PL235836B1

PL235836B1 - Pochodne kamptotecyny, sposób ich otrzymywania i zastosowanie

Info

Publication number: PL235836B1
Application number: PL401345A
Authority: PL
Inventors: Lech Kozerski; Robert KAWĘCKI; Robert Kawęcki; Beata NAUMCZUK; Beata Naumczuk; Karolina HYZ; Karolina Hyz; Wojciech BOCIAN; Wojciech Bocian; Jerzy SITKOWSKI; Jerzy Sitkowski; Elżbieta BEDNAREK; Elżbieta Bednarek; Katarzyna WIKTORSKA; Katarzyna Wiktorska; Katarzyna LUBELSKA; Katarzyna Lubelska
Original assignee: Inst Chemii Organicznej Polskiej Akademii Nauk; Narodowy Inst Lekow
Priority date: 2012-10-25
Filing date: 2012-10-25
Publication date: 2020-11-02
Also published as: EP2912039A1; PL2912039T3; PL401345A1; US20150266888A1; US9682992B2; WO2014064654A1; EP2912039B1

Abstract

Przedmiotem wynalazku są rozpuszczalne w wodzie pochodne kamptotecyny o wzorze ogólnym (I), ich synteza, związki pośrednie o wzorze ogólnym (II) i (III) oraz ich zastosowanie do wytwarzania leków przeciwnowotworowych.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są rozpuszczalne w wodzie pochodne kamptotecyny, ich synteza oraz zastosowanie. Związki te wykazują korzystne właściwości biologiczne, znajdujące zastosowanie w terapii przeciwnowotworowej.

Topoizomerazy są ważnymi enzymami, konwertującymi energię chemiczną pochodzącą od ATP w energię torsyjnego napięcia cząsteczki o superhelikalnej strukturze. Enzymy te rozplatają podwójną helisę DNA osłabiając naprężenia skręcające w cząsteczce DNA, udostępniając w ten sposób matrycę dla enzymów replikacyjnych lub transkrypcyjnych^{1 2}.

W przypadku topoizomerazy I (topo I) odpowiedzialnej za rozpad jednego wiązania poprzez nacięcie jednej nici i relaksację superskrętów w DNA, u ludzi w reakcji tej uczestniczy Tyr723, która oddziałuje ze szkieletem fosforanowym powodując powstanie 3’-fosfotyrozyny.³ W wyniku obrotu przeciętej nici, DNA oddziałuje z uwolnioną grupą 5’-OH fosfotyrozyny.² W ten sposób, różnorodne małe cząstki aromatyczne, takjak produkt pochodzenia naturalnego kamptotecyna (CPT) lub jej pochodna topotekan (TPT), znane w użyciu klinicznym jako Hycamtin™,⁴’ ^{5 6} mogą zostać wstawione w miejscu rozpadu powstałym w wyniku działania topo I i stabilizować kompleks DNA-topo I.^7-10. Prowadzi to do śmierci komórki, co wyjaśnia dlaczego TPT i jego analogi są zazwyczaj określane jako trucizny, zamieniające istotny enzym w cząstkę uszkadzającą DNA. „Trucizny” topoizomerazy I, II są obiektem dużego zainteresowania w badaniach biochemicznych, ponieważ stanowią one ważną chemioterapeutyczną metodę walki z rakiem.

Inhibicja topoizomerazy I DNA stanowi zatem ważny sposób walki z rakiem przy użyciu chemioterapii. Istnieje kilka skutecznych bioorganicznych strategii pomocnych w osiągnięciu tego celu, jak na przykład; niekowalencyjne wiązanie trucizny w miejscu rozpadu,^{8 11 12} sieciowanie z użyciem metali wiążących,¹³ alkilacja DNA^{14 15} lub fotochemiczne uszkodzenie DNA.¹⁶

Pochodne należące do rodziny kamptotecyny odgrywają istotną rolę, jak na przykład, preparat Hycamtin™ lub irinotekan, Camptosar ™, stosowane są one w leczeniu klinicznym jako środki przeciwrakowe. Wszystkie dotychczas znane pochodne uczestnicząc w procesie inhibicji topo I, tworzą jedynie kompleksy molekularne z naciętym DNA. W związku ze wspomnianą wyżej strukturą kompleksu molekularnego, związki te słabo wiążą nowotworowy DNA.

Istnieje niewiele danych na temat transformacji fotochemicznych przeprowadzanych przez związki należące do rodziny kamptotecyn (CPT). W dziedzinie brak jest również informacji o innym, możliwym mechanizmie reakcji oddziaływania pochodnych kamptotecyny z nowotworowym DNA. Dotychczasowe publikacje skupiają się jedynie na inhibicji enzymu topo I na drodze utworzenia molekularnych kompleksów trójskładnikowych zawierających oligomer DNA/topo I /ligand organiczny.

Istnieje zatem duża potrzeba zapewnienia nowego rozwiązania, zapewniającego uzyskanie trwałego kompleksu z wykorzystaniem pochodnych kamptotecyny.

Niniejszy wynalazek dotyczy syntezy nowych, rozpuszczalnych w wodzie pochodnych wykazujących nieoczekiwanie korzystne właściwości kowalencyjnego wiązania DNA.

Przedmiotem wynalazku jest związek określony wzorem ogólnym (I):

R¹ R2

(I) gdzie R¹ oznacza (N-piperydyno)metyl; (N-piperazyno)metyl; (N-(N-metylopiperazyno)metyl; (Nmorfolino)metyl; (N-pirolidyno)metyl; (N-azetydyno)metyl; (N-azyrydyno)metyl; (N-metyloamino)metyl;

(N-dietyloamino)metyl; R² oznacza etyl; R³ oznacza H; (N-piperydyno)metyl; (N-piperazyno)metyl; (NPL 235 836 B1 (N-metylopiperazyno)metyl; (N-morfolino)metyl; (N-pirolidyno)metyl; (N-azetydyno)metyl; (N-azyrydyno)metyl; (N-metyloamino)metyl; (N-diethyloamino)metyl;

lub R¹ oznacza H; R² oznacza etyl; R³ oznacza (N-piperydyno)metyl; (N-piperazyno)metyl ; (N-(N-metylopiperazyno)metyl; (N-morfolino)metyl; (N-pirolidyno)metyl; (N-azetydyno)metyl; (N-azyrydyno)metyl; (N-metyloamino)metyl; (N-diethyloamino)metyl.

