PL238575B1

PL238575B1 - Związek oraz jego zastosowanie do wykrywania nowotworów nabłonkowych

Info

Publication number: PL238575B1
Application number: PL422233A
Authority: PL
Inventors: Adam LESNER; Adam Lesner; Natalia Gruba
Original assignee: Univ Gdanski
Priority date: 2017-07-17
Filing date: 2017-07-17
Publication date: 2021-09-06
Also published as: PL422233A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest nowy związek o wzorze ogólnym: ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5-ANB-NH26, gdzie: ABZ oznacza kwas 2-amino benzoesowy i ANB oznacza amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego. Ponadto, przedmiotem zgłoszenia jest sposób otrzymywania nowego związku oraz zestaw do wykrywania nowotworów nabłonkowych, korzystnie nowotworu nabłonkowego układu moczowego, który zawiera nowy związek. Zgłoszenie obejmuje też zastosowanie hydrolizy in vitro nowego związku w pozycji 5 poprzez enzymy proteolityczne do wykrywania nowotworów nabłonkowych, korzystnie nowotworu nabłonkowego układu moczowego.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowy związek oraz diagnostyczne zastosowanie związku do wykrywania nowotworów nabłonkowych, zwłaszcza nowotworu nabłonkowego układu moczowego.

Znane są peptydy służące do wykrywania raka pęcherza moczowego z publikacji patentowych takich jak WO 2011/038142 czy WO 2014/042209. Ujawnione peptydy posiadają jednak odmienną strukturę w stosunku do nowego peptydu przedstawionego w niniejszym zgłoszeniu, a ich sposób wykrywania nowotworu jest odmienny, gdzie poprzez znakowanie markerami pozwalają na wykrycie stanu chorobowego.

Przedmiotem badań było opracowanie związku (substratu o właściwościach chromogenicznych i fluorogenicznych), którego hydrolizę enzymatyczną obserwujemy tylko w obecności moczu pacjenta ze zdiagnozowanym nowotworem nabłonkowym.

Wiadomo, że jednym ze skutków choroby nowotworowej jest podwyższenie aktywności enzymów proteolitycznej guza i okolicznych tkanek wynikających z wielu procesów, do których zaliczamy podwyższoną angiogenezę, remodeling tkanek, nekrozę tkanek zdrowych wskutek nacieku nowotworu a także apoptozę komórek nowotworowych.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie związku i sposobu, które mogłyby być zastosowane do wykrywania nowotworów nabłonkowych, korzystnie nowotworu pęcherza moczowego. Nieoczekiwanie problem ten został rozwiązany w istotnym stopniu w niniejszym wynalazku.

Przeprowadzono badania celem identyfikacji związku, który byłby podatny na zwiększoną aktywność proteolityczną ludzkiego moczu ze zdiagnozowanym nowotworem nabłonka układu moczowego. Wyniki przeprowadzono na moczu osób chorych (połączone próbki 60 osób chorych) i 25 osób zdrowych.

W wyniku tych badań został opracowany związek, którego hydrolizę enzymatyczną obserwuje się poprzez monitoring uwalnianej cząsteczki ANB-NH2 (amid kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego) przy długości fali 410 nm.

Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze ogólnym:

ABZ1-Met²-Lys³-Val⁴-Trp⁵-ANB-NH2⁶ gdzie:

ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy

ANB oznacza kwas 5-amino-2-nitrobenzoesowy

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie diagnostyczne ww. związku jako marker do diagnostyki nowotworu nabłonkowego, zwłaszcza układu moczowego, w moczu.

Działanie diagnostyczne związku polega na tym, że poprzez enzymy proteolityczne następuje hydroliza in vitro nowego związku w pozycji 5, w przypadku obecności nowotworu nabłonkowego. Wizualizacji hydrolizy dokonuje się, po inkubacji tego związku z próbką biologiczną, poprzez pomiar absorbancji powstałej na skutek hydrolizy enzymatycznej.

