PL238379B1 - Urządzenie do perfuzyjnych hodowli komórkowych - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest urządzenie do perfuzyjnych hodowli komórkowych.

Hodowle komórkowe polegają na utrzymywaniu żywych komórek poza organizmem żywym (in vitro) dłużej niż 24 godziny. Korzyści z posiadania hodowli komórkowych w laboratoriach prowadzących szeroko pojęte badania biologiczne są nieocenione. Po pierwsze, hodowla stanowi wygodne źródło konkretnej populacji komórek, będących przedmiotem badań takich jak badania genetyczne, biochemiczne, cytometryczne czy w końcu wyrafinowanych obserwacji mikroskopowych. Kolejną zaletą badań hodowli in vitro jest możliwość dokładnej kontroli wszystkich parametrów takich jak stężenia substancji, pH lub temperatura. O wynikach badań często decyduje kondycja komórek, będąca rezultatem doboru odpowiednich warunków hodowli. Nierzadko, obserwacje komórek wystawionych np. na działanie pewnego czynnika muszą być długotrwałe, co wymusza konieczność utrzymywania komórek przy życiu podczas trwania eksperymentu, a więc przeprowadzanie hodowli. Jako wyniki obserwacji i pomiarów dokonywanych na żywych komórkach otrzymujemy bardzo cenne informacje pozwalające określić odpowiedź komórki na różne bodźce i dzięki temu wnioskować o procesach, które w niej zachodzą. Komórki w hodowli są laboratoryjnym modelem układu żywego, pozwalającym badać złożoność materii żywej a także podstawy jej funkcjonowania na coraz głębszych poziomach. Istotną korzyścią jaką niesie praca z hodowlami komórkowymi jest możliwość weryfikacji hipotez poprzez badania komórek pod działaniem określonych substancji, o których podejrzewamy, że mogą mieć działanie biologiczne: toksyczne, lecznicze lub sygnałowe. Metodyka hodowli komórkowych jest również użyteczna w procesie badań klinicznych a także w badaniach związanych z medycyną regeneracyjną. Najbardziej oczywistym warunkiem utrzymania żywych komórek w laboratorium jest zapewnienie środowiska przypominającego warunki naturalne, a więc odpowiedniej temperatury, pH, osmolarności, a także zaspokojenie ich podstawowych potrzeb fizjologicznych takich jak odżywianie oraz wymiana gazowa. Aby spełnić te warunki umieszcza się komórki w specjalnie do tego celu przygotowanych roztworach tzw. pożywkach (mediach). Dodatkowo, większość czasu hodowla przebywa wewnątrz komory specjalnego urządzenia, czyli tzw. cieplarki (inkubatora), gdzie panuje odpowiednia temperatura a także optymalne wartości ciśnień parcjalnych gazów oddechowych. Kolejnym warunkiem przeprowadzenia udanej hodowli komórkowej jest odpowiedni materiał, do którego może nastąpić adhezja komórek. Adhezja, czyli silne związanie mechaniczne z otaczającym środowiskiem jest kluczową cechą komórek organizmów wielokomórkowych, zapewniającą ich trwałość. Komórka pozbawiona sygnału mechanicznego i chemicznego o występowaniu substancji, które mogłoby stanowić dla niej podporę, ginie. Dlatego ważną cechą jest zapewnienie biokompatybilnego podłoża hodowlanego. Wyjątek stanowią komórki nowotworowe, które mogą przez dłuższy czas przebywać w zawiesinie. Kolejnym ważnym aspektem jest zapewnienie aseptyki, zabezpieczającej przez zakażeniem hodowli obcymi drobnoustrojami.

