМ; дължина

на колоната 150 мм; диаметър на колоната 4.6 мм; скорост на протичане 1 мл/мин; програма на разтворители от 95 % вода (т/0.1% TFA)/5 % CH3CN (т/0.1% TFA) до 100 % CH3CN (т/0.1% TFA) в 8 минути, след това се държи постоянно 3 минути; дължина на вълната на детектора 254 нм]. Масспектрални данни се получават или на Agilent 1100 LC/MS или на Thermofmigan AQA/Gilson LC/MS система. ’Н- и ¹³С- ЯМР спектър се получава на Bruker AC-300 MHz апарат. Мигновенна хроматография при средно налягане се провежда върху Isco Inc., Combiflash SglOOc система. Тънкослойна хроматография се провежда при използване на EM Science silica gel 60 F254 пластмасови ТСХ плаки. Температурите на топене се определят в отворени капилярни тръбички в Meltemp II апарат. УВ светлина се използва за проследяване на съединенията върху ТСХ плаки. Използваните в реакциите реактиви се закупуват от Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI), Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO), Fluka Chemical Corp. (Milwaukee, WI), Fisher Scientific (Pittsburgh, PA), TCI America (Portland, OR), Transworld Chemicals, Inc. (Rockville, MD), Maybridge Chemical Ltd., (London,

England) и Lancaster Synthesis (Windham, NH).

Пример 1 - Синтез на лигазни инхибитори

χ-

реактив на Jone

--------------------->.

И7-метил-Н7-(1-нафтален-1-ил-пропил)-пиримидо[4,5-0]-пиримидин-

2,4,7-триамин

Съединение 1: Към разтвор на 4.25 г (27.2 ммола) нафталдехид в 30 мл сух етер в ледена водна баня бавно се прибавят 13 мл етилмагнезиев бромид, 3 М в етер. Сместа се бърка още 30 минути при стайна температура и след това се прибавят 40 мл IN HCI разтвор. Органичният слой се промива с вода (20 мл), с наситен разтвор на натриев бикарбонат (20 мл х 2), със солев разтвор (20 мл) и след това се суши над безводен натриев сулфат. Изпаряване на органичният разтворител дава суровия продукт 1 който се използва направо в следващия етап на реакцията без допълнително пречистване.

Съединение 2: Суровото съединение 1 се разтваря в 30 мл ацетон и получената смес се поставя в баня с лед и вода и бавно се прибавя реактива на Jone до трайно кафяво оцветяване. След това разтворът се бърка 15 мин при стайна температура и след това се прибавят 5 мл изопропанол. След прибавянето и на 50 мл етилацетат, получената смес се промива с вода (30 мл), с наситен разтвор на натриев бикарбонат (30 мл х 2), с наситен разтвор на натриев хлорид и след това се суши над безводен натриев сулфат. Изпаряване на органичните разтворители дава маслообразен остатък, който се пречиства чрез колонно хроматографиране върху силикагел. Получават се 4.01 г от кетона 2.

Съединение 3: Към сместа от 4.01 г кетон 2 и 16.3 мл (2 М) метиламин в метанол се прибавят 1.61 г натриев цианоборохидрид и 160 мг цинков хлорид. Получената смес се бърка една нощ при 50° С. Прибавянето на 1 N HCI спира реакцията. След като по-голямата част от метанола се отстрани под вакуум, разтворът се екстрахира с дихлорометан (15 мл х 2). pH на водния слой се нагласява на около 9 с 2N NaOH. След това продуктът се екстрахира с дихлорометан (15 х 3). Събраните органични слоеве се промиват с наситен разтвор на натриев хлорид и се сушат върху безводен натриев сулфат. След изпаряване на разтворителя се получават 3.54 г от съединението 3.

Съединение 4: Смес от 2.89 г (14.5 ммола) пиримидин 11, 3.54 г (15 ммола) съединение 3 и 2.5 мл (18 ммола) триетиламин в 25 мл 2метоксиетанол се бърка при 80° С 2 часа. Получената смес се оставя да се охлади до стайна температура и разтворителят се изпарява за да се получи маслообразен остатък. Прибавят се 30 мл етилацетат за да се разтвори остатъка и полученият разтвор се промива три пъти с вода, след това се суши над безводен натриев сулфат. След изпаряване се получава маслообразен остатък, който се пречиства чрез колонно хроматографиране върху силикагел за да се получат 3.95 г от съединението 4 като бял прах.

N7-Meran-N 7-(1 -нафтален-1 -ил-пропил)-пиримидо[4,5 -d] -пиримидин-

2,4,7-триамин:

Към разтвор на 3.60 г от съединение 4 в 40мл 2-метоксиетанол се прибавят 24 мл 1 М гуанидин в метанол и 16 мл 1.5 М СНзОИа в метанол. Сместа се бърка при 140° С 12 часа и се свързва с апаратче на Дин и Старк за да се отстрани метаноловия разтвор. Реакционната смес се охлажда и изпарява под вакуум за да даде маслообразен остатък, който след това се разтваря в 30 мл метанол. Прибавят се 50 мл вода за да се утаи продукта. Той се пречиства след това чрез прекристализиране от метанол и прекристализираният продукт след това се разбърква в метанол три пъти. Получават се 1.95 г от съединението като бял прах. Чистотата му е поголяма от 99 %, установено с ВЕТХ анализ.

К7-(1-бензо[Ь]тиофен-3-ил-етил)-Л7-метил-пиримидо[4,5-с1]пиримидин-2,4,7 -триамин

Смес от 2.89 г (14.5 ммола) пиримидин 11, 2.87 г (15 ммола) метиламин 1а и 2.5 мл (18 ммола) триетиламин в 25 мл 2-метоксиетанол се бърка при 80° С 2 часа. Реакционната смес се охлажда до стайна температура и разтворителят се изпарява за да се получи маслообразен остатък. Прибавят се 30 мл етилацетат за да се разтвори остатъка и полученият разтвор се промива три пъти с вода и се суши над натриев сулфат. След изпаряване се получава маслообразен остатък, който се пречиства чрез прекристапизиране от етер/хексан. Получават се 3.95 г продукт lb като бял прах.

Към разтвор на 3.71 г 1а в 40 мл 2-метоксиетанол се прибавят 24 мл 1М гуанидин в метанол и 16 мл 1.5 М натриев метилат в метанол. Сместа се бърка при 140° С 12 часа с уловител на Дин и Старк за отстраняване на метаноловия разтвор. Реакционната смес се охлажда и се изпарява под вакуум за да даде маслообразен остатък, който след това се разтваря в 30 мл метанол. Прибавят се 50 мл вода за да се утаи продукта. Продуктът се пречиства чрез прекристализиране от метанол, след това се бърка в метанол три пъти. Получават се 920 мг продукт като бял прах. Чистотата му е 98.22

N

Н₂ГГ ^Вг

------------------------------------------1

2а % на базата на ВЕТХ анализ.

2Ь

К7-метил-М7-[1-(4-метил-нафтален-1-ил)-етил]-пиримидо[4,5-с1]пиримидин-2,4,7-триамин

Използва се подобен начин на работа както при получаването на N7(1-бензо[Ь]тиофен-3-ил-етил)-К7-метил-пиримидо[4,5-0]-пиримидин-2,4,7триамин. Получават се 860 мг от крайния продукт като бял прах, който има 98.80 % чистота съгласно ВЕТХ анализ.

Синтез на 7-аминозаместени пиримидопиримидини (структура IV)

NH₂

(IV)

Амините (структура II) се получават чрез редуктивно аминиране на 1ацетофенон със съответните амини (схема 2)структура II.