Sposób otrzymywania związku według wynalazku polega na przeprowadzeniu następujących etapów metodyki:

a) proces pęcznienia żywicy amidowej TentaGel S RAM;

b) deprotekcja osłony Fmoc, w 20% roztworze piperydyny w NMP;

c) przemywanie żywicy (DMF, piperydyna);

d) wykonanie testu chloranilowego;

e) osadzenie kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego;

f) przemywanie żywicy (DMF, DCM);

g) wykonanie testu chloranilowego;

h) powtarzanie etapów od b) do g) aż do momentu uzyskania związku/peptydu z zastrzeżenia 1;

i) odszczepienie peptydu od żywicy z jednoczesnym usunięciem osłon za pomocą mieszaniny

TFA : fenol : woda : TIPS (88 : 5 : 5 : 2, v/v/v/v);

j) odsączenie, odwirowanie, rozpuszczenie osadu w wodzie destylowanej przy pomocy ultradźwięków, następnie poddanie liofilizacji;

k) analiza i oczyszczanie za pomocą HPLC, MS, NMR;

l) spektrometria mas w celu potwierdzenia tożsamości.

PL 238 575 B1

Określenia stosowane powyżej oraz w opisie i zastrzeżeniach patentowych, mają następujące znaczenie:

Nowotwór nabłonkowy - czyli taki, którego komórki wywodzą się z nabłonka gruczołów wydzielania zewnętrznego i wewnętrznego oraz z przewodów tych gruczołów, np. nowotwór nabłonka układu moczowego.

Właściwości chromogeniczne - oznaczają powstawanie produktu barwnego

Właściwości fluorogeniczne - oznaczają powstawanie produktu emitującego fluorescencję

NMP - N-metylopirolidon

DMF - dimetyloformamid

Boc - grupa tert-butyloksykarbonylowa

Fmoc - grupa 9-fluorenylometoksykarbonylowa

DCM - dichlorometan

TFA - kwas trifluorooctowy

TIPS - triizopropylosilan

TRIS-HCl - chlorowodorek tris(hydroksymetylo)aminometanu

ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy

ANB oznacza kwas 5-amino-2-nitrobenzoesowy

Wynalazek objaśniono w przykładzie i na rysunku.

Opis figur:

Fig. 1-4 - Wykresy 1-4 - wyniki HPLC próbek.

Fig. 5 - przedstawia szybkość hydrolizy substratu ABZ-Met-Lys-Val-Trp-ANB-NH2 w próbkach moczu ze zdiagnozowanym nowotworem. Cyfry arabskie oznaczają numer losowo wybranej próbki moczu.

Fig. 6 - przedstawia szybkości hydrolizy substratu ABZ-Met-Lys-Val-Trp-ANB-NH2 w zależności od obecności inhibitora, w próbce ludzkiego moczu ze stwierdzonym nowotworem nabłonka układu moczowego.

Fig. 7 - przedstawia zależność stopnia hydrolizy substratu ABZ-Met-Lys-Val-Trp-ANB-NH2 od środowiska pH.

Fig. 8 - przedstawia wydajności hydrolizy substratu ABZ-Met-Lys-Val-Trp-ANB-NH2 w zależności od stopnia zagęszczenia ludzkiego moczu ze stwierdzonym nowotworem nabłonka układu moczowego. P r z y k ł a d 1

I) Synteza nowego związku:

a) Pierwszym etapem syntezy było otrzymanie peptydu chromogenicznego, który otrzymano metodą syntezy w fazie stałej z wykorzystaniem chemii Fmoc/tBu.

Związek o sekwencji ABZ1-Met²-Lys³-Val⁴-Trp⁵-ANB-NH2⁶, gdzie ABZ - oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, otrzymano na drodze syntezy chemicznej w fazie stałej z wykorzystaniem następujących pochodnych aminokwasowych:

Boc-ABZ, Fmoc-Met, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Trp(tBu), ANB

Syntezę substratów peptydowych prowadzono na nośniku stałym:

- żywicy TentaGel S RAM firmy RAPP Polymere (Niemcy) o osadzeniu 0,23 mmol/g.

