PL237158B1 - Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie i sposób hodowli komórek macierzystych - Google Patents
Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie i sposób hodowli komórek macierzystych Download PDFInfo
- Publication number
- PL237158B1 PL237158B1 PL426289A PL42628918A PL237158B1 PL 237158 B1 PL237158 B1 PL 237158B1 PL 426289 A PL426289 A PL 426289A PL 42628918 A PL42628918 A PL 42628918A PL 237158 B1 PL237158 B1 PL 237158B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- roridula
- stem cells
- plant
- resin
- leaves
- Prior art date
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 18
- 230000028327 secretion Effects 0.000 title description 41
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title description 14
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 41
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 23
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 23
- 241000220267 Roridula Species 0.000 claims description 17
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 11
- 241000220268 Roridula gorgonias Species 0.000 claims description 9
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 8
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 8
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 6
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 2
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 2
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 101150106167 SOX9 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000007443 liposuction Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000004854 plant resin Substances 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 108091007065 BIRCs Proteins 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000711846 Homo sapiens Transcription factor SOX-9 Proteins 0.000 description 1
- 102000055031 Inhibitor of Apoptosis Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102100034204 Transcription factor SOX-9 Human genes 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000013022 venting Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/70—Undefined extracts
- C12N2500/76—Undefined extracts from plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie oraz sposób hodowli ludzkich i zwierzęcych adherentnych komórek macierzystych z zastosowaniem wydzieliny roślinnej otrzymanej z roślin z rodzaju Roridula (tuliłezka).
Wydzielina gatunków z rodzaju Roridula ma postać silnie klejącej żywicy i nie ma charakteru śluzu. Jest nierozpuszczalna w wodzie, częściowo rozpuszcza się w etanolu i chloroformie; jest rozpuszczalna w acetonie.
W roku 1991 roku odkryto i opisano po raz pierwszy mezenchymalne komórki macierzyste (MSC-Mesenchymal Stem Cells) (Caplan 1991). W kolejnych latach udowodniono, że MSC w hodowlach in vitro po odpowiedniej stymulacji różnicują się w kierunku innych komórek: osteocytów, chondrocytów, neurocytów lub adipocytów. MSC są niezróżnicowanymi komórkami znajdującymi się w różnych tkankach człowieka i mają zdolność do samoodnowy. MSC to naturalny materiał wykorzystywany w medycynie regeneracyjnej. Terapia MSC daje nadzieję na wyleczenie różnych przewlekłych chorób człowieka.
Jednym ze źródeł pozyskiwania MSC jest krew pępowinowa i galareta Whartona pępowiny. Z powodu niewielkiej liczby MSC w materiale wyjściowym konieczne jest prowadzenie hodowli MSC in vitro, w celu uzyskania odpowiednio dużej liczby MSC, które po różnicowaniu można podać pacjentowi jako terapeutyczny materiał biologiczny.
Obecnie jednak największym i nierozwiązanym problemem jest uzyskanie dużej liczby MSC od pacjenta. Można je uzyskać w hodowlach komórkowych in vitro otrzymując materiał spersonalizowany. Dotychczas stosowane sposoby hodowli MSC są nieskuteczne ze względu na trudności MSC w kontakcie z podłożem i sąsiednimi komórkami - co uniemożliwia wzrost MSC i ich proliferację.
Nieoczekiwanie problem ten został rozwiązany w niniejszym wynalazku.
Celem wynalazku jest poprawienie wydajności hodowli komórek macierzystych prowadzonych in vitro.
Istota wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest powierzchnia do hodowli komórek macierzystych charakteryzująca się tym, że posiada zewnętrzną powłokę zawierającą żywicę wydzielaną przez liście roślin z rodzaju Roridula, korzystnie żywicę wydzielaną przez emergencje znajdujące się na liściach Roridula gorgonias.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób prowadzenia hodowli adherentnych komórek macierzystych w znanych warunkach i w znanym medium hodowlanym, charakteryzujący się tym, że hodowlę prowadzi się na stałej powierzchni, przy czym powierzchnia do hodowli komórek macierzystych posiada zewnętrzną powłokę zawierającą żywicę wydzielaną przez liście roślin z rodzaju Roridula, korzystnie żywicę wydzielaną przez emergencje znajdujące się na liściach Roridula gorgonias.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie powierzchni posiadającej zewnętrzną powłokę zawierającą żywicę wydzielaną przez liście roślin z rodzaju Roridula, korzystnie żywicę wydzielaną przez emergencje znajdujące się na liściach Roridula gorgonias, do prowadzenia hodowli adherentnych komórek macierzystych.
