PL238285B1 - Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie oraz sposób hodowli adherentnych komórek macierzystych - Google Patents
Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie oraz sposób hodowli adherentnych komórek macierzystych Download PDFInfo
- Publication number
- PL238285B1 PL238285B1 PL428366A PL42836618A PL238285B1 PL 238285 B1 PL238285 B1 PL 238285B1 PL 428366 A PL428366 A PL 428366A PL 42836618 A PL42836618 A PL 42836618A PL 238285 B1 PL238285 B1 PL 238285B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- plants
- cells
- stem cells
- species
- secretions
- Prior art date
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims description 73
- 241000208733 Drosophyllum lusitanicum Species 0.000 title claims description 47
- 230000028327 secretion Effects 0.000 title description 60
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title description 27
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 63
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 12
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 7
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 52
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 35
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 32
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 6
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101000749331 Homo sapiens Claudin-1 Proteins 0.000 description 5
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 5
- 101000711846 Homo sapiens Transcription factor SOX-9 Proteins 0.000 description 5
- 229920000715 Mucilage Polymers 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 5
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 5
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 4
- 102100032044 Amphoterin-induced protein 1 Human genes 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100040836 Claudin-1 Human genes 0.000 description 4
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 4
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 4
- 101000776170 Homo sapiens Amphoterin-induced protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 4
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 description 4
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 4
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 4
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 4
- 102100034204 Transcription factor SOX-9 Human genes 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 4
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 4
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 3
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 description 3
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 3
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 102100022524 Alpha-1-antichymotrypsin Human genes 0.000 description 2
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 2
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 241000208732 Drosophyllum Species 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 101000678026 Homo sapiens Alpha-1-antichymotrypsin Proteins 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 238000007443 liposuction Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 241000191380 Byblis gigantea Species 0.000 description 1
- 101150014851 CLDN1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004162 Claudin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000600 Claudin-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000617451 Drosophyllaceae Species 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101100510266 Homo sapiens KLF4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150070299 KLF4 gene Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101150082761 POU5F1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150106167 SOX9 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150037203 Sox2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 239000012984 antibiotic solution Substances 0.000 description 1
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000013022 venting Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000003136 vital staining of cell Methods 0.000 description 1
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/70—Undefined extracts
- C12N2500/76—Undefined extracts from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
- C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
- C12N2506/1369—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. MSC from umbilical blood
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych oraz sposób hodowli ludzkich i zwierzęcych adherentnych komórek macierzystych z zastosowaniem wydzieliny roślinnej otrzymanej z roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum.
Wydzielina gatunków z rodzaju Drosophyllum lusitanicum ma postać klejącego śluzu.
W roku 1991 roku odkryto i opisano po raz pierwszy mezenchymalne komórki macierzyste (MSCMesenchymal Stem Cells) (Caplan 1991). W kolejnych latach udowodniono, że MSC w hodowlach in vitro po odpowiedniej stymulacji różnicują się w kierunku innych komórek: osteocytów, chondrocytów, neurocytów lub adipocytów. MSC są niezróżnicowanymi komórkami znajdującymi się w różnych tkankach człowieka i mają zdolność do samoodnowy. MSC to naturalny materiał wykorzystywany w medycynie regeneracyjnej. Terapia MSC daje nadzieję na wyleczenie różnych przewlekłych chorób człowieka.
Jednym ze źródeł pozyskiwania MSC jest krew pępowinowa i galareta Whartona pępowiny. Z powodu niewielkiej liczby MSC w materiale wyjściowym konieczne jest prowadzenie hodowli MSC in vitro, w celu uzyskania odpowiednio dużej liczby MSC, które po różnicowaniu można podać pacjentowi jako terapeutyczny materiał biologiczny.
Obecnie jednak największym i nierozwiązanym problemem jest uzyskanie dużej liczby MSC od pacjenta. Można je uzyskać w hodowlach komórkowych in vitro otrzymując materiał spersonalizowany. Dotychczas stosowane sposoby hodowli MSC są nieskuteczne ze względu na trudności MSC w kontakcie z podłożem i sąsiednimi komórkami - co uniemożliwia wzrost MSC i ich proliferację.
Nieoczekiwanie problem ten został rozwiązany w niniejszym wynalazku.
Celem wynalazku jest poprawienie wydajności hodowli komórek macierzystych prowadzonych in vitro.