Syntezę wszystkich peptydów prowadzono w sposób manualny z zastosowaniem wytrząsarki laboratoryjnej. Przez większość etapów reaktorami była strzykawka zakończona spiekiem do syntezy w fazie stałej o pojemności 25 ml.

Wszystkie syntezowane substraty zawierały w swojej sekwencji na N-końcu kwas 2-aminobenzoesowy (ABZ) i cząsteczkę kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego na C-końcu (ANB). ABZ pełnił rolę donora fluorescencji, natomiast ANB pełniła rolę wygaszacza fluorescencji i jednocześnie chromoforu. Peptydy w swojej sekwencji zawierały jedno miejsce reaktywne zlokalizowane pomiędzy resztami aminokwasowymi Trp-ANB-NH2.

Osadzenie ANB na żywicy TentaGel S RAM:

Syntezę peptydów wykonano na żywicy TentaGel S RAM firmy Rapp Polymere o osadzeniu 0,23 mmol/g. W pierwszym etapie dokonano spulchnienia żywicy poprzez cykl przemywań. Kolejno przystąpiono do usunięcia z nośnika osłony grupy aminowej Fmoc - za pomocą 20% roztworu piperydyny w NMP. Następnie przeprowadzono cykl przemywań rozpuszczalnikami. W celu potwierdzenia obecności wolnych grup aminowych wykonano test chloranilowy.

Cykl przemywań rozpuszczalnikami: DMF 1x10 minut

IsOH 1x10 minut

DCM 1x10 minut Usunięcie osłony Fmoc: DMF 1x5 minut

PL 238 575 B1

20% piperydyna w NMP 1x3 minuty

20% piperydyna w NMP 1x8 minut

Cykl przemywań rozpuszczalnikami: DMF 3x2 minuty

IsOH 3x2 minuty

DCM 3x2 minuty Test chloranilowy:

Test chloranilowy polegał na przeniesieniu za pomocą łopatki, kilku ziaren żywicy z reaktora - strzykawki do szklanej ampułki, do której następnie dodano 100 μl nasyconego roztworu p-chloranilu w toluenie i 50 μl świeżego aldehydu octowego. Po upływie 10 minut przeprowadzono kontrolę zabarwienia ziaren.

Na tym etapie po przeprowadzeniu testu otrzymano zielone zabarwienie ziaren, które świadczyło o obecności wolnych grup aminowych. Po potwierdzeniu usunięcia osłon fluorenylometoksykarbonylowych z żywicy można było przystąpić do kolejnego etapu, przyłączania pochodnej ANB (kwasu 5-amino-2-nitrobenozesowego).

Osadzenie kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego na nośniku stałym

Pierwszym etapem syntezy biblioteki peptydowej było osadzenie ANB na 1 g żywicy. Przed przyłączeniem chromoforu przemyto żywicę używaną do reakcji następującymi rozpuszczalnikami: DMF, DCM i ponownie DMF, po czym usunięto osłonę Fmoc- z grupy funkcyjnej nośnika. Jeden cykl usuwania osłony Fmoc- obejmował następujące etapy:

