PL238700B1 - Związki chemiczne mające zastosowanie jako markery diagnostyczne stanu zapalnego i nowotworów do zastosowania jako zestaw diagnostyczny i metoda diagnozowania i różnicowania procesów zapalnych i nowotworów nabłonkowych - Google Patents
Związki chemiczne mające zastosowanie jako markery diagnostyczne stanu zapalnego i nowotworów do zastosowania jako zestaw diagnostyczny i metoda diagnozowania i różnicowania procesów zapalnych i nowotworów nabłonkowych Download PDFInfo
- Publication number
- PL238700B1 PL238700B1 PL434554A PL43455418A PL238700B1 PL 238700 B1 PL238700 B1 PL 238700B1 PL 434554 A PL434554 A PL 434554A PL 43455418 A PL43455418 A PL 43455418A PL 238700 B1 PL238700 B1 PL 238700B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- abz
- anb
- val
- pna
- pro
- Prior art date
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 71
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 title claims abstract description 52
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 title claims abstract description 41
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 38
- 208000034179 Neoplasms, Glandular and Epithelial Diseases 0.000 title description 14
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title description 14
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 title 1
- RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N anthranilic acid Chemical compound NC1=CC=CC=C1C(O)=O RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 33
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 32
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 19
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 35
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 19
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 19
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 18
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 14
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 14
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 13
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 7
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 claims description 7
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 claims description 6
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 claims description 6
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 claims description 3
- ZWLPBLYKEWSWPD-UHFFFAOYSA-N o-toluic acid Chemical compound CC1=CC=CC=C1C(O)=O ZWLPBLYKEWSWPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 2
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 107
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 68
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 61
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 61
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 36
- UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N tetrachloro-1,4-benzoquinone Chemical compound ClC1=C(Cl)C(=O)C(Cl)=C(Cl)C1=O UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 27
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 26
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 25
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 22
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 19
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 101100074988 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) nmp-1 gene Proteins 0.000 description 18
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 17
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- -1 9-fluorenylmethoxycarbonyl Chemical group 0.000 description 14
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 13
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 13
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 description 13
- ZPGDWQNBZYOZTI-UHFFFAOYSA-N 1-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl)pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCN1C(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 ZPGDWQNBZYOZTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- AHDSRXYHVZECER-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-tris[(dimethylamino)methyl]phenol Chemical compound CN(C)CC1=CC(CN(C)C)=C(O)C(CN(C)C)=C1 AHDSRXYHVZECER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 11
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 10
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 9
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 8
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 7
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007821 HATU Substances 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012317 TBTU Substances 0.000 description 6
- CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000008636 Neoplastic Processes Diseases 0.000 description 5
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 125000004213 tert-butoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C(O*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 5
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 208000006593 Urologic Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N dmso dimethylsulfoxide Chemical compound CS(C)=O.CS(C)=O CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000037189 immune system physiology Effects 0.000 description 4
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZZOKVYOCRSMTSS-UHFFFAOYSA-N 9h-fluoren-9-ylmethyl carbamate Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N)C3=CC=CC=C3C2=C1 ZZOKVYOCRSMTSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 3
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 3
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 3
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 3
- 210000003741 urothelium Anatomy 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 208000010932 epithelial neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- QTBFPMKWQKYFLR-UHFFFAOYSA-N isobutyl chloride Chemical compound CC(C)CCl QTBFPMKWQKYFLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 230000035778 pathophysiological process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- UMRUUWFGLGNQLI-QFIPXVFZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-6-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]hexanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 UMRUUWFGLGNQLI-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 1
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZZWQCKYLNIOBT-UHFFFAOYSA-N 5-amino-2-nitrobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(O)=O)=C1 KZZWQCKYLNIOBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000549556 Nanos Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N Trifluoroethanol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010046431 Urethral cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010046458 Urethral neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- WXIONIWNXBAHRU-UHFFFAOYSA-N [dimethylamino(triazolo[4,5-b]pyridin-3-yloxy)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CN=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 WXIONIWNXBAHRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- BLMPQMFVWMYDKT-NZTKNTHTSA-N carfilzomib Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)[C@]1(C)OC1)NC(=O)CN1CCOCC1)CC1=CC=CC=C1 BLMPQMFVWMYDKT-NZTKNTHTSA-N 0.000 description 1
- 108010021331 carfilzomib Proteins 0.000 description 1
- 229960002438 carfilzomib Drugs 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037828 epithelial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100001039 immunological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000013101 initial test Methods 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- VWBWQOUWDOULQN-UHFFFAOYSA-N nmp n-methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O.CN1CCCC1=O VWBWQOUWDOULQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007838 tissue remodeling Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Wynalazek obejmuje markery diagnostyczne w użyciu jako zestaw diagnostyczny do zastosowania we wczesnej diagnostyki nowotworu nabłonkowego i/lub stanu zapalnego, zawierający związek o wzorze ogólnym ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-X6 i związek o wzorze ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5-pNA gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, X oznacza ANB-NH2 lub pNA, przy czym ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego, pNA oznacza 4-nitroanilinę. Wynalazek obejmuje również sposób diagnozowania i różnicowania nowotworu nabłonkowego i procesu zapalnego w materiale biologicznym ssaka w oparciu o w/w markery.
Description
Przedmiot wynalazku mieści się w dziedzinie diagnostyki stanów zapalnych toczących się in vivo w wyniku reakcji komórek immunologicznych w ognisku zapalnym oraz diagnostyki nowotworów, zwłaszcza nabłonkowych, jak i markerów diagnostycznych procesów zapalnych i markerów diagnostycznych umożliwiających wykrywanie, na wczesnym etapie, rozwój nowotworów nabłonkowych. Wynalazek dotyczy związków do zastosowania medycznego - diagnostycznego - w diagnostyce stanów zapalnych oraz we wczesnej diagnostyce nowotworów nabłonkowych, przy czym związki te używane są jako zestaw diagnostyczny - markery diagnostyczne - do wykrywania procesu patofizjologicznego w materiale biologicznym ssaków, zwłaszcza krwi i moczu człowieka. Wynalazek w związku z tym dotyczy zestawu diagnostycznego zawierającego co najmniej dwa nowe związki - odczynnik diagnostyczny do wykrywania zmian immunologicznych w tym do predykcji rozwoju procesu nowotworzenia z komórek nabłonkowych na bardzo wczesnym etapie rozwoju choroby, nawet przed procesem nowotworzenia, i diagnozowania procesu zapalnego, czy też wykrywania już rozpoczętego procesu nowotworzenia z jednoczesną reakcją zapalną, oraz odczynnik do wykrywania dodatkowych procesów zapalnych przy obecności nowotworu nabłonkowego np. zakażenia bakteryjnego lub wirusowego. Wynalazek dotyczy różnicowania nowotworu nabłonkowego i procesu zapalnego.
Znane są związki i markery diagnostyczne do wykrywania stanu zapalnego jak i procesu nowotworzenia.
Ze względu na fakt, że późno wykryty stan zapalny zmierzający do powstania nowotworu wiąże się ze zmniejszeniem szans na wyleczenie lub wiąże się z trudnościami terapeutycznymi wciąż poszukuje się nowych związków diagnostycznych mogących w sposób jak najbardziej czuły i specyficzny wykryć procesy chorobowe jak w najwcześniejszym etapie procesu patofizjologiczne.