Istota wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych charakteryzująca się tym, że stanowi powierzchnię naczynia hodowlanego pokrytą zewnętrzną powłoką zawierającą śluz wydzielany przez rośliny z gatunku Drosophyllum lusitanicum, korzystnie śluz wydzielany przez emergencje znajdujące się na liściach roślin tego gatunku
Korzystnie, powierzchnię według wynalazku otrzymuje się poprzez pokrycie powierzchni naczynia hodowlanego wspomnianym śluzem roślinnym. Przed rozpoczęciem hodowli naczynie suszy się i sterylizuje. Korzystnie suszenie prowadzi się w warunkach sterylnych, pod ciśnieniem atmosferycznym i w temperaturze pokojowej, natomiast sterylizację prowadzić metodą autoklawowania, korzystnie w temperaturze 121°C, pod ciśnieniem 215 kPa, przez 20 minut.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób prowadzenia hodowli adherentnych komórek macierzystych w znanych warunkach i w znanym medium hodowlanym charakteryzujący się tym, że hodowlę prowadzi się na stałej powierzchni naczynia hodowlanego pokrytą zewnętrzną powłoką zawierającą śluz wydzielany przez rośliny z gatunku Drosophyllum lusitanicum, korzystnie śluz wydzielany przez emergencje znajdujące się na liściach roślin tego gatunku.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie powierzchni naczynia hodowlanego pokrytej zewnętrzną powłoką zawierającą śluz wydzielany przez rośliny z gatunku Drosophyllum lusitanicum, korzystnie śluz wydzielany przez emergencje znajdujące się na liściach roślin tego gatunku, do prowadzenia hodowli adherentnych komórek macierzystych.
Szczegółowy opis przykładowych realizacji
W przykładowej realizacji, hodowanymi komórkami macierzystymi są komórki ludzkie, zwłaszcza mezenchymalne komórki macierzyste. Korzystnie, w przykładowych realizacjach hoduje się komórki mezenchymalne izolowane z tkanki tłuszczowej (KT) otrzymane wg standardowej procedury liposukcji, po trawieniu enzymatycznym kolagenazą typu I oraz komórki mezenchymalne z galarety Whartona (GW), otrzymane drogą eksplantów komórkowych.
Za wyjątkiem stosowania specjalnie zmodyfikowanej zgodnie z wynalazkiem powierzchni hodowlanej pozostałe parametry prowadzenia hodowli nie odbiegają od standardowych.
Korzystnie, w przykładowych realizacjach hodowle komórkowe prowadzi się w czasie pozwalającym na uzyskanie odpowiedniej ilości komórek, korzystnie w czasie 21 dni w standardowych warunkach: w temp. 37°C, w stężeniu tlenu na poziomie 21% oraz 5% CO2. Korzystnie, w trakcie hodowli komórki pasażuje się po osiągnięciu odpowiedniej fazy wzrostu, zwłaszcza co 3 dni, z zastosowaniem trypsyny. Korzystnie, w przykładowych realizacjach stosuje się podłoże o następującym składzie: 10% FBS (Fetal
PL 238 285 B1
Bovine Serum), 0,5% penicyliny ze streptomycyną, 0,5% amfoterycyny, DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium).
W przykładowej realizacji opisano sposób zwiększenia przylegania (adherencji) MSC do podłoża w celu zwiększenia ich proliferacji (podziałów komórkowych). W tym celu wykorzystano śluz roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum. Istotą opisanego sposobu prowadzenia hodowli komórkowych jest zastosowanie wydzieliny roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum do pokrycia dna naczynia hodowlanego (szklanego lub plastikowego) co zwiększa adherentność MSC a przez to uzyskanie odpowiednio dużej liczby MSC jako materiału przeszczepowego.
Nieoczekiwanie ustalono, że właściwości wydzieliny roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum poprawiają adherentność komórek macierzystych i zwiększają proliferację w hodowlach komórkowych, jednocześnie pozostając bez niepożądanego wpływu cytotoksycznego - co zostało udowodnione w przeprowadzonych testach in vitro.
Zastosowanie wydzieliny roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum wywołało pozytywne efekty w hodowlach krótko- i długoterminowych komórek macierzystych człowieka.
Wydzielinę pozyskiwano z roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum, nanoszono na podłoża stałe (szklane lub plastikowe) tworzące komórkowe naczynia hodowlane, które suszono i sterylizowano. Po zalaniu medium hodowlanym prowadzono długoterminowe hodowle komórek macierzystych pozyskanych z różnych tkanek. Do oceny sposobu hodowli komórek macierzystych z zastosowaniem wydzieliny roślinnej zastosowano znane procedury badawcze: obserwacje przyżyciowe komórek, obserwacje żywotności z zastosowaniem testu z MTT i aneksyną V/jodek propidiowy, analiza cytometryczna i ocena ekspresji wybranych genów.
Wyniki przeprowadzonych badań pozwoliły na stwierdzenie pozytywnego wpływu wydzieliny roślinnej na przebieg hodowli komórek macierzystych.
Ustalono, że właściwości wydzieliny roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum nie powodują niepożądanego wpływu cytotoksycznego na ludzkie komórki macierzyste.
Nieoczekiwanie kontakt komórek macierzystych z wydzieliną roślinną wpłynął na wzrost ekspresji dwóch genów kodujących białka przylegania AMIG01 i CLDN1 - odpowiedni o 9% i 35%. Zatem, wydzieliny (śluz) roślin Drosophyllum lusitanicum wpływają korzystnie na ekspresję genów kodujących cząsteczki adhezyjne - zwiększające przyleganie komórek do podłoża, przez co poprawiające ich potencjał wzrostowy i proliferacyjny. Białka te również wytyczają kierunek migracji hodowanych komórek w środowisku zewnątrzkomórkowym.
