PL237994B1 - Sposób amplifikacji komplementarnego DNA w reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją za pomocą starterów genowo i regiono-specyficznych dla prekursora miRNA-944 - Google Patents
Sposób amplifikacji komplementarnego DNA w reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją za pomocą starterów genowo i regiono-specyficznych dla prekursora miRNA-944 Download PDFInfo
- Publication number
- PL237994B1 PL237994B1 PL432230A PL43223019A PL237994B1 PL 237994 B1 PL237994 B1 PL 237994B1 PL 432230 A PL432230 A PL 432230A PL 43223019 A PL43223019 A PL 43223019A PL 237994 B1 PL237994 B1 PL 237994B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- mirna
- pri
- cdna
- qpcr
- gapdh
- Prior art date
Links
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 title claims abstract description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 239000002243 precursor Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 title abstract description 9
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 title abstract description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title description 33
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 title description 22
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims abstract description 28
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 claims abstract description 28
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 58
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 38
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 20
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 13
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 13
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 108091007428 primary miRNA Proteins 0.000 description 7
- 102100027881 Tumor protein 63 Human genes 0.000 description 6
- 101710140697 Tumor protein 63 Proteins 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 3
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 3
- 101710087047 Cytoskeleton-associated protein 4 Proteins 0.000 description 3
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 3
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 3
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 208000008636 Neoplastic Processes Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000008436 biogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 239000001046 green dye Substances 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001073 sample cooling Methods 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Przedmiotem wynalazku jest sposób amplifikacji komplementarnego DNA w reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) za pomocą starterów genowo i regiono-specyficznych dla prekursora miRNA-944, który charakteryzuje się tym, że stosuje się startery posiadające następujące sekwencje nukleotydowe: a) startery genowo-specyficzne (służące przepisaniu sekwencji RNA pri-miRNA-944 oraz GAPDH na komplementarne dla nich DNA - cDNA) wykorzystywane w pierwszym etapie RT-qPCR: 1. starter genowo-specyficzny (G1) dla RNA pri-miRNA-944: 5'- ATGGGAGACACAGC - 3', 2. starter genowo-specyficzny (G2) dla RNA GAPDH: 5' - GGACTGAGATTGGC - 3' b) startery regiono-specyficzne (służące amplifikacji cDNA pri-miRNA-944 oraz GAPDH) wykorzystywane w drugim etapie RT-qPCR: 1. starter sensowny (F1) dla cDNA pri-miRNA-944: 5'- GTTCCAGACACATCTCATCTGATA - 3', 2. starter antysensowny (R1) dla cDNA pri-miRNA-944: 5'- TCCCAGACACAGCTCATCCG - 3', 3. starter sensowny (F2) dla cDNA GAPDH: 5,- CCATCTCAGTCGTTCCCAAAGT - 3', 4. starter antysensowny (R2) dla cDNA GAPDH: 5'- AGGTGATCGGTGCTGGTTCC - 3'.
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób amplifikacji uzyskanego cDNA w reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją (ang. quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction; RT-qPCR) za pomocą starterów genowo i regiono-specyficznych.
Prekursory miRNA (pri-miRNA) należą do rodziny długich, niekodujących białek cząsteczek kwasu rybonukleinowego (ang. longnon-coding RNA; IncRNA) oraz stanowią pierwszy, jądrowy produkt transkrypcji genu kodującego określone miRNA (stąd określenie prekursor). W procesie jądrowej i cytoplazmatycznej obróbki pri-miRNA przekształcane są w dojrzałe miRNA. miRNA regulują funkcję genów na poziomie potranskrypcyjnym, tzn. posiadają zdolność do wiązania się do matrycowego RNA (ang. messenger RNA; mRNA), wpływając przez na to na poziom syntezowanych w organizmie białek. Rola miRNA w molekularnej regulacji funkcjonowania ludzkich genów została dotychczas opisana w wielu pracach naukowych. Na szczególną uwagę zasługuje jednak rola miRNA w procesie rozwoju chorób nowotworowych, w których obserwuje się zaburzenie ekspresji tych cząsteczek w porównaniu do stanu fizjologii. Istotne różnice w profilu ekspresji miRNA między osobami zdrowymi oraz chorymi na nowotwory złośliwe, a także możliwość ich badania we krwi obwodowej czynią je obiecującymi markerami diagnostycznymi umożliwiającymi wczesne i nieinwazyjne wykrycie raka [Chang TC. i wsp. Genomewide annotation of microRNA primary transcript structures reveals novel regulatory mechanisms, Genome Res 2015;25(9): 1401-1409 oraz Peng Y. i wsp. The role of microRNAs in human cancer. Signal Transduct Target Ther 2016; 1:15004.]
