PL237232B1 - Zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej Borrelia burgdorferi, sposób wykrywania Borrelia burgdorferi, sposób diagnostyki boreliozy i zestaw do diagnostyki boreliozy - Google Patents
Zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej Borrelia burgdorferi, sposób wykrywania Borrelia burgdorferi, sposób diagnostyki boreliozy i zestaw do diagnostyki boreliozy Download PDFInfo
- Publication number
- PL237232B1 PL237232B1 PL423217A PL42321717A PL237232B1 PL 237232 B1 PL237232 B1 PL 237232B1 PL 423217 A PL423217 A PL 423217A PL 42321717 A PL42321717 A PL 42321717A PL 237232 B1 PL237232 B1 PL 237232B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- sequence
- borrelia burgdorferi
- reverse
- nucleic
- detection
- Prior art date
Links
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 title claims description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 20
- 239000007858 starting material Substances 0.000 title 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 20
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 claims description 19
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 9
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 7
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 6
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 3
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 claims description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 21
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 10
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej Borrelia burgdorferi, sposób wykrywania Borrelia burgdorferi, sposób diagnostyki boreliozy i zestaw do diagnostyki boreliozy. Wynalazek ma zastosowanie w diagnostyce medycznej.
Zgłoszenie dotyczy opracowania sekwencji specyficznych oligonukleotydów dedykowanych detekcji kwasu nukleinowego Borrelia burgdorferi, jego genu RecA (GenBank NC_001318.1; gene ID 1194966) z wykorzystaniem technologii LAMP (loop mediated isothermal amplification), która to metoda została przykładowo ujawniona w opisach patentowych WO0028082, WO0224902. Zgłoszenie dotyczy także opracowania metody detekcji, składu mieszaniny reakcyjnej, warunków temperaturowych oraz warunków liofilizacji reagentów. Borrelia burgdorferi należy do spiralnie zwiniętych, Gram-ujemnych bakterii. Krętki Borrelia burgdorferi stanowią jeden z gatunków należących do Borrelia sensu lato, wywołujących boreliozę (chorobę z Lyme). Kleszcze z rodzaju lxodes znane są jako wektory choroby z Lyme. Typowymi objawami boreliozy są gorączka, bóle głowy, zmęczenie i charakterystyczne zmiany skórne w postaci rumienia wędrującego. Nieleczona infekcja może rozprzestrzeniać się obejmując stawy, serce czy układ nerwowy. Diagnostyka infekcji wywołanych przez Borrelia burgdorferi opiera się na analizie objawów ogólnoustrojowych i zmian skórnych oraz możliwości kontaktu z zainfekowanym kleszczem. Z chińskich zgłoszeń patentowych CN101967513, CN102703587; CN101967513 znane jest wykorzystanie starterów w metodzie LAMP do diagnozy Borelli. Wspomniane zgłoszenia patentowe dotyczą genu 23S RNA. Gen ten występuje u każdej z bakterii, różniąc się sekwencją. Jednak ze względu na jego stosunkową wysoką konserwatywność mogącą skutkować obniżeniem specyficzności.
Nadal więc istnieje potrzeba zapewnienia takiego zestawu starterów oraz składu mieszaniny reakcyjnej wykorzystywanych w metodzie diagnostycznej do wykrywania Borrelii z wykorzystaniem metody LAMP, które będą skutkowały niskim limitem detekcji patogenu uzyskiwanym w krótkim czasie. Nieoczekiwanie problem rozwiązał prezentowany wynalazek.