Схема 2

(П)

Н l\L Ю (ПА)

Ο

Η (ПВ)

(ПА) трет.-бутил 1М-(2-{[1-(1-нафтил)етил]амино}етил)карбамат

Към разтвор на 1-ацетофенон (152 мкл, 1 ммол) в ацетонитрил (2 мл) се прибавя трет.-бутил М-(2-аминоетил)-карбамат (189 мкл, 1.2 ммола), NaBH₃CN (126мг, 2 ммола) и безводен цинков хлорид (136 мг, 1 ммол). Реакционната смес се нагрява една нощ при 80° С в затворен съд с магнитно бъркане. Утайката се отфилтрува и разтворът се изпарява. Остатъкът се разтваря в 3 мл 0.1 N HCI и се екстрахира с метиленхлорид (2x5 мл). Събраните органични слоеве се сушат над безводен натриев сулфат и се изпаряват. Суровият продукт се пречиства чрез хроматографиране върху силикагел като се използва 1. метиленхлорид и 2. метиленхлорид/метанол (10/0.1) за елуент за да се получи бял восъчен продукт с добив 77 %. Структурното охарактеризиране на продуктите се прави с Н ЯМР; С ЯМР; MS (m/z): 315 (МН⁺).

(ПВ) трет.-бутил М-(2-{[1-(1-нафтил)етил]амино}пропил)карбамат

Към разтвор на 1-ацетофенон (152 мкл, 1 ммола) в ацетонитрил (2 мл) се прибавя трет.-бутил М-(2-аминопропил)-карбамат (209 мкл, 1.2 ммола), NaBH₃CN (126мг, 2 ммола) и безводен цинков хлорид (136 мг, 1 ммол). Реакционната смес се нагрява 70 часа при 80° С в затворен съд с магнитно бъркане. Утайката се отфилтрува и разтворът се изпарява. Остатъкът се разтваря в 3 мл 0.1 N HCI и се екстрахира с метиленхлорид (1x5 мл). Органичният слой се суши над безводен натриев сулфат и се изпаряват. Суровият продукт се пречиства чрез мигновенно хроматографиране върху силикагел като се използва 1. метиленхлорид/метанол (10/0.1) и 2. метиленхлорид/метанол (10/1) за елуент за да се получи маслообразен продукт 70 %. Структурното охарактеризиране на продуктите се прави с 'Н ЯМР; ¹³С ЯМР; MS (m/z): 329 (МН⁺).

(ПС) трет.-бутил Ь1-(2-{[1-(1-нафтил)етил]амино}бутил)карбамат

Към разтвор на 1-ацетофенон (152 мкл, 1 ммола) в ацетонитрил (2 мл) се прибавя М-Вос-1,4-диаминобутан (229 мкл, 1.2 ммола), NaBH₃CN (126 мг, 2 ммола) и безводен цинков хлорид (136 мг, 1 ммол). Реакционната смес се нагрява 55 часа при 80° С в затворен съд с магнитно бъркане. Утайката се отфилтрува и разтворът се изпарява. Остатъкът се разтваря в 3 мл 0.1 N HCI и се екстрахира с метиленхлорид (1x5 мл). Органичният слой се суши над безводен натриев сулфат и се изпаряват. Суровият продукт се пречиства чрез мигновенно хроматографиране върху силикагел като се използва 1. метиленхлорид/метанол (10/0.1) и 2. метиленхлорид/метанол (10/1) за елуент за да се получи маслообразен продукт 80 %. Структурното охарактеризиране на продуктите се прави с ^!Н ЯМР; ¹³С ЯМР; MS (m/z): 343 (MPT).

Схема 3

IIB п=3

НС п=4

NH

ШВ

III А 4-амино-2- {[4-аминоетил-( 1 -нафтил)етил] амино} -5пиримидинкарбонитрил

4-амино-2-бромопиримидин-5-карбонитрил (1 ммола, 199 мг), трет,бутил ^(2-{[1-(1-нафтил)етил]амино}-етил)карбамат (ПА) (1.2 ммола, 377 мг), Ν,Ν-диизопропилетиламин (DIEA) (2 ммола, 342 мкл) и 2метоксиетанол (2 мл) се поставят в съд и се загряват при 150° С 4 часа. 2метоксиетанолът се изпарява. Остатъкът се разтваря в 3 мл 0.1 N НС1 и се екстрахира с метиленхлорид (2x5 мл). Събраните органични екстракти се сушат над натриев сулфат и се изпаряват. Суровият продукт се пречиства чрез хроматографиране върху силикагел (sp) като се използва метиленхлорид/метанол (10/0.1) за елуент. Получава се бял, аморфен продукт.

Към аморфния продукт се прибавя студен разтвор на 50 % трифлуороцетна киселина в дихлорометан (1 мл) и сместа се разклаща в продължение на 1 час при стайна температура. Разтворът се изпарява. Към суровия продукт се прибавя наситен разтвор на натриев карбонат и се екстрахира с метиленхлорид (2x5 мл). Органичните слоеве се сушат върху натриев сулфат и се изпаряват. Получават се 36 % бяло твърдо вещество. Структурното охарактеризиране на продуктите се прави с ^!Н ЯМР; ¹³С ЯМР; MS (m/z): 333 (МН⁺).

ШВ 4-амино-2-{[4-аминопропил-(1-нафтил)етил]амино}-5пиримидинкарбонитрил

4-амино-2-бромопиримидин-5-карбонитрил (1 ммола, 199 мг), трет.бутил №(2-{[1-(1-нафтил)етил]амино}пропил)карбамат (ПВ) (1.2 ммола, 394 мг), Ν,Ν-диизопропилетиламин (DIEA) (2 ммола, 342 мкл) и 2метоксиетанол (2 мл) се поставят в съд и се загряват при 150° С 5 часа. 2метоксиетанолът се изпарява. Остатъкът се разтваря в 3 мл 0.1 N НС1 и се екстрахира с метиленхлорид (2x5 мл). Събраните органични екстракти се сушат над натриев сулфат и се изпаряват. Суровият продукт се пречиства чрез хроматографиране върху силикагел (sp) като се използва метиленхлорид/метанол (10/0.1) за елуент. Получава се бял, аморфен продукт.

Към аморфния продукт се прибавя студен разтвор на 50 % трифлуороцетна киселина в дихлорометан (2 мл) и сместа се разклаща в продължение на 1 час при стайна температура. Разтворът се изпарява. Към суровия продукт се прибавя наситен разтвор на натриев карбонат и се екстрахира с метиленхлорид (2x5 мл). Органичните слоеве се сушат върху натриев сулфат и се изпаряват. Получават се 66 % бяло твърдо вещество. Структурното охарактеризиране на продуктите се прави с ’Н ЯМР; ¹³С ЯМР; MS (m/z): 347 (ΜΗ*).

ШС 4-амино-2-{[4-аминобутил-(1 -нафтил)етил]амино}-5пиримидинкарбонитрил

4-амино-2-бромопиримидин-5-карбонитрил (1 ммола, 199 мг), трет.бутил Т4-(2-{[1-(1-нафтил)етил]амино}бутил)карбамат (ПС) (1.2 ммола, 410 мг), Ν,Ν-диизопропилетиламин (DIEA) (2 ммола, 342 мкл) и 2метоксиетанол (2 мл) се поставят в съд и се загряват при 150° С 4 часа. 2метоксиетанолът се изпарява. Остатъкът се разтваря в 3 мл 0.1 N НС1 и се екстрахира с метиленхлорид (2x5 мл). Събраните органични екстракти се сушат над натриев сулфат и се изпаряват. Суровият продукт се пречиства чрез хроматографиране върху силикагел (sp) като се използва метиленхлорид/метанол (10/0.1) за елуент. Получава се бял, аморфен продукт.