Ze względu na obiecujące wyniki badań dotyczących oceny miRNA jako markerów nowotworowych, coraz większą uwagę poświęca się również ich prekursorom, ze względu na ich odmienną biologię w porównaniu do miRNA. pri-miRNA w odróżnieniu od dojrzałych miRNA są strukturami dwuniciowymi o długości ok. 100 par zasad, zlokalizowane są w jądrze komórkowym oraz są bezpośrednimi, niezmodyfikowanymi produktami genów kodujących miRNA [O’Brien J i wsp. Overview of microRNA biogenesis, mechanisms of actions, and circulation. Front Endocrinol 2018;9:402.]. Mimo że ich rola w procesie rozwoju raka jest dotychczas niejasna, to ostatnie doniesienia naukowe zdają się potwierdzać istotną rolę pri-miRNA w procesie rozwoju chorób nowotworowych. W liniach komórkowych oraz materiale komórkowym pobranym od chorych z ostrą białaczką szpikową Rommer i wsp. odnotowali istotnie większą ekspresję prekursora miRNA-221/222 (pri-miRNA-221/222) w porównaniu do dojrzałych cząsteczek miRNA-221 i 222. Obecnie pri-miRNA-221/222 uznaje się za obiecujący onkogen związany z rozwojem ostrej białaczki szpikowej, a ocena jego ekspresji może być użyteczna w ocenie stopnia zaawansowania choroby [Rommer A. i wsp. Overexpression of primary microRNA 221/222 in acute myeloid leukemia. BMC Cancer 2013; 13:364]. W materiale tkankowym pobranym z guzów od chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca o utkaniu gruczołowym odnotowano natomiast istotnie wyższą ekspresję prekursora miRNA-3662 (pri-miRNA-3662) w porównaniu do tkanek o utkaniu płaskonabłonkowym i tkanki płucnej nieobjętej procesem nowotworowym. Ocena ekspresji pri-miRNA-3662 umożliwiła odróżnienie tkanki raka gruczołowego od tkanki zdrowej ze 80% czułością oraz swoistością na poziomie 96% oraz od tkanki raka płaskonabłonkowego z czułością 100% i swoistością 80%. Większą wartość diagnostyczną zdaje się posiadać jednoczesna analiza ekspresji prekursora i dojrzałego miRNA. Ocena pri-miRNA-3662 i miRNA-3662 umożliwiła odróżnienie tkanki raka gruczołowego od płaskonabłonkowego z czułością 96% i swoistością 85,7% oraz od tkanki zdrowej z czułością i swoistością odpowiednio 92% i 92% [Powrózek T. i wsp. Analysis of primary-miRNA-3662 and its mature form may improve detection of the lung adenocarcinoma. J Cancer Res Clin Oncol 2017; 143( 10): 1941-1946]. Pri-miRNA-3662 podobnie jak jego dojrzała forma miRNA-3662 jest uwalniany do krążenia, stąd może stanowić potencjalny marker diagnostyczny gruczołowego raka płuca. Ocena ekspresji krążącego primiRNA-3662 we krwi obwodowej umożliwia wykrycie wczesnych stadiów zaawansowania raka gruczołowego (operacyjne stadia choroby I i II) z czułością 71,4% oraz swoistością 98,5%. Ekspresja primiRNA-3662 we krwi obwodowej jest istotnie wyższa u chorych z rakiem gruczołowym płuca w porównaniu do chorych z rakiem płaskonabłonkowym i osób zdrowych [Powrózek T. i wsp. The diagnostic role of plasma circulating precursors of miRNA-944 and miRNA-3662 for nonsmall cell lung cancer detection. Pathol Res Pract 2017;213(11): 1384-1387].
Gen kodujący pri-miRNA-944, który następnie zostaje przekształcony w dojrzałe miRNA-944 zlokalizowany jest w sekwencji intronowej genu TP63 (ang. tumorprotein 63) kodującego białko p63, które jest regulatorem proliferacji komórek podstawnych nabłonka. Zwiększoną ekspresję TP63 oraz p63 od
PL 237 994 B1 notowuje się w guzach nowotworowych o utkaniu płaskonabłonkowym, a w rutynowej diagnostyce histopatologicznej używane są przeciwciała przeciwko białku p63 w celu określenia typu histologicznego nowotworu.