Szczegółowy opis wynalazku
W przykładowej realizacji powierzchnię według wynalazku otrzymuje się poprzez pokrycie powierzchni naczynia hodowlanego wspomnianą żywicą roślinną. Przed rozpoczęciem hodowli naczynie suszy się i sterylizuje. W korzystnej realizacji, suszenie prowadzi się warunkach sterylnych, pod ciśnieniem atmosferycznym i w temperaturze pokojowej, natomiast sterylizację prowadzi się metodą autoklawowania, zwłaszcza w temperaturze 121°C, pod ciśnieniem 215 kPa, przez 20 minut.
W przykładowej realizacji, hodowanymi komórkami macierzystymi są komórki ludzkie, szczególnie korzystnie mezenchymalne komórki macierzyste. W przykładowych realizacjach hoduje się w szczególności komórki mezenchymalne izolowane z tkanki tłuszczowej (KT) otrzymane wg standardowej procedury liposukcji, po trawieniu enzymatycznym kolagenazą typu I oraz komórki mezenchymalne z galarety Whartona (GW), otrzymane drogą eksplantów komórkowych.
Za wyjątkiem stosowania specjalnie zmodyfikowanej zgodnie z wynalazkiem powierzchni hodowlanej pozostałe parametry prowadzenia hodowli nie odbiegają od standardowych.
W przykładowych realizacjach hodowle komórkowe prowadzi się zwłaszcza w czasie pozwalającym na uzyskanie odpowiedniej ilości komórek, korzystnie w czasie 21 dni w standardowych warunkach: w temp. 37°C, w stężeniu tlenu na poziomie 21% oraz 5% CO2. W trakcie hodowli komórki mogą być
PL 237 158 B1 pasażowane po osiągnięciu odpowiedniej fazy wzrostu, zwłaszcza co 3 dni, z zastosowaniem trypsyny. Korzystnie, w przykładowych realizacjach stosuje się podłoże o następującym składzie: 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 0,5% penicyliny ze streptomycyną, 0,5% amfoterycyny, DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium).
Efektem wynalazku jest dostarczenie sposobu zwiększenia przylegania (adherencji) MSC do podłoża w celu zwiększenia ich proliferacji (podziałów komórkowych). W tym celu wykorzystano żywicę roślin z rodzaju Roridula (Roridula gorgonias Planch.). Istotną cechą sposobu prowadzenia hodowli komórkowych według wynalazku jest zastosowanie wydzieliny roślin z rodzaju Roridula do pokrycia dna naczynia hodowlanego (szklanego lub plastikowego) co zwiększa adherentność MSC a przez to uzyskanie odpowiednio dużej liczby MSC jako materiału przeszczepowego.
Nieoczekiwanie ustalono, że właściwości wydzieliny roślin z rodzaju Roridula poprawiają adherentność komórek macierzystych i zwiększają proliferację w hodowlach komórkowych, jednocześnie pozostając bez niepożądanego wpływu cytotoksycznego - co zostało udowodnione w przeprowadzonych testach in vitro.
Zastosowanie wydzieliny roślin z rodzaju Roridula wywołało pozytywne efekty w hodowlach krótko- i długoterminowych komórek macierzystych człowieka.
Wydzielinę pozyskiwano z roślin z rodzaju Roridula, nanoszono na podłoża stałe (szklane lub plastikowe) tworzące komórkowe naczynia hodowlane, które suszono i sterylizowano. Po zalaniu medium hodowlanym prowadzono długoterminowe hodowle komórek macierzystych pozyskanych z różnych tkanek. Do oceny sposobu hodowli komórek macierzystych z zastosowaniem wydzieliny roślinnej zastosowano znane procedury badawcze: obserwacje przyżyciowe komórek, obserwacje żywotności z zastosowaniem testu z MTT i aneksyną V/jodek propidiowy, analiza cytometryczna i ocena ekspresji genów.
Wyniki przeprowadzonych badań pozwoliły na stwierdzenie pozytywnego wpływu wydzieliny roślinnej na przebieg hodowli komórek macierzystych, które w hodowlach prowadzonych zgodnie z wynalazkiem łatwiej się przyklejały do podłoża i szybciej proliferowały - bez działań niepożądanych na komórki, w tym bez efektów cytotoksycznych (bez różnicy w testach z MTT) i bez różnicy w testach apoptozy/nekrozy - z aneksyną V/jodek propidiowy).