Przedmiotem wynalazku było opracowanie czułego i specyficznego markera diagnostycznego, który umożliwi zdiagnozowanie nowotworu, zwłaszcza nabłonkowego, zwłaszcza raka pęcherza, raka przewodów moczowych, raka cewki moczowej, czy też innych nowotworów, którym towarzyszy podwyższenie aktywności enzymów proteolitycznych, i których to proces chorobowy może być obserwowany w materiale biologicznym, zwłaszcza moczu pacjenta, na bardzo wczesnym etapie chorobotwórczym, czyli nawet na etapie reakcji zapalnej. Nieoczekiwanie okazało się, że opracowane nowe związki zawierające aminokwasy stanowią markery diagnostyczne, które jedynie w obecności enzymów proteolitycznych, które są wynikiem reakcji zapalnej i/lub nowotworu nabłonkowego, i które to enzymy uwalniane są i obecne w materiale biologicznym, wykazują właściwości chromogeniczne i/lub fluorogeniczne mierzone w zakresie fal 300-500 nm, zwłaszcza 380-430. Właściwości barwne są obserwowane podczas hydrolizy enzymatycznej tych związków w materiale biologicznym, zwłaszcza moczu i krwi pacjenta, u którego rozwija się lub już rozwinął się nowotwór nabłonkowy, w tym z towarzyszącym procesem zapalnym czy też rozwinęła się sama odpowiedź zapalna lub odpowiedź zapalna towarzysząca dodatkowo chorobie nowotworowej. W przypadku nowotworów, proces ten wiąże się ze skutkami choroby nowotworowej czyli podwyższeniem aktywności enzymów proteolitycznych guza i okolicznych tkanek wynikających z wielu procesów, do których zalicza się podwyższoną angiogenezę, remodeling tkanek, nekrozę tkanek zdrowych wskutek nacieku nowotworu a także apoptozę komórek nowotworowych. Część związków według wynalazku umożliwia wykrywanie nawet już procesu zapalnego, poprzez również ich hydrolizę, w tym za pomocą uwalnianych enzymów z ogniska zapalnego w trakcie procesu immunologicznego, co wiąże się z wywołaniem reakcji barwnej wykrywanej poprzez pomiar absorbancji w zakresie fal 300-500 nm, zwłaszcza 380-430.
W trakcie badań prowadzonych w Pracowni Analityki i Nanodiagnostyki Biochemicznej Uniwersytetu Gdańskiego przeprowadzono identyfikację związków, które byłyby podatne na zwiększoną aktywność proteolityczną w materiale biologicznym, zwłaszcza ludzkim moczu mających zastosowanie jako markery diagnostyczne nowotworów nabłonkowych i markety diagnostyczne procesów zapalnych, w tym zwłaszcza nowotworu nabłonka układu moczowego. W trakcie badań przeprowadzono badanie eksperymentalne na materiale biologicznym człowieka, w tym moczu osób chorych, u których potwierdzono reakcję zapalną i/lub nowotwory nabłonkowe na różnym etapie rozwoju, jak i moczu osób z wykluczonym stanem zapalnym - grupie kontrolnej.
W wyniku tych badań zostały opracowane związki o sekwencji ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB-NH2, gdzie ABZ to kwas 2-aminobenzoesowy a ANB-NH2 to amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego, ANB to kwas 5-amino-2-benzoesowy, oraz ABZ-Leu-Glu-Pro-VaI-pNA, gdzie pNA to para-nitroanilina. Związki te znajdują zastosowanie jako markery już do wykrywania procesu immunologicznego - odpowiedzi
PL 238 700 B1 immunologicznej jak również markery diagnostyczne nowotworów nabłonkowych. W wyniku badania został opracowany również związek o wzorze ABZ-Met-Lys-Val-Trp-pNA, gdzie ABZ to kwas 2-aminobenzoesowy zaś pNA to para-nitroanilina, które znajdują zastosowanie jako markery do wykrywania nowotworu nabłonkowego. Wykrywany proces zapalny przez związki wymienione jako pierwsze, może być skorelowany również w chwili pojawienia się nowotworu, wokół którego pojawia się stan zapalny. Wykrycie stanu zapalnego może być również przydatne w przypadku zakażenia bakteriami lub wirusami w obecności lub bez obecności nowotworu nabłonkowego.
W obu diagnozowanych przez zaproponowane związki procesach towarzyszy hydroliza enzymatyczna tych markerów - w wyniku uwalniania enzymów w trakcie procesów immunologicznych zachodzących in vivo i/lub enzymów proteolitycznych uwalnianych w wyniku rozwoju nowotworu nabłonkowego. Proces ten obserwuje się poprzez odpowiednio monitoring uwalnianej cząsteczki ANB-NH2 (amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego) lub pNA (p-nitroanilina) przy długości fali 300-400, korzystnie 380-430 nm, czyli hydroliza następuje w pozycji 5 związku - po 5-tym w kolejności aminokwasie.
Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze ogólnym; ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-X6, gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, X to oznacza ANB-NH2 lub pNA, przy czym ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego, ANB - kwas 5-amino-2benzoesowy, a pNA oznacza 4-nitroanilinę.
Przedmiotem wynalazku jest również związek o wzorze: ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5-pNA6, gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, pNA oznacza 4-nitroanilinę.
Przedmiotem wynalazku jest zestaw diagnostyczny do zastosowania we wczesnej diagnostyki nowotworu, zwłaszcza nabłonkowego i/lub stanu zapalnego, i różnicowania nowotworu i stanu zapalnego zawierający co najmniej dwa w/w/ związki - związek o wzorze ogólnym ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5X6 i związek o wzorze ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5-pNA, gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, X oznacza ANB-NH2 lub pNA, przy czym ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego, pNA oznacza 4-nitroanilinę.
Sposób diagnozowania i różnicowania nowotworu nabłonkowego i procesu zapalnego w materiale biologicznym ssaka, charakteryzuje się tym, że jako marker diagnostyczny stosuje się co najmniej jeden związek o wzorze ogólnym ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-X6, który stanowo marker odpowiedzi immunologicznej i dodatkowo nowotworu, oraz związek o wzorze, ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5-pNA, który stanowi marker nowotworu; gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, X oznacza ANB-NH2 lub pNA, przy czym ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego, pNA oznacza 4-nitroanilinę. Związki dodaje się do materiału biologicznego, każdy do osobnej próbki, a następnie dokonuje się pomiaru absorbancji przy długości fali w zakresie od 300 do 500 nm. Wzrost absorbancji wskazuje na wynik pozytywny. Zabarwienie jest wynikiem hydrolizy enzymatycznej związku zwłaszcza w pozycji 5 po piątym z kolei aminokwasie, pod wpływem enzymów proteolitycznych obecnych w materiale biologicznym in vitro w wyniku odpowiedzi immunologicznej i/lub nowotworu in vivo. Czas odczytu absorbancji ustala się w zależności od ilości dodanego związku. Odczyt może nastąpić po około 60 minutach,
Korzystnie, pomiaru absorbancji dokonuje się przy długości fali 380-430 nm.
Część określeń stosowanych powyżej oraz w opisie i zastrzeżeniach patentowych, mają następujące znaczenie:
Nowotwór nabłonkowy - czyli taki, którego komórki wywodzą się z nabłonka gruczołów wydzielania zewnętrznego i wewnętrznego oraz z przewodów tych gruczołów, np. nowotwór nabłonka układu moczowego.
Właściwości chromogeniczne - oznaczają powstawanie produktu barwnego
Właściwości fluorogeniczne oznaczają powstawanie produktu emitującego fluorescencję
NMP - N-metylopirolidon
DMF - dimetyloformamid
DCM - chlorek metylenu pNA - 4-nitroanilina, para-nitroanilina
ABZ - kwas 2-aminobeznoesowy,
ANB-NH2 - amid kwasu 5-amino-2-benzoesowy.
Wynalazek przedstawiono bliżej w przykładach wykonania na rysunku, na którym:
Fig. 1 - przedstawia szybkość hydrolizy substratu ABZ-Leu-Glu-Pro-VaI-ANB-NH2 w próbkach moczu ze zdiagnozowanym nowotworem. Cyfry arabskie oznaczają numer losowo wybranej próbki moczu.
PL 238 700 B1
Fig. 2 - przedstawia szybkość hydrolizy substratu ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-pNA w próbkach moczu ze zdiagnozowanym nowotworem. Cyfry arabskie oznaczają numer losowo wybranej próbki moczu.
Fig. 3 - przedstawia szybkości hydrolizy substratu ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB-NH2 w zależności od obecności inhibitora ludzkiej elastazy neutrofilnej, który to enzym jest markerem stanu zapalnego, w próbce ludzkiego moczu ze stwierdzonym stanem zapalnym i/lub nowotworem nabłonka układu moczowego.
Fig. 4 - przedstawia zależność stopnia hydrolizy substratu ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB NH2 od środowiska pH.
Fig. 5 - przedstawia wydajności hydrolizy substratu ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB NH2 w zależności od stopnia zagęszczenia ludzkiego moczu ze stwierdzonym nowotworem nabłonka układu moczowego.
Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia
P r z y k ł a d 1
Synteza związku ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-ANB-NH26
1. Otrzymanie peptydu chromogenicznego
a) Pierwszym etapem syntezy było otrzymanie peptydu chromogenicznego który otrzymano metodą syntezy w fazie stałej - na nośniku stałym - z wykorzystaniem chemii Fmoc/tBu, czyli z użyciem osłon.