Wynalazek rozwiązuje zagadnienie sposobu amplifikacji cDNA w reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) za pomocą określonych starterów genowo i regiono-specyficznych dla pri-miRNA-944. Amplifikację cDNA pri-miRNA-944 służącą badaniu jego ekspresji przeprowadza się za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR), która jest techniką dwuetapową. Zgodnie z założeniami RT-qPCR amplifikacji cDNA sekwencji badanej (w tym przypadku pri-miRNA-944) musi towarzyszyć równoległa amplifikacja sekwencji cDNA kontrolnej, która jest niezbędna jest do wyznaczenia ekspresji badanego primiRNA. W wynalazku jako kontrolę reakcji wykorzystano cDNA genu GAPDH (ang. Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase). Sposób prowadzenia RT-qPCR oraz kontrolę reakcji opisano szczegółowo w dalszej części.
Sposób amplifikacji cDNA w reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) za pomocą starterów genowo i regiono-specyficznych dla pri-miRNA-944 według wynalazku charakteryzuje się tym, że stosuje się startery genowo-specyficzne (służące przepisaniu sekwencji RNA pri-miRNA-944 oraz GAPDH na komplementarne dla nich DNA - cDNA) wykorzystywane w pierwszym etapie RT-qPCR oraz startery regiono-specyficzne (służące amplifikacji cDNA primiRNA-944 oraz GAPDH) wykorzystywane w drugim etapie RT-qPCR posiadające sekwencje nukleotydowe przedstawione w załączniku.
Powyższe startery genowo-specyficzne stosowane są jednocześnie podczas trwania reakcji odwrotnej transkrypcji, tzn. do każdej próbki RNA pochodzącej od osoby badanej dodawane są oba startery (G1 i G2). Natomiast startery regiono-specyficzne stosuje się w parach (F1 z R1 oraz F2 z R2) podczas trwania reakcji qPCR służącej amplifikacji cDNA (startery umożliwiają uzyskanie następujących produktów qPCR: cDNA o długości odpowiednio 87 par zasad (pri-miRNA-944) oraz 118 par zasad (GAPDH)). W tym etapie każda uzyskana próbka cDNA (pochodząca od jednej badanej osoby) oznaczana jest osobno w czterech dołkach na płytce reakcyjnej PCR. W pierwszym dołku prowadzona jest reakcja ze starterami regiono-specyficznymi dla cDNA pri-miRNA-944 (startery: F1 i R1), natomiast w drugim dołku amplifikowane jest cDNA genu kontrolnego (GAPDH) (startery F2 i R2). Trzeci i czwarty dołek na płytce reakcyjnej stanowią powtórzenia powyższych reakcji. Zabieg ten ma na celu poprawę jakości uzyskanych wyników, które zostają następnie matematycznie uśrednione. Sposób rozmieszczenia badanych prób oraz powtórzeń reakcji przedstawiono na przykładzie - rycina 1. Dzięki prowadzeniu reakcji amplifikacji cDNA w aparacie Real-time PCR, wszystkie reakcje mogą być prowadzone w tym samym czasie, co umożliwia bieżący przebieg procesu amplifikacji cDNA oraz zapewnia obiektywną analizę uzyskanych wyników.
Zastosowanie powyższych starterów genowo-specyficznych umożliwia szybkie, wydajne i selektywne przepisanie tylko sekwencji RNA pri-miRNA-944 i GAPDH na komplementarne dla nich sekwencje DNA. Dzięki wykorzystaniu sposobu według wynalazku spośród dziesiątek tysięcy RNA obecnych w próbce pacjenta, na cDNA przepisywane są tylko dwie sekwencje niezbędne do dalszych eksperymentów. Znane metody przepisywania RNA, choćby te wykorzystywane w cytowanych publikacjach oparte są na globalnym przepisywaniu RNA na cDNA, tzn. przepisane na cDNA zostają wszystkie sekwencje RNA obecne w próbce badanej osoby. Wynalazek dzięki zastosowaniu starterów genowo-specyficznych umożliwia selektywne przepisanie na cDNA tylko sekwencji RNA pri-miRNA-944 i GAPDH. Zapewnia to po pierwsze wydajne uzyskanie cDNA wyłącznie badanych RNA, a po drugie zwiększa to efektywność amplifikacji w kolejnym etapie eksperymentu, gdyż nie jest ona zaburzana przez inne niepożądane cDNA. Natomiast zastosowanie starterów regiono-specyficznych dzięki korzystaniu ze sposobu według wynalazku umożliwia szybkie, wydajne i stosunkowe tanie otrzymywanie kopii matrycy cDNA pri-miRNA i GAPDH. Znane metody służące amplifikacji cDNA pri-miRNA-944 i GAPDH dotyczą innych fragmentów badanych sekwencji oraz są bardziej kosztowne głównie ze względu na wykorzystanie sond znakowanych fluorescencyjnie w drugim etapie RT-qPCR. Wynalazek dzięki wykorzystaniu regiono-specyficznych starterów umożliwia szybką i czułą, a przede wszystkim specyficzną amplifikację cDNA krążącego pri-miRNA-944 krwi obwodowej z wykorzystaniem barwnika interkalującego, tzn. wysycającego powstającego podczas reakcji PCR cDNA. Uzyskane w reakcji wyniki są odpowiednie do wyznaczenia ekspresji pri-miRNA-944. Opis metody amplifikacji pri-miRNA-944 za pomocą wynalazku opisano poniżej.