Pierwszym przedmiotem wynalazku jest zestaw starterów zdolnych do powielania sekwencji nukleotydowej Borrelia burgdorferi charakteryzujący się tym, że zawiera zestaw starterów wewnętrznych zawierający następujące sekwencje nukleotydowe a) i b) oraz zestaw starterów zewnętrznych zawierający następujące sekwencje nukleotydowe c) i d):
a)5' CCTCAGCAATCGCTTGAAGAGTTA.3’(sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 5 lub sekwencja odwrotna i komplementarna) połączona, korzystnie mostkiem TTTT, z sekwencją 5' CGCATAATAGAAATTTTTGGCC3(sekwencja nukleinowa SEQ ID NO 3 lub lub sekwencja odwrotna i komplementarna)
b) 51, TGGGATAGCTGCTTTTATTGATGC3(sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 6 lub sekwencja odwrotna i komplementarna połączona, korzystnie mostkiem TTTT, z sekwencją 5' GTTCTGCAACATTAACACCTAA3(sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 4 lub sekwencja odwrotna i komplementarna)
c) 5' GCATTGGCGGATATCCTAG3r sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 1 lub sekwencja odwrotna i komplementarna oraz
d) 5' TTGCTCTCCGGTATCAGG3'sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 2 lub sekwencja odwrotna i komplementarna. Równie korzystnie zestaw według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera dodatkowo zestaw sekwencji nukleinowych starterów loop zawierający sekwencje nukleinowe o numerach SEQ ID NO: 7-
5' TCTTGCCAGACGACTCGG3' i 8: 5'AGCATGCTCTTGATCCTGTTTATG3' lub sekwencje odwrotne i komplementarne.
Drugim przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania Borrelia burgdorferi charakteryzujący się tym, że obejmuje powielanie wybranego regionu sekwencji nukleinowej Borrelia burgdorferi z wykorzystaniem zestawu starterów jak zdefiniowano w pierwszym przedmiocie wynalazku przy czym metodą powielania jest metoda LAMP, korzystnie o następującym profilu temperaturowym:
- wstępna denaturacja 98°C, 5 min. bez polimerazy
- 65°C, 30 min.
- korzystnie przy reakcjach typu end-point 80°C, 5 min.
Trzecim przedmiotem wynalazku jest sposób diagnostyki boreliozy charakteryzujący się tym, że obejmuje sposób wykrywania zdefiniowany w drugim przedmiocie wynalazku.
Czwartym przedmiotem wynalazku jest zestaw do diagnostyki boreliozy charakteryzujący się tym, że zawiera zestaw starterów zdefiniowany w pierwszym przedmiocie wynalazku oraz korzystnie 20 mM
PL 237 232 Β1
Tris-HCI, pH 8,8, 10 mM (NH^SCU, 150 mM KCI, 6 mM MgSO4, 0.1% Tween® 20, 0,8 mM dNTP mix (NEB), 0,4 mM Betaina (Lucigen), przy czym poszczególne startery mają następujące stężenia 0,1 μΜ F3, 0,1 μΜ B3, 0,8 μΜ FIP, 0,8 μΜ BIP, 0,2 μΜ LoopF, 0,2 μΜ LoopB, 0,32 U/μΙ Bst 3.0 Polimeraza (NEB) oraz znacznik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA - GreenFluorescent Dye (Lucigen) w ilości <1 μΙ lub EvaGreen < 1X lub Syto-13 < 16 μΜ lub SYTO-82 < 16 μΜ lub inny barwnik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA w stężeniu niewykazującym inhibicji reakcji amplifikacji.
Przykładowe realizacje wynalazku przedstawiono na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia charakterystykę specyficzności oraz czułości metody, gdzie specyficzny sygnał uzyskano z matrycą bakterii Borrelia bulgdorferi szczep B31 (Quantitative Genomie DNA from Borrelia burgdorferi (ATCC® 35210DQ™), brak natomiast produktu w NTC; Linia 1.: marker mas (Quick-Load® Purple 100 bp DNA Ladder, NewEngland Biolabs); linia 2.: NTC; linia 3.: 5 kopii B. bulgdorferi; linia 4.: 10 kopii B. bulgdorferi; linia: 25 kopii B. bulgdorferi; linia 6.: 50 kopii B. bulgdorferi; Linia 7.: 100 kopii B. bulgdorferi; linia 8.: 1000 kopii B. bulgdorferi; linia 9.: 10000 kopii B. bulgdorferi; linia 10.: 100000 kopii B. bulgdorferi a fig. 2 ilustruje czułość metody wg wynalazku mierzonej przez nastawienie serii rozcieńczeń standardu Borrelia bulgdorferi szczep B31 (Quantitative Genomie DNA from Borrelia burgdorferi (ATCC® 35210DQ™) z minimalną ilością bakterii 5 kopii/μΙ, gdzie przyrost produktu mierzono w czasie rzeczywistym.
