PL238941B1

PL238941B1 - Związki chemiczne o działaniu przeciwuszkodzeniowym i/lub neuroprotekcyjnym

Info

Publication number: PL238941B1
Application number: PL425131A
Authority: PL
Inventors: Artur CZUPRYN; Artur Czupryn; Piotr Mucha; Piotr Skowron; Jarosław Mazuryk; Marta Wiśniewska; Kamil KOZIŃSKI; Kamil Koziński; Małgorzata Beresewicz; Olga Krupska; Izabela Załuska; Małgorzata Palczewska-Groves; Agnieszka ŻYLICZ-STACHULA; Agnieszka Żyliczstachula; Joanna Żebrowska; Arkadiusz Piotrowski; Michał PIKUŁA; Michał Pikuła; Paweł SACHADYN; Paweł Sachadyn
Original assignee: Gdanski Univ Medyczny; Inst Biologii Doswiadczalnej Im M Nenckiego Polskiej Akademii Nauk; Medventures Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia; Politechnika Gdanska; Pro Science Polska Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia; Pro Science Polska Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością; Univ Gdanski
Priority date: 2018-04-04
Filing date: 2018-04-04
Publication date: 2021-10-25
Also published as: PL425131A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są związki chemiczne o działaniu przeciwuszkodzeniowym i/lub neuroprotekcyjnym z sekwencją aminokwasową RGD: Arg-Gly-Asp w formie pojedynczej lub zwielokrotnionej.

Uszkodzenia neurologiczne obejmują wszelkiego rodzaju urazowe i szybkie patologiczne zmiany układu nerwowego i powiązanego z nim układu krwionośnego. Szczególnie groźne dla zdrowia i życia są uszkodzenia ośrodkowego układu nerwowego (OUN), czyli mózgu i rdzenia kręgowego. W ich przypadku uszkodzenie powoduje niepożądane zmiany strukturalne, dysfunkcje przekaźnictwa elektrycznego i chemicznego, śmierć komórek (nie tylko neuronów, ale i komórek glejowych różnego rodzaju), skutkujące zmianami fizjologicznymi, poznawczymi, jak również dotyczącymi uczuć, emocji oraz pamięci. Takie uszkodzenia, zwane także traumami, są najczęściej rezultatem kontuzji mechanicznej (rany) oraz udaru niedokrwiennego lub krwotocznego (wylewu), i w większości przypadków prowadzą do przewlekłej lub nieodwracalnej encefalopatii. Olbrzymia liczba przypadków prowadzi do śmierci pacjenta w wyniku bezpośredniego uszkodzenia lub zachodzenia szeregu zjawisk wtórnych, którym współczesna medycyna nie potrafi jeszcze sprostać.

W OUN kontuzje mechaniczne (fizyczne) są najpowszechniejszymi przypadkami klinicznymi uszkodzeń mózgu (ang. brain injury) i rdzenia kręgowego (ang. spinal cord injury). Zaliczamy do nich traumatyczne uszkodzenie mózgu (uszkodzenia kompresyjne) będące skutkiem silnych uderzeń oraz mechaniczne uszkodzenie mózgu (zranienia) z bezpośrednim powstaniem ran głębokich mózgu. Oba typy kontuzji powstają najczęściej w wyniku wypadków komunikacyjnych, upadków i innych obrażeń prowadzących do wstrząśnienia mózgu i fizycznych ubytków a w dalszej kolejności do śmierci lub odwracalnych albo trwałych napadów epileptycznych, migren, oraz zaburzeń funkcjonowania określonych obszarów mózgu. Z kolei uszkodzenie rdzenia kręgowego, będące najczęściej wynikiem przerwania ciągłości kręgosłupa (częściowe lub całkowite przecięcie) lub zmiażdżenia (uszkodzenia kompresyjne), prowadzi do częściowej lub trwałej dysfunkcji mięśni, utraty czucia lub braku autonomicznych odpowiedzi w tych partiach ciała, które kontrolowane są przez nerwy znajdującego się poniżej miejsca przerwania lub uszkodzenia rdzenia.