PL 237 994 B1
Wynalazek może mieć zastosowanie w wykrywaniu nowotworów płaskonabłonkowych zwłaszcza regionów głowy i szyi.
Opis metody RT-qPCR
RT-qPCR jest jedną z podstawowych technik badawczych zarówno w badaniach eksperymentalnych jak i w rutynowej praktyce diagnostycznej. Metoda ta umożliwia głównie badanie i ocenę ekspresji genów na poziomie mRNA, ale również ocenę ekspresji RNA: IncRNA, miRNA i pri-miRNA. Omawiana metoda składa się dwóch etapów: odwrotnej transkrypcji (ang. reverse transcription; RT) oraz reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (ang. quantitative polymerase chain reaction; qPCR). Pierwszy etap RT-qPCR to odwrotna transkrypcja (RT). W etapie tym dzięki wykorzystaniu enzymu odwrotnej transkryptazy oraz starterów reakcji RT wyizolowane z próbek biologicznych RNA przepisywane jest na cDNA. Drugi etap RT-qPCR stanowi PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) podczas którego uzyskane w poprzednim etapie cDNA jest amplifikowane, tj. namnażane dzięki zastosowaniu starterów reakcji specyficznych dla sekwencji badanych i kontrolnych. Dzięki zastosowaniu barwnika interkalującego (wysycającego) cDNA, które jest namnażane podczas PCR, wynalazek umożliwia szybką, czułą i tanią ocenę ekspresji badanych RNA.
Jak wspomniano wcześniej, ocena ekspresji wybranych do badania sekwencji RNA wymaga równoległej oceny ekspresji genu kontrolnego, np. GAPDH, którego ekspresja w komórkach jest stała i niezależna od stanu zdrowia i choroby, co czyni go idealną i uniwersalną cząsteczką kontrolną. Ponieważ wydajność amplifikacji oraz namnażanie nowych kopii cDNA w reakcji PCR zależy głównie od jakości przeprowadzonej izolacji RNA oraz reakcji odwrotnej transkrypcji, to bez zastosowania kontroli reakcji uzyskany wynik mógłby być nierzetelny i nieobiektywny. Dzięki równoczesnej analizie cDNA genu kontrolnego z cDNA badanej sekwencji RNA z tej samej próbki badanej, możliwa jest normalizacja wyniku ekspresji badanego RNA. Poprzez normalizację należy rozumieć wyznaczenie cyklu progowego (Ct), tzn. określenie, w którym cyklu qPCR rozpoczyna się wykładniczy przyrost produktu amplifikacji cDNA kontroli i badanej sekwencji (w tym przypadku GAPDH i pri-miRNA-944), a następnie porównanie obu uzyskanych Ct względem siebie, poprzez obliczenie ACt (ACt = Ct dla pri-miRNA-944 - Ct dla GAPDH). Dzięki procesowi normalizacji ostateczny wynik, czyli wartość ekspresji badanego RNA jest rzetelny i obiektywny. Im większe wartości ACt, tym mniejsza jest relatywna ekspresja badanej cząsteczki (zależność odwrotnie proporcjonalna). Ekspresję badanego pri-miRNA-944 oblicza się matematycznie z uproszczonego wzoru Pffafl’a (Pffafl MW. A new mathematical model for relative quantification in realtime RT-PCR. Nucleic Acids Res 2001; 29(9): e45.):
Relatywna ekspresja pri-miRNA-944 = 2-ACt gdzie ACt— Ctpri-miRNA-944 - CtGAPDH
Opis działania wynalazku przedstawiono i omówiono na poniższym przykładzie.