Związek o sekwencji ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-ANB-NH26, gdzie ABZ - oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, a ANB-NH2 to amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego, zaś ANB to kwas 5-amino-2-benzoesowy, otrzymano na drodze syntezy chemicznej w fazie stałej z wykorzystaniem następujących pochodnych aminokwasowych.
Boc-ABZ, Fmoc-Leu, Fmoc-Glu(Trt), Fmoc-Pro, Fmoc-Val, ANB
Syntezę związku czyli markera diagnostycznego do wykrywania nowotworów nabłonkowych, których diagnostyka jest związana z hydrolizą tego związku pod wpływem enzymów proteolitycznych prowadzono na nośniku stałym umożliwiającym przekształcenie kwasu 5-amino-2-beznoesowego w amid ANB-NH2:
- np. żywicy amidowej np. TentaGel S RAM firmy RAPP Polymere (Niemcy) np. o osadzeniu 0,23 mmol/g.
Możliwe jest zastosowanie innej dostępnej handlowo żywicy amidowej, w tym... Rink Amide (Niemcy).
Syntezę związku prowadzono w sposób manualny z zastosowaniem wytrząsarki laboratoryjnej, Przez większość etapów reaktorami była strzykawka zakończona spiekiem do syntezy w fazie stałej o pojemności 25 ml.
Wszystkie otrzymywane końcowe związki zawierały w swojej sekwencji w pozycji 1 czyli na N-końcu kwas 2-aminobenzoesowy - ABZ i w pozycji 6: cząsteczkę kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego ANB na C-końcu. ABZ pełni rolę donora fluorescencji, natomiast ANB - kwas 5-amino-2-benzoesowy pełni rolę wygaszacza fluorescencji i jednocześnie chromoforu. Peptydy w swojej sekwencji zawierały co najmniej i korzystnie jedno miejsce reaktywne zlokalizowane pomiędzy resztami aminokwasowymi Val-ANB-NH2: w pozycji 5 związku. Syntezę polegającą na przyłączaniu pochodnych aminokwasowych prowadzi się od reszty 6 do 1, czyli od końca C do N.
b) Osadzenie ANB na żywicy TentaGel S RAM:
Syntezę peptydów wykonano na żywicy TentaGel S RAM firmy Rapp Polymere o osadzeniu 0,23 mmol/g. W pierwszym etapie przygotowano żywicę, w tym dokonano spulchnienia żywicy poprzez cykl przemywań. Kolejno przystąpiono do usunięcia z nośnika osłony grupy aminowej Fmoc - za pomocą 20% roztworu piperydyny w NMP.
Następnie przeprowadzono cykl przemywań rozpuszczalnikami. W celu potwierdzenia obecności wolnych grup aminowych wykonano test chloranilowy.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 1 x 10 minut
IsOH 1 x 10 minut
DCM 1 x 10 minut
Usunięcie osłony Fmoc :
DMF 1 x 5 minut
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty
20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut
PL 238 700 B1
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty
IsOH 3 x 2 minuty
DCM 3 x 2 minuty
c) Test chloranilowy:
Test chloranilowy polegał na przeniesieniu za pomocą łopatki, kilku ziaren żywicy z reaktora strzykawki do szklanej ampułki, do której następnie dodano 100 pl nasyconego roztworu p-chloranilu w toluenie i 50 pl świeżego aldehydu octowego. Po upływie 10 minut przeprowadzono kontrolę zabarwienia ziaren.
Na tym etapie po przeprowadzeniu testu otrzymano zielone zabarwienie ziaren, które świadczyło o obecności wolnych grup aminowych. Po potwierdzeniu usunięcia osłon 9-fluorenylometoksykarbonylowych z żywicy można było przystąpić do kolejnego etapu, przyłączania pochodnej ANB (kwasu 5-amino-2-nitrobenozesowego)
d) Osadzenie kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego na nośniku stałym
Pierwszym etapem syntezy biblioteki peptydowej - mieszaniny peptydów, było osadzenie ANB na 1 g żywicy. Przed przyłączeniem chromoforu przemyto żywicę używaną do reakcji następującymi rozpuszczalnikami: DMF, DCM i ponownie DMF, po czym usunięto osłonę Fmoc- z grupy funkcyjnej nośnika. Jeden cykl usuwania osłony Fmoc- obejmował następujące etapy:
Usunięcie osłony Fmoc-:
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty
20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut
e) Przemywanie
DMF 3 x 2 minuty
IsOH 3 x 2 minuty
DCM 3 x 2 minuty
f) Test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych
Żywicę z wolną grupą aminową przemyto 5% roztworem N-metylomorfoliny (NMM) w DMF, a następnie DMF. Procedurę usuwania osłony Fmoc- oraz cykl przemywań przeprowadzono w naczynku Merrifielda. W osobnej kolbie rozpuszczono ANB w DMF i dodano kolejno TBTU, DMAP, a na koniec diizopropyloetyloaminę (DIPEA) w następujących nadmiarach w stosunku do osadzenia polimeru: ANB/TBTU/DMAP/DIPEA, 3:3:2:6. Tak przygotowaną mieszaninę dodano do żywicy i mieszano przez 3 godziny. Żywicę odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem, przemyto DMF, DCM i izopropanolem, a całą procedurę acylowania powtórzono dwa razy. Do przeprowadzenia kolejnych reakcji przyłączania ANB do żywicy zastosowano heksafluorofosforan-O -(7-azabenzotriazoI-1-yl)-N,N,N',N'-tetramelylouroniowy (HATU), a potem heksafluorofosforan-O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'’-tetrametylouroniowy (HBTU). W ostatnim etapie żywicę przemyto kolejno DMF, DCM oraz izopropanolem i suszono na powietrzu.
g) Przyłączenie C-końcowej reszty1 aminokwasowej do ANB
Odpowiednią pochodną aminokwasową (9-krotny nadmiar molowy w stosunku do osadzenia żywicy) rozpuszczono w pirydynie i przeniesiono do kolby zawierającej żywicę z osadzonym ANB. Całość chłodzono do uzyskania temperatury -15°C (łaźnia lodowa: 1 cz. wagowa NH4CI, 1 cz. wagowa NaNOs, 1 cz. wagowa lodu). Po osiągnięciu żądanej temperatury dodano POCh (w stosunku 1:1 do użytej ilości pochodnej aminokwasowej) i całość mieszano na mieszadle magnetycznym: 20 minut w -15°C, 30 minut w temperaturze pokojowej oraz 6 godzin w 40°C (łaźnia olejowa). Po zakończeniu reakcji żywicę odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem, przemyto DMF oraz MeOH i zostawiono do wysuszenia.
W kolejnym etapie przyłączono resztę w pozycji P2 (prolinę)
Wszystkie przyłączania reszt aminokwasowych poprzedzono przemywaniem żywicy za pomocą DMF przez 5 minut. W kolejnych przyłączaniach stosowano diisopropylokarbodiimid jako środek sprzęgający. Procedurę powtarzano dwukrotnie.
Po każdym z acylowań rozpoczynano cykl przemywań żywicy, a następnie wykonywano test chloranilowy, w celu monitorowania przyłączania pochodnej aminokwasowej do wolnych grup aminowych żywicy.
PL 238 700 B1
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty
IsOH 3 x 2 minuty
DCM 3 x 2 minuty
Test chloranilowy:
W wyniku przeprowadzonych testów po dwóch pierwszych sprzęganiach zabarwienie ziaren najpierw było zielone, a następnie szare, więc konieczne było przeprowadzenie kolejnego acylowania, w wyniku którego ziarna żywicy badanej testem chloranilowym były bezbarwne. Świadczyło to przyłączeniu ANB do żywicy TentaGel S RAM, co pozwoliło przejść do następnego etapu syntezy peptydu.
h) Przyłączanie kolejnych chronionych reszt aminokwasowych:
Żywicę wraz z przyłączoną resztą ANB znajdującą się w reaktorku przemyto za pomocą DMF, a następnie przystąpiono do deprotekcji osłony Fmoc z grupy aminowej w celu przyłączenia chronionej pochodnej aminokwasowej glicyny.