Jest to bardzo istotna informacja dla efektywnego prowadzenia hodowli komórek adherentnych (rosnących na podłożu a nie w zawiesinie), w tym komórek macierzystych.
Reasumując, nieoczekiwanie stwierdzono, że wydzieliny (śluz) roślin Drosophyllum lusitanicum poprawiają adherentność ludzkich komórek macierzystych.
Ponadto, nieoczekiwanie kontakt komórek macierzystych z wydzieliną roślinną wpłynął na wzrost ekspresji dwóch genów związanych z utrzymywaniem potencjału pluripotencji komórek macierzystych: POU5F1 i KLF4. W ten sposób śluz roślin Drosophyllum lusitanicum wpływa pozytywnie na potencjał pluripotencji („macierzystości”) oraz przeciwdziała różnicowaniu w hodowlach komórkowych - są to bardzo korzystne właściwości efektywnego prowadzenia hodowli komórek macierzystych, nie uzyskiwane w takich samych warunkach hodowli tych samych komórek prowadzonych bez wydzieliny roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum.
Reasumując, nieoczekiwanie stwierdzono, że wydzieliny (śluz) roślin Drosophyllum lusitanicum poprawia potencjał pluripotencji komórek macierzystych oraz przeciwdziała ich różnicowaniu się w hodowlach komórkowych.
Ponadto, nieoczekiwanie okazało się, że wydzieliny (śluzy) roślin Drosophyllum lusitanicum zwiększają ekspresję genów regulujących transkrypcję: SOX2 i SOX9 (kodują czynniki transkrypcyjne), utrzymujących pluripotencję komórek macierzystych. Utrzymanie pluripotencji komórek macierzystych w hodowli jest niezwykle ważne dla efektywnego prowadzenia hodowli komórek macierzystych jako źródła komórek macierzystych do przeszczepów i eksperymentów. Test na obecność antygenów powierzchniowych CD105, CD73, CD90 charakterystycznych dla komórek macierzystych potwierdził, iż komórki w kontakcie z wydzieliną roślinną utrzymują swoje właściwości.
Reasumując, nieoczekiwanie stwierdzono, że wydzieliny (śluz) roślin Drosophyllum lusitanicum poprawiają utrzymanie pluripotencji komórek macierzystych w hodowli.
PL 238 285 B1
P r z y k ł a d 1. Otrzymywanie wydzieliny z roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum.
W badaniach wykorzystano rośliny gatunku Drosophyllum lusitanicum (L.) Link (rodzina Drosophyllaceae). Rośliny pochodziły z uprawy w Instytucie Botaniki UJ. Drosophyllum lusitanicum jest rośliną mięsożerną chwytającą owady za pomocą lepkich liści. Wydzielina roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum ma postać klejącego śluzu produkowanego przez emergencje (gruczoły) trzoneczkowe występujące na liściach i kwiatostanach. W rezultacie na wierzchołku każdej emergencji znajduje się kropla śluzu. Zostało to przedstawione na fig. 1.
Krople śluzu mogą być zbierane dowolnymi znanymi metodami.
W opisywanym przykładzie krople śluzu zbierano z powierzchni liści wykorzystując w tym celu szklaną bagietkę.
P r z y k ł a d 2. Nanoszenie wydzieliny roślinnej na powierzchnie do hodowli komórek macierzystych.
Wydzielinę pozyskiwano z roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum, nanoszono za pomocą pędzelka na podłoża stałe (szklane lub plastikowe) tworzące naczynia hodowlane. Następnie naczynia hodowlane posiadające zmodyfikowane w ten sposób powierzchnie suszono w jałowej komorze laminarnej (Komora laminarna SafeFast Elite 212S) i sterylizowano w autoklawie LABOKLAV 55V.
Suszenie prowadzono w warunkach sterylnych, pod ciśnieniem atmosferycznym i w temperaturze pokojowej, natomiast sterylizację prowadzono metodą autoklawowania, w temperaturze 121°C, pod ciśnieniem 215 kPa, przez 20 minut.
Warunki suszenia: ciśnienie atmosferyczne, temp. pokojowa.
Parametry sterylizacji: temperatura 121°C, ciśnienie 215 kPa, ekspozycja 20 minut, wolne schładzanie, odpowietrzanie grawitacyjne.
P r z y k ł a d 3. Hodowla komórek macierzystych na powierzchniach pokrytych wydzieliną z roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum.
W celu ustalenia wpływu zmodyfikowanej zgodnie z wynalazkiem powierzchni do hodowli komórek macierzystych na przebieg hodowli przeprowadzono testy porównujące wyniki hodowli przykładowych ludzkich komórek macierzystych w standardowych warunkach na standardowych powierzchniach naczyń hodowlanych oraz w tych samych warunkach na powierzchniach zmodyfikowanych zgodnie z wynalazkiem.