Към аморфния продукт се прибавя студен разтвор на 50 % трифлуороцетна киселина в дихлорометан (1.5 мл) и сместа се разклаща в продължение на 1 час при стайна температура. Разтворът се изпарява. Към суровия продукт се прибавя наситен разтвор на натриев карбонат и се екстрахира c метиленхлорид (3x5 мл). Органичните слоеве се сушат върху натриев сулфат и се изпаряват. Получават се 54 % бяло твърдо вещество. Структурното охарактеризиране на продуктите се прави с 'Н ЯМР; ¹³С ЯМР; MS (m/z): 361 (ΜΗ⁴).

Получаването на 7-заместени пиримидопиримидини (структура IV) се провежда чрез кондензиране на 2-заместени 2,4-диамино-5пиримидинкарбонитрили (структура III) с гуанидин (схема 4)

Схема 4

NH

nh₂ nh₂

Съединение IVC

4-амино-2- {[4-аминобутил-(1 -нафтил)етил] амино} -5-пиримидинкарбонитрил (ШС) (0.26 ммола, 95 мг) се разтварят в 1.2 мл гуанидин свободна база (за получаването й виж по-долу) в 2-метоксиетанол. Реакционната смес се бърка в съд при 150° С в продължение на 1.5 часа. 265 метоксиетанолът се изпарява. Прибавя се вода и утайката се отфилтрува. Суровият продукт се пречиства чрез хроматографиране върху силикагел (sp) като се използва метиленхлорид/метанол/амоняк (2/1/0.1) за елуент. Получава се бяло твърдо вещество с 42 % добив. Структурното охарактеризиране на продуктите се прави с *Н ЯМР; ¹³С ЯМР; MS (m/z): 403 (МН⁺).

Съединение IVB

4-амино-2- {[4-аминопропил-(1 -нафтил)етил] амино} -5-пиримидинкарбонитрил (ШВ) (0.26 ммола, 93 мг) се разтварят в 1.3 мл гуанидин свободна база (за получаването й виж по-долу) в 2-метоксиетанол. Реакционната смес се бърка в съд при 150° С в продължение на 1.5 часа. 2метоксиетанолът се изпарява. Прибавя се вода и утайката се отфилтрува. Суровият продукт се пречиства чрез хроматографиране върху силикагел (sp) като се използва метиленхлорид/метанол/амоняк (2/1/0.1) за елуент. Получава се бяло твърдо вещество с 38 % добив. Структурното охарактеризиране на продуктите се прави с ’Н ЯМР; ¹³С ЯМР; MS (m/z): 389(МН⁺).

Съединение IVA

4-амино-2- {[4-аминоетил-( 1 -нафтил)етил]амино} -5 -пиримидинкарбонитрил (ША) (0.3 ммола, 100 мг) се разтварят в 1.4 мл гуанидин свободна база (за получаването й виж по-долу) в 2-метоксиетанол. Реакционната смес се бърка в съд при 150° С в продължение на 1.5 часа. 2метоксиетанолът се изпарява. Прибавя се вода и утайката се отфилтрува. Суровият продукт се пречиства чрез хроматографиране върху силикагел (sp) като се използва метиленхлорид/метанол/амоняк (10/2/0.2) за елуент. Получава се бяло твърдо вещество с 46 % добив. Структурното охарактеризиране на продуктите се прави с *Н ЯМР; ¹³С ЯМР; MS (m/z): 375 (МН⁺).

Получаване на гуанидин свободна база в 2-метоксиетанол

В отделна колба се поставя метален натрий (1 г, 44 ммола) към 30 мл

2-метоксиетанол, бърка се в инертна атмосфера докато не се наблюдават парченца от натрия в разтвора.

В отделен съд се получава разтвор на гуанидин хидрохлорид (4.2 г, 44 ммола) в 2-метоксиетанол (30 мл). Към този разтвор се прибавя разтвора на натриев метоксиетоксид. След прибавянето се образува бяла утайка (натриев хлорид). Реакционната смес се бърка при 25° С 30 минути. Утайката се отфилтрува и разтворът се съхранява в хладилник и се използва като разтвор на гуанидин свободна база.

N о

3-[(5,7-Диамино-пиримидо[4,5-с1]пиримидин-2-ил)-(2-етоксинафтален-1 -илметил)-амино]-2-хидрокси-пропионова киселина

Алфа хидрокси-карбоксилната киселина се синтезира в многоетапен процес като се излиза от изосерин, при използване на експерименталните методи и условия подобни на описаните подробно в описанието.

Енантиомерните алкохоли могат да се синтезират стереоселективно при използване на реакцията на 2-етоксинафтилметиламин върху естери на глициновата киселина (епоксид).

N-(2 -амино-етил)-3- [(5,7 -диамино-пиримидо[4,5 -d] пиримидин-2-ил)(2-етокси-нафтален-1-илметил)-амино]-2-хидрокси-пропионамид

Към 3-[(5,7-диамино-пиримидо[4,5-б]пиримидин-2-ил)-(2-етоксинафтален-1-илметил)-амино]-2-хидрокси-пропионова киселина (200 мг, 0.445 ммола) в сух диметилформамид (2 мл) се прибавя ВгоР (249 мг, 0.534 ммола). След като сместа се бърка 30 минути се прибавя DIEA (126 мг, 0.979 ммола). След като се бърка нови 20 минути, се прибавя етилендиамин (53.5 мг, 0.89 ммола). Сместа се бърка при стайна температура 16 часа и се пречиства направо чрез ВЕТХ за да се получат 35 мг (16 %) от съединението от заглавието: MS (m/z): 492 (М+Н).

Общ метод за взаимодействие на различни амини с ароматни кетони при редукционни условия

СН₃

СН₃ АА

NH₂CH₃

2М в метанол

NaCNBH₃ (62.84

ZnCI₂(136.28)

FW =

170.21

Следващият метод се основава на литературен метод (J. Org. Chem. 1985,50, 1927- 1932).

При стайна температура, към разтвор на 1-ацетилнафтален (1 екв. 1 ммол, 170 мг, 151 мкл) в метанолен разтвор на метиламин (4 екв. 4 ммола, 2 мл от 2М разтвор в метанол) се прибавя твърд натриев цианоборохидрид (2 екв., 2 ммола, 126 мг) и безводен цинков хлорид (1 екв. 1 ммола, 136 мг). Реакционната смес се нагрява до 65° С в отворена колба при магнитно бъркане.

Хода на реакцията може да се наблюдава или чрез ТСХ или чрез ВЕТХ. На 30-тата минута се наблюдават няколко пика. За сравнение се използва проба от N-метил-!-нафталенимин. След 1 час реакцията е протекла > 50 %. На 4-ия час кетонът напълно е изчезнал и продуктът е повече от 95 % чист, замръсен е само с < 5 % от междинния имин. Понататъшно нагряване на реакционната смес може да доведе до получаването на бистър продукт. Ние препоръчваме време на реагиране най-малко 6 часа за този конкретен кетон, при все че реакционното време може да варира в зависимост от характера на кетона. След това се доработва по обичайния

начин и суровите продукти се пречистват при използването на стандартни лабораторни техники.

nh₂

3-((5,7-диамино-пиримидо[4,5-с1]пиримидин-2-ил)-(2-етокси- нафтален-1 -илметил)-амино]-пропионова киселина

Ο

NH₂

nh₂ трет.-бутилов естер на {4-[(5,7-диамино-пиримидо[4,5-0]пиримидин2-ил)-(2-етокси-нафтален-1-илметил)-амино]-бутил}-карбаминова киселина

Суспензия на заместен-цианоаминопиримидин (12.37 г, 0.025 мола), гуанидин хидрохлорид (7.16 г, 0.075 мола), твърд натриев метоксид (5.40 г, 0.1 мола) в метоксиетанол (150 мл) се нагрява при кипене 48 часа. Приключването на реакцията се проследява чрез ВЕТХ. Реакционната смес се охлажда до стайна температура и се излива в излишък от вода. Твърдата фаза се отделя чрез филтруване, суши се под вакуум за да даде 13.05 г суров продукт, който се използва в следващия етап без допълнително пречистване.

