PL236857B1 - Sposób wytwarzania polilaktydowego substytutu kości gąbczastej o zwiększonej hydrofilowości - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polilaktydowego substytutu kości gąbczastej o zwiększonej hydrofilowości.

W transplantologii kostnej, zamiast transplantacji żywych narządów, coraz częściej wykorzystuje się substytuty, takie jak biokompatybilne metale, ceramikę i polimery [1]. Materiały polimerowe zyskały szeroką akceptację chirurgów, ponieważ posiadają właściwości sprężyste i cierne, które zbliżają je do właściwości tkanki stawów maziowych. Dodatkowo implanty polimerowe cechuje mała masa. Obecnie najczęstszym zastosowaniem polimerów w ortopedii jest alloplastyka stawów. Polimery takie jak wysokocząsteczkowy polietylen (UHMWPE) stanowią powierzchnie nośne w stawach kolanowych, biodrowych, barkach, stawach kostnych i stawach kręgosłupa. Polieteroeteroketon (PEEK) zyskał popularność w łączeniu kości kręgosłupa, ze względu na podobieństwo w modułach sprężystości z kością. Zbliżone właściwości elastyczne polimerów i kości zmniejszają występowanie zjawiska, które jest określane w stanie techniki jako ekranowanie naprężeniowe [2]. Ponieważ materiały polimerowe są bardziej sprężyste niż metaliczne i ceramiczne, przejmują większy procent obciążenia. Skutkiem jest zapobieganie atrofii (zanikaniu) kości. Przewagę w zastosowaniach w ortopedii zdobywają polimery resorbowalne, ponieważ są stopniowo zastępowane przez kość gospodarza i nie ma potrzeby ponownej operacji. Ze względu na biozgodność i możliwość sterowania czasem degradacji ważną pozycję wśród polimerów stosowanych w regeneracji kości zajmują poliestry [3-6]. Polimery te zastosowano z pozytywnym rezultatem nie tylko w badaniach przedklinicznych na zwierzętach, lecz również w badaniach klinicznych na ludziach [7]. Szeroko stosowanym poliestrem w inżynierii tkankowej jest polilaktyd (PLA) [8]. Degraduje on w organizmie w przewidywalny sposób, co pozwala na kontrolowaną regenerację kości. PLA ulega degradacji w wyniku hydrolizy i jest wydalany w naturalnych procesach fizjologicznych [9, 10]. Dzięki stopniowej degradacji implantu polilaktydowego, z czasem coraz większe obciążenie jest przenoszone na kość. Dzięki temu nowo odbudowana kość jest mocniejsza.

Testy biologiczne materiałów poliestrowych (w tym polilaktydu) ujawniły, że są one w przeważającej części biologicznie obojętne (nie wykazują negatywnej, ani pozytywnej interakcji z żywymi tkankami). Brak interakcji jest pożądany z perspektywy immunologicznej, jednakże ten sam brak bioaktywności wymaga dodatkowego zabiegu w celu integracji biologicznie obojętnego implantu z twardą tkanką pacjenta. Poprawę bioaktywności powierzchni materiałów polimerowych można osiągnąć poprzez modyfikację mechaniczną, fizyczną lub chemiczną.

Z polskiego zgłoszenia patentowego P.415317 znany jest sposób wytwarzania polilaktydowych rusztowań gąbczastych do hodowli komórek nabłonka walcowatego, zgodnie z którym w reaktorze szklanym umieszcza się roztwór polilaktydu w dioksanie, dichlorometanie lub chloroformie o stężeniu 1,5-6% wag., roztwór miesza się przez 20-28 h z szybkością 550-700 obr/min., w temperaturze 20-30°C, do całkowitego rozpuszczenia polimeru, następnie do roztworu dodaje się nierozpuszczalnik polilaktydu, którym jest woda w takiej ilości, aby stężenie nierozpuszczalnika wynosiło od 0-5% wag. w stosunku do masy polimeru. Po uzyskaniu jednorodnego roztworu polimeru, roztwór zamraża się przez 20-28 h w temperaturze -10 do -20°C, i uzyskane zamrożone rusztowanie poddaje się żelowaniu w wodzie z metanolem i/albo etanolem w temperaturze od -10°C do -20°C przez 30-48 h, a następnie otrzymane rusztowanie oczyszcza się w wodzie i suszy się z pozostałości wody i rozpuszczalników.