Udary to następna grupa uszkodzeń neurologicznych, na które składają się dwa typy schorzeń: udar niedokrwienny, będący skutkiem zatamowania światła naczynia krwionośnego w mózgu lub naczyń prowadzących do mózgu, oraz udar krwotoczny (wylew), będący wynikiem przerwania ścian naczyń w obrębie mózgu. W pierwszym przypadku wyróżnić można udary globalne oraz lokalne (ogniskowe). O ile oba te podtypy udaru niedokrwiennego dotyczą niedoboru składników dostarczanych przez krew neuronom i komórkom glejowym, o tyle różnią się przyczyną takiej dysfunkcji naczyniowej. Udar globalny wywołany jest ogólnoustrojowym niedotlenieniem i zatrzymaniem akcji serca, kończącym się zwykle utratą przytomności, podczas gdy udar lokalny jest skutkiem zablokowania światła naczyń przez skrzep krwi lub złogi tłuszczowe (miażdżyca). Klinicznym objawem tego przypadku jest obumarcie tkanki w najbliższym otoczeniu miejsca niedokrwienia, w ognisku udarowym (ang. ischemic core) oraz penumbry, czyli miejsca, w którym możliwa jest reperfuzja (ponowny przepływ krwi), jeśli zapewniona jest przez natychmiastową interwencję medyczną w przeciągu kilku minut. Niedotlenienie mózgu może powstawać także u noworodków w nieprawidłowym przebiegu akcji porodowej. Wylew natomiast (udar krwotoczny) jest rezultatem nagłego przerwania ścian naczyń krwionośnych najczęściej w wyniku nadciśnienia lub pęknięcia tętniaka, i prowadzi do spadku ciśnienia krwi oraz zniszczenia parenchymy/tkanki nerwowej w uszkodzonym obrębie OUN.

W wyniku opisanych powyżej kontuzji mechanicznych mózgu i rdzenia kręgowego (zarówno uszkodzeń kompresyjnych/pouderzeniowych jak i po zranieniu mózgu czy przecięciu rdzenia kręgowego) jak i udarów (niedokrwiennego lub krwotocznego) indukowane są przeplatające się i nawzajem pobudzające się procesy: 1) nadmiernego pobudzenia neuronów (ekscytotoksyczności), 2) stanu zapalnego stymulowanego komórki mikroglejowe znajdujące się w OUN lub komórki limfatyczne wnikające z naczyń krwionośnych, oraz 3) zjawiska śmierci komórkowej (zarówno zachodzącej według programu wewnątrzkomórkowego zwanego apoptozą jak i w śmierci nekrotycznej). Zjawiska te pokazano na Fig. 1 i 2 - stan techniki. Te trzy grupy procesów zachodzą w różnym czasie i z różną intensywnością po uszkodzeniu, co przedstawiono na Fig. 1.

Wspólną cechą uszkodzeń neurologicznych wymienionych powyżej jest charakterystyczna kaskada spowodowanych przez nie następczych procesów fizjologicznych (Fig. 2A). Najważniejszym czynnikiem klinicznym, leżącym u podstaw tychże mechanizmów, jest utrata ciągłości naczyń krwio

PL 238 941 B1 nośnych i w konsekwencji przerwanie bariery krew-mózg (ang. blood-brain barrier, BBB). W ogólnym przypadku zatrzymanie przepływu krwi w mózgu skutkuje brakiem dopływu tlenu, glukozy i składników odżywczych, czyli tzw. deprywacją energetyczno-oddechową, co prowadzi do natychmiastowej śmierci (nekrozy) komórek nerwowych oraz, w dalszej perspektywie, do programowanej śmierci komórek (apoptozy), znajdujących się w pobliskich regionach mózgu i ogólnego stanu zapalnego w obrębie tkanki. Deprywacja energetyczna jest podstawowym procesem metabolicznym, powodującym samostymulujący się szereg reakcji biochemicznych i neurochemicznych. Biorąc pod uwagę czas trwania tych reakcji, wyróżnić należy krótkotrwałe (minuty) procesy depolaryzacyjne, prowadzące do sprzężonych ze sobą mechanizmów zwiększania wewnątrzkomórkowego stężenia jonów wapnia, obniżenia pH w tkance wskutek wzrostu stężenia mleczanu, jako produktu oddychania beztlenowego, oraz przede wszystkim do niebezpiecznego, samonapędzającego się nadmiernego pobudzenia neuronów, czyli ekscytotoksyczności (ang. excitotoxicity), w następstwie których pojawiają się procesy długotrwałe (godziny, dni), wśród których dominują stany zapalne i apoptoza. Kluczowym symptomem patologicznym jest ekscytotoksyczność, będąca wynikiem niekontrolowanej depolaryzacji neuronów i wapniowo-zależnej aktywacji receptorów glutaminianowych, skutkujących nadmiernym wyrzutem neurotransmiterów pobudzających (glutaminianu). W ostateczności, nagromadzenie glutaminianu w przestrzeni synaptycznej prowadzi do lawinowej stymulacji sąsiednich neuronów. Zaburzenie równowagi elektrochemicznej w synapsach w połączeniu z niedoborem tlenu w tkance ma z kolei bezpośrednie przełożenie na hamowanie oddychania komórkowego, czyli powstanie stresu oksydacyjnego.