P r z y k ł a d 1. RT-qPCR z wykorzystaniem unikalnych starterów genowo i regiono-specyficznych dla oznaczenia ekspresji pri-miRNA-944
W celu przeprowadzenia reakcji niezbędne są:
1. Wyizolowane z osocza krwi obwodowej całkowite RNA
2. Unikalna mieszanina reakcyjna RT zawierająca startery genowo-specyficzne (G1 i G2) oraz inne odczynniki chemiczne w odpowiednich proporcjach i stężeniach (tabela 1)
3. Termocykler z możliwością ustawienia optymalnych warunków termicznych (tabela 2)
4. Unikalna mieszanina reakcyjna qPCR zawierająca startery regiono-specyficzne (F1 i R1 oraz F2 i R2) oraz inne odczynniki chemiczne w odpowiednich proporcjach i stężeniach (tabela 3)
5. Aparat real-time PCR z możliwością ustawienia optymalnych warunków termicznych qPCR (tabela 4)
RT-qPCR w wariancie oznaczania poziomu ekspresji pri-miRNA-944 oraz GAPDH według wynalazku, prowadzono z wykorzystaniem opisanych wyżej starterów genowo i regiono-specyficznych. W omawianym przykładzie oceniono ekspresję pri-miRNA-944 w osoczu krwi obwodowej u 40 chorych na nowotwory okolicy głowy i szyi o utkaniu płaskonabłonkowym oraz u 40 osób zdrowych. W 8-stanowiskowych probówkach typu strip (pojemność probówek po 0,2 ml; każde stanowisko odpowiada jednej badanej osobie) przygotowano mieszaninę reakcyjną dla RT zgodnie z proporcjami przedstawionymi w tabeli 1. Do przygotowanych mieszanin reakcyjnych dodano startery reakcji RT (starter G1 i G2) oraz wyizolowane wcześniej RNA. Reakcję RT prowadzono w termocyklerze zgodnie z warunkami czasowymi i temperaturowymi przedstawionymi w tabeli 2. W wyniku przeprowadzonej reakcji RT w każdej z probówek uzyskano cDNA sekwencji pri-miRNA-944 oraz GAPDH dla badanych chorych oraz osób zdrowych.
PL 237 994 Β1
W 96 kołkowej płytce przystosowanej do odpowiedniego aparatu Real-time PCR przygotowano mieszaninę reakcyjną zgodnie z proporcjami przedstawionymi w tabeli 3. W celu lepszego zrozumienia działania wynalazku oraz omówienia przebiegu ostatniego etapu RT-qPCR, tzn. qPCR, opis przykładu oraz interpretację wyników omówiono na wyniku dwóch osób: chorej na raka z wysoką ekspresją primiRNA- 944 oraz osoby zdrowej z niską ekspresją badanej sekwencji. Dla osoby chorej na raka w dołu nr A1 sporządzono mieszaninę ze starterami regiono-specyficznymi dla pri-miRNA-944 (starter F1 oraz R1), natomiast w dołku nr A2 ze starterami regiono-specyficznymi dla GAPDH (starter F2 oraz R2). Dołki nr A3 i A4 stanowią powtórzenia wspomnianych reakcji. W analogiczny sposób przygotowano mieszaniny reakcyjne dla osoby zdrowej: w dołkach nr B1 i B3 dodano startery dla pri-miRNA-944 (F1 oraz R1), a w dołkach nr B2 i B4 startery dla GAPDH (F2 oraz R2). Przygotowaną płytkę zabezpieczano folią ochronną, umieszczono w aparacie Real-time PCR i zaprogramowano parametry reakcji qPCR (tabela 4). Po zakończeniu qPCR wyniki interpretowano na monitorze komputera podłączonego do aparatu Real-time PCR. Wyznaczone przez oprogramowanie cykle progowe (Ct) reakcji zapisywano w arkuszu programu Microsoft Excel, który wykorzystano również do wyliczenia średnich wartości Ct z dwóch powtarzanych oznaczeń oraz w celu wyznaczenia relatywnej ekspresji pri-miRNA-944 wprowadzając do arkusza kalkulacyjnego uproszczony wzór Pffaffa. U osoby chorej po uśrednieniu Ct dla pri-miRNA-944 i GAPDH wynosił odpowiednio 28 i 26 cykl qPCR, natomiast dla osoby zdrowej odpowiednio 28 i 22 cykl qPCR (rycina 2 oraz rycina 3). Następnie obliczono ACt dla osoby chorej i zdrowej. Wynosiły odpowiednio dla osoby chorej ACtosoba chora= Ctpri-miRNA-944- CtGAPDH (ACtosoba chora= 28 cykl - 26 cykl = 2 cykle) oraz zdrowej ACt osoba zdrowa = Ctpri-miRNA-944 - CtGAPDH (ACtosoba zdrowa =28 cykl - 22 cykl = 6 cykli). Podstawiając uzyskane ACt do wzoru PffafTa wyliczono ekspresję pri-miRNA-944:
Relatywna ekspresja pri-miRNA-944 = 2 Δα
Ekspresja pri-miRNA-944 osobachora= 2 ACt = 2-2= 0,25
Ekspresja pri-miRNA-944 osoba zdrowa = 2 ACt = 2-6= 0,016
Porównując wartość ekspresji pri-miRNA-944 u obu badanych osób (Ekspresja pri-miRNA944osoba chora / Ekspresja pri-miRNA-944osoba zdrowa) można stwierdzić, że ekspresja pri-miRNA-944 jest ok. 15,63 raza większa (0,25/0,016) u osoby chorej na raka w porównaniu do osoby zdrowej.