Obecnie, hodowle komórkowe zakłada się w dwojaki sposób: jako źródło komórek do założenia hodowli korzysta się ze świeżo wyciętych z organizmu fragmentów tkanki - tzw. eksplantów lub dostępnych na rynku linii komórkowych, czyli komórek, które były już wcześniej hodowane w laboratorium. Eksplanty umieszcza się bezpośrednio na podłożu hodowlanym lub poddaje działaniu odpowiednich enzymów, uzyskując zawiesinę komórkową. W formie zawiesiny są także komórki linii komórkowych po rozbankowaniu. Komórki z zawiesiny wysiewa się na podłoże, po czym zalewa się je warstwą odpowiedniej pożywki i całe naczynie wstawiane jest do cieplarki. Pożywkę należy wymieniać co parę dni ze względu na wyczerpanie składników odżywczych i nagromadzenie produktów ubocznych metabolizmu komórkowego. W każdym z omawianych przypadków, komórki rozpłaszczają się po czym następuje ich podział i stopniowo pokrywają one coraz większą powierzchnię podłoża. We wszystkich omówionych przypadkach, otrzymujemy pojedynczą warstwę komórek pokrywającą całą dostępną powierzchnię naczynia hodowlanego, czyli tzw. monowarstwę. Ze względu na występowanie zjawiska zahamowania kontaktowego, po zajęciu całej dostępnej powierzchni, komórki przestają się dzielić. Znów wyjątek stanowią komórki nowotworowe, które tworzą wielowarstwowe kolonie, jednakże ich wielkość limituje dyfuzja składników odżywczych i tlenu do najgłębszych warstw. Obecnie, najczęściej hodowle przeprowadza się w butelkach hodowlanych, szalkach Petriego lub płytkach wielodołkowych. Naczynia te wykonane są z tworzywa, które samo może być biokompatybilnym podłożem oraz umożliwiającego obrazowanie hodowli z użyciem mikroskopu optycznego.

Powszechnie stosowane hodowle mają dwuwymiarową geometrię. Stan komórki w monowarstwie odbiega od stanu fizjologicznego. Metabolizm komórek w hodowli jest mniej wydajny i może od

PL 238 379 Β1 biegać od charakterystycznego metabolizmu tkanki wyjściowej. Oddychanie zachodzi głównie na drodze glikolizy. Z powyższych powodów, hodowla 2D nie ma dostatecznej wartości jako model fizjologiczny tkanki. Hodowle jednowarstwowe in vitro są cennym narzędziem badawczym dającym pewne wyobrażenie na temat funkcjonowania układów biologicznych, jednak są jedynie modelami tych systemów i wyniki uzyskiwane tą metodą nie mogą być bezrefleksyjnie odnoszone do systemów in vivo. Różnice w zachowaniu się komórek w hodowli, w porównaniu z ich zachowaniem w organizmie są skutkiem wyizolowania z trójwymiarowej struktury tkanki. Brak jest w takich hodowlach specyficznych interakcji międzykomórkowych, właściwych dla struktury tkanki - komórki nie otrzymują całej gamy bodźców generowanych przez złożone środowisko tkanki, narządu lub docierających z całego organizmu. Bodźcami mogą być rozmaite sygnały biochemiczne (stężenia substancji sygnałowych w przestrzeni międzykomórkowej lub przenoszone bezpośrednio z komórki do komórki przez połączenia kontaktowe) lub bodźce mechaniczne (nacisk), a w przypadku komórek pobudliwych także potencjał elektryczny błony komórki sąsiadującej. Układ modelowy o większej złożoności niż hodowle 2D, jednak prostszy od naturalnych tkanek, stanowiłby pomost do dalszego poznaniu funkcjonowania organizmów. Możliwe stałoby się badanie nie tylko właściwości samych komórek, ale zupełnie nowych właściwości wynikających ze skomplikowanych oddziaływań międzykomórkowych, charakterystycznych dla poziomu tkanki. To właśnie jest przeznaczenie trójwymiarowych hodowli komórkowych. Funkcjonowanie komórek w takich hodowlach jest bardziej zbliżone do sytuacji in vivo. Analiza zachowania prostych układów, w których komórki tworzą struktury trójwymiarowe, rozpoczyna interesujące badania na temat migracji komórek, różnicowania i organogenezy, rozwoju guzów nowotworowych czy odpowiedzi na różne czynniki farmakologiczne. Rozwijanie technik hodowli komórkowych 3D stworzyłoby w przyszłości możliwość produkcji tkanek do zastosowań klinicznych, np. do przeprowadzania przeszczepów. Wzrost komórek w hodowli w trzecim wymiarze limituje przede wszystkim konieczność zapewnienia każdej komórce dostępu do substancji odżywczych, a przede wszystkim tlenu. Pokonanie tego ograniczenia wymaga stworzenia systemu dystrybucji tych substancji, który może być wzorowany na naturalnych systemach naczyniowych.