Usunięcie osłony Fmoc :
DMF 1 x 5 minut
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty
20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty
IsOH 3 x 2 minuty
DCM 3 x 2 minuty
Test chloranilowy:
W wyniku przeprowadzenia testu chloranilowego otrzymano wynik pozytywny, o czym świadczyło zielone zabarwienie ziaren żywicy. Pozwoliło to na rozpoczęcie kolejnego etapu - przyłączania reszty aminokwasowej Fmoc-Glu(Trt)-OH.
Przyłączanie pochodnej aminokwasowej:
Wykonywane sprzęgania poprzedzono przemywaniem żywicy w DMF. Podczas przyłączania chronionej reszty kwasu glutaminowego skład mieszaniny sprzęgającej pozostawał bez zmian.
Po zakończeniu każdego z acylowań stosowano cykl przemywań rozpuszczalnikami według podanej procedury, a następnie przeprowadzono test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych w roztworze.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty
IsOH 3 x 2 minuty
DCM 3 x 2 minuty
Test chloranilowy:
Ziarna żywicy podczas testu przeprowadzonego po drugim acylowaniu były bezbarwne, co pozwoliło na przejście do kolejnego etapu syntezy, jakim było wprowadzenie kolejnej chronionej pochodnej aminokwasowej - leucyny i cząsteczki kwasu 2-aminobenzoesowego. Procesy sprzęgania odbyły się zgodnie z procedurą omówioną wcześniej.
Testy przeprowadzone po przyłączeniu wyżej wymienionych reszt wykazały wyniki pozytywne, ziarna żywicy były bezbarwne.
2. Usuwanie peptydu z nośnika
Po zakończeniu syntezy amid peptydu ABZ-Leu-GIu-Pro-Val-ANB-NH2 usunięto z nośnika wraz z jednoczesnym usunięciem osłon bocznych za pomocą mieszaniny: TFA : fenol : woda : TIPS (88 : 5 : 5 : 2, v/v/v/v) w kolbie okrągłodennej na mieszadle magnetycznym.
Po upływie 3 godzin zawartość kolby odsączyło się pod zmniejszonym ciśnieniem na lejkach ze spiekiem Schotta przemywając eterem dietylowym. Powstały osad odwirowano na wirówce SIGMA 2K30 (Laboratory Centrifuges) w czasie 20 minut. Osad otrzymany po wirowaniu rozpuszcza się w wodzie przy pomocy ultradźwięków, a następnie poddano liofilizacji.
Tożsamość/charakterystyka nowego związku - analiza HPLC, MS
HPLC warunki: kolumna RP Bio Wide Pore Supelco C8 250 mm 4 mm, układ faz A 0,1% TFA w wodzie, B: 80% acetonitrylu w A), przepływ 1 ml/min, detekcja UV przy 226 nm. Potwierdzono otrzymanie związku.
PL 238 700 B1
P r z y k ł a d 2
Otrzymywanie związku o wzorze związku ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-pNA6.
Proces prowadzi się w podobny sposób jak opisano w przykładzie 1 z tym, że wykorzystuje się odpowiednie pochodne aminokwasowe i dodatkowe podstawniki i proces przeprowadza się częściowo w roztworze częściowo na nośniku stałym.
Otrzymanie p-nitroanilidu Val
a. Pierwszym etapem syntezy było otrzymanie chronionego peptydu, który otrzymano metodą syntezy w fazie stałej z wykorzystaniem chemii Fmoc/tBu
Związek ABZ1-Leu2-Glu(OtBu)3-Pro4-OH, gdzie ABZ- oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, otrzymano na drodze syntezy chemicznej w fazie stałej z wykorzystaniem następujących pochodnych aminokwasowych:
Boc-ABZ, Fmoc-Leu, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Pro.
Syntezę związku prowadzono na nośniku stałym:
- żywica 2-chloro-chlorotytylowa np. firmy Iris BIOTECH GMBH (Niemcy) o osadzeniu grup 1,6 mmoli Cl/g
Syntezę związku prowadzono manualnie z zastosowaniem wytrząsarki laboratoryjnej. Przez wszystkie etapy reaktor stanowiła strzykawka zakończona spiekiem do syntezy w fazie stałej o pojemności 25 ml.
Syntezę peptydów wykonano na nośniku: żywicy 2-chloro-chlorotytylowa np. firmy Iris BIOTECH GMBH (Niemcy) o osadzeniu grup 1,6 mmol Cl/g. W pierwszym etapie dokonano spulchnienia żywicy poprzez cykl przemywań. Kolejno przystąpiono do usunięcia z nośnika osłony grupy aminowej Fmoc za pomocą 20% roztworu piperydyny w NMP. Następnie przeprowadzono cykl przemywań rozpuszczalnikami. W celu potwierdzenia obecności wolnych grup aminowych wykonano test chloranilowy.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 1x10 minut
IsOH 1 x 10 minut
DCM 1x10 minut
Usunięcie osłony Fmoc :
DMF 1 x 5 minut
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty
20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty
IsOH 3 x 2 minuty
DCM 3 x 2 minuty
b) Test chloranilowy:
Test chloranilowy polegał na przeniesieniu za pomocą łopatki, kilku ziaren żywicy z reaktora - strzykawki do szklanej ampułki, do której następnie dodano 100 μl nasyconego roztworu p-chloranilu w toluenie i 50 μl świeżego aldehydu octowego. Po upływie 10 minut przeprowadzono kontrolę zabarwienia ziaren.
Na tym etapie po przeprowadzeniu testu otrzymano zielone zabarwienie ziaren, które świadczyło o obecności wolnych grup aminowych. Po potwierdzeniu usunięcia osłon 9-fluorenylometoksykarbonylowych z żywicy można było przystąpić do kolejnego etapu, przyłączania pochodnej Fmoc-Pro.
b. Osadzenie Fmoc-Pro na nośniku stałym
Pierwszym etapem syntezy biblioteki peptydowej było osadzenie Fmoc-Pro na 1 g żywicy. Przed przyłączeniem pochodnej aminokwasowej przemyto żywicę używaną do reakcji następującymi rozpuszczalnikami: DMF (dimetyloformamid), DCM (chlorek metylenu) i ponownie DMF, po czym usunięto osłonę Fmocz grupy funkcyjnej nośnika. Jeden cykl usuwania osłony Fmoc- obejmował następujące etapy:
Usunięcie osłony Fmoc-:
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty
20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut
Przemywanie
DMF 3x2 minuty
IsOH 3 x 2 minuty
DCM 3x 2 minuty
Test chloranilowy na obecność wolnych grap aminowych.
PL 238 700 B1
Żywicę z wolną grupą aminową przemyto DMF. W osobnej kolbie rozpuszczono Fmoc-Pro w DMF i dodano kolejno TBTU, DMAP, a na koniec diizopropyloetyloaminę (DDPEA) w następujących nadmiarach w stosunku do osadzenia polimeru: Fmoc-Pro/TBTU/DMAP/DIPEA, 3:3:2:6. Tak przygotowaną mieszaninę dodano do żywicy i mieszano przez 3 godziny. Żywicę odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem, przemyto DMF, DCM i izopropanolem, a całą procedurę acylowania powtórzono dwa razy. Do przeprowadzenia kolejnych reakcji przyłączania Fmoc-Pro do żywicy zastosowano heksafluorofosforan-O -(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N'N'-tetrametylouroniowy (HATU), a potem heksafluorofosforanO-(benzotriazol-1-yl) N,N,N'N'-tetrametylouroniowy (HBTU). W ostatnim etapie żywicę przemyto kolejno DMF, DCM oraz izopropanolem i suszono na powietrzu.
c. Przyłączanie kolejnych chronionych reszt aminokwasowych:
Żywicę wraz z przyłączoną resztą Fmoc-Pro znajdującą się w reaktorku przemyto za pomocą DMF, a następnie przystąpiono do deprotekcji osłony Fmoc z grupy aminowej w celu przyłączenia chronionej pochodnej aminokwasowej kwasu glutaminowego.
Usunięcie osłony Fmoc :
DMF 1 x 5 minut
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty
20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty
IsOH 3 x 2 minuty
DCM 3 x 2 minuty
Test chloranilowy:
W wyniku przeprowadzenia testu chloranilowego otrzymano wynik pozytywny, o czym świadczyło zielone zabarwienie ziaren żywicy. Pozwoliło to na rozpoczęcie kolejnego etapu - przyłączania reszty aminokwasowej Fmoc-GIu(OtBu)-OH.