Uzyskane wyniki hodowli ludzkich komórek macierzystych z zastosowaniem wydzieliny roślinnej były korzystniejsze niż w warunkach hodowli komórek macierzystych bez wydzieliny roślinnej.
Nieoczekiwanie ustalono, że zastosowanie wydzieliny roślin z rodzaju Roridula wywołuje pozytywne efekty w hodowlach krótko- i długoterminowych komórek macierzystych człowieka poprzez zwiększenie ich przylegania do podłoża co umożliwia ich proliferację i uzyskanie odpowiednio dużej liczby MSC do przeszczepu dla pacjenta.
Korzystną cechą sposobu hodowli komórek macierzystych z zastosowaniem wydzieliny roślinnej roślin z rodzaju Roridula jest optymalny wzrost MSC w hodowlach in vitro i brak toksycznego wpływu wydzieliny roślinnej na MSC w czasie hodowli in vitro. Wynalazek umożliwia otrzymanie odpowiednio dużej liczby MSC przez wzrost ich adherentności bez działań niepożądanych na komórki, w tym bez efektów cytotoksycznych oraz apoptozy/nekrozy. Wynalazek wpływa korzystnie na potencjał proliferacyjny MSC.
P r z y k ł a d 1. Otrzymywanie wydzieliny z roślin z rodzaju Roridula.
W badaniach wykorzystano rośliny gatunku Roridula gorgonias.
Na liściach Roridula gorgonias znajdują się emergencje (gruczoły) wytwarzające żywicę. Produkowana i wydzielana żywica gromadzi się na powierzchni liści w miejscach odpowiadających produkujących ją emergencjom. W rezultacie na wierzchołku każdej emergencji znajduje się kropla żywicy. Zostało to przedstawione na fig. 1.
Krople żywicy mogą być zbierane dowolnymi znanymi metodami.
W opisywanym przykładzie krople żywicy zbierano z powierzchni liści wykorzystując w tym celu szklaną bagietkę.
P r z y k ł a d 2. Nanoszenie żywicy na powierzchnie do hodowli komórek macierzystych.
W celu naniesienia żywicy na powierzchnię przeznaczoną do hodowli komórek macierzystych żywicę nakładano wprost z emergencji, przykładając emergencję do powierzchni, bezpośrednio na powierzchnię komercyjnie dostępnych naczyń hodowlanych (szklanych lub plastikowych) bądź szkiełek mikroskopowych, które umieszczano następnie w naczyniach hodowlanych.
PL237 158 Β1
W przypadku wykorzystywania bagietek szklanych do zbioru kropel żywicy, żywicę zgromadzoną na powierzchni bagietki nanoszono następnie w analogiczny sposób wprost z bagietki na powierzchnię komercyjnie dostępnych naczyń hodowlanych.
Następnie naczynia hodowlane posiadające zmodyfikowane w ten sposób powierzchnie suszono w jałowej komorze laminarnej (Komora laminarna SafeFast Elitę 212S) i sterylizowano w autoklawie LABOKLAV 55V.
Warunki suszenia: ciśnienie atmosferyczne, temp, pokojowa.
Parametry sterylizacji: temperatura 121°C, ciśnienie 215 kPa, ekspozycja 20 minut, wolne schładzanie, odpowietrzanie grawitacyjne.
Przykład 3. Hodowla komórek macierzystych na powierzchniach pokrytych wydzieliną z roślin z rodzaju Roridula.
W celu ustalenia wpływu zmodyfikowanej zgodnie z wynalazkiem powierzchni do hodowli komórek macierzystych na przebieg hodowli przeprowadzono testy porównujące wyniki hodowli przykładowych ludzkich komórek macierzystych w standardowych warunkach na standardowych powierzchniach naczyń hodowlanych oraz w tych samych warunkach na powierzchniach zmodyfikowanych zgodnie z wynalazkiem.
Do badań użyto dwóch rodzajów komórek macierzystych człowieka - mezenchymalnych komórek macierzystych izolowanych z tkanki tłuszczowej (KT) otrzymanych wg standardowej procedury liposukcji, po trawieniu enzymatycznym kolagenazą typu I oraz komórki mezenchymalne z galarety Whartona (GW), otrzymane drogą eksplantów komórkowych.