Związek według wynalazku jest korzystnie związkiem wybranym z grupy obejmującej:

7-etylo-9-(N-morfolino)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-11 -(N-morfolino)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9, 11-bis(N-morfolino)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9-(N-piperydyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-11-(N-piperydyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9, 11-bis(N-piperydyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9-(N-piperazyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-11-(N-piperazyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę, 7-etylo-9,11-bis(N-piperazyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9-(N-(N-metylopiperazyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę, 7-etylo-11-(N-(N-metylopiperazyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę, 7-etylo-9,11-bis(N-(N-metylopiperazyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9-(N-pirolidyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-11 -(N-pirolidyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9,11-bis(N-pirolidyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9-(N-azetydyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę, 7-etylo-11-(N-azetydyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę, 7-etylo-9,11-bis(N-azetydyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9-(N-azyrydyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę, 7-etylo-11-(N-azyrydyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę, 7-etylo-9,11-bis(N-azyrydyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9-(N-metyloamino)metylo-10-hydroksykamptotecynę

7-etylo-11 -(N-metyloamino)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9,11-bis(N-metyloamino)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9-(N-dietyloamino)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-11 -(N-dietyloamino)metylo-10-hydroksykamptotecynę, 7-etylo-9,11-bis(N-dietyloamino)metylo-10-hydroksykamptotecynę.

Innym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania związku wyżej określonego, charakteryzujący się tym, że związek SN38, 7-etylo-10-hydroksykamptotecynę, poddaje się reakcji z odpowiednią aminą i formaldehydem w środowisku acetonitrylu i kwasu octowego, w temperaturze wrzenia i otrzymuje się pochodne 10-hydroksykamptotecyny podstawione jak określono w definicji związku o wzorze (I).

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest związek pośredni (QM) o-metylenochinon o wzorze (II) odpowiednim do podstawienia jak określono w definicji związku o wzorze (I):

PL 235 836 Β1

(Π)

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest związek pośredni (QM) o-metylenochinon o wzorze (III) odpowiednim do podstawienia jak określono w definicji związku o wzorze (I):

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie związku pośredniego określonego wzorem (II) do wytwarzania leków przeciwnowotworowych.

Korzystnie, związek ten znajduje zastosowanie do wytwarzania leku do leczenia raka piersi.

Korzystnie, związek ten znajduje zastosowanie do wytwarzania leku do leczenia białaczki.

Korzystnie, związek ten znajduje zastosowanie do wytwarzania leku do leczenia raka okrężnicy.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie związku pośredniego określonego wzorem (III) do wytwarzania leków przeciwnowotworowych.

Korzystnie, związek ten znajduje zastosowanie do wytwarzania leku do leczenia raka piersi. Korzystnie, związek ten znajduje zastosowanie do wytwarzania leku do leczenia białaczki. Korzystnie, związek ten znajduje zastosowanie do wytwarzania leku do leczenia raka okrężnicy.

Zgodnie z wynalazkiem, pierścień ATPT może ulegać fotochemicznie indukowanej transformacji do związku pośredniego o-metylenochinonu, który może reagować in situ z nukleofilowymi centrami guaniny w dupleksie DNA (Schemat 1).

Co więcej, związki według wynalazku wykazują właściwości spontanicznego, kowalencyjnego wiązania oligomerów DNA.

PL 235 836 Β1

Schemat 1

Przebieg reakcji wynika z przyłączenia TPT do ostatniej pary zasad GC, jak wykazano w przypadku naturalnego oligomeru d(GCGATCGC)2, wewnątrz miejsca rozpadu w dekamerze DNA.

Wynalazek opiera się na pochodnych kamptotecyny i ich syntezie, pozwalającej uzyskać rozpuszczalne pochodne o nadzwyczaj korzystnych właściwościach. Związki według wynalazku umożliwiają przeprowadzenie reakcji alkilowania nukleofilowego atomu azotu w zasadach wchodzących w skład nowotworowego DNA w sposób skuteczny i łatwy do wykonania. Wykazano, że związki według wynalazku przejawiają aktywność spontanicznego lub indukowanego UV tworzenia wiązania z oligomerem DNA.

Przedmiot wynalazku w przykładach wykonania jest uwidoczniony na rysunku, na którym, na fig. 1 przedstawiono wyniki analizy PFGSE NMR dla pochodnej DNA/TPT przed naświetleniem UV. Zaznaczone linie wskazują współczynniki dyfuzji, Di, dla DNA (z niekowalencyjnie związanej pochodnej TPT), ok. 1.7 χ 1O^-10 m²/s, oraz niezwiązanej pochodnej TPT w szybkiej wymianie z DNA, 2.3 χ 1O^-10 m²/s;

na fig. 2 przedstawiono eksperyment PFGSE NMR z użyciem pochodnej DNA/TPT po naświetleniu UV. Zaznaczone linie wskazują współczynniki dyfuzji, Di, ok. 1.4 χ 1O^-10 m²/s dla biokoniugatu DNA - TPT;

na fig. 3 przedstawiono diagram MALDI MS dla produktów reakcji alkilacji d(GCGATCGC)2 z użyciem soli [Me3N⁺CF3SO3^_] TPT po naświetleniu UV, wskazano obszar podwójnoniciowy (ds) alkilowanego koniugatu. Pełnymi strzałkami zaznaczono niealkilowany, podwójnoniciowy DNA a przerywanymi strzałkami wskazano monoalkilowany koniugat TPT;

na fig. 4 przedstawiono wyniki analizy biologicznej z użyciem 7-etylo-9-N-(dimetyloamino)metylo10-hydroksykamptotecyny dla trzech badanych linii komórkowych: L-1210 - komórki mysiej białaczki, MCF-7 - komórki ludzkiego raka piersi oraz linii komórkowej Caco-2 (komórki ludzkiego raka okrężnicy);

na fig. 5 przedstawiono wyniki analizy biologicznej z użyciem 7-etylo-9-(N-morfolino)metylo-10hydroksykamptotecyny dla trzech badanych linii komórkowych: L-1210-komórki mysiej białaczki, MCF7 - komórki ludzkiego raka piersi oraz linii komórkowej Caco-2 (komórki ludzkiego raka okrężnicy);

na fig. 6 przedstawiono widmo ESI MS związku określonego w zastrz. 1 z widocznym sygnałem o-metylenochinonu, m/z 405.1371.