Do badań użyto dwóch rodzajów komórek macierzystych człowieka - mezenchymalnych komórek macierzystych izolowanych z tkanki tłuszczowej (KT) otrzymanych wg standardowej procedury liposukcji, po trawieniu enzymatycznym kolagenazą typu I oraz komórki mezenchymalne z galarety Whartona (GW), otrzymane drogą eksplantów komórkowych.
Hodowle komórkowe przeprowadzono w czasie 21 dni (z pasażowaniem co 3 dni) w inkubatorze Brunswick New Galaxy 170R w standardowych warunkach: w temp. 37°C w standardowym stężeniu tlenu na poziomie 21% oraz 5% CO2. Komórki hodowano w komercyjnie dostępnych naczyniach hodowlanych, a następnie pasażowano po osiągnięciu odpowiedniej fazy wzrostu z zastosowaniem trypsyny.
Skład podłoża: 10% FBS (Fetal Bovine Serum, firmy Sigma), 0,5% penicyliny ze streptomycyną (firmy Sigma), 0,5% amfoterycyny (firmy Sigma), DMEM (firmy Sigma).
P r z y k ł a d 4. Efekt hodowli komórek macierzystych na powierzchniach hodowlanych według wynalazku.
W celu ustalenia wpływu zmienionych zgodnie z wynalazkiem warunków hodowli na przebieg hodowli komórek macierzystych zastosowano następujące procedury badawcze:
- hodowle komórkowe,
- barwienie przyżyciowe komórek w celu ustalenia żywotności komórek,
- obserwacje w mikroskopie świetlnym i skaningowym mikroskopie elektronowym w celu potwierdzenia prawidłowej morfologii komórek, oraz oceny adhezji komórek do podłoża,
- ocenę ekspresji genów (izolację RNA, oznaczanie stężenia RNA, reakcję odwrotnej transkrypcji, PCR w czasie rzeczywistym).
Hodowle komórkowe. Komórki wyizolowane z galarety Whartona ze sznura pępowinowego hodowano w naczyniach hodowlanym przystosowanym do hodowli komórek adherentnych o powierzchni 25 cm2 TC Flask T25 firmy Sarstedt. Komórki hodowano w podłożu hodowlanym zawierającym: pożywkę hodowlaną DMEM/F-12 50/50 IX + L-glutamine firmy Corning, 10% płodową surowicę bydlęcą FBS Good Filtrated Bovine Serum firmy Pan Biotech i 1% roztwór antybiotyków Antibiotic-Antimycotic
PL 238 285 B1 (100X) Penicylina, Streptomycyna, Amfoterycyna B firmy Gibco. Hodowle komórkowe inkubowano w inkubatorze Galaxy 170R firmy New Brunswick w warunkach: temperatura 37°C, stężenie tlenu 4%, stężenie dwutlenku węgla 5% i wilgotność 95%. Podłoże hodowlane zmieniano co 3 dni, z mikroskopową hodowanych komórek przy użyciu mikroskopu odwróconego Olympus CX 41. Komórki przygotowywano do analizy cytometrycznej oraz izolacji RNA. Hodowle komórkowe prowadzono w czasie pozwalającym na uzyskanie odpowiedniej liczby komórek, korzystnie w czasie 21 dni w standardowych warunkach: w temp. 37°C, w stężeniu tlenu na poziomie 21% oraz 5% CO2. W trakcie hodowli komórki pasażowano po osiągnięciu odpowiedniej fazy wzrostu, zwłaszcza co 3 dni, z zastosowaniem trypsyny.
Izolacja RNA. Izolację komórkowego RNA przeprowadzono za pomocą metody Chomczyńskiego i Sacchi przy użyciu odczynników: Tri Reagent Solution firmy Ambion, chloroform firmy Sigma-Aldrich, izopropanol firmy Sigma i alkohol etylowy bezwodny 99,8% firmy POCh. Komórki umieszczono w probówkach typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Następnie do każdej z probówek dodano po 0,5 ml odczynnika Tri Reagent i homogenizowano komórki przy użyciu pipety, aż do uzyskania jednorodnej mieszaniny. Kolejno próby inkubowano przez 5 min. w temperaturze pokojowej, po czym do każdej próbki dodano po 100 μl chloroformu, wytrząsano ręcznie i ponownie inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 min.
Spektrofotometryczne oznaczanie stężenia RNA. Następnie próbki wirowano przez 15 min w wirówce 5415R firmy Eppendorf z prędkością 13,2 tys. obr./min. w temperaturze 4°C. Po odwirowaniu zebrano fazę wodną do nowych probówek typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml po czym dodano 250 μl izopropanolu, a kolejno próbki mieszano ręcznie, inkubowano przez 20 min w temperaturze pokojowej i wirowano przez 20 min w wirówce 5415R firmy Eppendorf z prędkością 13,2 tys. obr./min. w temperaturze 4°C. Po odwirowaniu pozbywano się supernatantu, a do powstałego osadu dodano 0,5 ml schłodzony 75% etanol. Po zwirowaniu supernatant zlano i pozostawiono próbki przez 10 min w celu wysuszenia osadu. Następnie próbki rozpuszczano w 12 μl wody ultraczystej i umieszczano na lodzie. Do oznaczania stężenia i czystości RNA wykorzystano 2 μl próbki. Pomiary próbek wykonano kilkukrotnie przy użyciu aparatu NanoDrop 2000c firmy Thermofisher. Próbki o stosunku wartości absorbancji 260/280 zawierające się w zakresie 1,8-2,0 wykorzystano do dalszych badań.