W stanie techniki opisane są różne próby pokonania tych ograniczeń. Próbuje się pokonać powyższe problemy wykonując materiały hodowlane w różnych kształtach, mikronośniki, czy materiały porowate.

W zgłoszeniu patentowym US 20090191631 A1 (opubl. 2009-0730) opisano układ o geometrii szalki Petriego umożliwiający prowadzenie trójwymiarowych hodowli komórkowych. Proponowany układ wykorzystuje membranę typu „hollow fiber” o strukturze włóknistej jako szkielet dla hodowli komórkowej 3D. Odżywianie komórek zapewniane jest przez pożywkę przepływającą przez włókna membrany. Włókna membrany włączone są do układu mikrofluidycznego, połączonego z zewnętrznym rezerwuarem. Istotnym ograniczeniem w szerokim rozpowszechnieniu opisanego rozwiązania jest jego złożoność konstrukcyjna, wpływająca na cenę wytworzenia oraz brak możliwości zmiany podłoża komórkowego.

Wzgłoszeniu patentowym US20110306122 A1 (opubl. 2011-12-15) opisano układ do wytwarzania trójwymiarowych hodowli komórkowych w zawieszonych w polu grawitacyjnym kroplach. Rozwiązanie to znalazło realizację komercyjną w postaci układów wytwarzanych przez firmę Insphero (www.insphero.com). Istotnym ograniczeniem rozwiązania są rozmiary otrzymywanych hodowli trójwymiarowych oraz brak możliwości perfuzyjnego zasilania układu pożywką.

Firma Microtissues, Inc. (www.microtissues.com) oferuje stelaże o rozmiarach standardowych szalek Petriego do prowadzenia trójwymiarowych hodowli komórkowych. Są to układy wielokrotnego użytku posiadające macierze hodowlane o różnej ilości dołków. Układy te pozwalają na prowadzenie semi-trójwymiarowych hodowli komórkowych o istotnie ograniczonych rozmiarach. Układy te nie pozwalają na ciągłą dostawę pożywki do hodowli. Macierze do hodowli komórkowych 3D o podobnej charakterystyce, lecz o gabarytach standardowych płytek hodowlanych oferowane są przez firmę 3D Biomatrix (3dbiomatrix.com).

Układy perfuzyjne do hodowli komórkowych produkowane są m. in. przez firmę MINUCELLS and MINUTISSUE Vertriebs GmbH (www.minucells.com) oraz Reinnervate Ltd, (reinnervate.com). Układy będące w ofercie tych oraz innych podobnych firm nie dają możliwości perfuzyjnego zasilania hodowli 3D wyposażonych w kanały imitujące naczynia krwionośne.

Pomimo opisanych wcześniej badań, patentów oraz wdrożeń poświęconych przeprowadzaniu trójwymiarowych hodowli komórkowych, istnieje ciągła potrzeba uzyskania skutecznego rozwiązania umożliwiającego łatwe i tanie wykonywanie takich układów oraz przeprowadzania na nich badań a także

PL 238 379 B1 utrzymanie przy życiu dużego trójwymiarowego agregatu komórkowego, posiadającego właściwości wynikające ze złożoności procesów sygnalizacji międzykomórkowej, a także system dystrybucji substratów metabolicznych.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie rozwiązania, które może być wykorzystane do badań nad perfuzyjnymi trójwymiarowymi hodowlami komórkowymi. Realizacja tak określonego celu i rozwiązanie opisanych w stanie techniki problemów związanych z wydajnym i prostym sposobem dostarczania substancji odżywczych do całej objętości podłoża hodowlanego zostały osiągnięte w nin iejszym wynalazku.