Dzięki wynalazkowi, uzyskano możliwość kowalencyjnej, spontanicznej lub zachodzącej z udziałem UV reakcji alkilowania DNA przez pochodne kamptotecyny, jak wykazano w poniższych przykładach wykonania z użyciem oligomerów DNA.

Uzyskane wyniki są niezwykle istotne z punktu widzenia zastosowania związków według wynalazku w medycynie, w szczególności w terapii przeciwnowotworowej.

W realizacjach wynalazku podano przykładowe związki i udowodniono powstawanie koniugatów stosując analizę NMR PFGSE, która umożliwiła łatwe rozróżnienie kompleksów molekularnych od kowalencyjnych koniugatów hybrydowych poprzez pomiar ich współczynnika dyfuzji. Wynalazek przetestowano ponadto w układach biologicznych z użyciem rakowych linii komórkowych, uzyskując korzystną wartość parametru IC50 na poziomie stężenia 20 μΜ.

W związku z powyższym, niniejszy wynalazek, dzięki niezwykle korzystnym właściwościom zastrzeganych związków, może stanowić przełom w chemioterapii, dostarczając skuteczne narzędzie do walki z chorobami nowotworowymi.

Wynalazek ujawniono za pomocą następujących przykładów wykonania, przedstawionych jedynie w celu ilustracyjnym, bez ograniczenia w żaden sposób jego zakresu, ani sposobu, w jaki może być on zrealizowany.

PL 235 836 B1

P r z y k ł a d I

Otrzymywanie 7-etylo-9-(N-morfolino)metylo-10-hydroksykamptotecyny

SN38 (7-etylo-10-hydroksykamptotecyna) (3,3 mg; 8 x 10^-3 mmol) zawieszono w 2,4 ml CH3CN, a następnie dodano kwas octowy (103 pxL), 37% wodny roztwór CH2O (8μΙ; 0,0986 mmol), 8,5 μl morfoliny (0,098 mmol). Uzyskaną mieszaninę mieszano w temperaturze 80°C. Po upływie 10 h rozpuszczalnik odparowano pod próżnią (w 40°C) i przemyto eterem dietylowym (3 x 1 mL). Otrzymaną pozostałość liofilizowano stosując 2 ml H2O i rozpuszczono w deuterowanym DMSO. Na podstawie analizy widma Ή NMR stwierdzono obecność dwóch substancji: SN38 oraz 7-etylo-9-(N-morfolino)metylo-10hydroksykamptotecyny (wydajność 33%). LR-MS (ESI): m/z 393 [M+H]+, 492 [M+H]⁺. Deuterowany DMSO odparowano pod próżnią. Pozostałość ekstrahowano stosując 0,5% HCl (3 x 1 ml) w celu rozpuszczenia w wodzie pochodnej morfolinokamptotecyny. Nierozpuszczalną 7-etylo-10-hydroksykamptotecynę usunięto poprzez filtrację. Następnie oczyszczono za pomocą HPLC na kolumnie RP-C18 LPH (150 mm x 10 mm) stosując układ fazy ciekłej: 20% CH3CN / 80% wodnego 0,1% HCOOH z prędkością przepływu 3 ml/min. Przebieg chromatografii monitorowano za pomocą detekcji UV przy długości fali 260 nm. Zbierano frakcje (czas retencji 8,5 min) i liofilizowano uzyskując czysty produktu. (>98%) Dane spektralne 7-etylo-9-(N-morfolino)metylo-10-hydroksykmptotecyny

LR-MS (ESI): m/z 492 [M+H]⁺

1H NMR δ (D2O, TSPA) 500 MHz: 1.01 (t, J=7.3 Hz, 3H), 1.45 (t, J=7.3Hz, 3H), 2.00 (m, 2H), 3.13 (m, 1H), 3.22 (m, 1H), 3.32 (m, 4H), 3.97 (m, 4H), 4.87 (d, J=15.0Hz, 1H), 4.88 (d, J=15.0Hz, 1H), 4.93 (d, J=18.7 Hz, 1H), 4.96 (d, J=18.7 Hz, 1H), 5.41 (J=16.14 Hz, 1H), 5.55 (J=16.14 Hz, 1H), 7,25 (d, J=9.17 Hz, 1H), 7.26 (s, 1H), 7.59 (d, J=9.17 Hz, 1H).

¹³C NMR δ (D2O, TSPA); HSQC 6.1, 13.4, 24.6, 30.5, 42.9, 49.8, 55.0, 63.4, 65.8, 97.8, 121.5, 130.7; HMBC 73.2, 117.5, 146.0, 146.9, 150.5, 174.30

UV nm: 378, 366, 329, 268, 224, 202.

IR (KBr) cm^-1 :1038, 1056, 1108, 1162, 1261, 1303, 1383, 1423, 1463, 1513, 1593, 1656, 1744, 2853, 2922, 2958, 3401

P r z y k ł a d II

Otrzymywanie 7-etylo-9-(N-morfolino)metylo-10-hydroksykamptotecyny (dwukrotny nadmiar CH3COOH)