Н7-(4-амино-бутил)-Л7-(2-етоксинафтален-1-илметил)пиримидо[4,5-й]пиримидин-2,4,7-триамин

Моно-Ьос-защитеното межсдинно съединение (13 г) се прибавя бавно в продължение на 10 минути към леденоохладена трифлуороцетна киселина (75 мл) при енергично бъркане. Приключването на реакцията се проследява чрез ВЕТХ/MS на проба от реакционната смес. След това сместа се излива върху леденоохладен разтвор на натриев етоксид (5 %) за да се утаи продукта. Продуктът се филтрува и се суши за да даде 8.0 г вещество: ВЕТХ Rt = 2.882 минути, 99 % чисто, MS m/z 433 (pos).

гуанидин HCI

NaOMe --------------->.

Етап 1: Редуктивно аминиране

20.0 г (0.12 мола) от кетона се разтварят в ЮОмл (~ 2 екв.) от 2 М метанолен разтвор на метиламин. В отделна колба, охладена до 0° С, се поставят 8.3 г (0.5 екв.) цинков двухлорид и 7.7 г (1.0 екв.) NaCNBH₃ в около 10 мл метанол. Zn(CNBH3)₂ се оставя да се разбърка при 0° С за около 5 минути и след това се прибавя като суспензия към сместа от кетон/амин. Реакционната смес се оставя една нощ при леко кипене, след това се охлажда до стайна температура и се ротационно изпарява до сухо. Материалът се оставя да престои под висок вакуум за да се отстрани цялото количество остатъчен метиламин.

Бялата утайка се стрива с диетилов етер в резултат на което се получава вискозно масло. По-добри резултати се наблюдават чрез стриване с диетилов етер чрез прибавяне на достатъчно метанол за да се предпази от образуването на масло. Материалът се филтрува и промива с етер след което се суши на въздуха. ТСХ на твърдото вещество по отношение на автентична проба дава чрез ЕТ идентична подвижност. На тегловна базата обаче, регенерирането е >100 % и се допуска, че все още има налични неорганични соли.

Поради онечистването от наличните соли, малко количество от материала се използва в следващия етап. Не се наблюдават видими проблеми. Поради това, аминокиселината се използва без допълнително пречистване.

Етап 2: Взаимодействие с CI-пиримидин г (теоретичен добив 21.8 г) от аминокиселината се разтваря приблизително в 50 мл етоксиетанол. Към него се прибавят 17.0 г (0.9 екв. на базата на кетона) 4-амино-2-хлоропиримидин-5-карбонитрил и 42 мл (2.0 екв.) DIEA и реакционната смес се оставя да се бърка около 2 часа при 80° С (температура на маслената баня). ТСХ показва липса на остатъчен хлорид. Сместа се оставя да се охлади до стайна температура и се концентрира до около 10 мл на ротационен изпарител. Получената суспензия се разрежда с около 400 мл вода и pH се нагласява на 5 - 6 (с pH хартия) при използването на конц. оцетна киселина, при което се получава светложълта утайка. Оставя се да престои една нощ при 0° С, филтрува се и се промива с около 1 л вода, след което се оставя на въздуха да се изсуши. Прекристализация от вода/метанол дава около 25 г от междинното съединение (69 %). ТСХ (метиленхлорид 10 % метанол) Rf -0.1. Изглежда да има бързо елуиращ се материал, неговото количество е обаче много малко и продуктът се използва без допълнително пречистване.

Етап 3: Реакция на циклизиране

Етоксиетанолът се използва като разтворител с оглед да се повиши температурата на реакцията до около 135° С. Към 16.0 г (54 ммола) от междинното съединение се разтварят в - 75 мл етоксиетанол. Към това се прибавят 10.2 г (2.0 екв.) гуанидин хидрохлорид и 11.6 г (4.0 екв.) натриев метилат и реакционната смес се довежда до леко кипене в атмосфера на аргон. Използва се ТСХ за проследяване изчезването на изходното вещество. След около 30 часа, сместа се охлажда и се прибавят допълнителни 5.1 г (1.0 екв.) гуанидин хидрохлорид и 2.9 г (1.0 екв.) натриев метилан и сместа отново се довежда до кипене. Чрез ТСХ се проследява приключването на реакцията за което са необходими около 72 часа.

Реакционната смес се оставя да се охлади и се концентрира до около 20 мл на ротационен изпарител. Получената суспензия се разрежда с около 600 мл вода и pH се нагласява на 5 - 6 с конц. оцетна киселина. Продуктът се утаява от разтвора и се остава да престои една нощ при 0° С. Отфилтрува се и се промива с изобилно количество вода, последвано от изобилни количества метанол (отстраняване на нереагиралите изходни съединения) и се суши на въздуха. Изолират се ~ 13.5 г (~ 75 %) от продукта. ВЕТХ анализ показва, че има минимално количество полярно онечистване, същото, което се наблюдава при реакцията в малък мащаб. Продуктът може да се използва без допълнително пречистване.

Трет.-бутилов естер на [2-(4-амино-5-циано-пиримидин-2-иламино)етил]-карбаминова киселина (5 т, 18 ммола) се разтваряте 60 мл разтвор от 50/50 о/о дихлорометан - трифлуороцетна киселина. Наблюдава се енергично отделяне на газ при прибавянето ана течност към твърдата маса. След това разтворът се бърка в инертна атмосфера 30 минути и след това се взима проба за ВЕТХ анализ за да се определи дали премахването на защитата е протекло цялостно. След приклъчването на реакцията, разтворът се концентрира под вакуум до видима сухота.

В отделна колба се поставя метален натрий (0.675 г) бавно към 30 мл 2-метоксиетанол в инертна атмосфера докато натриевият метал се разтвори напълно. В отделна колба се приготвя разтвор на гуанидин хидрохлорид (2.645 г) в 2 метоксиетанол (30 мл). Към този разтвор се прибавя разтвора на натриевия метоксиетоксид. След прибавянето се получава бяла утайка от натриев хлорид и полученият разтвор се бърка 30 минути. Разтворът се филтрува в инертна атмосфера, прибавя се към суровия остатък от етап 1 и се бърка енергично. За 15 минути се образува жълта утайка. Утайката се филтрува за да даде Ш-(4-амино-етил)-пиримидо[4,5-с1]пиримидин-2,4,7триамин (2.1 г, 52 % добив).

4-аминобутиламид на 4-(Л-[2,4-диамино-6-птеридинил-метил]- Nметиламино)-бензоена киселина

Към суспензия на 4-(Л-[2,4-диамино-6-птеридинил-метил]- Nметиламино)-бензоена киселина хемихидрохлорид (250 мг, 0.73 ммола) в сух диметилформамид (20 мл) се прибавя Ν,Ν-диизопропилетиламин (250 мкл, 1.46 ммола, 2 екв.) и диетил цианофосфонат (225 мкл, 1.46 ммола, 2 екв.) Получава се бързо разтваряне и реакционната смес се бърка 4 часа при стайна температура. След това се прибавят 1,4-диаминобутан (367 мкл, 3.65 нмола, 5 екв.) и Ν,Ν-диизопропилетиламин (250 мкл, 1.46 ммола, 2 екв.) и разтворът се бърка 45 минути при стайна температура. Приключването на реакцията се потвърждава чрез ВЕТХ и се прибавя твърд натриев бикарбонат. След това разтворителят се изпарява под вакуум и остатъкът се суспендира в малко количество метанол. След това се прибавя разреден воден разтвор на амоняк, филтрува се и се промива с вода. Слуд сушене се получават 153 г (53 %) от продукта: MS m/z (М + Н) 396.