Zgodnie z wynalazkiem, urządzenie do perfuzyjnych hodowli komórkowych o trójwymiarowej geometrii według wynalazku zawiera stelaż stanowiący płaski element ze znajdującymi się na jego powierzchni uchwytami do mocowania elastycznych wężyków, oraz ograniczającą hodowlane pole, otwartą od góry i zamkniętą od dołu, ramkę, zawierającą w bocznych ściankach otwory, przy czym każdy z umieszczonych w otworach bocznych ścianek ramki elastycznych wężyków posiada jeden koniec znajdujący się w hodowlanym polu oraz drugi koniec znajdujący się poza hodowlanym polem, a także zestalone w hodowlanym polu biokompatybilne podłoże zawierające kanały łączące parami elastyczne wężyki i uszczelniające połączenie elastycznych wężyków z ramką. Dodatkowo, znajdujące się poza hodowlanym polem końce elastycznych wężyków są połączone w układ umożliwiający jednoczesne wprowadzenie do każdego z kanałów w hodowlanym polu dyfundującej do zestalonego biokompatybilnego podłoża płynnej pożywki.

Korzystnie, urządzenie według wynalazku zawiera elementy regulujące przepływ płynnej pożywki przez elastyczne wężyki.

Korzystnie, urządzenie według wynalazku zawiera elementy regulujące przepływ w każdym kanale.

Korzystnie, w urządzeniu według wynalazku elementy regulujące przepływ stanowią regulatory śrubowe będące integralną częścią stelaża.

Korzystnie, w urządzeniu według wynalazku układ umożliwiający jednoczesne wprowadzenie do każdego z kanałów w hodowlanym polu dyfundującej do zestalonego biokompatybilnego podłoża płynnej pożywki posiada symetrię umożliwiającą dostarczanie równych objętości płynnej pożywki w jednostce czasu do każdego z kanałów.

Korzystnie, urządzenie według wynalazku jest połączone z układem wymuszającym przepływ płynnej pożywki.

Korzystnie, urządzenie według wynalazku jest połączone z rezerwuarem płynnej pożywki.

Korzystnie, urządzenie według wynalazku zawiera odpływ płynnej pożywki.

Korzystnie, urządzenie według wynalazku zawiera czujniki umożliwiające kontrolę pracy układu oraz zachodzących procesów biochemicznych w czasie rzeczywistym.

Aby uzyskać biokompatybilne podłoże zawierające kanały materiał podłoża hodowlanego zestala się dookoła matrycy, którą następnie usuwa się uzyskując służący do dostarczania pożywki drożny kanał lub zestaw kanałów o wcześniej zaprojektowanej strukturze trójwymiarowej.

Materiał podłoża hodowlanego można zestalić w polu hodowlanym w formie ramki bez dna, z otworami w ściankach, które umożliwiają przejście wężyków zasilających do wnętrza pola hodowlanego.

Możliwe jest zastosowanie wężyków wykonanych z różnych materiałów, niezbędne jest jednak by były one odpowiednio elastyczne, tak aby system wężyków mógł zachować swoją zwartość. Do każdego kanału można doprowadzić wężyk.

Matrycę mogą stanowić cienkie włókna. W szczególności, ich rolę mogą pełnić polimerowe przewody.

Matrycę można wprowadzić do obszaru wytwarzania podłoża hodowlanego poprzez wężyki. Ramkę bez dna może stanowić element stelaża, który umieszcza się na szalce Petriego.

Ramkę bez dna można też umieścić na szkiełku mikroskopowym.

Materiał podłoża zastyga w polu hodowlanym, uszczelniając cały układ. Obecna w obszarze hodowlanym matryca prowadzi do powstania kanałów, przez które będzie następował ciągły przepływ pożywki.