SN38 (2.9 mg, 7 x 10^-3 mmol) zawieszono w 2,1 ml CH3CN, a następnie dodano kwas octowy (190 μυ>, 37% wodny CH2O (6,8 μΐ, 0,084 mmol), i morfolinę (7.3 μΐ, 0.084 mmol). Uzyskaną mieszaninę mieszano w temperaturze 80°C. Po upływie 8 h odparowano pod próżnią rozpuszczalnik (w 40°C) i przemyto eterem dietylowym (3 x 1 ml). Otrzymaną pozostałość liofilizowano stosując 2 ml H2O i rozpuszczono w deuterowanym DMSO. Na podstawie analizy widma Ή NMR odnotowano obecność dwóch substancji: SN38 oraz 7-etylo-9-(N-morfolino)metylo-10-hydroksykamptotecyny (wydajność 25%). LR-MS (ESI): m/z 393 [M+H]⁺, 492 [M+H]⁺. Deuterowany DMSO odparowano pod próżnią. Pozostałość ekstrahowano stosując 0,5% HCl (3 x 1 ml) w celu rozpuszczenia w wodzie pochodnej kamptotecyny. Nierozpuszczalną kamptotecynę usunięto poprzez filtrację. Oczyszczanie pozostałości przeprowadzono za pomocą HPLC w następujący sposób: osad rozpuszczono w fazie ciekłej (20% CH3CN, 80% 0,1% wodny HCOOH) i wstrzyknięto na kolumnę RP-C18 LPH 150 mm x 10 mm, po czym wymywano z prędkością 3 ml/min. Przebieg chromatografii monitorowano za pomocą detekcji UV przy 260 nm. Zbierano frakcje (czas retencji 8,5 min) i liofilizowano uzyskując czysty produkt (>95%).

Dane spektralne 7-etylo-9-(N-morfolino)metylo-10-hydroksykmptotecyny jak w przykładzie I.

P r z y k ł a d III

Otrzymywanie 7-etylo-9-(N-morfolino)metylo-10-hydroksykamptotecyny (dwukrotny nadmiar CH3COOH i 24-krotny nadmiar odczynnika)

SN38 (2,27 mg, 5,54 x 10^-3 mmol) zawieszono w 1,65 ml CH3CN, a następnie dodano kwas octowy (142 μθ, 37% wodny CH2O (10,8 μ!; 0,133 mmol), morfolinę (11,6 μl 0,133 mmol). Uzyskaną mieszaninę mieszano w temperaturze 80°C. Po upływie 6 h odparowano pod próżnią rozpuszczalnik (w 40°C) i przemyto eterem dietylowym (3 x 1 ml). Otrzymaną pozostałość liofilizowano stosując 2 ml H2O i rozpuszczono w deuterowanym DMSO. Na podstawie analizy widma ¹H NMR odnotowano obecność dwóch substancji: SN38 oraz 7-etylo-9-N-morfolinometylo-10-hydroksykamptotecyna (wydajność 37%). LR-MS (ESI): m/z 393 [M+H]⁺, 492 [M+H]⁺. Deuterowany DMSO odparowano pod próżnią. Pozostałość ekstahowano stosując 0,5% HCl (3 x 1 ml) w celu rozpuszczenia w wodzie pochodnej

PL 235 836 B1 kamptotecyny. Nierozpuszczalną kamptotecynę usunięto poprzez filtrację. Oczyszczanie pozostałości przeprowadzono za pomocą HPLC w następujący sposób: osad rozpuszczono w fazie ciekłej (20% CH3CN, 80% 0,1% wodny HCOOH) i wstrzyknięto na kolumnę RP-C18 LPH 150 mm x 10 mm, po czym wymywano z prędkością 3 ml/min. Przebieg chromatografii monitorowano za pomocą detekcji UV przy 260 nm. Zbierano frakcje (czas retencji 8,5 min) i liofilizowano uzyskując czysty produkt (>96%).

P r z y k ł a d IV

Alkilowanie TPT²³

Trifluorometanosulfonian metylu (0,1 ml; 0,9 mmol) rozpuszczono w CH2CI2 (3 ml), a następnie dodano niewielką ilość K2CO3. Mieszaninę mieszano przez 30 min. w celu zobojętnienia kwasu trifluorometanosulfonowego (CF3SO3H^-). Roztwór odfiltrowano od K2CO3, dodano do suchego wolnego TPT (1,8 mg; 4,4 x 10^-3 mmol) i mieszano przez 24 h w temperaturze pokojowej. Mieszaninę odparowano do sucha pod próżnią w temperaturze pokojowej i rozpuszczono w deuterowanym DMSO-d6. Na podstawie analizy widma 1H NMR stwierdzono obecność pięciu produktów: N-metylowany TPT([Me3N+ CF3SO3^-], sól TPT); N,O-dimetylowany TPT, protonowany TPT-[TPTH+ CF3SO3^-], alkohol 23CH2OH. N-metylowany TPT ([Me3N+ CF3SO3^-] sól TPT) stanowił do 50% mieszaniny. Wykonano LR ESI MS mieszaniny reakcyjnej; LR-MS (ESI): m/z: 149 [CF3SO3^-] ^- 422 [M+H]+, 436 [M]⁺, 450 [M]⁺.

Odparowaną do sucha mieszaninę reakcyjną przemyto wodą (5 x 1 ml). Osad odfiltrowano i liofilizowano warstwę wodną. Następnie oczyszczono za pomocą HPLC na kolumnie RP-C18 LPH (150 mm x 10 mm) stosując układy fazy ciekłej: 10% CH3CN / 90% wodnego 0,1% HCOOH przez pierwsze 15 min po czym zmieniono układ na 20% CH3CN/ 80% wodnego 0.1% HCOOH ze stałą prędkością przepływu 3 ml/min. Przebieg chromatografii monitorowano za pomocą detekcji UV przy długości fali 260 nm. Zebrano frakcje (czas retencji 25 min) i liofilizowano uzyskując 2 produkty.

LR-MS (ESI): m/z 422 [M+H]⁺ - [TPTH+ CF3SO3^-] - w UV niereaktywny; 436 [M]⁺ - [Me3N⁺ CF3SO3^-] - w UV reaktywny.

Szczegóły eksperymentalne HPLC

Chromatografię w układzie faz odwróconych C-18 przeprowadzono stosując kolumnę analityczną (Bionacom Velocity C 18 LPH, 4,6 x 250 mm, 5 mikronów) oraz kolumnę semipreparatywną (Bionacom Velocity C 18 LPH, 10 mm x 150 mm, 5 micronów) oraz aparat Shimadzu LC-8A HPLC wyposażony w detektor spektrofotometryczny Shimadzu SPD-6A UV.