Hodowle komórkowe przeprowadzono w czasie 21 dni (z pasażowaniem co 3 dni) w inkubatorze Brunswick New Galaxy 170R w standardowych warunkach: w temp. 37°C w standardowym stężeniu tlenu na poziomie 21% oraz 5% CO2. Komórki hodowano w komercyjnie dostępnych naczyniach hodowlanych, a następnie pasażowano po osiągnięciu odpowiedniej fazy wzrostu z zastosowaniem trypsyny.
Skład podłoża: 10% FBS (Fetal Bovine Serum, firmy Sigma), 0,5% penicyliny ze streptomycyną (firmy Sigma), 0,5% amfoterycyny (firmy Sigma), DMEM (firmy Sigma).
W celu oceny fenotypowej mezenchymalnych komórek macierzystych dokonano analizy cytometrycznej przy użyciu cytometru przepływowego Navios (Beckman Coulter). Zastosowano specyficzne przeciwciała przeciw ludzkim antygenom znakowane odpowiednimi standardowymi fluorochromami: CD73-PC5 i CD105-PE.
Analiza cytometryczna komórek hodowanych z wydzieliną roślinną vs. bez wydzieliny roślinnej pozwoliła na potwierdzenie uzyskania komórek spełniających kryteria stawiane przez ISCT - ponad 95% populacji badanych komórek we wszystkich podłożach wykazywało ekspresję antygenów CD73 i CD 105. Szczegółowe wyniki przedstawiono w Tabeli 1 i na Fig. 2-5.
Tabela 1. Rozkład komórek macierzystych CD73+ i CD105+ z tkanki tłuszczowej (KT) lub galarety Whartona (GW) hodowanych in vitro na powierzchni z wydzieliną roślinną (wydzielina) i na powierzchni standardowej (K).
| Zmienna | Statystyki opisowe | ||||||
| N | Średnia | Mediana | Minimum | Maksimum | Odchylenie standardowe | Standardowy błąd średniej (SEM) | |
| Komórki GW przeciwciała CD/3 Wydzielina | 6 | 97,7800 | 97,8300 | 95,5800 | 100,00 | 1,462395 | 0,597020 |
| GW CD73 Kontrola | 6 | 97,95167 | 98,2200 | 96,2300 | 100,00 | 1,459677 | 0,595911 |
| GW CD105 Wydzielina | 6 | 97,25667 | 96,9300 | 95,0200 | 100,00 | 2,360438 | 0,963645 |
| GWCD105 Kontrola | 6 | 98,29833 | 98,2600 | 96,2500 | 100,00 | 1,638846 | 0,669056 |
| KT CD73 Wydzielina | 6 | 97,91833 | 97,7700 | 95,6500 | 100,00 | 1,942930 | 0,793198 |
| KTCD73 Kontrola | 6 | 96,9200 | 96,76500 | 95,0200 | 99,3200 | 1,807241 | 0,737803 |
| KTCD105 Wydzielina | 6 | 98,88833 | 99,600 | 95,800 | 100,00 | 1,652518 | 0,674638 |
| KT CD105 Kontrola | 6 | 97,3300 | 97,18500 | 94,780 | 100,00 | 2,003138 | 0,817777 |
PL 237 158 B1
Na Fig. 2 przedstawiono odsetek komórek macierzystych z galarety Whartona (GW) z dodatnim antygenem CD73 hodowanych na podłożu z wydzieliną roślinną (wydzielina) vs. bez wydzieliny roślinnej (K).
Na Fig. 3 - odsetek komórek macierzystych z galarety Whartona (GW) z dodatnim antygenem CD 105 hodowanych na podłożu z wydzieliną roślinną (wydzielina) vs. bez wydzieliny roślinnej (K).
Na Fig. 4 - odsetek komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej (KT) z dodatnim antygenem CD73 hodowanych na podłożu z wydzieliną roślinną (wydzielina) vs. bez wydzieliny roślinnej (K).
Na Fig. 5 - odsetek komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej (KT) z dodatnim antygenem CD 105 hodowanych na podłożu z wydzieliną roślinną (wydzielina) vs. bez wydzieliny roślinnej (K).
Do zgłoszenia dołączono również zdjęcia z hodowli komórkowych.
Na Fig. 6 - przedstawiono mezenchymalne komórki macierzyste KT otrzymane z tkanki tłuszczowej w podłożu z wydzieliną roślinną.
Na Fig. 7 - mezenchymalne komórki macierzyste KT otrzymane z tkanki tłuszczowej w podłożu bez wydzieliny roślinnej (kontrolne).