Przykład 1 Sekwencje starterów
Sekwencje specyficznych oligonukleotydów wykorzystywanych do detekcji materiału genetycznego Borrelia burgdorferi z wykorzystaniem technologii LAMP przedstawiono i scharakteryzowano poniżej.
1. Sekwencja oligonukleotydu Borrelia burgdorferi RecAF3:
5’ GCATTGGCGGATATCCTAG 3 ' stanowi sekwencję identyczną z genem RecA Borrelia burgdorferi (nić 5'-3'), który od strony 3' końca sąsiaduje ze starterem Borrelia burgdorferi F2.
2. Sekwencja oligonukleotydu Borrelia burgdorferi RecAB3:
5’ TTGCTCTCCGGTATCAGG 3 ’stanowi komplementarny fragment genu RecA Borrelia burgdorferi (nić 5’-3’) oddalona o 181 nukleotydów od końca 3' oligonukleotydu 1, który od strony 5' sąsiaduje ze starterem B2.
3. Sekwencja oligonukleotydu Borrelia burgdorferi RecAF2:
5'CGCATAATAGAAATTTTTGGCC 3 'stanowi sekwencję identyczną z genem RecA Borrelia burgdorferi (nić 5'-3') oddalona o 4 nukleotydy od końca 3' oligonukleotydu 1, który sąsiaduje ze starterem F3 od strony 5'.
4. Sekwencja oligonukleotydu Borrelia burgdorferi RecAB2: 5'GTTCTGCAACATTAACACCTAA 3 'stanowi komplementarny fragment genu RecA Borrelia burgdorferi (nić 5'-3') oddalona o 145 nukleotydów od końca 3' oligonukleotydu 1, który od końca 3' sąsiaduje ze starterem B3.
5. Sekwencja oligonukleotydu Borrelia burgdorferi RecAFIc:
5' CCTCAGCAATCGCTTGAAGAGTTA 3 ' stanowi komplementarny fragment genu RecA Borrelia burgdorferi (nić 5 '-3') oddalona o 50 nukleotydów od końca 3' oligonukleotydu 1.
6. Sekwencja oligonukleotydu Borrelia burgdirferi RecABIc·.
5' IGGGATAGCTGCTTTTATTGATGC 3 ' stanowi sekwencję identyczną z genem RecA Borrelia burgdorferi (nić 5'-3') oddalona o 87 nukleotydów od końca 3' oligonukleotydu 1.
Sekwencja oligonukleotydu Borrelia burgdorferi RecALoopF:
5'TCTTGCCAGACGACTCGG3'
Sekwencje oligonukleotydów F1c i F2 zostały połączone mostkiem TTTT i wykorzystane w postaci FIP. Sekwencje oligonukleotydów B1 c i B2 zostały połączone mostkiem TTTT i wykorzystane w postaci BIP Przykład 2
Metoda amplifikacji genu RecA Borrelia burgdorferi z wykorzystaniem oligonukleotydów scharakteryzowanych w przykładzie 1 w technologii LAMP o następującym składzie mieszaniny reakcyjnej.
mM Tris-HCI, pH 8,8 mM (NH4)2SO4
PL 237 232 B1
150 mM KCI mM MgSQ4
0,1% Tween® 20
0,8 mM dNTP mix (NEB)
0,4 mM Betaina (Lucigen)
0,1 μM F3
0,1 μM B3
0,8 μM FIP
0,8 μM BIP
0,2 μM LoopF
0,2 μM LoopB
0,32 U/μΙ Bst 3.0 Polimeraza (NEB)
Znacznik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA - GreenFluorescent Dye (Lucigen) w ilości < 1 ul lub EvaGreen < 1 μΙ lub Syto-13 <16 μM lub SYTO-82 <16 μM lub inny barwnik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA w stężeniu niewykazującym inhibicji reakcji amplifikacji.
Matryca DNA > 1 kopia/reakcję
Całkowita objętość reakcyjna dopełniona do 25 μl wodą wolną od DNaz i RNaz.
P r z y k ł a d 3
Metoda amplifikacji genu RecA dla Borrelia burgdorferi z wykorzystaniem oligonukleotydów scharakteryzowanych w przykładzie 1 w technologii LAMP o składzie mieszaniny reakcyjnej scharakteryzowanej w przykładzie 2 o następującym profilu temperaturowym:
1) wstępna denaturacja 98°C, 5 min. bez polimerazy
2) 65°C, 30 min.