Szczegóły eksperymentalne ESI MS

Rozpuszczalnik: 0,1% HCOOH, ACN 1:1; źródło jonów: ESI; wstrzyknięta objętość 1 μ-L; zakres m/z: 150-1500; czas wyłapywania jonów w pułapce jonowej: 10 ms; napięcie detektora: 1,7 kV; napięcie interfejsu: 4,5 oraz -4,5 kV; temperatura CDL: 200 C; temperatura Heat Block: 200 C; gaz nośny: 1,5 L/min; prędkość przepływu: 0,1 ml/min; długość fali: Ch1: 254 nm, Ch2: 220 nm; Aparat: LCMS-ITTOF Shimadzu.

P r z y k ł a d V

Eksperymenty NMR z wykorzystaniem dyfuzji

Przeprowadzono analizę PFGSE stosując pochodną DNA/TPT przed naświetlaniem UV (fig. 1) oraz po naświetlaniu UV (fig. 2). Następnie rozdzielano niezwiązaną pochodną TPT i analizowano chromatograficznie za pomocą HPLC.

Na podstawie uzyskanego widma stwierdzono wyraźną różnicę pomiędzy kompleksem molekularnym a biokoniugatem. Wyniki eksperymentu stanowią dowód na istnienie kowalencyjnego wiązania pomiędzy chemicznie zmodyfikowaną jednostką CPT a oligomerem DNA.

P r z y k ł a d VI

Przygotowanie próbki i analiza MALDIMS

Suchą próbkę przygotowaną zgodnie z powyższą procedurą, zawierającą do 50% soli TPT [Me3N⁺ CF3SO3^-], dodano w nadmiarze (2 ekw) do wodnego roztworu zawierającego 1 mmol oligonukleotydu d(GCGATCGC)2 bez dodatku buforu, w kwarcowych probówkach do NMR. Roztwór naświetlano stosując lampę UV o długości fali 365 nm, przez 20 godz. Wytrącony osad odsączono, a roztwór odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. W celu przeprowadzenia analizy MALDI, ciało stałe rozpuszczono w wodzie dejonizowanej. Widmo masowe dla jonów ujemnych MALDI zarejestro

PL 235 836 B1 wano za pomocą urządzenia Voyager-Elite (PerSeptive Biosystems Inc., Framingham, MA, USA), wyposażonego w laser azotowy (337 nm) w trybie liniowym przy napięciu przyspieszenia 20 kV i opóźnionej ekstrakcji jonów.

Mieszaninę 50 mg/ml roztworu kwasu 3-hydroksypikolinowego w 50% acetonitrylu oraz 50 mg/ml roztworu wodorocytrynianu diamonu w wodzie dejonizowanej (8:1, obj/obj) zastosowano jako matrycę. Jeden μL roztworu oligonukleotydu w wodzie dejonizowanej w stężeniu 0,01 OD^L wymieszano na płytce MALDI z jednym μL matrycy i pozostawiono do wysuszenia na powietrzu.

Widmo masowe uzyskano z co najmniej 100 impulsów lasera i przetwarzano stosując program Data Explorer wer. 4 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Analiza MALDI pozwoliła na uzyskanie masy m/z z dokładnością wyższą niż 0,1% (tj. ±1 jednostka masy na [M-1]^-1000).

Wyniki analizy MALDI MS dla produktów reakcji alkilacji d(GCGATCGC)2 z użyciem soli TPT [Me3N+CF3SO3^-] po naświetleniu UV wykazały istnienie obszaru podwójnoniciowego (ds) w alkilowanym koniugacie DNA, jak przedstawiono na fig. 3.

P r z y k ł a d VII

Analiza biologiczna komórek

Linia komórkowa mysiej białaczki L1210

Hodowlę komórek mysiej białaczki L1210 prowadzono w pożywce RPMI-1640, uzupełnionej 10% inaktywowaną cieplnie płodową surowicą bydlęcą, penicyliną (100 Ul/ml), streptomycyną (100 μg/ml), amfoterycyną (250 ng/ml), L-glutaminą (2mM) oraz 1% nie-niezbędnymi aminokwasami. Komórki hodowano w 37°C, w atmosferze zawierającej 5% CO2 i 95% powietrza. Pożywkę wymieniano na świeżą co 48 godzin. Do wszystkich eksperymentów komórki były wysiewane w gęstości 1 x 10⁵ komórek/ml.

Test MTT

Test ten opiera się na pomiarze ilości formazanu powstającego dzięki zdolności redukcji rozpuszczalnego w wodzie bromku 3-(4,5-dimetylotiazolo-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliowego (MTT) przez dehydrogenazę mitochondrialną, wchodzącą w skład łańcucha oddechowego. Komórki uszkodzone lub martwe wykazują niską lub zerową aktywność dehydrogenazy. Za pomocą testu możliwe jest zatem określenie żywotności komórek. Roztwór 7-etylo-9-N-(dimetyloamino)metylo-10-hydroksykamptotecyny lub 7-etylo-9-(N-morfolino)metylo-10-hydroksykamptotecyny przygotowano w DMSO. W celu określenia cytotoksyczności badanych związków, komórki L1210 inkubowano przez 24 godziny wraz z roztworem 7-etylo-9-N-(dimetyloamino)metylo-10-hydroksykamptotecyny lub 7-etylo-9-(N-morfolino)metylo-10-hydroksykamptotecyny w stężeniach 1 μM, 5 μM, 10 μM, 20 pM, 30 μM, 40 μM oraz 50 μM. Po odwirowaniu i przemyciu buforem PBS komórki inkubowano przez 3 godziny w roztworze MTT, a powstałe kryształy rozpuszczano za pomocą alkoholu izopropylowego. Absorbancja formazanu mierzona była w spektrofotometrze płytkowym „Power Wavex microplate” (Biotek Instruments) przy długości fali 570 nm.

Analiza statystyczna

Do oceny istotności statystycznej zmian w poziomie cytotoksyczności zastosowano analizę wariancji (ANOVA) z testem post-hoc Dunnett’a przy poziomie istotności p <0.05. Obliczenia przeprowadzono stosując program Statistica wer. 9.0 (StatSoft, Inc USA).