Sposób według zgłoszenia P.415435 prowadzi do otrzymania rusztowania polilaktydowego o wewnętrznej gąbczastej strukturze i regularnym rozmieszczeniu porów, z funkcją dostarczania substancji odżywczych, jednak powierzchnia rusztowania pozostaje hydrofobowa. Problemem jest połączenie dwóch niemieszających się polimerów (hydrofobowego polilaktydu i innego polimeru hydrofilowego), aby uzyskać materiał o właściwościach hydrofilowych, zachowując jednocześnie odpowiednie właściwości mechaniczne polilaktydu i wysoką porowatość materiału. Problem ten został rozwiązany w obecnym wynalazku, dzięki modyfikacji rusztowania polilaktydowego za pomocą kopolimeru kwasu metakrylowego. Modyfikacja skafoldów polilaktydowych za pomocą kopolimeru kwasu metakrylowego nie była do tej pory praktykowana.

Sposób wytwarzania polilaktydowego substytutu kości gąbczastej o zwiększonej hydrofilowości według wynalazku charakteryzuje się tym, że sporządza się roztwór polilaktydu w dioksanie o stężeniu 1-12%, następnie dodaje się kopolimer kwasu metakrylowego w ilości 0,01-100% masowych w stosunku do polilaktydu, po czym dodaje się porofor, wybrany spośród wody i alkoholu C1-C3, w ilości 0,1-30% objętościowych w stosunku do roztworu polimeru. Mieszaninę miesza się przez 3-24 h w temperaturze 20-60°C, z szybkością 160-300 rpm, po czym roztwór wylewa się do formy i zmraża się

PL 236 857 B1 w temperaturze -25 - -35°C, przez 12-36 h. Następnie otrzymany substytut pozostawia się w wodzie, o temperaturze -10°C - 10°C na 3-5 dni, po czym suszy się próżniowo w temperaturze 30-45°C przez 24-48 h.

Korzystnie jako polilaktyd stosuje się poli-L-laktyd, korzystnie o ciężarze cząsteczkowym M_n 50 000-150 000 g/mol, dyspersyjności D=1,2-2.

Korzystnie stosuje się poli-L-laktyd mający 0-1% zawartość centrów D, a zawartość Sn <20 ppm.

Korzystnie jako kopolimer kwasu metakrylowego stosuje się poli(kwas metakrylowy-co-metakrylan metylu) o stosunku grup bocznych od 1:3 do 3:1, poli(kwas metakrylowy-co-metakrylan dimetyloaminoetylu-co-metakrylan butylu) o stosunku grup bocznych 1:2:1.

Korzystnie stosuje się kopolimer kwasu metakrylowego o ciężarze cząsteczkowym M_w 45 000130 000 g/mol.

Korzystnie jako porofor stosuje się wodę. Korzystnie stosuje się wodę demineralizowaną o czystości miliq, a alkohol o czystości min. 99%.

Korzystnie porofor dodaje się w czasie 5-20 minut, najkorzystniej za pomocą pompy strzykawkowej.

W wyniku procesu przeprowadzonego zgodnie z wynalazkiem uzyskuje się trójwymiarowy substytut kości gąbczastej z polilaktydu modyfikowanego kopolimerem kwasu metakrylowego. Obecność wielu bocznych grup estrowych powoduje, że polimetakrylany są polimerami o większej hydrofilowoś ci niż polilaktyd, a jednocześnie mieszają się z roztworem polilaktydu. Powierzchnia implantów otrzymanych według wynalazku jest bardziej hydrofilowa w stosunku do samego polilaktydu i sprzyja regeneracji kości gąbczastej. Specjalna budowa wewnętrzna substytutu oraz właściwości powierzchni umożliwiają wtłoczenie do substytutu zwiększonej ilości hydrofilowych czynników wzrostu komórek w postaci osocza bogatopłytkowego. Pory we wnętrzu rusztowania po hydrofilizacji mogą być zasiedlane przez namnażające się komórki. Możliwa jest również poprawa adhezji komórek do powierzchni implantu. Ponadto, w zależności od podstawnika można dysponować również polimetakrylanami hydrofilowymi o właściwościach anionowych (grupa karboksylanowa), bądź kationowych (grupa trimetyloamoniowa). Otrzymane substytuty charakteryzują się porowatością otwartą 90-97% oraz nasiąkliwością względem izopropanolu 1000-2200%.

Na rysunku przedstawiono:

Fig. 1. Zdjęcie implantu polilaktydowego o zwiększonej hydrofilowości (po lewej) oraz schematyczny rysunek miejsc poboru próbek do analizy SEM (po prawej).