Na Fig. 8 - mezenchymalne komórki macierzyste GW otrzymane z galarety Whartona w podłożu z wydzieliną roślinną.
Na Fig. 9 - mezenchymalne komórki macierzyste GW otrzymane z galarety Whartona w podłożu bez wydzieliny roślinnej (kontrolne).
Podsumowując uzyskane wyniki należy stwierdzić, że obserwowana gęstość komórek w hodowli z wykorzystaniem ekstraktów była znacznie większa niż w hodowli kontrolnej (gęściej pokrywały podłoże). W hodowli kontrolnej pożywka zmieniana była co 3-4 dni. W hodowli z ekstraktami konieczność wymiany pożywki była co 2-3 dzień. Świadczy to o zwiększonej proliferacji i adherentność komórek hodowanych na podłożu z wydzieliną roślinną.
Przeprowadzono również badanie ekspresji genów „macierzystości” i genów związanych z procesem apoptozy. W trakcie badania, po 6 pasażach izolowano całkowity komórkowy RNA metodą Chomczyńskiego i Sacchii (Chomczyński i wsp., 1987), w celu wykonania ekspresji genów - w komórkach kontrolnych (hodowanych bez wydzieliny roślinnej) i w komórkach hodowanych na podłożu z wydzieliną roślinną. Metodami standardowymi oceniano preparaty mRNA, wykonano syntezę cDNA i analizę ekspresji genów techniką qPCR w aparacie StepOnePlus firmy Applied Biosystems, wykorzystując zestawy odczynników firmy Applied Biosystems, reakcje prowadzono w objętości 25 μl/dołek. Poziomy ekspresji (ACt) badanych genów badanych obliczono według wzoru znanego z publikacji Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 2001; 25:402-408. W celu ustalenia wartości ACt, AACt oraz RQ skorzystano z poniższych wzorów:
ACt badanego genu = Ct badanego genu - CtGAPDH
ACt genu kalibratora = Ct genu kalibratora - Ct GAPDH
AACt = ACt badanego genu - ACt kalibratora, gdzie ACt kalibratora stanowi średnia wyników ACt genu kalibratora w grupie kontrolnej
RQ = 2-AACt
Analizowano poziomy ekspresji genów związanych z procesem apoptozy oraz proliferacji, w odniesieniu do kontroli endogennej - genem referencyjnym był gen GAPDH. Po analizie ekspresji badanych genów nie stwierdzono niekorzystnych zmian w poziomie ekspresji, a dodatkowo, potwierdzono wzrost ekspresji dwóch genów „macierzystości” i wzrost ekspresji trzech genów przeciw-apoptotycznych oraz obniżenie ekspresji jednego genu apoptotycznego - w komórkach hodowanych na podłożu z wydzieliną roślinną w odniesieniu do ekspresji ww. genów w komórkach hodowanych na podłożu bez wydzieliny roślinnej, były to geny:
SOX9 - wartość logRQ = 0,113 co oznacza, że ekspresja genu SOX9 w komórkach hodowanych na podłożu z wydzieliną roślinną wzrosła o 11,3% w stosunku do ekspresji genu SOX9 w komórkach rosnących na podłożu bez wydzieliny roślinnej.
NANOG - wartość logRQ = 0,075 - analogiczny wzrost ekspresji o 7,5% oraz wzrost ekspresji genów przeciw-apoptotycznych:
BCL-2- wartość logRQ = 0,091 - analogiczny wzrost ekspresji o 9,1%
NAIP- wartość logRQ = 0,118 - analogiczny wzrost ekspresji o 11,8%
PL 237 158 B1
BIRC2 - wartość logRQ = 0,079 - analogiczny wzrost ekspresji o 7,9% oraz obniżenie ekspresji genu apoptotycznego BAX - log RQ = minus 0,5 - analogiczny spadek ekspresji o 50%
Uzyskane wyniki analizy ekspresji badanych genów w komórkach hodowanych z wydzieliną roślinną były korzystniejsze dla hodowli komórek macierzystych niż w warunkach hodowlanych tych komórek bez wydzieliny roślinnej.
Claims (3)
- Zastrzeżenia patentowe1. Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, znamienna tym, że posiada zewnętrzną powłokę zawierającą żywicę wydzielaną przez liście roślin z rodzaju Roridula, korzystnie żywicę wydzielaną przez emergencje znajdujące się na liściach Roridula gorgonias.