Linia komórkowa ludzkiego raka piersi MCF-7

Hodowlę linii komórkowej ludzkiego raka piersi MCF-7 prowadzono w pożywce minimalnej Eagle’a (Minimum Essential Medium Eagle (MEM)), uzupełnionej 10% inaktywowaną cieplnie płodową surowicą bydlęcą, penicyliną (100 Ul/ml), streptomycyną (100 μg/ml), amfoterycyną (250 ng/ml), L-glutaminą (2mM) oraz 1% nie-niezbędnymi aminokwasami. Komórki hodowano w 37°C, w atmosferze zawierającej 5% CO2 i 95% powietrza. Pożywkę wymieniano na świeżą co 48 godzin, a po uzyskaniu 80% konfluencji komórki pasażowano roztworem 0,25% trypsyny. Do wszystkich eksperymentów komórki były wysiewane w gęstości 5 x 10⁴ komórek/ml.

Test MTT

Test ten opiera się na pomiarze ilości formazanu powstającegoo dzięki zdolności redukcji rozpuszczalnego w wodzie bromku 3-(4,5-dimetylotiazolo-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliowego (MTT) przez dehydrogenazę mitochondrialną, wchodzącą w skład łańcucha oddechowego. Komórki uszkodzone lub martwe wykazują niską lub zerową aktywność dehydrogenazy. Za pomocą testu możliwe jest zatem określenie żywotności komórek. Roztwór 7-etylo-9-N-(dimetyloamino)metylo-10-hydroksykamptotecyny lub 7-etylo-9-(N-morfolino)metylo-10-hydroksykamptotecyny przygotowano w DMSO. W celu określenia

PL 235 836 B1 cytotoksyczności badanych związków, komórki MCF-7 inkubowano przez 24 godziny wraz z roztworem 7-etylo-9-N-(dimetyloamino)metylo-10-hydroksykamptotecyny lub 7-etylo-9-(N-morfolino)metylo-10-hydroksykamptotecyny w stężeniach 1 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM oraz 50 μM. Po przemyciu buforem PBS, komórki inkubowano przez 3 godziny w roztworze MTT, a powstałe kryształy rozpuszczano za pomocą alkoholu izopropylowego. Absorbancja formazanu mierzona była w spektrofotometrze płytkowym „Power Wavex microplate” (Biotek Instruments) przy długości fali 570 nm.

Analiza statystyczna

Linia komórkowa ludzkiego raka okrężnicy Caco-2

Hodowlę linii komórkowej ludzkiego raka okrężnicy Caco-2 prowadzono w pożywce minimalnej Eagle’a (Minimum Essential Medium Eagle (MEM)), uzupełnionej 20% inaktywowaną cieplnie płodową surowicą bydlęcą, penicyliną (100 Ul/ml), streptomycyną (100 μg/ml), amfoterycyną (250 ng/ml), L-glutaminą (2mM) oraz 1% nie-niezbędnymi aminokwasami. Komórki hodowano w 37°C, w atmosferze zawierającej 5% CO2 i 95% powietrza. Pożywkę wymieniano na świeżą co 48 godzin, a po uzyskaniu 80% konfluencji komórki pasażowano roztworem 0,25% trypsyny. Do wszystkich eksperymentów komórki były wysiewane w gęstości 6,5 x 10⁴ komórek/ml.

Test MTT

Test ten opiera się na pomiarze ilości formazanu powstającego dzięki zdolności redukcji rozpuszczalnego w wodzie bromku 3-(4,5-dimetylotiazolo-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliowego (MTT) przez dehydrogenazę mitochondrialną, wchodzącą w skład łańcucha oddechowego. Komórki uszkodzone lub martwe wykazują niską lub zerową aktywność dehydrogenazy. Za pomocą testu możliwe jest zatem określenie żywotności komórek. Roztwór 7-etylo-9-N-(dimetyloamino)metylo-10-hydroksykamptotecyny lub 7-etylo-9-(N-morfolino)metylo-10-hydroksykamptotecyny przygotowano w DMSO. W celu określenia cytotoksyczności badanych związków, komórki Caco-2 inkubowano przez 24 godziny wraz z roztworem 7-etylo-9-N-(dimetyloamino)metylo-10-hydroksykamptotecyny lub 7-etylo-9-(N-morfolino)metylo-10-hydroksykamptotecyny w stężeniach 1 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM M oraz 50 μM. Po przemyciu buforem PBS, komórki inkubowano przez 3 godziny w roztworze MTT a powstałe kryształy rozpuszczano za pomocą alkoholu izopropylowego. Absorbancja formazanu mierzona była w spektrofotometrze płytkowym „Power Wavex microplate” (Biotek Instruments) przy długości fali 570 nm.

Analiza statystyczna

Wyniki analizy biologicznej z użyciem 7-etylo-9-N-(dimetyloamino)metylo-10-hydroksykamptotecyny dla trzech badanych linii komórkowych: L-1210 - komórki mysiej białaczki, MCF-7 - komórki ludzkiego raka piersi oraz Caco-2 - komórki ludzkiego raka okrężnicy, przedstawiono na fig. 4.

Wyniki analizy biologicznej z użyciem 7-etylo-9-(N-morfolino)metylo-10-hydroksykamptotecyny dla trzech badanych linii komórkowych: L-1210 - komórki mysiej białaczki, MCF-7 - komórki ludzkiego raka piersi oraz Caco-2 - komórki ludzkiego raka okrężnicy przedstawiono na fig. 5.

P r z y k ł a d VIII

Tytuł: Zastosowane materiały i metody eksperymentalne

Szczegóły eksperymentalne

Oligomery DNA nabyto z Integrated DNA Technologies, Inc i oczyszczono zgodnie z opisem.¹²Oligonukleotyd d(GCGATCGC)2 nabyto z Integrated DNA Technologies, Inc. i oczyszczono za pomocą chromatografii jonowymiennej, z użyciem kolumny HiTrap™-Q (Pharmacia Biotech) stosując gradientowe wymywanie roztworem wodorowęglanu amonu (0,1 M-0,8 M) i odsolono na kolumnie zawierającej Sephadex G-10. Czystość >95+

Chlorowodorek topotekanu nabyto z Alexis Biochemicals i zastosowano bezpośrednio, bez żadnych dodatkowych etapów oczyszczania. Czystość >98+

PL 235 836 B1

W celu uzyskania wolnej zasady TPT, chlorowodorek topotekanu (2 mg, 4.4 x 10^-3 mmol) rozpuszczono w H2O (0,5 mL) i ustalono pH na poziomie 7 stosując wodny roztwór NaHCO3. Wolny TPT ekstrahowano z użyciem CH2CI2 i suszono pod próżnią.