3) opcjonalnie przy reakcjach typu end-point 80°C, 5 min.
P r z y k ł a d 4
Metoda amplifikacji i detekcji genu RecA dla Borrelia burgdorferi z wykorzystaniem oligonukleotydów scharakteryzowanych w przykładzie 1 w technologii LAMP o składzie mieszaniny reakcyjnej scharakteryzowanej w przykładzie 2 o profilu temperaturowym scharakteryzowanym w przykładzie 3 i sposobie detekcji opisanym poniżej.
Użyty barwnik fluorescencyjny wykazujący zdolność odziaływania z dwuniciowym DNA dodany do mieszaniny reakcyjnej w ilości 0,5 μl lub stężeniu <1X; <16 μM odpowiednio dla barwnika GreenFluorescent Dye (Lucigen); EvaGreen; SYTO-13 i SYTO-82 przed rozpoczęciem reakcji, pomiar w czasie rzeczywistym i/lub typu end-point. Długość fali wzbudzenia w zakresie zbliżonym do barwnika FAM 490-500 nm (optymalnie 494 nm) dla barwników GreenFluorescent Dye (Lucigen); EvaGreen; SYTO13 oraz dla barwnika SYTO-82 535 nm (optymalnie 541 nm) długość fali emisji w zakresie 509-530 nm (optymalnie 518 nm) dla barwników GreenFluorescent Dye (Lucigen); EvaGreen; SYTO-13 oraz dla barwnika SYTO-82 556 nm (optymalnie 560 nm), sposób detekcji, czas rejestracji zmian w 13 minucie od rozpoczęcia reakcji dla Borrelia bulgdorferi oraz kontroli negatywnej.
P r z y k ł a d 5 Metoda przygotowania i liofilizacji odczynników do detekcji amplifikacji i detekcji genu RecA bakterii Borrelia bulgdorferi z wykorzystaniem oligonukleotydów scharakteryzowanych w przykładzie 1 w technologii LAMP o składzie mieszaniny reakcyjnej scharakteryzowanej w przykładzie 2 o profilu temperaturowym scharakteryzowanym w przykładzie 3 i sposobie detekcji opisanym w przykładzie 4.
P r z y k ł a d 6 Opis procesu liofilizacji
Komponenty reakcji mieszano zgodnie ze składem opisanym w przykładzie 2, poza matrycą DNA, do całkowitej objętości 25 μl. Mieszaninę przeniesiono do probówek o pojemności 0,2 ml i poddano procesowi liofilizacji zgodnie z poniższymi parametrami.
Mieszanina umieszczona w probówkach została wstępnie schłodzona do -25°C. Następnie prowadzono proces liofilizacji w temperaturze -80°C przez 3-8 godzin pod ciśnieniem 5-2 mBar.
P r z y k ł a d 7 Czułość metody
Czułość określono przez nastawienie serii rozcieńczeń standardu Borrelia bulgdorferi szczep B31 (Quantitative Genomic DNA from Borrelia burgdorferi (ATCC® 35210DQ™) z minimalną ilością bakterii 5 kopii/μl, gdzie przyrost produktu mierzono w czasie rzeczywistym - Figura 2 (RealTime-LAMP dla serii rozcieńczeń Borrelia burgdorferi).
PL 237 232 Β1
Czas, po którym możliwa jest detekcja emitowanej fluorescencji dla poszczególnych próbek przedstawiono w tabeli 1. Scharakteryzowane startery umożliwiają detekcję Borrelia burgdoferi przy minimalnej ilości 5 kopii/μΙ.
Tabela 1
Czas niezbędny do detekcji fluorescencji dla poszczególnych stężeń Borrelia bulgdorferi
Czas przekroczenia linii
Próbka bazowej fluorescencji [min]
B. bulgdorferi NTC Nieokreślony
B. bulgdorferi 5 kopii 24,60907
B. bulgdorferi 10 kopii 23,072092
B. bulgdorferi 25 kopii 28,597315
B. bulgdorferi 50 kopii 21,267418
B. bulgdorferi 100 kopii 21,876034
B. bulgdorferi 1000 kopii 17,512388
B. bulgdorferi 10000 kopii 15,219044
B. bulgdorferi 100000 kopii 14,369184
Wyższość metody amplifikacji oraz oligonukleotydów scharakteryzowanych w niniejszym opisie patentowym nad bazującymi na technologii RealTime-LAMP polega na znacznie wyższej czułości, którą przedstawiono na figurze 1 skróceniu czasu analiz przedstawionego na figurze 2 oraz tabeli 1.