Fig. 2. Obrazy SEM powierzchni substytutu otrzymanego według wynalazku. Zastosowano dodatek poli(kwasu metakrylowego-co-metakrylanu metylu) o stosunku grup bocznych 1:2. Jako porofor zastosowano metanol.

Fig. 3. Obrazy SEM powierzchni substytutu otrzymanego według wynalazku. Zastosowano dodatek poli(kwas metakrylowy-co-metakrylan dimetyloaminoetylu-co-metakrylan butylu). Jako porofor zastosowano metanol.

Fig. 4. Obrazy SEM powierzchni substytutu otrzymanego według wynalazku. Zastosowano dodatek poli(kwas metakrylowy-co-metakrylan dimetyloaminoetylu-co-metakrylan butylu). Jako porofor zastosowano wodę.

Sposób według wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładach.

P r z y k ł a d 1

W kolbie stożkowej 250 mL rozpuszczano 6,2 g poli-L-laktydu (PLLA, M_n 86 000 g/mol, PDI 1,8, zawartość Sn 10 ppm) w 200 mL dioksanu o czystości 99,5% przez 3 h, w 60°C. Następnie roztwór PLA/dioksan ochłodzono do 25°C i mieszano przez 21 h przy użyciu mieszadła magnetycznego oraz baryłkowatego elementu mieszającego, którego objętość wynosi min. 50% objętości roztworu polim eru (szybkość mieszania 200 min^-1). Do kolby stożkowej o pojemności 50 mL wlano 20 mL przygotowanego roztworu PLLA w dioksanie. Następnie, za pomocą pompy strzykawkowej, wkroplono 2 mL metanolu i wsypano 0,05 g poli(kwasu metakrylowego-co-metakrylanu metylu) o stosunku grup bocznych 1:2 (nazwa handlowa Eudragit S100). Zawartość kolby mieszano przy użyciu mieszadła magnetycznego oraz elementu mieszającego przez 24 h w 25°C. Następnie roztwór wylano do odpowiednio przygotowanej formy teflonowej z odkręcanym dnem o pojemności 50 mL. Natychmiast po wylaniu roztworu, formy umieszczono w zamrażarce, w temperaturze -18°C, na 24 h. Po upływie tego czasu zamrożony roztwór wyjęto z formy i umieszczono w 300 mL schłodzonej wody na czas 5 dni. Temperatura wody wynosiła 4°C przez cały czas trwania procesu. Substytuty suszono przez 48 h w temp 30°C pod próżnią 10 mbar. Otrzymano substytut posiadający mikro i mikroporowatość według Fig. 2.

PL 236 857 B1

P r z y k ł a d 2

Procedurę powtórzono jak w przykładzie 1, z tą różnicą że zastosowano dodatek poli(kwasu metakrylowego-co-metakrylanu dimetyloaminoetylu-co-metakrylan butylu) o stosunku grup bocznych 1:2:1 (nazwa handlowa E100) w ilości 0,05 g. Otrzymano substytut posiadający mikro i mikroporowatość według Fig. 3.

P r z y k ł a d 3

W kolbie stożkowej 250 mL rozpuszczono 6,2 g poli-L-laktydu (PLLA, M_n 86 000 g/mol, PDI 1,8, zawartość Sn 10 ppm) w 200 mL dioksanu o czystości 99,5% przez 3 h, w 60°C. Następnie roztwór PLA/dioksan ochłodzono do 30°C i mieszano przez 21 h przy użyciu mieszadła magnetycznego oraz elementu mieszającego (szybkość mieszania 200 min^-1). Do kolby stożkowej o pojemności 50 mL wlano 20 mL przygotowanego roztworu PLLA w dioksanie. Do kolby wsypano 0,4 g Eudragitu E100. Zawartość kolby mieszano przy użyciu mieszadła magnetycznego oraz elementu mieszającego przez w 50°C do rozpuszczenia zawartości. Następnie, za pomocą pompy strzykawkowej, wkroplono porcjami 1,5 mL porofora, za każdym razem po 0,5 mL wody demi o czystości miliq (porofor). Czynność powtórzono po około 15 minutach, upewniając się, że roztwór jest klarowny. Uzyskany roztwór mieszano 21 h, w temperaturze 25°C. Następnie roztwór wylano do odpowiednio przygotowanej formy teflonowej z odkręcanym dnem o pojemności 50 mL. Natychmiast po wylaniu roztworu, formę umieszczono w zamrażarce, w temperaturze -18°C, na 24 h. Po upływie tego czasu zamrożony roztwór wyjęto z formy i umieszczono w 300 mL schłodzonej wody na czas 5 dni. Temperatura wody wynosiła 4°C przez cały czas trwania procesu. Substytuty suszono przez 48 h w temp 45°C pod próżnią 10 mbar. Otrzymano substytut posiadający mikro i mikroporowatość według Fig. 4.