Reakcja odwrotnej transkrypcji. Po wstępnym oznaczeniu stężenia w aparacie NanoDrop Agilen t doprowadzano próbki do koncentracji 1 μg/μl RNA. Następnie przeprowadzano reakcję odwrotnej transkrypcji polegającą na przepisaniu mRNA na komplementarne cDNA przy użyciu enzymu odwrotnej transkryptazy zgodnie z protokołem poniżej: 10x RT Buffer - 2 μl, 25x dNTP Mix (100 mM) - 0.8 μl, 10x RT Random Primers - 2.0 μl, MultiScribe Reverse Transcriptase - 1.0 μβ RNase Inhibitor - 1.0 μl i Nuclease-free H2O - 3.2 μl. Po dodaniu wszystkich odczynników z zestawu High-Capacity cDNA Transcrption Kits firmy Applied Biosystems kolejno dodano 10 μl RNA o stężeniu 1 μg/μl, następnie próbki wymieszano przy użyciu aparatu Vortex MS3 basic firmy IKA, wirowano przez 10 s w wirówce 5415R firmy Eppendorf z prędkością 2 tys. obr./min po czym umieszczano w termocyklerze Veriti firmy Applied Biosystems w cyklach: 10 min w temperaturze 25°C, 2 godziny w temperaturze 37°C i 5 min w temperaturze 85°C. Po zakończonej reakcji próbki przechowywano w temperaturze -20°C.
PCR w czasie rzeczywistym. W trakcie badania, po 6 pasażach izolowano całkowity komórkowy RNA metodą Chomczyńskiego i Sacchii (Chomczyński i wsp., 1987), w celu wykonania ekspresji genów - w komórkach kontrolnych (hodowanych bez wydzieliny roślinnej) i w komórkach hodowanych na podłożu z wydzieliną roślinną. Metodami standardowymi oceniano preparaty mRNA, wykonano syntezę cDNA i analizę ekspresji genów techniką qPCR w aparacie StepOnePlus firmy Applied Biosystems, wykorzystując zestawy odczynników firmy Applied Biosystems, reakcje prowadzono w objętości 25 μl/dołek. Poziomy ekspresji (ACT) badanych genów obliczono według wzoru znanego z publikacji Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 2001; 25:402-408. W celu ustalenia wartości ACT, AACT oraz RQ skorzystano z poniższych wzorów:
ACT badanego genu = CT badanego genu - CT GAPDH
ACT genu kalibratora = CT genu kalibratora - CT GAPDH
AACT= ACT badanego genu - ACT kalibratora, gdzie ACT kalibratora stanowi średnia wyników ACT genu kalibratora w grupie kontrolnej RQ=2-AACT
Analizowano poziomy ekspresji genów związanych z procesem apoptozy oraz proliferacji, w odniesieniu do kontroli endogennej - genem referencyjnym był gen GAPDH (sonda Hs. Stosowano następujące sondy firmy ThermoFisher dla badanych genów: POU5F1 (Hs00999634_gH), KLF4
PL 238 285 B1 (Hs00358836_m1), SOX2 (Hs04234836_s1), SOX9 (Hs00165814_m1), AMIG01 (Hs00827030_g1) i CLDN1 (Hs00221623_m1).
Zastosowane procedury te umożliwiły pozytywną ocenę wpływu wydzieliny roślinnej na przebieg hodowli komórek macierzystych, które łatwiej się przyklejały do podłoża i szybciej proliferowały.
Oceniano również testem z MTT i aneksyną V/jodek propidiowy wpływ wydzieliny roślinnej na komórki i wykluczono efekty cytotoksyczne. Jednocześnie wykonano dokumentację hodowanych komórek stosując mikroskopię świetlną i elektronową.
Wyniki i ich dyskusja
Wydzieliny (śluz) roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum poprawiają adherentność ludzkich komórek macierzystych wyizolowanych z galarety Whartona pępowiny. Zbadano ekspresję wybranych genów kodujących białka błony komórkowej, które umożliwiają przyleganie komórek do siebie lub do substancji (macierzy) międzykomórkowej. Białka te również wytyczają kierunek migracji hodowanych komórek w środowisku zewnątrzkomórkowym. Wydzieliny (śluz) roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum wpływają korzystnie na ekspresję genów kodujących cząsteczki adhezyjne - zwiększające przyleganie komórek do podłoża, przez co poprawiające ich potencjał wzrostowy i proliferacyjny.