W badanej grupie 40 chorych na nowotwory głowy i szyi oraz 40 zdrowych ochotników, średnią ekspresję z wszystkich pomiarów pri-miRNA-944 wykorzystano jako wartość progową, tzn. u badanych osób, u których ekspresja badanego pri-miRNA była niższa niż wartość ekspresji dla całej grupy ekspresję uznawano za niską, natomiast u osób z wynikiem powyżej średniej, ekspresję uznawano za wysoką. Następujące wyniki uzyskano dla grupy 40 chorych na raka oraz 40 osób zdrowych:
| ekspresja pri-miRNA-944 | chorzy (40 osób) | zdrowi (40 osób) |
| ekspresja wysoka (wynik dodatni) | 35 (87,5%) | 2 (5%) |
| ekspresja niska (wynik ujemny) | 5(12,5%) | 38 (95%) |
Obecność niskiej ekspresji pri-miRNA-944 (wynik ujemny) u osób zdrowych może świadczyć o braku rozwijającego się procesu nowotworowego w obrębie głowy i szyi lub innego raka o utkaniu histologicznym typu płasko nabłonkowego. Natomiast u zdrowych osób z wysoką ekspresją (wynik dodatni) pri-miRNA-944, zalecana jest dalsza diagnostyka, np. w oparciu o badanie obrazowe oraz wywiad i badanie lekarskie mające na celu ustalenie przyczyny nieprawidłowego wyniku badania genetycznego. W przypadku chorych z niską ekspresją (wynik ujemny) pri-miRNA-944, należy ustalić przyczynę uzyskania wyniku ujemnego badania genetycznego - może być to związane, m.in. z wielkością i lokalizacją guza oraz innymi cechami kliniczno-demograficznymi chorych. Obecność produktu qPCR potwierdza prawidłowe przeprowadzenie reakcji RT ze starterami genowo-specyficznymi oraz odpowiednio skonstruowane startery regiono-specyficzne dla badanych sekwencji. Metoda oceniająca ekspresję primiRNA-944 z wykorzystaniem opisanych starterów genowo i regiono-specyficznych charakteryzuje się wysoką czułością i swoistością diagnostyczną, odpowiednio 87,5% i 95%.
PL 237 994 Β1
T a b e I a 1. Stężenia i objętości odczynników stosowanych podczas reakcji odwrotnej transkrypcji (RT) dla oznaczania ekspresji pri-miRNA-944 oraz GAPDH (pierwszy etap reakcji RT-qPCR)
| Skład mieszaniny reakcyjnej RT | ilość |
| Bufor RT (10x) | 3 μΙ |
| Mieszanina nukleotydów (25x) (100 mmol) | 0,8 μΙ |
| Enzym odwrotna transkryptaza - MultiScribe (50 U/μΙ) | 1 μΙ |
| Inhibitor RNAz (20 U/μΙ) | 1 μΙ |
| Starter RT (Gl) dla pri-miRNA-944 (lOOpmol/μΙ) | 1 μΙ |
| Starter RT (G2) dla GAPDH (100 pmol/μΙ) | 1 μΙ |
| woda wolna od nukleaz | 4,2 μΙ |
| Badane mRNA (>lng/pl) | 8 μΙ |
| Razem | 20 μΙ |
T a b e I a 2. Warunki temperaturowe prowadzenia reakcji RT w wariancie przystosowanym do oznaczania ekspresji pri-miRNA-944 oraz GAPDH
| Etap reakcji RT | Temperatura | Czas | |
| 1 | Przyłączenie starterów genowospecyficznych oraz przepisanie RNA na cDNA | 37°C | 60 minut |
| II | 95°C | 5 minut | |