Matryce powinny mieć średnicę pozwalającą na ich wprowadzenie do obszaru wytwarzania podłoża hodowlanego poprzez wężyki dochodzące do jego ścianek. Po zastygnięciu podłoża hodowlanego

PL 238 379 B1 matryce, np. polimerowe przewody, należy usunąć pozostawiając po sobie kanały dystrybuujące pożywkę. Wprowadzenie przewodów niezbędnych do wytworzenia kanałów następuje w stanie, gdy układ doprowadzający składniki jest rozłączony.

W obszarze hodowlanym stelaż może posiadać wycięcie pozwalające na łatwą obserwację hodowli komórkowej za pomocą mikroskopu optycznego, w szczególności konfokalnego.

Wymuszenie przepływu w układzie może być zrealizowane poprzez podłączenie do pompy (perystaltycznej lub strzykawkowej) lub grawitacyjnie, poprzez umieszczenie rezerwuaru z pożywką powyżej stelaża.

Czujniki umożliwiające kontrolę pracy układu oraz zachodzących procesów biochemicznych w czasie rzeczywistym w urządzeniu według wynalazku mogą być źródłem cennych danych np. poprzez analizę transparentności przepływającej przez wężyki pożywki.

W jednej z odmian, urządzenie według wynalazku wyróżnia się charakterystyczną geometrią pozwalającą umieścić stelaż w szalce Petriego o standardowych rozmiarach. Jest więc ono kompatybilne ze standardowym wyposażeniem laboratoriów.

W urządzeniu według wynalazku istnieje swoboda tworzenia konfiguracji połączeń układu doprowadzającego pożywkę. W szczególności, można rozważać konfiguracje z przepływem jednokierunkowym lub kierunkiem przepływu zależnym od kanału. Układ doprowadzający może być również zrealizowany w konfiguracji, w której w zależności od kanału wprowadzane są różnego typu substancje. Taka konfiguracja umożliwia np. prowadzenie badań dotyczących dyfuzji danego czynnika poprzez hodowlę komórkową. Proces dyfuzji jest tu badany poprzez analizę składników wypływających z danego kanału. W tej konfiguracji urządzenie może znaleźć zastosowanie przy badaniu rozprowadzania farmaceutyków w organizmach żywych. Wprowadzenie żywych komórek do urządzenia może odbyć się na wiele sposobów.

W szczególności można wymienić:

1) zmieszanie zawiesiny komórkowej z płynnym materiałem stanowiącym podłoże hodowlane (bezpośrednio przed zalaniem matrycy),

2) wprowadzenie komórek w formie zawiesiny do kanałów gotowego układu,

3) umieszczenie linii komórkowej na powierzchni zestalonego podłoża hodowlanego,

4) lokalne wprowadzenie, poprzez iniekcję, komórek do objętości zestalonego podłoża,

Korzystną własnością proponowanego urządzenia jest to, że może ono pracować z różnymi podłożami do hodowli komórkowych. Umożliwia to pracę z szerokim spektrom linii komórkowych.

Korzystną własnością urządzenia według wynalazku jest również to, że jego konstrukcja nie wymaga stosowania zaawansowanych technik wytwarzania. Szkielet konstrukcji może być (jak to miało miejsce w przypadku rozwiązania prototypowego) wykonany w technologii druku 3D. Dzięki temu, produkcja może być opłacalna nawet przy niewielkiej ilości wytwarzanych egzemplarzy układu.

Z pomocą urządzenia według wynalazku łatwo i szybko można tworzyć bloki z agaru lub innego biozgodnego materiału z kanałami, przez które przepuszczana jest pożywka komórkowa. Kanały w macierzy hodowlanej oraz przepływający przez nie roztwór spełniają zadanie doprowadzenia substratów metabolicznych do każdej komórki. Dzięki temu hodowla może osiągać większe rozmiary. W ramach prezentowanego rozwiązania, istnieje możliwość uzyskania większej liczby warstw komórek, czego nie można uzyskać stosując tradycyjne metody, gdyż dyfuzja substancji odżywczych jest niewystarczająca, aby zapewnić odpowiednie warunki wszystkim komórkom.