Przyłączanie pochodnej aminokwasowej:
Wykonywane sprzęgania poprzedzono przemywaniem żywicy w DMF. Podczas przyłączania chronionej reszty kwasu glutaminowego skład mieszaniny sprzęgającej pozostawał bez zmian.
Po zakończeniu każdego z acylowań stosowano cykl przemywań rozpuszczalnikami według podanej procedury, a następnie przeprowadzono test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych w roztworze.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty
IsOH 3 x 2 minuty
DCM 3 x 2 minuty
Test chloranilowy:
Ziarna żywicy podczas testu przeprowadzonego po drugim acylowaniu były bezbarwne, co pozwoliło na przejście do kolejnego etapu syntezy, jakim było wprowadzenie kolejnej chronionej pochodnej aminokwasowej - leucyny i cząsteczki kwasu 2-aminobenzoesowego. Procesy sprzęgania odbyły się zgodnie z procedurą omówioną wcześniej.
Testy przeprowadzone po przyłączeniu wyżej wymienionych reszt wykazały wyniki pozytywne, ziarna żywicy były bezbarwne.
d. Usuwanie peptydu z nośniku z zachowaniem osłon grup bocznych
Po zakończeniu syntezy chroniony peptyd ABZ-Leu-Glu(OtBu)-Pro-OH usunięto z nośnika wraz z zachowaniem osłon bocznych za pomocą mieszaniny: kwas octowy: TFE (trifluoroetanoI):DCM (2:2:6, v/v/v) w kolbie okrągłodennej na mieszadle magnetycznym.
Po upływie 2 godzin zawartość kolby odsączyło się pod zmniejszonym ciśnieniem na lejkach ze spiekiem Schotta przemywając mieszaniną ściągającą. Roztwór przemyto heksanem (1:10 v/v), odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie poddano liofilizacji.
e. Chemiczna synteza pochodnych paranitroanilidu Val
Do syntezy Fmoc-Val-pNA wykorzystano metodę mieszanych bezwodników. W pierwszym etapie 2 mmole Fmoc-Val rozpuszczono w bezwodnym tetrahydrofuranie (THF) w obecności 2 mmoli N-metylomorfoliny (NMM). Grupa karboksylowa pochodnej aminokwasowej była aktywowana 2 mmolami chlorku izobutylu. Po 10 minutach aktywacji dodano 3 mmmole p-nitroaniliny. Reakcje
PL 238 700 B1 prowadzono przez 2 godziny w temperaturze -15°C, a następnie dobę w temperaturze pokojowej. Po skończonej reakcji rozpuszczalnik odparowano, a suchą pozostałość rozpuszczono w octanie etylu. Otrzymany roztwór przemywano kolejno nasyconym wodnym roztwo rem NaCI, 10% kwasem cytrynowym, 5% wodorowęglanem sodu. Otrzymany roztwór wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, octan etylu oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a suchą pozostałość suszono w eksykatorze próżniowym nad P2O5 i KOH.
f. Sprzęganie chronionego peptydu z paranitroanilidem Val
Chroniony peptyd ABZ1-Leu2-Glu(OtBu)3-Pro4-OH rozpuszczono w niewielkiej ilości DCM, kolejno aktywowano za pomocą TFFH (tetrametylofluoroformamid) przez 30 minut w temperaturze 0°C, Następnie dodano katalityczną ilość DMAP oraz Fmoc-Val-pNA. Reakcję prowadzono przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, po czym odparowano rozpuszczalnik. Otrzymany roztwór zalano mieszaniną ściągającą osłony boczne: TFA : fenol : woda : TIPS (88 : 5 : 5 : 2, v/v/v/v) i mieszano w kolbie okrągłodennej na mieszadle magnetycznym przez 3 godziny.
Po tym czasie do kolby dodano zimny eter dietylowy, a powstały osad odwirowano na wirówce SIGMA 2K30 (Laboratory Centrifuges) w czasie 20 minut. Osad otrzymany po wirowaniu rozpuszcza się w wodzie przy pomocy ultradźwięków, a następnie poddano liofilizacji.
Tożsamość/charakterystyka nowego związku - analiza HPLC, MS
HPLC warunki : kolumna RP Bio Wide Pore Supelco C8 250 mm 4 mm, układ faz A 0,1% TFA w wodzie. B: 80% acetonitrylu w A), przepływ 1 ml/min, detekcja UV przy 226 nm.
Potwierdzono otrzymanie związku.
P r z y k ł a d 3
Badanie zastosowania nowych związków otrzymanych według przykładu 1 i 2 w diagnostyce stanów zapalnych i diagnostyce nowotworów nabłonkowych.
Badanie wykonano, na grupie 130 chorych - nowotwory nabłonkowe / stan zapalny, 430 osób bez choroby nowotworowej w postaci kontroli.
Inkubacja związku o strukturze ABZ-Leu-GIu-Pro-Val-ANB-NH2 / ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-pNA w niżej opisanych warunkach;
- 80 gl moczu pacjentów z diagnozą nowotworu nabłonka układu moczowego lub mocz od grupy kontrolnej
- 100 gl buforu (50 mM Tris-HCl, pH 8.3)
- 20 gl substratu ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB NH2 -NH2 (0,5 mg/ml DMSO - dimetylosulfotle- nek) lub ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-pNA (0,5 mg/ml DMSO - dimetylosulfotlenek)
- Czas inkubacji 60 minut
- Temperatura 37°C
Przeprowadzono również badanie zastosowania markera diagnostycznego otrzymanego według przykładu 1 lub 2 do wykrywania stanu zapalnego. W tym celu marker dodawano do moczu ze zdiagnozowanym stanem zapalnym, potwierdzonym wykryciem markera, stanu zapalnego jakim jest elastaza neutrofilna. W wyniku badań wykazano, że marker ten może zostać zastosowany jako marker stanu zapalnego, jak również marker stanu zapalanego i nowotworu nabłonkowego, w przypadku obecności i nowotworu i potwierdzonego stanu zapalenia. W obu przypadkach obserwowano zabarwienie - odczyt absorbancji przy długości fali około 410 nm - w zakresie 380-430 nm.
W wyniku inkubacji otrzymano następujące wyniki, których przykłady przedstawiono i opisano poniżej.
Przeprowadzono również badania użycia tych związków do wykrywania stanu zapalnego i nowotworu nabłonkowego w próbkach krwi pacjentów z rozpoznanym stanem zapalnym / nowotworem nabłonkowym. Proces pomiaru absorbancji przeprowadza się w analogiczny sposób jak opisano dla próbek moczu. Wstępne wyniki badań potwierdzają ich zastosowanie diagnostyczne również dla tego materiału biologicznego - osocza lub surowicy.
PL 238 700 Β1
Analiza HPLC:
Substrat ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB NH2 w buforze o składzie 50 mM Tris-HCl, pH 8.3
ABZ-Leu-Glu-Pro-Voi-ANB-NH, t =22.89
Hydroliza substratu ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB NH2 w moczu ze zdiagnozowanym nowotworem nabłonka układu moczowego Próbka moczu z substratem
Aktywność proteolityczna enzymów obecnych w badanym materiale biologicznym (próbki moczu ze zdiagnozowanym nowotworem) jest proporcjonalna do intensywności obserwowanego sygnału absorbancji, uwalnianego w wyniku hydrolizy wiązania peptydowego ANB. Analiza potwierdziła, że w przypadku badanych próbek hydroliza substratu ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-ANB-NH26 następuje w pozycji 5, gdzie otrzymujemy ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5 oraz ANB-NH26. Analogicznemu procesowi ulega związek ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-pNA6 który uwalnia wolną cząsteczkę pNA i fragment ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-OH.
Z wykresu - Fig. 1 odczytać możemy, że w przypadku próbek 148, 305, i 233 rozpad substratu ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB-NH2 zachodzi wydajniej niż w przypadku materiałów 89, 42 czy 117. Taki rezultat może być spowodowany różnicą w aktywności, jak i ilości enzymów odpowiedzialnych za proteolizę. Identyczny obraz otrzymujemy przy zastosowaniu substratu ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-pNA - Fig.2.