PL 237 232 Β1
Lista sekwencji <110> Genomtec S.A.
<120> Zestaw starterów do wykrywania Borrelia burgdorferi, sposób wykrywania i diagnostyki Borrelia burgdorferi z wykorzystaniem zestawu starterów oraz zestaw do wykrywania Borrelia burgdorferi <170> Patentln version 3.5 <210> 1 RecAF3 <211>24 <212> DNA <213> artificial <223> primer <400>1
GCATTGGCGG ATATCCTAG19 <210> 2 RecAB3 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <223> primer <400>2
TTGCTCTCCG GTATCAGG18 <210> 3 RecAF2: 5' <211>24 <212> DNA <213> artificial
PL 237 232 Β1 <223> primer <400>3
CGCATAATAG AAATTTTTGG CC22
| <210> | 4 RecAB2 |
| <211> 24 <212> DNA <213> artificial <223> primer <400> 4 GTTCTGCAAC ATTAACACCT AA | 22 |
| <210> | 5 RecAFlc |
| <211> | 24 |
| <212> | DNA |
| <213> | artificial |
| <223> | primer |
<400>5
CCTCAGCAAT CGCTTGAAGA GTTA 24 <210> RecABlc <211>24 <212> DNA <213> artificial <223> primer <400>6
PL 237 232 Β1
TGGGATAGCT GCTTTTATTG ATGC 24
| <210> | 7 RecALoopF |
| <211> | 24 |
| <212> | DNA |
| <213> | artificial |
<223> primer <400> 7
TCTTGCCAGA CGACTCGG 18 <210> 8 RecALoopB <211> 24 <212> DNA <213> artificial <223> primer <400> 8
AGCATGCTCT TGATCCTGTT TATG 24 <210> 9 RecA <211> 24 <212> DNA <213>
<223> gen <400> 9
| atgtcaaagt | taaaggaaaa aagagaaaaa | gctgttgttg | gcatagaaag | ggcaagtaaa | 60 |
| gaggaagcta | ttgagcttgc aagagttcaa | atagaaaaag | cttttggaaa | gggaagtctt | 120 |
| attaagatgg | gggaatctcc tgttggacaa | ggtataaaaa | gtatgtcaag | tggatctatt | 180 |
PL 237 232 Β1 cttagaaaaa gtattagatg ggccccgagt gaaggtggga gctttaggtg cttgagattg gtagcggctt cttcaagcaa aatacttgca cctgagacca cgaaagatcg agagttaaga tattttggga ttaatacaaa gagagtgtta
| aggctctcgg | cattggcgga | tatcctaggg | ggcgcataat | agaaattttt | 240 |
| cgtctggcaa | gactacttta | actcttcaag | cgattgctga | ggtgcaaaaa | 300 |
| tagctgcttt | tattgatgct | gagcatgctc | ttgatcctgt | ttatgcaaaa | 360 |
| ttaatgttgc | agaactttgg | cttagtcagc | ctgataccgg | agagcaagct | 420 |
| ctgagcattt | aatcagaagt | ggtggtgttg | atttgattgt | agttgattct | 480 |
| taacccctaa | attagagata | gatggagaaa | tgggagattc | tcagattggt | 540 |
| ggctaatgag | caaagctctt | agaaagatta | ccggtatact | ttctaaatcc | 600 |
| ttatgtttat | taatcaaata | aggatgagga | ttggtgttat | gtttggcaat | 660 |
| ctaccggtgg | gaatgcttta | aaattttatt | catctcttag | acttgaggtt | 720 |
| aacaagtaac | tagatcgggc | tcaagcgatg | atgttattgg | caataagatt | 780 |
| ttgtaaagaa | caaggttgct | ccaccttttc | gtaaagtaga | attgataatt | 840 |
| aaggtatttc | aagagaagct | ggcattttag | atgctgctat | taagcataat | 900 |
| aaacaggctc | atggtattca | ttgggagata | ataagttggg | acaggggaga | 960 |
| ttgagtatct | tagcaaagaa | gtagaacttg | caaataattt | ggataagagg | 1020 |
| taatttttaa | taattttgat | caagagaatg | ataattttat | tgaatttaaa | 1080 |
gaagatgaat ctgagtaa
Claims (5)
1) wstępna denaturacja 98°C, 5 min. bez polimerazy
1. Zestaw starterów zdolnych do powielania sekwencji nukleotydowej Borrelia burgdorferi znamienny tym, że zawiera zestaw starterów wewnętrznych zawierający następujące sekwencje nukleotydowe a) i b) oraz zestaw starterów zewnętrznych zawierający następujące sekwencje nukleotydowe c) i d):
a) 5' CCTCAGCAATCGCTTGAAGAGTTA3'sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 5 lub sekwencja odwrotna i komplementarna) - połączona, korzystnie mostkiem TTTT, z sekwencją