| III | Chłodzenie próbki | 4°C | (do momentu schłodzenia) |
T a b e I a 3. Stężenia i objętości odczynników stosowanych podczas reakcji qPCR dla oznaczania ekspresji primiRNA-944 oraz GAPDH (drugi etap reakcji RT-qPCR)
| Skład mieszaniny reakcyjnej qPCR | ilość |
| Mix PCR z barwnikiem SYBR Green | 13 μΙ |
| Starter FI dla pri-miRNA-944 lub F2 dla GAPDH | 0,8 μ! |
| Starter R1 dla pri-miRNA-944 lub R2 dla GAPDH | 0,8 μΙ |
| woda wolna od nukleaz | 1,4 μΙ |
| Badane cDNA (>lng/pl) | 4 μΙ |
| Razem | 20 μΙ |
T a b e I a 4. Warunki temperaturowe prowadzenia qPCR w wariancie przystosowanym do oznaczania ekspresji pri-miRNA-944 oraz GAPDH
| Etap | Temperatura | Czas | Liczba cykli reakcji |
| Aktywacja polimerazy DNA oraz wstępna denaturacja DNA | 95°C | 30 sekund | 1 |
| Właściwa denaturacja DNA | 95 °C | 10 sekund | 40 |
| Przyłączanie starterów regiono-specyficznych | 60 °C | 45 sekund |
Rysunek przedstawia na Fig. 1 reprezentatywny przykład przygotowania płytki reakcyjnej dla qPCR w celu oznaczenia ekspresji pri-miRNA-944 oraz kontroli (GAPDH) w pojedynczej próbce cDNA (jedna osoba badana). W dołkach płytki oznaczonych A1-A4 znajduje się mieszanina reakcyjna dla przeprowadzenia qPCR, do dołków A1 i A3 dodano startery F1 i R1 (dla pri-miRNA-944), natomiast do dołków- A2 i A4 startery F2 i R2 (dla GAPDH). Sekwencję badaną (pri-miRNA-944) oraz kontrolną
PL 237 994 B1 (GAPDH) oznacza się w dwóch powtórzeniach, odpowiednio pary A1 i A3 oraz A2 i A4. Wynik ekspresji uzyskany w badanych dołkach zostaje matematycznie uśredniony.
Fig. 2 obejmuje przykładowy wynik reakcji qPCR (drugi etap RT-qPCR), a mianowicie wynik chorego na nowotwór złośliwy okolicy głowy i szyi - obecność wysokiej ekspresji pri-miRNA-944 we krwi obwodowej (wynik dodatni). Na rycinie widoczne są krzywe obrazujące obecność amplifikacji produktu qPCR przy użyciu starterów regiono-specyficznych dla pri-miRNA-944 oraz kontroli reakcji - GAPDH. Zaznaczono również cykle progowe (Ct) dla obu badanych sekwencji, kiedy produkt reakcji qPCR narasta wykładniczo. W celu obliczenia ACt od Ct pri-miRNA-944 odejmuje się Ct GAPDH, w tym przypadku różnica wynosi 2 cykle.
Fig. 3 pokazuje przykładowy wynik reakcji qPCR (drugi etap RT-qPCR), a mianowicie wynik osoby zdrowej - obecność niskiej ekspresji pri-miRNA-944 we krwi obwodowej (wynik ujemny). Na rycinie widoczne są krzywe obrazujące obecność amplifikacji produktu qPCR przy użyciu starterów regiono- specyficznych dla pri-miRNA-944 oraz kontroli reakcji - GAPDH. Zaznaczono również cykle progowe (Ct) dla obu badanych sekwencji, kiedy produkt reakcji qPCR narasta wykładniczo. W celu obliczenia ACt od Ct pri-miRNA-944 odejmuje się Ct GAPDH, w tym przypadku różnica wynosi 6 cykli.