Na Fig. 2 przedstawiono wyniki pomiaru poziomu ekspresji genów AMIGO1 i CLDN1 w komórkach macierzystych. Wartość LogRQ dla komórek badanych (hodowle z wydzieliną) vs. komórki k ontrolne (bez wydzieliny). Zaobserwowano średni wzrost ekspresji genu AMIGO1 o 9% (Fig. 2) - w stosunku do komórek hodowanych w tych samych warunkach bez wydzieliny roślinnej. Jednocześnie zaobserwowano średni wzrost ekspresji genu CLDN1, kodującego klaudynę 1 o 35 % (Fig. 2) - w stosunku do komórek hodowanych w tych samych warunkach bez wydzieliny roślinnej
Nieoczekiwanie kontakt komórek macierzystych z wydzieliną roślinną wpłynął na wzrost ekspresji dwóch genów kodujących białka przylegania AMIGO1 i CLDN1 - odpowiedni o 9% i 35% (Fig. 2). Jest to bardzo istotna informacja dla efektywnego prowadzenia hodowli komórek adherentnych (rosnących na podłożu a nie w zawiesinie), w tym komórek macierzystych.
Stwierdzono również, że śluz roślin gatunku Drosophyllum lusitanicum zwiększa potencjał pluripotencji oraz przeciwdziała różnicowaniu w hodowlach komórkowych - są to bardzo korzystne właściwości efektywnego prowadzenia hodowli komórek macierzystych, nie uzyskiwane w takich samych warunkach hodowli tych samych komórek bez obecności wydzieliny (śluzu) roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum.
Zasadniczy efekt techniczny uzyskiwany dzięki wynalazkowi dotyczy zwiększenia przylegania (adherencji) MSC do podłoża w celu zwiększenia ich proliferacji (podziałów komórkowych). W tym celu wykorzystano wydzieliny (śluz) roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum. Istotą sposobu prowadzenia hodowli komórkowych według wynalazku jest zastosowanie wydzieliny roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum do pokrycia dna naczynia hodowlanego (szklanego lub plastikowego) co zwiększa adherentność MSC a przez to uzyskanie odpowiednio dużej liczby MSC jako materiału przeszczepowego. W przeprowadzonych eksperymentach hodowlanych in vitro nieoczekiwanie ustalono, że właściwości wydzieliny roślin z gatunku Drosophyllum poprawiają adherentność komórek macierzystych i zwiększają proliferację w hodowlach komórkowych, jednocześnie pozostając bez niepożądanego wpływu cytotoksycznego.
Następnie badano wpływ wynalazku na ekspresję badanych genów związanych z utrzymywaniem potencjału pluripotencji komórek macierzystych.
Na Fig. 3 przedstawiono wyniki pomiaru poziomu ekspresji genów POU5F1 i KLF4 w komórkach macierzystych. Wartość LogRQ dla komórek badanych (hodowle z wydzieliną) vs. komórki kontrolne (bez wydzieliny). Nieoczekiwanie kontakt komórek macierzystych z wydzieliną roślinną wpłynął na wzrost ekspresji genu POU5F1 - średni wzrost ekspresji o 10% (Fig. 3) - w stosunku do komórek hodowanych w tych samych warunkach bez wydzieliny roślinnej. Gen koduje białko odpowiedzialne za zachowywanie cech pluripotencji komórek macierzystych. Równie nieoczekiwanie kontakt komórek macierzystych z wydzieliną roślinną wpłynął na wzrost ekspresji genu KLF4 - średni wzrost ekspresji o 2,5% (Fig. 3) - w stosunku do komórek hodowanych w tych samych warunkach bez wydzieliny roślinnej. Gen koduje białko odpowiedzialne za zachowywanie cech macierzystości i przeciwdziała różnicowaniu komórek - co jest bardzo istotną cechą w uzyskaniu dużej liczby komórek macierzystych do przeszczepów.
Następnie badano wpływ wynalazku na ekspresję badanych genów kodujących czynniki transkrypcyjne związane z utrzymywaniem pluripotencji komórek macierzystych. Nieoczekiwanie okazało
PL 238 285 Β1 się, że wydzieliny (śluzy) roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum zwiększają ekspresję genów regulujących transkrypcję (kodują czynniki transkrypcyjne), utrzymujących pluripotencję komórek macierzystych:
Na Fig. 4 przedstawiono wyniki pomiaru poziomu ekspresji genów S0X2 i S0X9 w komórkach macierzystych. Wartość LogRQ dla komórek badanych (hodowle z wydzieliną) vs. komórki kontrolne (bez wydzieliny). Nieoczekiwanie kontakt komórek macierzystych z wydzieliną roślinną wpłynął na wzrost ekspresji genów S0X2 i S0X9 (Fig. 4) - regulujących transkrypcję (kodują czynniki transkrypcyjne), utrzymujących pluripotencję komórek macierzystych. Wykazano średni wzrost ekspresji genu S0X2 o 45% - w stosunku do komórek hodowanych w tych samych warunkach bez wydzieliny roślinnej. Jednocześnie wykazano średni wzrost ekspresji genu S0X9 o 17% - w stosunku do komórek hodowanych w tych samych warunkach bez wydzieliny roślinnej.