5' CGCATAATAGAAATTTTTGGCC3(sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 3 lub sekwencja odwrotna i komplementarna)
b) 5' TGGGATAGCTGCTTTTATTGATGC3'_ (sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 6 lub sekwencja odwrotna i komplementarna) połączona, korzystnie mostkiem TTTT, z sekwencją 5 ' AGCATGCTCTTGATCCTGTTTATG3 ' _ (sekwencja nakteinowa SEQ |D NO: 4 lub sekwencja odwrotna i komplementarna
c) 5' GCATTGGCGGATATCCTAG3' sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 1 lub sekwencja odwrotna i komplementarna
d) 5' TTGCTCTCCGGTATCAGG3' sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 2 lub sekwencja odwrotna i komplementarna.
2) 65°C, 30 min.
2. Zestaw według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera dodatkowo zestaw sekwencji nukleinowych starterów loop zawierający sekwencje nukleinowe o numerach SEQ ID NO 7:
5'TCTTGCCAGACGACTCGG3' i 8: 5'AGCATGCTCTTGATCCTGTTTATG3' lub sekwencje odwrotne i komplementarne
3) opcjonalnie przy reakcjach typu end-point 80°C, 5 min.
3. Sposób wykrywania Borrelia burgdorferi znamienny tym, że obejmuje powielanie wybranego regionu sekwencji nukleinowej Borrelia burgdorferi z wykorzystaniem zestawu starterów jak zdefiniowano w zastrz. 1 albo 2 przy czym metodą powielania jest metoda LAMP, korzystnie o następującym profilu temperaturowym:
4. Sposób diagnostyki boreliozy, znamienny tym, że obejmuje sposób wykrywania zdefiniowany w zastrz. 3.
5. Zestaw do diagnostyki boreliozy, znamienny tym, że zawiera zestaw starterów jak zdefiniowano w zastrz. 1 albo 2 oraz korzystnie 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10 mM (NH^SCM, 150 mM KCI, 6 mM MgSO4, 0,1% Tween® 20, 0,8 mM dNTP mix (NEB), 0,4 mM Betaina (Lucigen), przy czym poszczególne startery mają następujące stężenia 0,1 μΜ F3, 0,1 μΜ B3, 0,8 μΜ FIP, 0,8 μΜ BIP, 0,2 μΜ LoopF, 0,2 μΜ LoopB, 0,32 U/μΙ Bst 3.0 Polimeraza (NEB) oraz znacznik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA - GreenFluorescent Dye (Lucigen) w ilości < 1 μΙ lub EvaGreen <1X lub Syto-13 <16 μΜ lub SYTO-82 < 16 μΜ lub inny barwnik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA w stężeniu niewykazującym inhibicji reakcji amplifikacji.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL423217A PL237232B1 (pl) | 2017-10-20 | 2017-10-20 | Zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej Borrelia burgdorferi, sposób wykrywania Borrelia burgdorferi, sposób diagnostyki boreliozy i zestaw do diagnostyki boreliozy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL423217A PL237232B1 (pl) | 2017-10-20 | 2017-10-20 | Zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej Borrelia burgdorferi, sposób wykrywania Borrelia burgdorferi, sposób diagnostyki boreliozy i zestaw do diagnostyki boreliozy |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL423217A1 PL423217A1 (pl) | 2019-04-23 |
| PL237232B1 true PL237232B1 (pl) | 2021-03-22 |
Family
ID=66167915
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL423217A PL237232B1 (pl) | 2017-10-20 | 2017-10-20 | Zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej Borrelia burgdorferi, sposób wykrywania Borrelia burgdorferi, sposób diagnostyki boreliozy i zestaw do diagnostyki boreliozy |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL237232B1 (pl) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101886113B (zh) * | 2009-05-13 | 2012-10-17 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 蜱体内检测莱姆病病原的检测试剂盒 |