PL 238 700 Β1
Tabela. Rodzaje inhibitorów, mechanizm ich działania oraz zastosowane stężenie efektywne
| Inhibitor | Rodzaj inhibitora | Klasa hamowanych enzymów | Steżenie [M] |
| Carfilzomib | Nieodwracalny | proteinazy treoninowe (aktywność chymotrypsyno w a ludzkiego proteasomu 20S) | 1,000 X 10'“ |
| AHK-WDnY^CiHjClh | nieodwracalny | proteinazy serynowe | 4,625 χ 10'4 |
| Bt-Nl(OBzl)YDAF(C4H2CI)2 | nieodwracalny | proteinazy serynowe | 3,215 χ 10‘4 |
| E-64 | nieodwracalny | proteinazy cysteinowe | 3,495 χ 10'4 |
Aktywność proteolityczna jest zależna od obecności określonych związków nazywanych inhibitorami (enzymów proteolitycznych). Ich inkubacja z danym materiałem biologicznym pozwala nam wstępnie określić klasę enzymów obecnych w badanych próbkach. W tym celu do połączonych próbek moczu osób chorych (nowotwór nabłonka układu moczowego) dodaliśmy efektywne stężenia hamujące określone klasy enzymów proteolitycznych. Wynik tego eksperymentu przedstawia.
Na aktywność enzymatyczną wpływa wiele czynników, spośród których jednym jest pH środowiska reakcji. Przeprowadzony eksperyment może wskazywać, że w badanym moczu znajdują się enzymy preferujące odmienne warunki. Obserwujemy jedno maksimum aktywności proteolitycznej, co sugeruje na obecność proteinaz przeprowadzających hydrolizę w warunkach zasadowych (fig. 3).
Użycie inhibitorów różnych klas enzymów nie spowodowało spadku aktywności proteolitycznej. Jedynie inkubacja moczu z AHX-VYDnVpQ(C4H2CI)2 skutkowała całkowitym wyhamowaniem hydrolizy (fig. 4). Taki wynik mógłby sugerować obecność proteinaz serynowych, a dokładniej tych o specyficzności elastazowej. Wykonaliśmy dodatkowy eksperyment, który potwierdził, ze stosowany przez nas związek ABZ-Leu-Glu-PrO-Val-ANB-NH2 jest hydrolizowany przez elastazę, podczas gdy proteinaza 3 nie powoduje proteolizy. Obserwowana aktywność może świadczyć o stanie zapalnym towarzyszącym chorobie nowotworowej, jako że elastaza jest uwalniana przez neutrofile jako odpowiedź immunologiczna na stan zapalny. Carfizomib także w pewnym stopniu hamuje proteolizę, stąd nasuwa się wniosek, że za aktywność enzymatyczną w moczu osób ze zdiagnozowaną chorobą nowotworową pęcherza moczowego odpowiadają) enzym(y) należący(e) do innego rodzaju niż wymienione w powyższej tabeli.
Aby zwiększyć czułość metody detekcji otrzymany materiał biologiczny (ludzki mocz ze stwierdzonym nowotworem nabłonka układu moczowego) został zagęszczony. W tym celu użyto kolumn filtracyjnych Amicon. W wyniku tego procesu otrzymaliśmy czterokrotnie krotnie zagęszczony materiał o aktywności około 2 krotnie wyższej niż materiał wyjściowy (fig. 5). Fakt liniowej odpowiedzi na wzrastające stężenie enzymu potwierdza selektywność otrzymanego przez nas związku.
Podsumowanie
Analiza potwierdziła zastosowanie związków według przykładu 1 i 2 w diagnostyce stanów zapalnych i w diagnostyce nowotworu nabłonkowego. Wstępne wyniki wskazują, że związki te mogą mieć zastosowanie do rozpoznania stanu zapalnego - odpowiedzi immunologicznej, który towarzyszy nowotworowi nabłonkowego jak również do rozpoznania dodatkowego stanu zapalnego np. wywołanego zakażeniem które towarzyszy nowotworowi lub przy braku obecności nowotworu, czyli rozpoznania samej odpowiedzi immunologicznej, która np. może prowadzić do procesu chorobowego w tym nowotworzenia.
Mechanizm działania nowych związków - markerów diagnostycznych według wynalazku polega na hydrolizie enzymatycznej w takim miejscu peptydu, w wyniku czego uwalnia się ANB-NH2 - amid kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego lub pNA, który wykazuje absorbancję przy długości fali 300-500 nm, zwłaszcza 380-430 nm.
Przykład 4
Otrzymywanie związku ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5-pNA6 gdzie:
ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, pNA oznacza 4-nitroanilinę.
PL 238 700 B1
Proces prowadzi się analogicznie do przykładu 2 i podobnie do przykładu 1, stosując odpowiednie inne pochodne aminokwasowe niż w przykładzie 2 i 1.
Otrzymanie p-nitroanilidu Trp
a. Pierwszym etapem syntezy było otrzymanie chronionego peptydu, który otrzymano metodą syntezy w fazie stałej z wykorzystaniem chemii Fmoc/tBu
Związek ABZ1-Mer2-Lys(Boc)3-Val4-OH, gdzie ABZ - oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, otrzymano na drodze syntezy chemicznej w fazie stałej z wykorzystaniem następujących pochodnych aminokwasowych:
Boc-ABZ, Fmoc-Met, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val.
Syntezę związku prowadzono na nośniku stałym:
- żywica 2-chloro-chlorotytylowa np. firmy Iris BIOTECH GMBH (Niemcy) o osadzeniu grup 1,6 mmol Cl/g
Syntezę związku prowadzono manualnie z zastosowaniem wytrząsarki laboratoryjnej . Przez wszystkie etapy reaktor stanowiła strzykawka zakończona spiekiem do syntezy w fazie stałej o pojemności 25 ml.
Syntezę peptydów wykonano na żywicy 2-chloro-chlorotytylowa firmy Iris BIOTECH GMBH (Niemcy) o osadzeniu grup 1,6 mmol Cl/g. W pierwszym etapie dokonano spulchnienia żywicy poprzez cykl przemywań. Kolejno przystąpiono do usunięcia z nośnika osłony grupy aminowej Fmoc - za pomocą 20% roztworu piperydyny w NMP. Następnie przeprowadzono cykl przemywań rozpuszczalnikami. W celu potwierdzenia obecności wolnych grup aminowych wykonano test chloranilowy.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 1 x 10 minut
IsOH 1 x 10 minut
DCM 1 x 10 minut
Usunięcie osłony Fmoc :
DMF 1 x 5 minut
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty
20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty
IsOH 3 x 2 minuty
DCM 3 x 2 minuty
b) Test chloranilowy:
Test chloranilowy polegał na przeniesieniu za pomocą łopatki, kilku ziaren żywicy z reaktora strzykawki do szklanej ampułki, do której następnie dodano 100 μl nasyconego roztworu p-chloranilu w toluenie i 50 μl świeżego aldehydu octowego. Po upływie 10 minut przeprowadzono kontrolę zabarwienia ziaren.
Na tym etapie po przeprowadzeniu testu otrzymano zielone zabarwienie ziaren, które świadczyło o obecności wolnych grup aminowych. Po potwierdzeniu usunięcia osłon 9-fluorenylometoksykarbonylowych z żywicy można było przystąpić do kolejnego etapu, przyłączania pochodnej Fmoc-Val.
b. Osadzenie Fmoc-Val na nośniku stałym
Pierwszym etapem syntezy biblioteki peptydowej było osadzenie Fmoc-Val na1 g żywicy. Przed przyłączeniem pochodnej aminokwasowej przemyto żywicę używaną do reakcji następującymi rozpuszczalnikami: DMF (dimetyloformamid), DCM (chlorek metylenu) i ponownie DMF, po czym usunięto osłonę Fmoc- z grupy funkcyjnej nośnika. Jeden cykl usuwania osłony Fmoc- obejmował następujące etapy:
Usunięcie osłony Fmoc:
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty
20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut
Przemywanie
DMF 3 x 2 minuty
IsOH 3 x 2 minuty
DCM 3 x 2 minuty
Test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych.