Następnie, stosując technikę cytometrii przepływowej (cytometr Navios) oceniono obecność antygenów charakterystycznych dla komórek macierzystych i porównano w obu grupach hodowanych komórek: w obecności wydzieliny (śluzu) roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum w hodowlach bez wydzieliny (śluzu) roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum.
Komórki te charakteryzowała obecność antygenów powierzchniowych CD105, CD73, CD90 przy jednoczesnym braku CD45, CD34, CD14. Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli:
| Badany antygen | Średni odsetek komórek macierzystych hodowanych w obecności wydzieliny (śluzu) roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum | Średni odsetek komórek macierzystych hodowanych bez wydzieliny (śluzu) roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum |
| CD105+ | 99,78 | 99,84 |
| CD73+ | 96,43 | 98,05 |
| CD90+ | 95,61 | 97,21 |
| CD45+ | 0 | 0 |
| CD34+ | 0 | 0 |
| CD14+ | 0 | 0 |
Korzystnie, w przykładowych realizacjach hodowle komórkowe prowadzi się w czasie pozwalającym na uzyskanie odpowiedniej ilości komórek, korzystnie w czasie 21 dni w standardowych warunkach: w temp. 37°C, w stężeniu tlenu na poziomie 21% oraz 5% CO2. Korzystnie, w trakcie hodowli komórki pasażuje się po osiągnięciu odpowiedniej fazy wzrostu, zwłaszcza co 3 dni, z zastosowaniem trypsyny. Korzystnie, w przykładowych realizacjach stosuje się podłoże o następującym składzie: 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 0,5% penicyliny ze streptomycyną, 0,5% amfoterycyny, DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium).
Na Fig. 5 i 6 przedstawiono komórki macierzyste hodowane z wydzielinami (śluzami) roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum.
Wnioski
W wyniku przeprowadzonych badań ustalono, że właściwości wydzieliny roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum nie powodują niepożądanego wpływu cytotoksycznego na ludzkie komórki macierzyste.
Ponadto, w wyniku przeprowadzonych badań ustalono, że wydzielina z roślin Drosophyllum lusitanicum poprawia adherentność ludzkich komórek macierzystych. Nieoczekiwanie kontakt komórek macierzystych z wydzieliną roślinną wpłynął na wzrost ekspresji dwóch genów kodujących białka przylegania AMIGO1 i CLDN1 - odpowiedni o 9% i 35%. Czyli wydzieliny (śluz) roślin Drosophyllum lusitanicum wpływają korzystnie na ekspresję genów kodujących cząsteczki adhezyjne - zwiększające przyleganie komórek do podłoża, przez co poprawiające ich potencjał wzrostowy i proliferacyjny. Białka te również wytyczają kierunek migracji hodowanych komórek w środowisku zewnątrzkomórkowym. Jest to bardzo istotna informacja dla efektywnego prowadzenia hodowli komórek adherentnych (rosnących na podłożu a nie w zawiesinie), w tym komórek macierzystych.
Ponadto, w wyniku przeprowadzonych badań ustalono, że wydzielina roślin Drosophyllum lusitanicum poprawia potencjał pluripotencji („macierzystości”) oraz przeciwdziała różnicowaniu w hodowlach komórkowych. Nieoczekiwanie kontakt komórek macierzystych z wydzieliną roślinną wpłynął na wzrost
PL 238 285 B1 ekspresji dwóch genów związanych z utrzymywaniem potencjału pluripotencji komórek macierzystych: POU5F1 i KLF4. W ten sposób (śluz) roślin Drosophyllum lusitanicum wpływa pozytywnie na potencjał pluripotencji („macierzystości”) oraz przeciwdziała różnicowaniu w hodowlach komórkowych - są to bardzo korzystne właściwości efektywnego prowadzenia hodowli komórek macierzystych, nie uzyskiwane w takich samych warunkach hodowli tych samych komórek bez wydzieliny (śluzu) roślin z gatunku Drosophyllum lusitanicum.
Ponadto, w wyniku przeprowadzonych badań ustalono, że wydzieliny roślin Drosophyllum lusitanicum poprawiają utrzymanie pluripotencji komórek macierzystych w hodowli. Nieoczekiwanie okazało się, że wydzieliny roślin Drosophyllum lusitanicum zwiększają ekspresję genów regulujących transkrypcję: SOX2 i SOX9 (kodują czynniki transkrypcyjne), utrzymujących pluripotencję komórek macierzystych. Utrzymanie pluripotencji komórek macierzystych w hodowli jest niezwykle ważne dla efektywnego prowadzenia hodowli komórek macierzystych jako źródła komórek macierzystych do przeszczepów i eksperymentów. Test na obecność antygenów powierzchniowych CD105, CD73, CD90 charakterystycznych dla komórek macierzystych potwierdził, iż komórki w kontakcie z wydzieliną roślinną utrzymują swoje właściwości.