ВЕТХ Rf = 3.80 минути.

4-хидроксифенил амид на 4-(Л-[2,4-диамино-6-птеридинил-метил]Н-метиламино)-бензоена киселина

Към суспензия на 4-(Л-[2,4-диамино-6-птеридинил-метил]- Nметиламино)-бензоена киселина хемихидрохлорид (100 мг, 0.29 ммола) в сух диметилформамид (около 6 мл) се прибавят 2 еквивалента от Ν,Νдиизопропилетиламин (100 мкл, 0.58 ммола) и 2 еквивалента от диетил цианофосфонат (290 мкл, 0.58 ммола) Получава се бързо разтваряне и реакционната смес се бърка 3 - 4 часа при стайна температура. За 4хидроксифениламида се прибавят след това 1.05 еквивалента р-аминофенол (33 мг, 0.30 ммола) и 2 еквивалента Ν,Ν-диизопропилетиламин (100 мкл, 0.58 ммола) и разтворът се бърка една нощ при стайна температура. Приключването на реакцията се потвърждава чрез ВЕТХ и се прибавя твърд натриев бикарбонат. След това разтворителят се изпарява под вакуум и остатъкът се суспендира в малко количество метанол. Прибавя се разреден воден разтвор на амоняк, филтрува се и се промива с разреден воден разтвор на оцетна киселина. След сушене се получават 77 мг (53 %, 0.19 ммола) от продукта: MS m/z (Μ - Η) 415, ВЕТХ време на задържане 4.66 минути.

(1Ч-бензил[2,4-диамино-6-птеридинил-метил]-1Ч-метиламин)

Петкратен излишък на N-метилбензиламин (245.4 мг, 261 мкл, 2.02 ммола) се разтварят в диметилформамид (4 мл) в 15 мл-ова затворена колба, снабдена с магнитна бъркалка. Прибавя се 2,4-диамино-6-хлорометилптерин (100 мг, 0.405 ммола) и се смесва добре. Реакционната смес се бърка при 60° С 4 часа. Аналитичен ВЕТХ анализ на проба потвърждава отсъствието на птериновия изходен продукт. Разтворителят се отстранява под вакуум при 60° С. Получената смес се промива с етанол (2 х 15 мл), след това разтворителят се отстранява под поток от азот и полученият продукт се суши на висок вакуум 18 часа. ЯМР и MS потвърждават структурата и чистотата на съединението.

nh₂

Ν.

NH₂

Ν.

Cl

(№(алфа-метил-4-метилбензил)[2,4-диамино-6-птеридинил-метил]-Мметиламин)

Петкратен излишък от (8)-(+)алфа-4-диметилбензиламин (272 мг, 298 мкл, 2.02 ммола) се разтварят в диметилформамид (4 мл) в 15 мл-ова затворена колба, снабдена с магнитна бъркалка. Прибавя се 2,4-диамино-6хлорометилптерин (100 мг, 0.405 ммола) и се смесва добре. Реакционната смес се бърка при 60° С 4 часа. Аналитичен ВЕТХ анализ на проба потвърждава отсъствието на птериновия изходен продукт. Разтворителят се отстранява под вакуум при 60° С. Получената смес се промива с етанол (2 х 15 мл), след това разтворителят се отстранява под поток от азот и полученият продукт се суши на висок вакуум 18 часа. Аналитична ВЕТХ, ^!Н ЯМР и MS потвърждават структурата и високата чистота на съединението.

Пример 2 -D-Ala-D-Ala лигазно К, определяне

Синтетичният аналог на пример 1 се разтваря в диметилсулфоксид (DMSO) в концентрация 100 мМ в дена на изпитанието, при използването на вортрекс смесител и сонифициране, необходимо за разтварянето. Разтворът се държи при стайна температура до приклячване на скринирането.

Приготвя се пресен 10 мМ NADH (Sigma) изходен разтвор в дена на скринирането чрез разтваряне на 32 мкмола NADH в 3.2 мл двойно дестилирана вода. NADH разтвора се държи върху лед. Изходни разтвори съдържащи 50 мМ фосфоноенолпируват (PEP; Sigma), 500 мкМ HERMES, 30 мМ аденозин трифосфат (АТР; Sigma), 200 мМ D-аланин (Sigma) и 4 х същински буфер (т.е. 400 мМ Hepes, 40 мМ магнезиев хлорид и 40 мМ калиев хлорид) също се съхраняват върху лед. Изходен разтвор от пируват киназа/лактат дехидрогеназа (PK/LDH) също се получават от Sigma.

Таблица от крайните концентрации, които зависят от типа на скринирането:

Тип скриниране	Аналожно Kj	Аналожно %	Аналожно К; и
	Крайна	инхибиране	начин на инхи-
	концентрация в	Крайна	биране. Крайна
	ензимната смес	концентрация в	концентрация в
		ензимната смес	ензимната смес
Същински буфер	1х	1х	1х
4х
NADH 10 мМ	500 мкМ	500 мкМ	500 мкМ
РЕР 50 мМ	2 мМ	2 мМ	2 мМ
PK/LDH смес	0.02 мл/мл	0,02 мл/мл	0.02 мл/мл
	ензимен изходен	ензимен изходен	ензимен изходен
	разтвор	разтвор	разтвор
Hermes 500 мкМ	200 нМ	400-600 нМ	200 нМ

Тип	Аналожно К;	Аналожно	%	Аналожно Kj	4 начин
скриниране	Крайна	инхибиране		на	инхибиране.
	концентрация в	Крайна	кон-	Крайна	концентрация
	субстратната смес	центрация субстратната	в смес	в субстратната смес
разтвор	АА	скриниране		А	В	С
АТР 30 мМ	4 мМ	20 мМ		4мМ	4мМ	ЮОмМ
D-Ala 200 мМ	2мМ	64мМ		2мМ	64мМ	64мМ
Същински буфер 1х	1х	1х		1х	1х	1х

Пример 3 - Определяне на Ki на аналози

За всеки комплект от изпитвани съединения се използват две 96кладенчеви плаки: една инхибиторна плака и една ензимна плака. Изпитваните съединения отговарят на редове А - G на плаките. Аденозин (Sigma), разтворен в DMSO, изолзван като контрола, отговаря на реда Н във всяка от плаките.

Ензимният разтвор се оставя да се темперира на 25° С.

Приготвят се следните разреждания в инхибиторната плака. 50 мкл диметилсулфоксид (DMSO) се прибавя във всяко кладенче на колонки 1 11, редове А - G на инхибиторната плака. 50 мкл DMSO се прибавят към всяко кладенче на колонки 1-11, ред Н. 100 мкл от 100 мМ от изпитваните разтвори се прибавят към колонка 12, редове А - G (т.е. първото съединение в ред А, второто съединение в ред В и т.н.). 100 мкл от 100 мМ аденозинов разтвор се прибавя към колонка 12, ред Н.