Przygotowanie próbki

Widma Ή NMR uzyskano, stosując spektrometr VARIAN VNMRS 500 MHz z użyciem sondy Nalorac ID wyposażonej w jednostkę gradientową generującą gradient wartości 60 gausów/cm (Gs/cm) wzdłuż osi Z, w temperaturze 25,0° C. Przesunięcia chemiczne odnoszono względem TSPA jako standardu wewnętrznego rozpuszczonego w D2O.

Parametry analizy 1H NMR; 25,3°C; sw = 8000 Hz (zakres spektralny); nt = 16, lub 64, lub 256; (ilość skanów), 32 K punktów pamięci; at = 2 s (czas akwizycji), d1 = 6 s (opóźnienie relaksacyjne), satdly = 2 s (czas presaturacji sygnału wody), 1b = 0.3 Hz (poszerzenie linii). Parametry analizy ¹³C NMR; 25,0°C;

Widmo ¹H/¹³C-HSQC. 1H-¹³C HSQC (heterojądrowe jednokwantowe widma korelacyjne) były otrzymywane, stosując zakres spektralny wynoszące 5000 Hz, 2048 punktów w domenie H i 8000 Hz, 800 x 2 inkrementów w domenie ¹³C; 128 skanów na inkrement t1, z opóźnieniem relaksacyjnym wynoszącym 1 s i ¹J (C,H) = 135 Hz. Dane były liniowo ekstrapolowane do 1600 punktów i dopełniane zerami do 4096 punktów w Fi przed transformacją Fouriera.

1H/¹³C-HMBC (heterojądrowe widmo korelacyjne przez wiele wiązań) Widma z gradientową selekcją koherencji Ή - ¹³C HMBC były otrzymywane, stosując czas akwizycji wynoszący 0,2 s, szerokość impulsu 1H - 90° wynoszącą 7.8 μβ, szerokość impulsu ¹³C - 90° wynoszącą 11.5 μβ, szerokość widmową wynoszącą 5000 Hz, 2048 punktów danych w wymiarze Ή i 25000 Hz, 1024 inkrementy w wymiarze ¹³C, opóźnienie relaksacyjne wynoszące 1.2 s. Dane były uzyskiwane w postaci wartości bezwzględnych, stosując 64 skany na inkrement t1. Doświadczenie było optymalizowane dla ⁿJ(C,H) = 8 Hz, a dla ¹J(C,H) = 140 Hz, stosowano filtr dolnoprzepustowy. Dane były liniowo ekstrapolowane do 2048 punktów i dopełniane zerami do 4096 punktów w F1 przed transformacją Fouriera.

(PFGSE) (Pulsed Field Gradient Spin Echo) (eksperymenty pomiaru dyfuzji)

DOSY NMR jest metodą o dużym potencjale do analizowania mieszanin związków chemicznych w roztworze, którą się mierzy translacyjny współczynnik dyfuzji Dt. Większe cząsteczki dyfundują dużo wolniej niż mniejsze cząsteczki. Każda linia spektralna w widmie 1H - 1D NMR danego indywiduum chemicznego jest charakteryzowana przez taki sam współczynnik Dt, różniący się dla każdej cząsteczki o innym ciężarze cząsteczkowym.

Eksperymenty wykonano stosując następujące warunki: 16 widm zbierano z zastosowaniem sekwencji PFGDSTE ¹⁸ ( Double Stimulated Echo with convection compensation) (podwójnie stymulowane echo z kompensacją konwekcji temperturowej) ze wstępnym nasycaniem resztkowego sygnału wody. Stałą cewki gradientowej skalibrowano, stosując znany współczynnik dyfuzji wody (Dt = 19.02 x 10^-10m²/s )¹⁹. Moce gradientu były zwiększane jako zależność kwadratowa w zakresie od 2 do 50 G/cm. Czas dyfuzji (Δ) i czas trwania gradientów pola magnetycznego (6) wynosiły odpowiednio 150 ms i 1.0 ms. Pozostałe parametry obejmują: szerokość przemiatania wynosząca 8000 Hz, 32K punktów pamięci, 64 skany i czas akwizycji danych 2.7 s oraz opóźnienie relaksacyjne wynoszące 2 s i 16 skanów bez stosowania impulsu. Dane są przetwarzane z zastosowaniem pakietu Varian realizującego DOSY ¹⁷.

Odnośniki literaturowe

1. Wang, J. C. DNA topoisomerases. Annu. Rev. Biochem. 1996, 65, 635-92.

2. Stewart, L.; Redinbo, M. R.; Qiu, X.; Hol, W. G.; Champoux, J. J. A model for the mechanism of human topoisomerase I. Science 1998, 279, 1534-41.

3. Redinbo, M. R.; Stewart, L.; Kuhn, P.; Champoux, J. J.; Hol, W. G. J. Crystal structures of human topoisomerase I in covalent and noncovalent complexes with DNA. Science 1998, 279, 1504-1513.

4. Pizzolato, J. F.; Saltz, L. B. The camptothecins. Lancet 2003, 361,2235-42.

5. Zunino, F.; Pratesi, G. Camptothecins in clinical development. Expert Opin. Investig. Drugs 2004,13, 269-84.

6. Takimoto, C. H.; Wright, J.; Arbuck, S. G. Clinical applications of the camptothecins. Biochim. Biophys. Acta 1998, 1400, 107-19.

7. Rivory, L. P.; Robert, J. Pharmacology of camptothecin and its derivatives. Bull. Cancer 1995, 82, 265-285.

PL 235 836 Β1

8. Slichenmyer, W. J.; Rowinsky, E. K.; Donehower, R. C.; Kaufmann, S. H. The current status of camptothecin analogs as antitumor agents. J. Natl. Cancerlnst. 1993, 85, 271291.