Claims (3)
1. Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, znamienna tym, że stanowi powierzchnię naczynia hodowlanego pokrytą zewnętrzną powłoką zawierającą śluz wydzielany przez rośliny z gatunku Drosophyllum lusitanicum, korzystnie śluz wydzielany przez emergencje znajdujące się na liściach roślin tego gatunku.
2. Sposób prowadzenia hodowli adherentnych komórek macierzystych w znanych warunkach i w znanym medium hodowlanym, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się na stałej powierzchni naczynia hodowlanego pokrytą zewnętrzną powłoką zawierającą śluz wydzielany przez rośliny z gatunku Drosophyllum lusitanicum, korzystnie śluz wydzielany przez emergencje znajdujące się na liściach roślin tego gatunku.
3. Zastosowanie powierzchni naczynia hodowlanego pokrytej zewnętrzną powłoką zawierającą śluz wydzielany przez rośliny z gatunku Drosophyllum lusitanicum, korzystnie śluz wydzielany przez emergencje znajdujące się na liściach roślin tego gatunku, do prowadzenia hodowli adherentnych komórek macierzystych.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL428366A PL238285B1 (pl) | 2018-12-30 | 2018-12-30 | Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie oraz sposób hodowli adherentnych komórek macierzystych |
| PCT/PL2019/050040 WO2020013719A1 (en) | 2018-07-10 | 2019-07-10 | Stem cell culture method using plant secretion |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL428366A PL238285B1 (pl) | 2018-12-30 | 2018-12-30 | Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie oraz sposób hodowli adherentnych komórek macierzystych |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL428366A1 PL428366A1 (pl) | 2020-07-13 |
| PL238285B1 true PL238285B1 (pl) | 2021-08-02 |
Family
ID=71512402
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL428366A PL238285B1 (pl) | 2018-07-10 | 2018-12-30 | Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie oraz sposób hodowli adherentnych komórek macierzystych |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL238285B1 (pl) |
-
2018
- 2018-12-30 PL PL428366A patent/PL238285B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL428366A1 (pl) | 2020-07-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chae et al. | Stromal vascular fraction shows robust wound healing through high chemotactic and epithelialization property | |
| EP1456357B1 (en) | Pluripotent embryonic-like stem cells derived from teeth and uses thereof | |
| CN104726406B (zh) | 一种诱导牙髓间充质干细胞分化为神经细胞的方法 | |
| US20230092739A1 (en) | Stem cell compositions and methods of producing stem cells for therapeutic applications | |
| Danišovič et al. | Comparative analysis of mesenchymal stromal cells from different tissue sources in respect to articular cartilage tissue engineering | |
| TW201900871A (zh) | 多能性幹細胞的製備方法、使用該製備方法而製備出多能性幹細胞、改善劑、以及該多能性幹細胞之分化誘導方法 | |
| Lisini et al. | Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells for clinical application: An efficient isolation approach | |
| RU2433172C2 (ru) | Способ получения гомогенной популяции стволовых клеток и ее применение | |
| CN111084905A (zh) | 利用羊膜间充质干细胞制备人工羊膜的方法 | |
| CN115125192B (zh) | 一种骨髓上清液及其在细胞培养中的应用 | |
| JP5636174B2 (ja) | 間葉系細胞または軟骨細胞の製法ならびに発癌性の抑制方法 | |
| RS65645B1 (sr) | Postupak za proizvodnju indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija od adipoznih mezenhimalnih matičnih ćelija i indukovane pluripotentne matične ćelije proizvedene tim postupkom | |
| KR101760239B1 (ko) | 세포배양 삽입체를 이용한 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 세포의 분리방법 | |
| WO2020013719A1 (en) | Stem cell culture method using plant secretion | |
| PL238285B1 (pl) | Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie oraz sposób hodowli adherentnych komórek macierzystych | |
| PL238286B1 (pl) | Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie oraz sposób prowadzenia hodowli adherentnych komórek macierzystych | |
| KR102435452B1 (ko) | 노화가 감소되고 줄기세포능이 보존된 초기 중간엽 줄기세포, 및 그 배양방법 | |
| CN102533641B (zh) | 体外无血清成体干细胞放大培养的方法及其培养液 | |
| Nor et al. | Growth Factor Cocktail to Facilitate Epithelial Differentiation of Exfoliated Deciduous Teeth Stem Cells | |
| PL237158B1 (pl) | Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie i sposób hodowli komórek macierzystych | |
| Calavul et al. | The role of stem cell in plastic reconstructive and aesthetic surgery | |
| RU2722173C1 (ru) | Способ прогнозирования скорости роста культуры по количеству альдегиддегидрогеназа-положительных мезенхимальных клеток костного мозга доноров | |
| CN115820555A (zh) | 一种维持体外连续传代的间充质干细胞干性的组合物 | |
| HANAA et al. | Separation and Culturing of Stem Cells from the Gastric Mucosa of the Adult Male Albino Rats | |
| A Rahman | The development of in vitro models of human salivary glands |