- 2. Sposób prowadzenia hodowli adherentnych komórek macierzystych w znanych warunkach i w znanym medium hodowlanym, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się na stałej powierzchni, przy czym powierzchnia do hodowli komórek macierzystych posiada zewnętrzną powłokę zawierającą żywicę wydzielaną przez liście roślin z rodzaju Roridula, korzystnie żywicę wydzielaną przez emergencje znajdujące się na liściach Roridula gorgonias.
- 3. Zastosowanie powierzchni posiadającej zewnętrzną powłokę zawierającą żywicę wydzielaną przez liście roślin z rodzaju Roridula, korzystnie żywicę wydzielaną przez emergencje znajdujące się na liściach Roridula gorgonias, do prowadzenia hodowli adherentnych komórek macierzystych.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL426289A PL237158B1 (pl) | 2018-07-10 | 2018-07-10 | Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie i sposób hodowli komórek macierzystych |
| PCT/PL2019/050040 WO2020013719A1 (en) | 2018-07-10 | 2019-07-10 | Stem cell culture method using plant secretion |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL426289A PL237158B1 (pl) | 2018-07-10 | 2018-07-10 | Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie i sposób hodowli komórek macierzystych |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL426289A1 PL426289A1 (pl) | 2020-01-13 |
| PL237158B1 true PL237158B1 (pl) | 2021-03-22 |
Family
ID=69161623
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL426289A PL237158B1 (pl) | 2018-07-10 | 2018-07-10 | Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie i sposób hodowli komórek macierzystych |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL237158B1 (pl) |
-
2018
- 2018-07-10 PL PL426289A patent/PL237158B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL426289A1 (pl) | 2020-01-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6687757B2 (ja) | ３ｄ軟骨オルガノイドブロックを調製するための方法 | |
| JP5647230B2 (ja) | 瘻孔治療のための自家及び同種異系の脂肪由来間質幹細胞組成物 | |
| Soleimannejad et al. | Fibrin gel as a scaffold for photoreceptor cells differentiation from conjunctiva mesenchymal stem cells in retina tissue engineering | |
| Danišovič et al. | Comparative analysis of mesenchymal stromal cells from different tissue sources in respect to articular cartilage tissue engineering | |
| CN111084905A (zh) | 利用羊膜间充质干细胞制备人工羊膜的方法 | |
| Seitz et al. | Influence of in vitro cultivation on the integration of cell-matrix constructs after subcutaneous implantation | |
| CN1938419B (zh) | 通过细胞巨团培养产生的细胞组织样组构和宏观组织样构建体以及巨团培养方法 | |
| RU2303632C1 (ru) | Способ получения мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга млекопитающих и популяция мезенхимальных стволовых клеток, полученная этим способом | |
| Inoue et al. | Establishment of three types of immortalized human skin stem cell lines derived from the single donor | |
| CN111094550A (zh) | 来源于幼猪的干细胞及其制备方法 | |
| PL237158B1 (pl) | Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie i sposób hodowli komórek macierzystych | |
| Kocak et al. | Comparison of enzymatic and nonenzymatic isolation methods for endometrial stem cells | |
| RU2620981C2 (ru) | Способ получения культуры мезенхимных стволовых клеток человека из периваскулярного пространства вены пупочного канатика | |
| JP2022042998A (ja) | 細胞シート小片、該細胞シート小片を収容した注射器、該細胞シート小片の製造方法及びその使用方法 | |
| EP4271398A2 (en) | Use of plant-derived exosomes for inducing differentiation of stem cell sources into cartilage and bone cells | |
| KR102121417B1 (ko) | Stat3 활성화제를 이용한 골격근세포 분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 골격근세포 분화 유도 방법 | |
| WO2020013719A1 (en) | Stem cell culture method using plant secretion | |
| KR20180092506A (ko) | 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 배양 및 분화시키는 방법 | |
| CN114728025A (zh) | 用于处置下肢疾病的细胞培养物 | |
| RU2821926C1 (ru) | Способ получения и ведения мезенхимальных стволовых клеток из костного материала млекопитающих | |
| PL238285B1 (pl) | Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie oraz sposób hodowli adherentnych komórek macierzystych | |
| US20250290044A1 (en) | Method for producing cell sheet | |
| PL238286B1 (pl) | Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie oraz sposób prowadzenia hodowli adherentnych komórek macierzystych | |
| JPWO2020067443A1 (ja) | 体細胞のシート化方法 | |
| RU2722173C1 (ru) | Способ прогнозирования скорости роста культуры по количеству альдегиддегидрогеназа-положительных мезенхимальных клеток костного мозга доноров |