9. Staker, B. L.; Hjerrild, K.; Feese, M. D.; Behnke, C. A.; Burgin, A. B.; Stewart, L. The mechanism of topoisomerase I poisoning by a camptothecin analog. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99,15387-15392.

10. Pommier, Y.; Kohlhagen, G.; Kohn, K. W.; Leteurtre, F.; Wani, M. C.; Wall, Μ. E. Interaction of an alkylating camptothecin derivative with a DNA base at topoisomerase l-DNA cleavage sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92, 8861-8865.

11. Dallavalle, S., Merlini, L. Camptothecin and Analogs: Structure and Synthetic Efforts. In Modem Alkaloids, Prof. Ernesto Fattorusso, P. O. T.-S., Ed. 2007; pp 503-520.

12. Bocian, W.; Kawęcki, R.; Bednarek, E.; Sitkowski, J.; Williamson, Μ. P.; Hansen, P. E.; Kozerski, L. Binding of Topotecan to a Nicked DNA Oligomer in Solution. Chem. Eur. J. 2008, 14, 2788-2794.

13. Reedijk, J. Why does Cisplatin reach Guanine-n7 with competing s-donor ligands available in the celi? Chem. Rev. 1999, 99, 2499-510.

14. Pandę, P.; Shearer, J.; Yang, J.; Greenberg, W. A.; Rokita, S. E. Alkylation of Nucleic Acids by a Model Ouinone Methide. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121,6773-6779.

15. Veldhuyzen, W. F.; Lam, Y. F.; Rokita, S. E. 2'-Deoxyguanosine reacts with a model quinone methide at multiple sites. Chem. Res. Toxicol. 2001, 14,1345-51.

16. Svoboda, J.; Konig, B. Templated photochemistry: toward catalysts enhancing the efficiency and selectivity of photoreactions in homogeneous Solutions. Chem. Rev. 2006, 106, 5413-30.

17. Johnson, C. S. Diffusion Ordered NMR Spectroscopy: Principles and Applications. Próg. Nuci. Magn. Reson. 1999, 34, 203-255.

18. Nilsson, M.; Gil, A. M.; Delgadillo, L; Morris, G. A. Improving pulse sequences for 3D diffusion-ordered NMR spectroscopy: 2DJ-IDOSY. Anal Chem. 2004, 76, 5418-22.

19. Mills, R. Self-Diffusion in Normal and Heavy Waterin the Rangę 1-45 C. J Phys. Chem. 1973, 77, 685-688.

Claims

1. Związek o wzorze ogólnym (I)

gdzie R¹ oznacza (N-piperydyno)metyl; (N-piperazyno)metyl; (N-(N-metylopiperazyno)metyl (Nmorfolino)metyl; (N-pirolidyno)metyl; (N-azetydyno)metyl; (N-azyrydyno)metyl; (N-metyloamino)metyl, (N-dietylamino)metyl;

R² oznacza etyl; R³ oznacza H, (N-piperydyno)metyl; (N-piperazyno)metyl; (N-(N-metylopiperazyno)metyl, (N-morfolino)metyl, (N-pirolidyno)metyl, (N-azetydyno)metyl, (N-azyrydyno)metyl, (N-metyloamino)metyl, (N-diethyloamino)metyl,

PL 235 836 B1 lub R¹ oznacza H; R² oznacza etyl; R³ oznacza (N-piperydyno)metyl; (N-piperazyno)metyl; (N(N-metylopiperazyno)metyl, (N-morfolino)metyl, (N-pirolidyno)metyl, (N-azetydyno)metyl, (Nazyrydyno)metyl, (N-metyloamino)metyl, (N-diethyloamino)metyl.

2. Sposób otrzymywania związku określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że związek SN38, 7-etylo-10-hydroksykamptotecynę, poddaje się reakcji z odpowiednią aminą i formaldehydem w środowisku acetonitrylu i kwasu octowego, w temperaturze wrzenia otrzymując pochodne 10-hydroksykamptotecyny podstawione jak określono w zastrz. 1.

3. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że jest związkiem wybranym z grupy obejmującej:

7-etylo-9-(N-morfolino)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-11-(N-morfolino)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9, 11-bis(N-morfolino)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9-(N-piperydyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-11-(N-piperydyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9, 11-bis(N-piperydyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9-(N-piperazyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-11-(N-piperazyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9,11-bis(N-piperazyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9-(N-pirolidyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-11-(N-pirolidyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9,11-bis(N-pirolidyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9-(N-azetydyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-11-(N-azetydyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9,11-bis(N-azetydyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9-(N-azyrydyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-11-(N-azyrydyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9,11-bis(N-azyrydyno)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9-(N-metyloamino)metylo-10-hydroksykamptotecynę

7-etylo-11-(N-metyloamino)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9,11-bis(N-metyloamino)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-9-(N-dietyloamino)metylo-10-hydroksykamptotecynę,

7-etylo-11-(N-dietyloamino)metylo-10-hydroksykamptotecynę, 7-etylo-9,11-bis(N-dietyloamino)metylo-10-hydroksykamptotecynę.

4. Związek pośredni (-QM) o-metylenochinon o wzorze (II) odpowiednim do podstawienia jak określono w zastrz. 1:

PL 235 836 Β1

(Π)

5. Związek pośredni (-QM) o-metylenochinon o wzorze (III) odpowiednim do podstawienia jak określono w zastrz. 1:

6. Zastosowanie związku pośredniego określonego w zastrz. 4 do wytwarzania leków przeciwnowotworowych.

7. Zastosowanie związku pośredniego określonego w zastrz. 5 do wytwarzania leków przeciwnowotworowych.

8. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że do wytwarzania leku do leczenia raka piersi.

9. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że do wytwarzania leku do leczenia białaczki.

10. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że do wytwarzania leku do leczenia raka okrężnicy.

11. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że do wytwarzania leku do leczenia raka piersi.

12. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że do wytwarzania leku do leczenia białaczki.

13. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że do wytwarzania leku do leczenia raka okrężnicy.