PL 238 700 B1
Żywicę z wolną grupą aminową przemyto DMF. W osobnej kolbie rozpuszczono Fmoc-Pro w DMF i dodano kolejno TBTU, DMAP, a na koniec diizopropyloetyloaminę (DIPEA) w następujących nadmiarach w stosunku do osadzenia polimeru: Fmoc-Pro/TBTU/DMAP/DIPEA, 3:3:2:6. Tak przygotowaną mieszaninę dodano do żywicy i mieszano przez 3 godziny. Żywicę odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem, przemyto DMF, DCM i izopropanolem, a całą procedurę acylowania powtórzono dwa razy. Do przeprowadzenia kolejnych reakcji przyłączania Fmoc-Pro do żywicy zastosowano heksafluorofosforan-O -(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetrametylouroniowy (HATU), a potem heksafluorofosforan- O -(berizotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetrametylouroniowy (HBTU). W ostatnim etapie żywicę przemyto kolejno DMF, DCM oraz izopropanolem i suszono na powietrzu.
c. Przyłączanie kolejnych chronionych reszt aminokwasowych:
Żywicę wraz z przyłączoną resztą Fmoc-Val znajdującą się w reaktorku przemyto za pomocą DMF, a następnie przystąpiono do deprotekcji osłony Fmoc z grupy aminowej w celu przyłączenia chronionej pochodnej aminokwasowej kwasu glutaminowego.
Usunięcie osłony Fmoc:
DMF 1 x 5 minut
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty
20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty
IsOH 3 x 2 minuty
DCM 3 x 2 minuty
Test chloranilowy:
W wyniku przeprowadzenia testu chloranilowego otrzymano wynik pozytywny, o czym świadczyło zielone zabarwienie ziaren żywicy. Pozwoliło to na rozpoczęcie kolejnego etapu - przyłączania reszty aminokwasowej Fmoc-Lys(Boc)-OH.
Przyłączanie pochodnej aminokwasowej :
Wykonywane sprzęgania poprzedzono przemywaniem żywicy w DMF. Podczas przyłączania chronionej reszty kwasu glutaminowego skład mieszaniny sprzęgającej pozostawał bez zmian.
Po zakończeniu każdego z acylowań stosowano cykl przemywań rozpuszczalnikami według podanej procedury, a następnie przeprowadzono test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych w roztworze.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty
IsOH 3 x 2 minuty
DCM 3 x 2 minuty
Test chloranilowy:
Ziarna żywicy podczas testu przeprowadzonego po drugim acylowaniu były bezbarwne, co pozwoliło na przejście do kolejnego, etapu syntezy, jakim było wprowadzenie kolejnej chronionej pochodnej aminokwasowej - metioniny i cząsteczki kwasu 2-aminobenzoesowego. Procesy sprzęgania odbyły się zgodnie z procedurą omówioną wcześniej.
Testy przeprowadzone po przyłączeniu wyżej wymienionych reszt wykazały wyniki pozytywne, ziarna żywicy były bezbarwne.
d. Usuwanie peptydu z nośniku z zachowaniem osłon grup bocznych
Po zakończeniu syntezy chroniony peptyd ABZ-Met-Lys(Boc)-Val-OH usunięto z nośnika wraz z zachowaniem osłon bocznych za pomocą mieszaniny; kwas octowy: TFE (trifluoroetanol) : DCM (2:2:6. v/v/v) w kolbie okrągłodennej na mieszadle magnetycznym.
Po upływie 2 godzin zawartość kolby odsączyło się pod zmniejszonym ciśnieniem na lejkach ze spiekiem Schotta przemywając mieszaniną ściągającą. Roztwór przemyto heksanem (1:10 v/v), odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie poddano liofilizacji.
e. Chemiczna synteza pochodnych paranitroanilidu Trp
Do syntezy Fmoc-Trp-pNA wykorzystano metodę mieszanych bezwodników. W pierwszym etapie 2 mmole Fmoc-Trp rozpuszczono w bezwodnym tetrahydrofuranie (THF) w obecności 2 mmoli N-metylomorfoliny (NMM). Grupa karboksylowa pochodnej aminokwasowej była aktywowana 2 mmolami chlorku izobutylu. Po 10 minutach aktywacji dodano 3 mmmole p-nitroaniliny. Reakcje prowadzono
PL 238 700 B1 przez 2 godziny w temperaturze -15°C, a następnie dobę w temperaturze pokojowej. Po skończonej reakcji rozpuszczalnik odparowano, a suchą pozostałość rozpuszczono w octanie etylu. Otrzymany roztwór przemywano kolejno nasyconym wodnym roztworem NaCI, 10% kwasem cytrynowym, 5% wodorowęglanem sodu. Otrzymany roztwór wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, octan etylu oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a suchą pozostałość suszono w eksykatorze próżniowym nad P2O5 i KOH.
f. Sprzęganie chronionego peptydu z paranitroanilidem Trp
Chroniony peptyd ABZ1-Met2-Lys(Boc)3-Val4-OH rozpuszczono w niewielkiej ilości DCM, kolejno aktywowano za pomocą TFFH (tetrametylofluoroformamid) przez 30 minut w temperaturze 0°C. Następnie dodano katalityczną ilość DMAP oraz Fmoc-Trp-pNA. Reakcję prowadzono przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, po czym odparowano rozpuszczalnik. Otrzymany roztwór zalano mieszaniną ściągającą osłony boczne: TFA : fenol : woda : TIPS (88:5:5:2, v/v/v/v) i mieszano w kolbie okrągłodennej na mieszadle magnetycznymi przez 3 godziny.
Po tym czasie do kolby dodano zimny eter dietylowy, a powstały osad odwirowano na wirówce SIGMA 2K30 (Laboratory Centrifuges) w czasie 20 minut. Osad otrzymany po wirowaniu rozpuszcza się w wodzie przy pomocy ultradźwięków, a następnie poddano liofilizacji.
Tożsamość/charakterystyka nowego związku - analiza HPLC, MS
HPLC warunki: kolumna RP Bio Wide Pore Supelco C8 250 mm 4 mm, układ faz A 0,1% TFA w wodzie, B: 80% acetonitrylu w A), przepływ 1 ml/min, detekcja LTV przy 226 nm. Potwierdzono otrzymanie związku.
P r z y k ł a d 5
Zastosowanie związku otrzymanego według przykładu 4 do diagnostyki nowotworu nabłonkowego in vitro w próbkach biologicznych.
Związek ABZ-Met-Lys-Val-Trp-pNA analizowano pod kątem zastosowania w diagnostyce nowotworów nabłonkowych podobnie jak opisano w przykładzie 3. Analizę przeprowadzono poprzez ocenę aktywności protolitycznej ludzkiego moczu w próbkach osób chorych: z potwierdzonym nowotworem nabłonkowym i w grupie kontrolnej: bez stanu zapalnego i nowotworu.
Procedura do 80 μl moczu pacjentów z diagnozą nowotworu nabłonka układu moczowego lub mocz od pacjenta zdrowego
- 100 μl buforu (50 mM Tris-HCI, pH 8.3)
- 20 μl substratu ABZ-Met-Lys-Val-Trp-pNA (0,5 mg/ml DMSO - dimetylosulfotlenek)
- Temperatura 37°C
- Pomiar wzrostu absorbacji monitorowano w zakresie 380-430 nm przez 60 minut.
W wyniku inkubacji odpowiednio zarejestrowano wzrost absorbacji w mierzalnym zakresie dla próbek osób chorych, brak wzrostu absorbacji dla próbek osób zdrowych, podobnie jak przedstawiono na fig. 1. Wstępne wyniki badań wskazują że związek według przykładu 2 umożliwia wykrycie odpowiedzi zapalnej, której towarzyszy wydzielanie enzymów proteolitycznych obecnych w badanym materiale biologicznym i ten proces immunologiczny może współtowarzyszyć nowotworowi nabłonkowemu. W przypadku związków według przykładu 4, wstępne wyniki badań wskazują, że umożliwiają one diagnostykę nowotworu nabłonkowego.
P r z y k ł a d 6
Diagnostyka stanów zapalnych i nowotworów nabłonkowych - zestaw diagnostyczny
Zestaw diagnostyczny zawiera co najmniej dwa związki: markery, które opisano w powyższych przykładach z tym, że zestaw zawiera co najmniej jeden związek A - marker stanu zapalnego i nowotworu nabłonkowego o wzorze ogólnym ABZ 1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-X6 i związek B - marker nowotworu nabłonkowego o wzorze ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5-pNA, gdzie: ABZ oznacza kwas 2aminobenzoesowy, X to oznacza ANB-NH2 lub pNA, przy czym ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5amino-2-benzoesowego, pNA oznacza p-nitroanilinę. Związki te ulegające hydrolizie pod wpływem enzymów proteolitycznych - markerów stanu zapalnego i/lub choroby nowotworowej. Ze względu na współistnienie procesu nowotworzenia i wywołanej powyższy odpowiedzi immunologicznej (stan zapalny) dwa rodzaje opracowanych związków zastosowano w diagnostyce różnicowej tych dwóch stanów.