мкл от изпитвания разтвор се пренася от колонка 12 във всяка редица до колонка 11 на същия ред, смесвайки разтвора с DMSO. 50 мкл от разтвора след това се пренася от колонка 11 на всеки ред до колонка 10 на същия ред, 50 мкл от колонка 10 се пренасят до колонка 9 и т.н. до колонка 2. Не се пренася разтвор в колонка 1. Използват се многоканални пипети за правене на серийното разреждане.

120 мкл от ензимния разтвор се прибавя към всеко кладенче на ензимната плака.

Субстратните разтвори се темперират при 25°С.

След това аналозите и ензимите се инкубират при 25°С. Тъй като реакциите са инициирани в колонки, аналозите също се прибавят колонка по колонка. При t = 0 минути, 5 мкл аналог се пренася от всеко кладенче от колонки 1 - 4 на инибиторната плака до съответното кладенче на ензимната плака. При t = 4 минути, 5 мкл аналог се пренася от всеко кладенче от колонки 5 - 8 на инхибиторната плака до съответното кладенче на ензимната плака. При t = 8 минути, 5 мкл аналог се пренася от всеко кладенче от колонки 9 - 12 на инхибиторната плака до съответното кладенче на ензимната плака. След това инхибиторната плака се замразява.

При t = 18 - 19 минути, субстратният разтвор се взима от 25° С и се поставя в Spectromax (R) UV-vis спектрофотометър. При t = 20 минути, в границите на 30 секунди, 125 мкл от субстратния разтвор се прибавя към всеко кладенче от колонки 1 - 4 и се отчита абсорбцията при 340 нм. При t = 24 минути и съответно t = 28 минути процесът се повтаря за колонки 5 - 8 и

9-12.

Така, концентрацията на съединенията от колонки 1-12 във всеки ред са 0, 1.9 мкМ, 3,9 мкМ, 7.8 мкМ, 15.6 мкМ, 31.2 мкМ, 62.5 мкМ, 125 мкМ, 125 мкМ, 250 мкМ, 500 мкМ, 1 мМ и съответно 2 мМ.

Редукционните стойности се умножават с -4.06 за да се превърнат mOD/мин единици в nM/сек (OD = XLM; λ = 6220 1/Mem; L = 0.66 см; mOD/сек = 6220 х 0.66 х (mM/сек) х 60; (mOD/сек) х 4.06 = пМ/сек); умножено по -1, тъй като NADH абсорбцията намалява колкото повече се получава от продукта).

Площи на скорости на реакцията по отношение концентрацията на инхибитора се получават като се използва Kaleidograph ® и Ki стойностите се определят след като данните се нагласяват към подходящите уравнения.

Повечето от етапите могат да се проведат алтернативно като се използва SciClone автоматизирана течна машина за работа. Тези етапи са: прибавяне на ензимната смес към ензимната плака, диспергиране на 50 мкл DMSO във всеко кладенче на колонки 1-11 редове А-Н на инхибиторната плака, серийно разреждане на аналозите + аденозиновата контрола в инхибиторната плака, прибавяне на аналожен инхибитор от инхибиторната плака в ензимната плака, прибавяне на субстрат към ензимната плака.

Пример 4 - Аналожно % инхибиране

Повтаря се начина на изпитание описан по-горе с изключение на това, че инхибиторните плаки се приготовляват с 5 мМ разтвори на инхибиторите в плаките (вместо серийно разреждане) за да се получи крайна концентрация от 100 мкМ инхибитор в крайната реакционна среда. Ензимната активност в присъствие на DMSO се използва като 100 %-на за сравняване на активността.

На таблицата по-горе са дадени точните концентрации.

Пример 5 - Аналожни К; и начин на инхибиране

Повтаря се начина на изпитание описан по-горе като се използват три различни субстратни разтвори, всеки от тях в различна ензимна плака. Крайните концентрации в реакционните смеси са: (А) 2 мМ АТР и 1 мМ Dаланин; (В) 2 мМ АТР и 32 мМ D-аланин и (С) 2 мкМ АТР и 32 мМ Dаланин. Използват се същите инхибиторни плаки с всичките три ензимни плаки. Като контроли се използват аденозин (Sigma) и циклосерин (Sigma). Точните концентрации са дадени в таблицата по-горе.

Пример 6 - Изпитание чрез микроразреждане за антимикробна чувствителност

Изходни разтвори от изпитваните съединения се получават в диметилформамид в концентрация 5 мг/мл. След това от изходните разтвори се приготвят работни разтвори от изпитваните съединения в Mueller - Hinton бульон (МНВ) с начална концентрация 64 мкг/мл (т.е. 25.6 мкл от изходния разтвор в 974.4 мкл МНВ = 128 мкг/мл, който се разрежда с равен обем от бактериалния инокулум по описания по-долу начин.).

Бактериален инокулум се получава от култура от една нощ (т.е.

пресна колония от агарова паничка в 5 мл МНВ; Н. Influenzae се отглежда в

МНВ с прибавяне на дрожден екстракт, хематин и NAD), центрофугира се 2 х 5 мин /3000 об/мин (за S. pneumoniae r Н. Influenzae, 2 х 10 мин /3000 об/мин) и се диспергира в 5 мл пресен МНВ всеки път, така че бактериалната суспензия се разрежда за да се получат 100 колонии, образуващи единици (cfu) в микроплочно кладенче (100 мкл общ обем).

Кладенчетата в микроплаката след това се запълват с двукратни разреждания на изпитваното съединение (50 мкл), като се започне с 64 мкг/мл. Колонките 2 - 12 се пълнят с 50 мкл бактериален инокулум (краен обем: 100 мкл/кладенче). Плочките се инкубират при 37° С 18-24 часа (S. pneumoniae расте в обогатена с СО₂ атмосфера).

Оптичната плътност на всяко кладенче се измерва след това при 590 нм (OD590) с ТЕСАМ SpectroFluor Plus (R), и се определя минималната инхибиторска концентрация (MIC) като концентрация, която показва 90 % инхибиране на растежа.

Пример 7 - MIC определяне при използване на свръхекспресиращи Е. coli

Повтаря се начина на работа от пример 5 със следните модификации: Използваната за растежа на бактериите среда е луриа бульон (LB) с прибавен антибиотик (20 мг/л хлорамфеникол за pBAD вектори, 100 мг/л ампицилин за рТАС векторите за плазмидно селекциониране) или М9 минимална среда с D-манитол като източник на въглерод.

Използваните за инокулум бактерии в LB се приготвят както следва: Еднонощна култура се разрежда 1 : 50 в пресна LB среда и се инкубира при 37° С на шейкер при 250 об/мин. След mid-log етап се постига OD₆₀o = 0.5 1.0, около 3 часа), прибавя се регулатор на реакцията (глюкоза, арабиноза или IPTG) и бактерийте се инокулират допълнително 3 часа. След 3 часа се измерва отново Οϋόοο за да се определи броя на бактериите и културата се разрежда в LB среда (антибиотици - хлорамфеникол или ампицилин и регулатори се прибавят в двойна концентрация). Крайният бактериален инокулум е около 10 000 cfu/кладенче.

Използваните за инокулума бактерии в М9 минимална среда се получават както следва: еднонощна култура в LB се центрофугира 2x5 мин/3000 об/мин, промива се с М9 среда, разрежда се 1:50 в М9 минимална среда, оставя се при 37° С 14 часа (OD₆₀o - 0.5), прибавя се регулатор на реакцията и бактериите се инкубират допълнително 3 часа.

След 3 часа се измерва отново Οϋβοο за да се определи броя на бактериите и куртурата се разрежда в М9 минимална среда (антибиотици хлорамфеникол или ампицилин и регулатори се прибавят в двойна концентрация). Крайният бактериален инокулум е около 10 000 cfu/кладенче.