| CN101967513B (zh) * | 2009-12-10 | 2013-03-20 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 区分莱姆病病原基因型的试剂 |
| CN102703587B (zh) * | 2012-05-18 | 2013-11-27 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 用于检测莱姆病螺旋体的环介导等温扩增法 |
| CN105861727B (zh) * | 2016-06-08 | 2019-06-18 | 首都医科大学附属北京朝阳医院 | 用于检测3种眼科感染螺旋体的lamp引物组合及应用 |
-
2017
- 2017-10-20 PL PL423217A patent/PL237232B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL423217A1 (pl) | 2019-04-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6983201B2 (ja) | 核酸プローブ | |
| EP3134553B1 (en) | Colorimetric detection of nucleic acid amplification | |
| US12534769B2 (en) | Primer sets for the detection of human papillomavirus type 16 (HPV16) and human papillomavirus type 18 (HPV18), the method of detecting HPV16 and HPV18 infections, the use of a primer set for the detection of HPV16 and HPV18 infections | |
| DE102010049607A1 (de) | Konjugate von Nukleotiden und Methoden zu deren Anwendung | |
| JP2003210199A (ja) | 高度ダイナミックレンジを有する定量的多重ｐｃｒ | |
| US20220025434A1 (en) | Composition for determining false positives using a unique artificial nucleotide sequence and method for determining false positives using the same | |
| KR102258934B1 (ko) | 라임병 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트 | |
| KR20210073220A (ko) | 중증열성혈소판감소증후군 및 쯔쯔가무시증 동시 검출용 프라이머 및 프로브 세트 | |
| WO2007024706A1 (en) | Detecting pathogens in companion animals | |
| CN116348614A (zh) | 开关寡核苷酸 | |
| JP3449961B2 (ja) | マルチプライマーｐｃｒ法による病原生物検出法 | |
| PL237232B1 (pl) | Zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej Borrelia burgdorferi, sposób wykrywania Borrelia burgdorferi, sposób diagnostyki boreliozy i zestaw do diagnostyki boreliozy | |
| JP7176682B2 (ja) | 白癬菌の遺伝子をｌａｍｐ法により検出するためのプライマーセット及びそれを含むキット並びにそれらを用いて白癬菌を検出する方法 | |
| KR102030245B1 (ko) | 치쿤군야 바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트 및 이의 용도 | |
| KR102219895B1 (ko) | 쯔쯔가무시병 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트 | |
| KR20200048076A (ko) | 중증 열성 혈소판 감소 증후군(sfts) 바이러스 감염 질환 진단용 키트 | |
| JP2024533474A (ja) | 様々な内部修飾を有するループ型プライマーおよび標的検出のためのループドループ法 | |
| KR101911017B1 (ko) | 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출방법, 및 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단방법 | |
| US12467083B2 (en) | Primer sets for detection of mycoplasma pneumoniae bacteria, method for detection of mycoplasma pneumoaniae infection, use of a primer set for detection of mycoplasma pneumoniae infection | |
| US20250277276A1 (en) | Amplification primer kit, a method for detecting a sexually transmitted bacterial infection, and a kit for detecting the infection | |
| US20240200152A1 (en) | Primer set, reagent composition and method for the detection of methicillin-resistant staphylococcus aureus (mrsa) | |
| CN111004855A (zh) | 一种用于检测金黄色葡萄球菌的引物组合和试剂盒 | |
| US20250277275A1 (en) | Set of primers, composition of reagents and method of detecting atypical bacteria | |
| KR102291584B1 (ko) | 반려동물 및 가축의 질병진단을 위한 분자진단 방법 | |
| WO2025262193A1 (en) | Rapid nucleic acid amplification method |