PL 238 700 B1
Użyto związków w następującej procedurze:
- do 80 μl i moczu pacjentów z diagnozą nowotworu nabłonka układu moczowego / stanem zapalnym lub mocz od pacjenta zdrowego
- 100 μΙ buforu (50 mM Tns-HCI, pH 8.3)
- 20 μl substratu - odpowiednio opisanego markera A i B dodanego osobno do innej próbki tego samego materiału biologicznego ABZ-Met-Lys-Val-Trp-pNA (0,5 mg/ml DMSO - dimetylosulfotlenek)
- Temperatura 37°C
- Pomiar wzrostu absorbancji monitorowano w zakresie 380-430 nm przez 60 minut.
Wzrost absorbancji przy użyciu związku A w zakresie opisanym wyżej w próbkach jedynie ze stanem zapalnym i ze stanem zapalnym i potwierdzonym nowotworem nabłonkowym wskazuje na obecność enzymu ludzkich neutrofili ściśle związanych z stanem zapalnym. Ich obecność związana jest także z odpowiedzią immunologiczną wywołaną w niektórych badanych próbkach obecnością komórek rakowych.
Badania eksperymentalne wskazują również, że w przypadku braku wykazania zabarwienia hydrolizy dodanego markera B - w próbce materiału biologicznego zaś obecność absorbancji w tej samej próbce przy obecności markera A, można zdiagnozować obecność stanu zapalnego np. zakażenia bakteryjnego lub wirusowego. Wstępne wyniki badań wskazują, że związki będące przedmiotem wynalazku mają wiele możliwości zastosowania w diagnostyce procesów immunologicznych i nowotworów zwłaszcza nabłonkowych.
Claims (3)
1. Zestaw diagnostyczny do zastosowania wczesnej diagnostyki nowotworu nabłonkowego i/lub stanu zapalnego, zawierający związek o wzorze ogólnym ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-X6 i związek o wzorze ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5-pNA gdzie:
ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy,
X oznacza ANB-NH2 lub-pNA, przy czym
ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego, pNA oznacza 4-nitroaniline.
2. Sposób diagnozowania i różnicowania nowotworu nabłonkowego i procesu zapalnego w materiale biologicznym ssaka, znamienny tym, że jako marker diagnostyczny stosuje się co najmniej jeden związek o wzorze ogólnym ABZ1-Leu2-GIu3-Pro4-Val5-X6 i jeden związek o wzorze ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5-pNA, gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, X oznacza ANB-NH2 lub pNA, przy czym ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego, pNA oznacza 4-nitroanilinę, przy czym związki dodaje się do materiału biologicznego, a następnie dokonuje się pomiaru absorbancji przy długości fali w zakresie od 300 do 500 nm.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że pomiaru absorbancji dokonuje się przy długości fali 380-430 nm.
PL 238 700 Β1
Rysunki
Fig.l - przedstawia szybkość hydrolizy substratu ABZ-Leu-Ghi-Pro-Yal-ANB-NHj w próbkach moczu ze zdiagnozowanym nowotworem. Cyfry arabskie oznaczają numer losowo wybranej próbki moczu.
Fig.2 - przedstawia szybkość hydrolizy substratu ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-pNA w próbkach moczu ze zdiagnozowanym nowotworem. Cyfry arabskie oznaczają numer losowo wybranej próbki moczu.
PL 238 700 Β1
0.08η
Fig.3 - przedstawia szybkości hydrolizy substratu ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB-NH2 w zależności od obecności inhibitora ludzkiej elstazy neutrofilnej, który to enzym jest markerem stanu zaplanego, w próbce ludzkiego moczu ze stwierdzonym stanem zapalnym i/lub nowotworem nabłonka układu moczowego.
Fig.4 - przedstawia zależność stopnia hydrolizy substratu ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB NH2 od środowiska pH
PL 238 700 Β1
0.08-,
Fig.5 - przedstawia wydajności hydrolizy substratu ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB NH2 w zależności od stopnia zagęszczenia ludzkiego moczu ze stwierdzonym nowotworem nabłonka układu moczowego.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL434554A PL238700B1 (pl) | 2018-07-14 | 2018-07-14 | Związki chemiczne mające zastosowanie jako markery diagnostyczne stanu zapalnego i nowotworów do zastosowania jako zestaw diagnostyczny i metoda diagnozowania i różnicowania procesów zapalnych i nowotworów nabłonkowych |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL434554A PL238700B1 (pl) | 2018-07-14 | 2018-07-14 | Związki chemiczne mające zastosowanie jako markery diagnostyczne stanu zapalnego i nowotworów do zastosowania jako zestaw diagnostyczny i metoda diagnozowania i różnicowania procesów zapalnych i nowotworów nabłonkowych |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL434554A1 PL434554A1 (pl) | 2021-03-08 |
| PL238700B1 true PL238700B1 (pl) | 2021-09-27 |
Family
ID=75107796
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL434554A PL238700B1 (pl) | 2018-07-14 | 2018-07-14 | Związki chemiczne mające zastosowanie jako markery diagnostyczne stanu zapalnego i nowotworów do zastosowania jako zestaw diagnostyczny i metoda diagnozowania i różnicowania procesów zapalnych i nowotworów nabłonkowych |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL238700B1 (pl) |
-
2018
- 2018-07-14 PL PL434554A patent/PL238700B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL434554A1 (pl) | 2021-03-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112358531B (zh) | 靶向her2蛋白的多肽及其应用 | |
| EP3431490B1 (en) | Chemical compounds for use as diagnostic markers of inflammation and neoplams, the method for synthesis of the chemical compounds, diagnostic kit for use in diagnosis of inflammatory processes and epithelial neoplasms and in vitro diagnostic method of inflammatory processes and epithelial neoplasms | |
| PL236125B1 (pl) | Związki chemiczne mające zastosowanie jako markery diagnostyczne stanu zapalnego i nowotworów, sposób ich otrzymywania, marker diagnostyczny i metoda diagnozowania procesów zapalnych i nowotworów nabłonkowych | |
| CN118202246A (zh) | Fret酶底物及其在肝癌中的应用 | |
| PL238699B1 (pl) | Związek chemiczny mający zastosowanie jako marker diagnostyczny nowotworów, sposób otrzymywania, metoda diagnozowania nowotworów nabłonkowych | |
| CN119072484A (zh) | 化合物-肾癌诊断标志物、酶活性检测方法、肾癌诊断方法、包含该化合物的试剂盒、化合物的用途及肾癌治疗方法 | |
| PL238575B1 (pl) | Związek oraz jego zastosowanie do wykrywania nowotworów nabłonkowych | |
| CN118451325A (zh) | Fret酶底物及其在肺癌中的应用 | |
| CN120476216A (zh) | 化合物-用于胆道癌的诊断标志物、用于检测酶活性的方法、用于诊断胆道癌的方法、包括该化合物的试剂盒、该化合物的用途和用于治疗胆道癌的方法 | |
| US20250206777A1 (en) | Compound - diagnostic marker for intestinal cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of intestinal cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of intestinal cancer | |
| HK40105068A (en) | Fret enzymatic substrate and uses thereof in liver cancer | |
| HK40107766A (en) | Fret enzymatic substrate and uses thereof in lung cancer | |
| US20250376711A1 (en) | Compound-diagnostic marker for uterine body cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of uterine body cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of uterine body cancer | |
| HK40116114A (en) | Compound-diagnostic marker for uterine body cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of uterine body cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of uterine body cancer | |
| CN119998307A (zh) | 化合物-卵巢癌诊断标记物、检测酶活性的方法、诊断卵巢癌的方法、包含所述化合物的试剂盒、所述化合物的用途和治疗卵巢癌的方法 | |
| HK40121437A (en) | Compound - diagnostic marker for ovarian cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of ovarian cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of ovarian cancer | |
| HK40111059A (en) | Compound - diagnostic marker for intestinal cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of intestinal cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of intestinal cancer | |
| KR20250143356A (ko) | 화합물, 위암 진단 마커, 효소 활성 검출 방법, 위암 진단 방법, 화합물을 포함하는 키트, 위암을 치료하기 위한 화합물의 용도 및 방법 |