Wykaz sekwencji nukleotydowych:
a) startery genowo-specyficzne (służące przepisaniu sekwencji RNA pri-miRNA-944 oraz GAPDH na komplementarne dla nich DNA - cDNA) wykorzystywane w pierwszym etapie RTqPCR:
1. starter genowo-specyficzny (G1) dla RNA pri-miRNA-944:
5’- ATGGGAGACACAGC - 3’
2. starter genowo-specyficzny (G2) dla RNA GAPDH:
5’ - GGACTGAGATTGGC - 3’
b) startery regiono-specyficzne (służące amplifikacji cDNA pri-miRNA-944 oraz GAPDH wykorzystywane w drugim etapie RT-qPCR:
1. starter sensowny (F1) dla cDNA pri-miRNA-944:
5’- GTTCCAGACACATCTCATCTGATA - 3’
2. Starter antysensowny (R1) dla cDNA pri-miRNA-944:
5’- TCCCAGACACAGCTCATCCG - 3’
3. Starter sensowny (F2) dla cDNA GAPDH:
5’- CCATCTCAGTCGTTCCCAAAGT - 3’
4. Starter antysensowny (R2) dla cDNA GAPDH:
5’- AGGTGATCGGTGCTGGTTCC-3’
Claims (1)
1. Sposób przepisywania sekwencji RNA oraz amplifikacji cDNA w reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) za pomocą starterów genowo i regiono-specyficznych dla prekursora miRNA-944, znamienny tym, że stosuje się startery genowo-specyficzne (służące przepisaniu sekwencji RNA pri-miRNA-944 oraz GAPDH na komplementarne dla nich DNA-cDNA) posiadające sekwencje nukleotydowe przedstawione w załączniku, wykorzystywane w pierwszym etapie RT-qPCR oraz startery regiono-specyficzne (służące amplifikacji cDNA, pri-miRNA-944 oraz GAPDH) wykorzystywane w drugim etapie RT-qPCR zawierające sekwencje nukleotydowe przedstawione w załączniku.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL432230A PL237994B1 (pl) | 2019-12-16 | 2019-12-16 | Sposób amplifikacji komplementarnego DNA w reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją za pomocą starterów genowo i regiono-specyficznych dla prekursora miRNA-944 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL432230A PL237994B1 (pl) | 2019-12-16 | 2019-12-16 | Sposób amplifikacji komplementarnego DNA w reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją za pomocą starterów genowo i regiono-specyficznych dla prekursora miRNA-944 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL432230A1 PL432230A1 (pl) | 2021-02-22 |
| PL237994B1 true PL237994B1 (pl) | 2021-06-28 |
Family
ID=74647669
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL432230A PL237994B1 (pl) | 2019-12-16 | 2019-12-16 | Sposób amplifikacji komplementarnego DNA w reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją za pomocą starterów genowo i regiono-specyficznych dla prekursora miRNA-944 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL237994B1 (pl) |
-
2019
- 2019-12-16 PL PL432230A patent/PL237994B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL432230A1 (pl) | 2021-02-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2654587C2 (ru) | Способ предсказания рецидива рака молочной железы при эндокринном лечении | |
| US9068974B2 (en) | Biomarkers in peripheral blood mononuclear cells for diagnosing or detecting lung cancers | |
| JP6216470B2 (ja) | 甲状腺腫瘍の分類におけるｍｉＲＮＡ発現シグネチャー | |
| EP2734636B1 (en) | Micro-rna biomarkers for identifying risk of and/or for diagnosing lung tumour | |
| US20180105888A1 (en) | Methods and Kits for Detecting Subjects at Risk of Having Cancer | |
| JP2015128442A (ja) | 早期結腸直腸癌の検出のための血漿マイクロｒｎａ | |
| CN102876676B (zh) | 一种与胰腺癌相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用 | |
| Nashtahosseini et al. | Circulating status of microRNAs 660‐5p and 210‐3p in breast cancer patients | |
| WO2015017537A2 (en) | Colorectal cancer recurrence gene expression signature | |
| WO2016186987A1 (en) | Biomarker micrornas and method for determining tumor burden | |
| EP3122905B1 (en) | Circulating micrornas as biomarkers for endometriosis | |
| CN103384829A (zh) | 预测大肠直肠癌复发的生物标记 | |
| US20250137066A1 (en) | Compostions and methods for diagnosing lung cancers using gene expression profiles | |
| CN108949992B (zh) | 一种与食管鳞癌及其分级相关的生物标志物 | |
| US20190316207A1 (en) | Mir-320e and colorectal cancer | |
| CN114908171B (zh) | 人HHIPL2 mRNA在非小细胞肺癌靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒 | |
| WO2010101916A1 (en) | Methods for predicting cancer response to egfr inhibitors | |
| US20220180973A1 (en) | Early detection and prediction method of pan-cancer | |
| CN111187840B (zh) | 一种用于早期乳腺癌诊断的生物标志物 | |
| CN106755343A (zh) | 胰腺癌预后诊断分子标记物 | |
| US20240254566A1 (en) | Analysis method, kit, and detection device | |
| PL237994B1 (pl) | Sposób amplifikacji komplementarnego DNA w reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją za pomocą starterów genowo i regiono-specyficznych dla prekursora miRNA-944 | |
| CN114746551A (zh) | 大肠癌诊断用标志物、辅助大肠癌的诊断的方法、收集数据以用于大肠癌诊断的方法、大肠癌的诊断试剂盒、大肠癌治疗药物、大肠癌的治疗方法、大肠癌的诊断方法 | |
| CN115261472B (zh) | 一种用于局部晚期食管鳞癌放疗疗效预测的标志物及其应用与试剂盒 | |
| RU2611340C2 (ru) | Способ мониторинга эффективности противоопухолевой терапии немелкоклеточного рака легкого |