1. Usunięcie osłony Fmoc-:

20% roztwór piperydyny w NMP 1x3 minuty 1x8 minut

2. Przemywanie

DMF 3x2 minuty izopropanol 3x2 minuty DCM 3x2 minuty

3. Test na obecność wolnych grup aminowych: Chloranilowy [167].

Żywicę z wolną grupą aminową przemyto 5% roztworem N-metylomorfoliny (NMM) w DMF, a następnie DMF. Procedurę usuwania osłony Fmoc- oraz cykl przemywań przeprowadzono w naczynku Merrifielda. W osobnej kolbie rozpuszczono ANB w DMF i dodałam kolejno TBTU, DMAP, a na koniec diizopropyloetyloaminę (DIPEA) w następujących nadmiarach w stosunku do osadzenia polimeru: ANB/TBTU/DMAP/DIPEA, 3:3:2:6. Tak przygotowaną mieszaninę dodano do żywicy i mieszano przez 3 godziny. Żywicę odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem, przemyto DMF, DCM i izopropanolem, a całą procedurę acylowania powtórzono dwa razy. Do przeprowadzenia kolejnych reakcji przyłączania ANB do żywicy zastosowano heksafluorofosforan-O-(7-azabenzotriazol-1-yl)- N,N,N’,N’-tetrametylouroniowy (HATU), a potem heksafluorofosforan-O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetrametylouroniowy (HBTU). W ostatnim etapie żywicę przemyto kolejno DMF, DCM oraz izopropanolem i suszono na powietrzu.

Przyłączenie C-końcowej reszty aminokwasowej do ANB

Odpowiednią pochodną aminokwasową (9-krotny nadmiar molowy w stosunku do osadzenia żywicy) rozpuszczono w pirydynie i przeniesiono do kolby zawierającej żywicę z osadzonym ANB. Całość chłodzono do uzyskania temperatury -15°C (łaźnia lodowa: 1 cz. wagowa NH4CI, 1 cz. wagowa NaNO3, 1 cz. wagowa lodu). Po osiągnięciu żądanej temperatury dodano POCI3 (w stosunku 1:1 do użytej ilości pochodnej aminokwasowej) i całość mieszano na mieszadle magnetycznym: 20 minut w -15°C, 30 minut w temperaturze pokojowej oraz 6 godzin w 40°C (łaźnia olejowa). Po zakończeniu reakcji żywicę odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem, przemyto DMF oraz MeOH i zostawiono do wysuszenia.

W kolejnym etapie przyłączono resztę w pozycji P2 (serynę).

Wszystkie przyłączania reszt aminokwasowych poprzedzono przemywaniem żywicy za pomocą DMF przez 5 minut. W kolejnych przyłączaniach stosowano diisopropylokarbodiimid jako środek sprzęgający. Procedurę powtarzano dwukrotnie.

Po każdym z acylowań rozpoczynano cykl przemywań żywicy, a następnie wykonywano test chloranilowy, w celu monitorowania przyłączania pochodnej aminokwasowej do wolnych grup aminowych żywicy.

Cykl przemywań rozpuszczalnikami: DMF 3x2 minuty

IsOH 3x2 minuty

DCM 3x2 minuty Test chloranilowy:

PL 238 575 B1

W wyniku przeprowadzonych testów po dwóch pierwszych sprzęganiach zabarwienie ziaren najpierw było zielone, a następnie szare, więc konieczne było przeprowadzenie kolejnego acylowania, w wyniku którego ziarna żywicy badanej testem chloranilowym były bezbarwne. Świadczyło to o przyłączeniu ANB do żywicy TentaGel S RAM, co pozwoliło przejść do następnego etapu syntezy peptydu.

Przyłączanie kolejnych chronionych reszt aminokwasowych:

Żywicę wraz z przyłączoną resztą ANB znajdującą się w reaktorku przemyto za pomocą DMF, a następnie przystąpiono do deprotekcji osłony Fmoc z grupy aminowej w celu przyłączenia chronionej pochodnej aminokwasowej glicyny.

Usunięcie osłony Fmoc: DMF 1x5 minut

20% piperydyna w NMP 1x3 minuty

20% piperydyna w NMP 1x8 minut

Cykl przemywań rozpuszczalnikami: DMF 3x2 minuty

IsOH 3x2 minuty

DCM 3x2 minuty Test chloranilowy:

W wyniku przeprowadzenia testu chloranilowego otrzymano wynik pozytywny, o czym świadczyło zielone zabarwienie ziaren żywicy. Pozwoliło to na rozpoczęcie kolejnego etapu - przyłączania reszty aminokwasowej Fmoc-Trp-OH.

Przyłączanie pochodnej aminokwasowej:

Wykonywane sprzęgania poprzedzono przemywaniem żywicy w DMF. Podczas przyłączania chronionej reszty glicyny skład mieszaniny sprzęgającej pozostawał bez zmian.