Literatura:

[1] Giannoudis P. V., Dinopoulos H., Tsiridis E. Bone substitutes: An update, Injury., 36 (2005), S20-S27.

[2] Huiskes R., Weinans H. H., Rietbergen R. The relationship between stress shielding and bone resorption around total hip stems and the effects of flexible materials, Clinical Orthopaedics and Related Research (1992) s. 124-134.

[3] Ip, W. Y., Gogolewski S. Clinical Application of Resorbable Polymers in Guided Bone Regeneration, Macromolecular Symposia., 253 (2007), s. 139-146.

[4] Avera S. P., Stampleg W.A., McAllister B.S. Histologic and clinical observation of resorbable and non resorbable barrier membranes used in maxillary sinus graft containment, The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants., 12 (1997), s. 88-90.

[5] Fugazzotto P.A. GBR using borine bone matrix and resorbable and non resorbable membrane. Part 2: clinical results, The International Journal of Periodontics and Restorative Dentistry., 23 (2003), s. 599-605.

[6] Slomkowski S., Biodegradable Polyesters for Tissue Engineering, Macromolecular Symposia., 253 (2007), s. 47-58.

[7] Ficek K., Filipek J., Wojciechowski P., Kopec K., Stodolak-Zych E., Blazewicz S. A bioresorbable polylactide implant used in bone cyst filling, Journal of Material Sciences: Materials in Medicine., 27 (2016), s. 33.

[8] Ruśkowski P., Gadomska-Gajadhur A., Polilaktyd w zastosowaniach medycznych, Tworzywa sztuczne w przemyśle 2017, 2, 32-35.

[9] Barbanti S. H., Santos A. R., Zavaglia C. A., Duek E. A. Porous and Dense PoIy(L-Lactic Acid) and Poly(D,L-Lactic Acid-Co-Glycolic Acid) Scaffolds: In Vitro Degradation in Culture Medium and Osteoblasts Culture. Journal of Materials Science: Materials in Medicine., 15 (2004), 1315-1321.

[10] Nowak B., Pająk J. Biodegradacja polilaktydu (PLA), Archiwum Gospodarki Odpadami i Ochrony Środowiska., 2010, 12, s. 1-10.

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania polilaktydowego substytutu kości gąbczastej o zwiększonej hydrofilowości, w którym sporządza się roztwór polilaktydu w dioksanie, dodaje się porofor, mieszaninę miesza się do rozpuszczania polimeru, po czym roztwór zamraża się, otrzymany substytut

   PL 236 857 B1 oczyszcza się w wodzie i suszy, znamienny tym, że stosuje się roztwór polilaktydu w dioksanie o stężeniu 1-12%, do tego roztworu dodaje się kopolimer kwasu metakrylowego w ilości 0,01-100% masowych w stosunku do polilaktydu, po czym dodaje się porofor, wybrany spośród wody i alkoholu C1-C3, w ilości 0,1-30% objętościowych w stosunku do roztworu polimeru, mieszaninę miesza się przez 3-24 h w temperaturze 20-60°C, z szybkością 160300 rpm, po czym roztwór wylewa się do formy i zmraża się w temperaturze -25 - -35°C, przez 12-36 h, następnie otrzymany substytut pozostawia się w wodzie, o temperaturze -10°C - 10°C na 3-5 dni, po czym suszy się próżniowo w temperaturze 30-45°C przez 24-48 h.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako polilaktyd stosuje się poli-L-laktyd.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się poli-L-laktyd o ciężarze cząsteczkowym Mn 50 000-150 000 g/mol, zawartości centrów D 0-1%, dyspersyjności D 1,2-2, zawartości Sn <20 ppm.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako kopolimer kwasu metakrylowego stosuje się poli(kwas metakrylowy-co-metakrylan metylu) o stosunku grup bocznych od 1:3 do 3:1, poli(kwas metakrylowy-co-metakrylan dimetyloaminoetylu-co-metakrylan butylu) o stosunku grup bocznych 1:2:1.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się kopolimer kwasu metakrylowego o ciężarze cząsteczkowym M_w 45 000-130 000 g/mol.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako porofor stosuje się wodę.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że porofor dodaje się w czasie 5-20 minut.