Оптична плътност се отчита след 24 и 48 часа поради по-бавния растеж в минимална среда.

Пример 8 - компютърен моделиращ протокол, използван за предвиждане на лигазната инхибиторна активност на представителни аналози

Виртуална библиотека от 7-заместени птеридини се получава чрез комбиниране на хлорометилптеридиновата същност показана по-долу в ляво с различни търговски достъпни амини, съгласно следната схема:

Комплект от 1500 търговски достъпни амини се подбират от Available Chemicals Directory (ACD, MDL) на базата на следните критерии:

МТ < 300, да нямат реактивоспособни или токсични функционални групи да имат лекарстеноподобни свойства да са достъпни от известни доставчици на които може да се разчита.

Съответните птеридинови производни се получават с аналожно образуващ модул включен в Analog Builder module от Cerius2 програма (MSI).

Провежда се структурно търсене върху получените аналози като се използва Catalyst програма (MSI) и общо 32 000 структри (около 20 за молекула) се вместват в активното място на D-Ala-D-Ala лигаза с програмата EUDOC (Mayo Clinic). Структурата на активното място, използвано за вмъкване (docking) се получава от рентгенова кристалографска структура на комплекса между ензима, ADP и фосфинатен инхибитор (получен от протеинови базаданни, pdb code: 2dln), с прегрупиране и минимизиране на структурата на страничната верига на лизин 215.

“Най-добрата” свързваща структура на всяка молекула след това се определя от резултатите за вмъкване. Съответната ориентация в активното място се преотчита със скала отчитаща функции, включени в програмата CSCORE (Tripos). След това разтворите се подреждат на база на консенсусна оценка като се използва функията Chemscore като вторичен критерии. Подбира се група от 76 от най-добрите съединения и отново се вмъкват с програмата FlexX (Tripos), като се използва същата структура на ензимното активно място. Разтворите за вмъкване отново се отчитат с CSCORE. Крайното селекциониране на 50 съединения се базира на консенсус между резултатите получени с двете програми за вмъкване. Предвидените Ki’s, изчислени с CSCORE на FlexX-получените разтвори, са в границите 0.1 - 10 мкМ.

Изчисленията се провеждат на SGI Octane (2 х 250 MHz CPU, 512 MB RAM), и SGI 02 (270 MHz CPU, 128 MB RAM) и клъстер от десет SGI Indigo2 компютри (195 MHz CPU, 512 MB RAM).

Други изпълнения

Трябва да се подразбира, че изобретението е описано подробното погоре с цел илюстриране, а не за да се ограничи обхвата му, който се дифинира от приложените претенции. Други аспекти, предимства и модификации са в обхвата на следващите претенции.

Claims

Патентни претенции

1. Съединение с формула:

в които:

7 7

А и В могат независимо да бъдат N или CR , където R означава водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислород- съдържаща функционална група;

R¹ и R² са еднакви или различни -NR⁵R⁶ групи, където всяки R⁵ и R⁶може независимо да означава водород или въглерод-съдържаща функционална група;

R³ е водород, алкил, амино, хидрокси, алкокси или алкиламино група;

R⁴ е въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислород-съдържаща функционална група, при условие, че ако А и В и двата са азот и R⁵ и R⁶ и двата са водород, тогава R⁴ не е NH₂, -Л(Н)(метил), -Ъ1(Н)(бутил), -М(Н)(хексил), -М(Н)(фенил), 14(Н)(бензил), -N(H)(NH₂), -N(H)(CH₂CH₂OH), -N(CH₂CH₂OH)₂, фенил, Nпиперадинил или -S(eTwi);

ако А е CH, В е азот и R⁵ и R⁶ и двата са водород, тогава R⁴ не е метил, изобутил, фенил, 4-метилфенил, 4-хлорофенил, 4-бромофенил, 2-(2,5диметоксифенил)-етил или -СН(ОСН₃)₂ и ако А и В и двата са СН групи, тогава R⁴ е аминогрупа различна от NH₂, (3,4-дихлорофенил)метиламино или (3,4-дихлорофенил)метиленимино група.
2. Съединение съгласно претенция 1, в което R⁴ може да бъде примерно заместена или незаместена, линейна, разклонена или циклична, алкилова, алкенилова, алкинилова, арилова, аралкилова или алкарилова група.
3. Съединение съгласно претенция 1, в което R⁵ и R⁶ и двата са водород.
4.

Съединение съгласно претенция

1, в което R⁴ включва най-малко една арилова група.
5.

Съединение съгласно претенция 4, в което R⁴ е подбран от група състояща се от:

или

R10

S 17 където R ’ могат независимо да бъдат водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислород-съдържаща функционална група.
7. Съединение съгласно претенция 4, което има структурата:

халоген- и/или кислород-съдържаща функционална група.
8. Съединение съгласно претенция 7, където R⁹ е водород или метил.
9. Съединение съгласно претенция 8, което има структурата:

в която η означава 1, 2, 3 или 4 и R¹⁷ е -NR¹⁸R¹⁹, в която R¹⁸ и R¹⁹ могат независимо да са водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислород-съдържаща функционална група.
10. Съединение съгласно претенция 9, в което R¹⁷ е подбран от група състояща се от:

> 9 9

OH

8 18 19
11. Съединение съгласно претенция 7, в което R е ~(CH2)nNR R , където η означава 1, 2, 3 или 4 hR¹⁸h R¹⁹ могат независимо да бъдат водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислород-съдържаща функционална група.
12. Съединение съгласно претенция 4, в което R⁴ е подбрано от група състояща се от -СН₂О-арил, -CH₂S-apwi, -СН=СН-арил или -NH(CH₂-apwi).
13. Съединение съгласно претенция 1, където съединението има структурата:

R² R3 в която: R²⁰ може да бъде водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислород-съдържаща функционална група.
14. Съединение съгласно претенция 1, в което R⁴ е подбран от група състояща се от -N(CH3)R²¹, -N(CH2CH3)R²¹, -N(CH(CH3)2)R²¹ и N(6eH3Hn)R²¹, където R²¹ означава въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислород-съдържаща функционална група.
15. Съединение съгласно претенция 1, в което R⁴ е подбран от група състояща се от -CH2NH2, -NHCH2CH2NR²²R²³ или -CH2NHC(=O)R²², където

R²² и R²³ могат независимо да бъдат водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислород-съдържаща функционална група.

22 23
16. Съединение съгласно претенция 15, в което R е водород и R е C(=O)R²⁴, където R²⁴ е водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислород-съдържаща функционална група.
17. Съединение съгласно претенция 1, което има структурата:

R2 където R²⁵ и R²⁶ са независимо водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислород-съдържаща функционална група.
18. Съединение съгласно претенция 17, в което R е водород, алкил, хидроксиалкил или аралкил и R може да бъде халогеналкил, хидроксиалкил, -C(=^:O)NR²⁷R²⁸, -C(=O)OR²⁷ или NR²⁷R²⁸, където R²⁷ и R²⁸ са независимо водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислородсъдържаща функционална група.

26 29
19. Съединение съгласно претенция 17, в което R е -C(H)(apHn)(R ),. където R²⁹ е водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислородсъдържаща функционална група.
20. Съединение съгласно претенция 19, в което R включва наймалко една ацилна група.