Po zakończeniu każdego z acylowań stosowano cykl przemywań rozpuszczalnikami według podanej procedury, a następnie przeprowadzono test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych w roztworze.

Cykl przemywań rozpuszczalnikami: DMF 3x2 minuty

IsOH 3x2 minuty

DCM 3x2 minuty Test chloranilowy:

Ziarna żywicy testu przeprowadzonego po drugim acylowaniu były bezbarwne, co pozwoliło na przejście do kolejnego etapu syntezy, jakim było wprowadzenie kolejnych chronionych pochodnych aminokwasowych - waliny, lizyny, metioniny i cząsteczki kwasu 2-aminobenzoesowego. Procesy sprzęgania odbyły się zgodnie z procedurą omówioną wcześniej.

Testy przeprowadzone po przyłączeniu wyżej wymienionych reszt wykazały wyniki pozytywne, ziarna żywicy były bezbarwne.

b) Usuwanie peptydu z nośnika

Po zakończeniu syntezy amid peptydu usunięto z nośnika wraz z jednoczesnym usunięciem osłon bocznych za pomocą mieszaniny: TFA : fenol : woda : TIPS (88 : 5 : 5 : 2, v/v/v/v) w kolbie okrągłodennej na mieszadle magnetycznym.

Po upływie 3 godzin zawartość kolby sączyło się pod zmniejszonym ciśnieniem na lejkach ze spiekiem Schotta, przemywając eterem dietylowym. Powstały osad odwirowano na wirówce SIGMA 2K30 (Laboratory Centrifuges) w czasie 20 minut. Osad otrzymany po wirowaniu rozpuszczono w wodzie przy pomocy ultradźwięków, a następnie poddano liofilizacji.

c) Tożsamość/charakterystyka nowego związku - analiza HPLC, MS oraz NMR

HPLC warunki: kolumna RP Bio Wide Pore Supelco C8 250 mm 4 mm, układ faz A 0,1% TFA w wodzie, B: 80% acetonitrylu w A), przepływ 1 ml/min, detekcja UV przy 226 nm.

tR 20.1

MS MALDI TOF matryca kwas alfa cynamonowy masa cząsteczkowa 845,4 Da obliczona 844,4.

Inkubacja tego związku w niżej opisanych warunkach:

- 3 μl moczu pacjentów z diagnozą nowotworu nabłonka układu moczowego lub mocz od pa- cjenta zdrowego

- 177 μl buforu (50 mM Tris-HCl, pH 8,3)

- 20 μl of ABZ-Met-Lys-Val-Trp-ANB-NH2 substratu (0,5 mg/ml)

- czas 60 minut

- temperatura 37°C daje wyniki, które przedstawiono poniżej.

Analiza HPLC. Wyniki pokazano na Fig. 1-4.

PL 238 575 Β1

Aktywność proteolityczna enzymów obecnych w badanym materiale biologicznym (próbki moczu ze zdiagnozowanym nowotworem) jest proporcjonalna do intensywności obserwowanego sygnału absorbancji, uwalnianego w wyniku hydrolizy wiązania peptydowego ANB. Hydroliza substratu ABZ¹-Met²-Lys³-Val⁴-Trp⁵-ANB-NH2⁶ następuje w pozycji 5, gdzie otrzymujemy ABZ¹-Met²-Lys³-Val⁴-Trp⁵oraz ANB-NH2.

Peptyd (substrat) o sekwencji ABZ¹-Met²-Lys³-Val⁴-Trp⁵-ANB-NH2⁶ wykazuje niską absorbcję przy długości fali 405/410 nm. Podczas hydrolizy uwalnia się wolna cząsteczka ANB-NH2, która wykazuje maksimum absorbancji przy 405/410. Innymi słowy hydroliza peptydu powoduje wzrost stężenia ANB-NH2 i tym samym wzrost absorbancji przy 405/410 nm.