Urządzenie według wynalazku można zrealizować w konstrukcji modułowej zawierającej zestaw stelaży w różnych konfiguracjach połączeń. Urządzenie może być rozbudowane przez dodanie odpowiednich czujników w ramach każdego ze stelaży.

Dzięki znormalizowanej charakterystyce wymiarowej, szczególnie cenne narzędzie zyskałyby badania wymagające wielu układów doświadczalnych cechujących się wysoką powtarzalnością, o którą trudno badając naturalne trójwymiarowe układy komórkowe.

Przedmiot wynalazku został zilustrowany w przykładzie wykonania na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia schemat urządzenia według wynalazku, fig. 2 przedstawia urządzenie według wynalazku w widoku z góry i przekroju osiowym, fig. 3 przedstawia schematycznie etapy wytwarzania podłoża hodowlanego, fig. 4 przedstawia schematycznie etapy napełniania urządzenia według wynalazku pożywką, fig. 5 przedstawia stelaż do urządzenia według wynalazku w wersji z dwoma kanałami w widoku perspektywicznym i w widoku z góry, zaś fig. 6 przedstawia stelaż do urządzenia według wynalazku w wersji z czterema kanałami w widoku perspektywicznym i w widoku z góry.

PL 238 379 B1

Przedmiot wynalazku został zilustrowany w przykładzie wykonania na rysunku, na którym fig. 3 przedstawia etapy wytwarzania podłoża hodowlanego. Fig. 3a. i 3b. ukazuje wprowadzenie matrycy 13 w postaci włókna nylonowego do obszaru, w którym była tworzona hodowla komórkowa ograniczonego ramką 16 bez dna, z otworami 17 w ściankach, które umożliwiają przejście wężyków zasilających do wnętrza pola hodowlanego 15, wykonaną z tworzywa sztucznego, poprzez otwory 17 i silikonowe wężyki 3a. Fig. 3c. ukazuje wypełnienie obszaru hodowlanego podłożem hodowlanym 5 w postaci hydrożelu agarozowego o stężeniu około 1% w bufor/c PBS w stanie ciekłym, zaś fig. 3d. wyciągnięcie włókna nylonowego 13 po zastygnięci hydrożelu 5 wypełniającego ramkę 16 oraz połączenie układu wężyków 3 łącznikiem 4, przy czym obszar, w którym tworzona jest hodowla komórkowa zamknięty jest od dołu mikroskopowym szkiełkiem 14.

W kolejnym przykładzie wykonania (fig. 1, fig. 2) wynalazku podłoże hodowlane było ograniczone ramką 16 stanowiącą element stelaża 1, zaś stelaż był umieszczony w szalce Petriego, która zastąpiła szkiełko mikroskopowe 14.

Urządzenie do perfuzyjnych hodowli komórkowych o trójwymiarowej geometrii według wynalazku uwidocznione w przykładzie wykonania na fig. 2 zawiera znajdujący się na szalce Petriego 2 stelaż 1, na którym znajduje się układ silikonowych wężyków 3 umieszczonych w uchwytach 10 oraz zestalone podłoże hodowlane 5 z agaru z dwoma kanałami 6. Wężyki 3 są połączone łącznikami z tworzywa sztucznego 4 do konfiguracji umożliwiającej jednoczesne wprowadzenie pożywki 18 do każdego z kanałów 6. Urządzenie jest zaopatrzone w odpływ substancji roboczej 9. Na wężykach 3 znajdują się elementy 12 regulacyjne ze śrubą dociskową, pozwalające kontrolować przepływ w wybranej odnodze systemu wężyków, zaś podłoże hodowlane 5 można obserwować przez okienko 14 ograniczone dnem szalki Petriego.