4.
21. Съединение съгласно претенция 19, в което ариловата трупа може да бъде нафтил или бензотиофенилна група.
22. Съединение съгласно претенция 19, в което R²⁹ включва алфахидрокси карбоксилатна група.
23. Съединение с формула:

Ν'

Ν'

R4 в която

R¹ и R² могат да са еднакви или различни -NR⁵R⁶ групи и всеки R⁵ и R⁶ може независимо да бъде водород или въглерод-съдържаща функционална група и

R⁴ е аминогрупа различна от -NH₂ или
24. Метод за инхибиране на О-аланил-О-аланин (D-Ala-D-Ala) лигаза, характеризиращ се с това, че включва етапа на излагане на D-Ala-D-Ala лигаза на съединение с формула I или формула II:

R2 R³

I

II в които

А и В са независимо N или CR , където R означава водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислород- съдържаща функционална група;

R¹ и R² са еднакви или различни -NR⁵R⁶ групи, където всяки R⁵ и R⁶може независимо да означава водород или въглерод-съдържаща функционална група;

R³ и R⁴ са независимо водород или въглерод-, азот-, сяра-, халогени/или кислород-съдържаща функционална група, при условие, че R³ и R⁴ не са и двата водород.
25. Метод съгласно претенция 24, характеризиращ се с това, че R¹ и R² и двата са NH₂.
26. Метод съгласно претенция 24, характеризиращ се с това, че R³ е водород.
27. Метод съгласно претенция 24, характеризиращ се с това, че

R³ и R⁴ са независимо разклонен или с права верига алкил, -О-алкил, О-алкил-СООН, -O-anKHn-NR⁷R⁸, -О-алкил-ОН, -NR⁷R⁸, -NR⁷-anKHn-NR⁷R⁸, 1\ЕИ⁷-алкил-СООН, -ЬЖ⁷-алкил-ОН, -CO-NR⁷R⁸, -CO-NR⁷-anKwi-NR⁷R⁸, -СОNR⁷-anKHn-COOH, -СО-№К.⁷-алкил-ОН, -S-алкил, -S-алкил-СООН, -S-алкилNR⁷R⁸, -S-алкил-ОН, -О-арил, -О-арил-СООН, -O-apmi-NR⁷R⁸, -О-арил-ОН, S-арил, -S-арил-СООН, -S-apnn-NR⁷R⁸, -S-арил-ОН, -NR⁷-apHn-NR⁸R⁹, -NR⁷арил-СООН, -М<⁷-арил-ОН; -CONR⁷-apwi-NR⁸R⁹, -CONR⁷-apmi-COOH, CONR⁷-apwi~OH, -CH₂NR⁵C6H4COOH; при условие, че R³ и R⁴ не могат едновременно да са еднакви алкилови групи с прави или разклонени вериги;

R¹ и R² са независимо водород, - NH2 или -NR^HR¹², където най-малко единия от R¹ и R² е - NH2;

R⁵ е нисш алкил, водород или -CH2NR¹⁰C6H4CONHR⁶; където R⁶ е алкил, -алкил-СООН, -алкил-Ь1Н2 или -алкил-ОН;

R⁷, R⁸, R¹⁰, R¹¹ и R¹² са независимо с права или разклонена верига алкил, арил или ацилови групи, евентуално заместени с един или повече кислорода, азота, сяра или халоген-базирани функционални групи и

А е N или СН.
28. Метод за лечение на пациент, характеризиращ се с това, че включва прилагане към пациента на ефективно количество от съединение с формула I или формула II:

R2 R³ в които:

7 7

А и . В са независимо N или CR , където R означава водород или въглерод-, азот-, сяра-, халоген- и/или кислород- съдържаща функционална група;

R¹ и R² са еднакви или различни -NR⁵R⁶ групи, където всяки R⁵ и R⁶ може независимо да означава водород или въглерод-съдържаща функционална група; и

R³ и R⁴ са независимо водород или въглерод-, азот-, сяра-, халогени/или кислород-съдържаща функционална група, при условие, че R³ и R⁴ не са и двата водород.
29. Метод съгласно претенция 28, характеризиращ се с това, че R¹ и

R са и двата - NH₂.
30. Метод съгласно претенция 28, характеризиращ се с това, че R³ е водород.
31. Метод съгласно претенция 28, характеризиращ се с това, че

R³ и R⁴ са независимо разклонен или с права верига алкил, -О-алкил, О-алкил-СООН, -O-anKwi-NR⁷R⁸, -О-алкил-ОН, -NR⁷R⁸, -NR⁷-anKHn-NR⁷R⁸, ГЖ⁷-алкил-СООН, -ЪП<⁷-алкил-ОН, -CO-NR⁷R⁸, -CO-NR⁷-anKHn-NR⁷R⁸, -СОNR⁷-anKHn-COOH, -СО->П<⁷-алкил-ОН, -S-алкил, -S-алкил-СООН, -S-алкил© NR⁷R⁸, -S-алкил-ОН, -О-арил, -О-арил-СООН, -О- apnn-NR⁷R⁸, -О-арил-ОН,

-S-арил, -S-арил-СООН, -S-apmi-NR⁷R⁸, -S-арил-ОН, -NR⁷-apwi-NR⁸R⁹, -NR⁷арил-СООН, -NR⁷-apwi-OH; -CONR⁷-apwi-NR⁸R⁹, -CONR⁷-apHn-COOH, CONR⁷-apnn-OH, -CFLNRAi-LiCOOH; при условие, че R³ и R⁴ не могат едновременно да са еднакви алкилови групи с прави или разклонени вериги;

R¹ и R² са независимо водород, - NH2 или -NR^HR¹², където най-малко единия от R¹ и R² е - NH2;

R⁵ е нисш алкил, водород или -CH2NR¹⁰C6H4CONHR⁶; където R⁶ е алкил, -алкил-СООН, -алкил-МН2 или -алкил-ОН;

q R , R , R , R и R са независимо с права или разклонена верига алкил, арил или ацилови групи, евентуално заместени с един или повече кислорода, азота, сяра или халоген-базирани функционални групи и

А е N или СН.
32. Формулировка характеризираща се с това, че включва съединение съгласно претенция 1 заедно с подходящ пълнител за прилагане върху пациент.
33. Метод за лечение на пациент с микробиална инфекция, характеризиращ се с това, че включва прилагане към пациента на ефективно количество от формулировката съгласно претенция 32.
34. Метод съгласно претенция 33, характеризиращ се с това, че пациента е животно.
35. Метод за инхибиране на бактериален растеж в нежива система, характеризиращ се с това, че системата се поставя в контакт с ефективно количество от съединение съгласно претенция 1 за инхибиране на бактериалния растеж.
36. Метод съгласно претенция 24, характеризиращ се с това, че D-AlaD-Ala лигазата включва секвенция, която е най-малко 90 % идентична със секвенцията на D-Ala-D-Ala лигаза на вид, подбран от групата състояща се от Escherichia coli, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Xylella fastidiosa, Bordetella pertussis, Thiobacillus ferrooxidans, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Buchnera aphidicola, Bacillus halodurans, Geobacter sulfiirreducens, Rickettsia prowazekii, Zymomonas mobilis, Aquifex aeolicus termophile, Thermotoga marirtima, Clostridium difficile, Enterococcus faecium, Streptomyces toyocaensis, Amycolatopsis orientalis, Enterococcus gallinarum, Enterococcus hirae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Deinococcus radiodurans, Synechocystis sp., Salmonella typhimurium, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium smeegmatis, Legionella pneumophila, Leuconostoc mesenteroides, Borrelia burgdorferi, Treponema pallidum, Vibrio cholerae и Heliobacter pilori.
37. Метод за получаване на съединение с претенция 1, характеризиращ се с това, че междинни съединения описани тук, взаимодействат с един или повече химически реактиви в един или повече етапи за да се получи съединение от претенция 1.
38. Продукт, получен по метода от претенция 37.