Z wykresu (Fig. 5) odczytać możemy, że w przypadku próbek 5, 6, 4 i 60 rozpad substratu ABZ-Met-Lys-Val-Trp-ANB-NH2 zachodzi wydajniej niż w przypadku materiałów 40, 3, 9 czy 7. Taki rezultat może być spowodowany różnicą w aktywności, jak i ilości enzymów odpowiedzialnych za proteolizę.

Inhibitor	Rodzaj	Klasa hamowanych enzymów	Stężenie końcowe w studzience pomiarowej [M]
Cartilzomib	Nieodwracalny	proteinazy trconinowe (aktywność chymotrypsynowa ludzkiego protcasomu 20S)	1,000 X 10^s
Bestatyna	nieodwracalny	aminopeptydazy	3,625 x 10^
AEBSF	nieodwracalny	proteinazy serynowe	5,215 χ JO⁴
E-64	nieodwracalny	proteinazy cysteino we	3,495 x 10^
Leupeptyną	odwracalny	proteinazy serynowe i cysteinowe	2,630 χ W⁴

Aktywność proteolityczna jest zależna od obecności określonych związków nazywanych inhibitorami w tym celu do połączonych próbek moczu osób chorych (nowotwór nabłonka układu moczowego) dodaliśmy efektywne stężenia hamujące określone klasy enzymów proteolitycznych. Wynik tego eksperymentu przedstawia Fig. 6.

W wyniku tego eksperymentu stwierdzono, że w badanym materiale występują co najmniej dwa enzymy wykazujące maksimum aktywności w pH kwaśnym i zasadowym.

Użycie inhibitorów różnych klas enzymów nie spowodowało spadku aktywności proteolitycznej. Jedynie inkubacja moczu z leupeptyną skutkowała zmniejszeniem wydajności hydrolizy. Taki wynik mógłby sugerować obecność proteinaz serynowych bądź cysteinowych. Pozostałe zastosowane inhibitory także hamują te klasy enzymów, stąd nasuwa się wniosek, że za aktywność enzymatyczną w moczu osób ze zdiagnozowaną chorobą nowotworową pęcherza moczowego odpowiadają) enzym(y) należący(e) do innego rodzaju niż wymienione w powyższej tabeli (Fig. 6).

Na aktywność enzymatyczną wpływa wiele czynników, spośród których jednym jest pH środowiska reakcji. Przeprowadzony eksperyment może wskazywać, że w badanym moczu znajdują się enzymy preferujące odmienne warunki. Obserwujemy dwa maksima aktywności proteolitycznej, co sugeruje obecność co najmniej dwóch proteinaz - z których co najmniej jedna przeprowadzająca hydrolizę w warunkach kwasowych druga zasadowych (Fig. 7).

Aby zwiększyć czułość metody detekcji otrzymany materiał biologiczny (ludzki mocz ze stwierdzonym nowotworem nabłonka układu moczowego) został zagęszczony. W tym celu użyto kolumn filtracyjnych Amicon. W wyniku tego procesu otrzymano czterokrotnie zagęszczony materiał o aktywności około 4-krotnie wyższej niż materiał wyjściowy (Fig. 8). Fakt liniowej odpowiedzi na wzrastające stężenie enzymu potwierdza selektywność otrzymanego związku.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Związek o wzorze ogólnym:

ABZ¹-Met²-Lys³-Val⁴-Trp⁵-ANB-NH₂ ⁶ gdzie:

ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy

ANB oznacza kwas 5-amino-2-nitrobenzoesowy.

PL 238 575 B1
2. Marker diagnostyczny o wzorze ogólnym ABZ¹-Met²-Lys³-Val⁴-Trp⁵-ANB-NH2⁶, gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, ANB oznacza kwas 5-amino-2-nitrobenzoesowy do zastosowania w diagnostyce nowotworów nabłonkowych.
3. Marker do zastosowania według zastrz. 2, znamienny tym, że wykrywany nowotwór to nowotwór nabłonkowy układu moczowego.
4. Marker do zastosowania według zastrz. 2, znamienny tym, że zastosowanie dotyczy materiału biologicznego w postaci moczu.