W przykładzie wykonania wynalazku stelaż 1 zrealizowano w wersji z dodatkowymi ściankami (niepokazanej na rysunku). Nie istnieje wtedy potrzeba umieszczania stelaża w szalce Petriego. W takim przypadku zamknięto dno obszaru hodowlanego szkiełkiem mikroskopowym umożliwiającym dogodne obrazowanie hodowli. Zastosowano standardowe szkiełko mikroskopowe o grubości 0,2 mm.

W przykładzie wykonania przedstawionym na fig. 5 przedstawiono stelaż 1 do urządzenia według wynalazku w wersji z dwoma kanałami.

W przykładzie wykonania przedstawionym na fig. 6 przedstawiono stelaż 1 do urządzenia według wynalazku w wersji z czterema kanałami.

W obydwu konfiguracjach układ był kompatybilny ze standardowymi szalkami Petriego 2 o średnicach wewnętrznych 85 mm. Stelaż 1 do urządzenia według wynalazku został wykonany z polilaktydu (PLA) z wykorzystaniem technologii druku 3D. Wężyki 3 zostały wykonane z silikonowych przewodów o średnicach wewnętrznych 0,8 mm. Jako zaciski 12 wykorzystano wkręty typu M3 wykonane z tworzywa sztucznego o zaokrąglonych końcach, tak by nie prowadziły one do mechanicznych uszkodzeń wężyków 3. Jako przewodu do wytwarzania kanałów użyto struny nylonowej.

W przeprowadzonych testach jako podłoża hodowlanego używano hydrożelu agarozowego o stężeniu około 1% w buforze PBS. Hydrożel o takim stężeniu jest powszechnie stosowany w praktyce laboratoryjnej do tworzenia podłoży pod hodowle komórkowe. W celu przygotowania materiału, 100 ml bufom PBS umieszczono w zlewce na mieszadle magnetycznym z funkcją podgrzewania. Po osiągnięciu temperatury 60°C do bufom dodano 1 g agarozy. Po uzyskaniu jednorodnej mieszaniny zakończono proces mieszania i ogrzewania. Otrzymaną substancję, za pomocą pipety automatycznej, wprowadzono do ramki stanowiącej centralną część stelaża, w której znajduje się matryca kanałów. Po zestaleniu się hydrożelu zrealizowano procedurę wytwarzania kanałów oraz ich napełniania.

Urządzenie według wynalazku napełniono pożywką 18. Z uwagi na napięcie powierzchniowe, procedurę tą przeprowadzono w odpowiedniej sekwencji, wprowadzając przepływ cieczy osobno przez każdy z kanałów. Było to możliwe dzięki zastosowaniu zacisków śrubowych (fig. 2, element 12) pozwalających wstrzymać przepływ cieczy w wybranym z kanałów. Sekwencję napełniania, dla przypadku stelaża z dwoma kanałami, przedstawiono na fig. 4. Na fig. 4a. przedstawiono moment, w którym dokręcając śrubę zaciskową 12a zatrzymano przepływ w jednym z kanałów. Pozwoliło to napełnić drugi kanał, przez który przepływ nie jest blokowany (zacisk 12b był zwolniony). Na fig. 4b. przedstawiono moment, gdy zwolniono zacisk 12a i za pomocą zacisku 12b zablokowano przepływ w napełnionym kanale. W ten sposób wygenerowano przepływ w poprzednio zamkniętym kanale. Po jego napełnieniu, zwolniono zacisk 12a, umożliwiając przepływ pożywki 18 przez oba napełnione kanały.

PL 238 379 B1

Przeprowadzono testy: napełniania i szczelności połączeń obszaru hodowlanego z układem zasilającym, metodyki wytwarzania kanałów oraz dyfuzji pożywki (w testach użyto pigmentu pozwalającego na obrazowanie procesu dyfuzji) z kanałów do hydrożelu. Przepływ w układzie indukowany był za pomocą pompy perystaltycznej oraz pompy strzykawkowej 7.

Testy wykazały, że:

1) Zaproponowana metodyka wytwarzania kanałów sprawdza się w praktyce i uzyskiwane są szczelne połączenia hodowli z układem zasilającym.

2) Układ jest wytrzymały na długotrwały przepływ płynu (pożywki).

3) Zaobserwowana dyfuzja pigmentu pozwala ocenić, że układ pozwala na doprowadzenie pożywki do całej objętości hodowli.

4) Istnieje możliwość wyrównania przepływów we wszystkich kanałach, co wykazała przeprowadzona analiza procesu dyfuzji pigmentu.

Z wykorzystaniem urządzenia według wynalazku przygotowano zestaw w formie pudełka z podłożem, posiadający wydrążenia na odpowiednie komponenty układu: stelaż, wężyki, łączniki, składniki potrzebne do wytworzenia podłoża hodowlanego, rezerwuar na pożywkę z grawitacyjnie indukowanym przepływem, instrukcję. Zestaw posiadał kompletny zbiór elementów pozwalających przygotować podłoże do podtrzymywania trójwymiarowych hodowli komórkowych.

Wykaz odnośników:

- stelaż

- szalka Petriego

- wężyk

- element łączący

- podłoże hodowlane

- kanał doprowadzający pożywkę

- układ wymuszający przepływ

- rezerwuar pożywki

- odpływ pożywki

- uchwyt na wężyk

- uchwyt łącznika

- elementy regulujący przepływ

- matryca

- szkiełko mikroskopowe, okienko obserwacyjne

- pole hodowlane

- ramka

- otwory

- płynna pożywka

Claims (9)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Urządzenie do perfuzyjnych hodowli komórkowych zawierające:

   stelaż (1), stanowiący płaski element ze znajdującymi się na jego powierzchni uchwytami (10) do mocowania elastycznych wężyków (3), oraz ograniczającą hodowlane pole (15), otwartą od góry i zamkniętą od dołu, ramkę (16), zawierającą w bocznych ściankach otwory (17), przy czym każdy z umieszczonych w otworach (17) bocznych ścianek ramki (16) elastycznych wężyków (3) posiada jeden koniec znajdujący się w hodowlanym polu (15) oraz drugi koniec znajdujący się poza hodowlanym polem (15), a także zestalone w hodowlanym polu (15) biokompatybilne podłoże (5) zawierające kanały (6) łączące parami elastyczne wężyki (3) i uszczelniające połączenie elastycznych wężyków (3) z ramką (16),

   PL 238 379 B1 a ponadto znajdujące się poza hodowlanym polem (15) końce elastycznych wężyków (3) są połączone w układ umożliwiający jednoczesne wprowadzenie do każdego z kanałów (6) w hodowlanym polu (15) dyfundującej do zestalonego biokompatybilnego podłoża (5) płynnej pożywki (18).
2. 2. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera elementy (12) regulujące przepływ płynnej pożywki (18) przez elastyczne wężyki (3).
3. 3. Urządzenie według zastrz. 2, znamienne tym, że zawiera elementy (12) regulujące przepływ w każdym kanale (6).
4. 4. Urządzenie według zastrz. 3, znamienne tym, że elementy (12) regulujące przepływ stanowią regulatory śrubowe będące integralną częścią stelaża (1).
5. 5. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że układ umożliwiający jednoczesne wprowadzenie do każdego z kanałów (6) w hodowlanym polu (15) dyfundującej do zestalonego biokompatybilnego podłoża (5) płynnej pożywki (18) posiada symetrię umożliwiającą dostarczanie równych objętości płynnej pożywki (18) w jednostce czasu do każdego z kanałów (6).
6. 6. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że jest połączone z układem (7) wymuszającym przepływ płynnej pożywki (18).
7. 7. Urządzenie według zastrz. 1 albo 6, znamienne tym, że jest połączone z rezerwuarem (8) płynnej pożywki (18).
8. 8. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera odpływ (9) płynnej pożywki (18).
9. 9. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera czujniki umożliwiające kontrolę pracy układu oraz zachodzących procesów biochemicznych w czasie rzeczywistym.