Uszkodzenia neurologiczne, zwłaszcza powikłania poudarowe, prowadzą do wielu zmian w unaczynieniu mózgu i zaburzenia angiogenezy. Angiogeneza jest procesem tworzenia nowych naczyń krwionośnych i odgrywa kluczową rolę podczas naprawy i regeneracji tkanek. Za te procesy odpowiedzialne są między innymi białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ang. extracellular matrix, ECM) wydzielane przez komórki, odpowiedzialne za nieustanną proliferację, migrację, adhezję, dojrzewanie i komunikację między komórkami śródbłonka naczyń (endotelium). ECM tworzą głównie białka fibrylarne (np. kolageny, elastyny), lamininy, fibronektyny oraz glikozoaminoglikany, siarczany heparanu, węglowodany nieproteoglikanowe (np. kwas hialuronowy). W szczególności rola tych ostatnich w procesie angiogenezy i regeneracji ran została potwierdzona w eksperymentach in vitro i in vivo. Fibronektyna oddziałuje z kolagenem i integrynami powierzchniowymi, czym przyczynia się do rearanżacji cytoszkieletu, umożliwiając tym samym adhezję fibryn do fibroblastów podczas krzepnięcia krwi (trombogenezy). Integryny to receptory heterodimerowe αβ biorące udział w tworzeniu połączenia komórka-komórka i komórka-ECM, co stanowi podstawę procesów sygnalizacji międzybłonowej, proliferacji, różnicowania, wzrostu i migracji. Naturalne ligandy tych receptorów przejawiają zróżnicowaną aktywność i selektywność strukturalną. Przykładami są: fibronektyna i witronektyna, wiążące się specyficznie do integryny αν|Ή fibrynogen z kolei do integryny α^β3 a tenascyna do ανβι i o^Pe; występują także oddziaływania ligandów z kilkoma różnymi typami integryn, np. lamininy i osteopontyny z integrynami. Wszystkie białka ECM wymienione powyżej charakteryzują się obecnością sekwencji aminokwasów Arg-Gly-Asp (inaczej RGD), otoczonej różnymi sekwencjami sąsiadującymi. Aktywność sekwencji RGD przejawia się głównie podczas transdukcji sygnału zewnątrzkomórkowego i proliferacji. Ponadto, integryny rozpoznające motyw RGD są uznawane za onkomarkery w niektórych guzach o wysokim potencjale do przerzutów. Konjugaty zawierające w swojej strukturze motyw RGD wykazują również pozytywne właściwości w stymulowaniu regeneracji tkanek kości, rogówki i serca.

RGD-zależne integryny pełnią istotną funkcję w plastyczności synaptycznej i chorobach układu nerwowego. Ich zadaniem jest przede wszystkim zapewnienie oddziaływań pomiędzy neuronami i komórkami glejowymi w postaci połączeń między cytoszkieletami tych komórek a macierzą zewnątrzkomórkową. Takie oddziaływania są nieodzowne do prawidłowego rozwoju układu nerwowego. Ponadto integryny uczestniczą w sprzężeniach receptorów neuroprzekaźnikowych, czym przyczyniają się do plastyczności synaptycznej, czyli mechanistycznej zdolności OUN do zmiany adaptacyjnych takich jak pamięć i uczenie się, jak również do zmian funkcjonalno-strukturalnych objawiających się w wyniku schorzeń neurologicznych, takich jak epilepsja, trauma, kontuzje czy neurodegeneracja. Jednak pomimo wielu dowodów eksperymentalnych potwierdzających powyższe doniesienia na temat roli integryn i ECM w neuropatologii, takich jak stwardnienie rozsiane, glejaki, guzy mózgu, choroby neurodegeneracyjne, epilepsja, udary, kontuzje neurologiczne i uszkodzenia nerwów obwodowych, wciąż niewiele wiadomo o mechanizmach molekularnych tych procesów.

Specyficzność wiązania sekwencji RGD do szerokiego spektrum receptorów zależy od jej konformacji i specyficzności allosterycznej względem centrum aktywnego danej integryny. Modyfikacje

PL 238 941 B1 budowy sekwencji RGD, takie jak C-amidacja lub N-acetylacja, zapewniają większą odporność na proteolizę w warunkach fizjologicznych. Z kolei, powielenie sekwencji aktywnej RGD w postaci oligopeptydu zwiększa aktywność motywu i zapewnia kontrolowane uwalnianie tripeptydu RGD w organizmie. W nawiązaniu do tych danych, interesujące wydają się badania in vivo, potwierdzające istotną i pozytywną rolę białek/peptydów zawierających motyw RGD w terapii schorzeń i uszkodzeń neurologicznych. Dane te wskazują na udział sekwencji RGD w allosterycznym blokowaniu oddziaływań integryna-białko ECM poprzez zmniejszenie liczby dostępnych receptorów integrynowych. Taka aktywność peptydów zawierających sekwencję RGD skutkuje terapeutycznym hamowaniem napadów padaczkowych oraz poprawą procesów poznawczych w modelu choroby Alzheimera. Pozytywny efekt peptydów zawierających sekwencję RGD wykazano również w regeneracji in vivo nerwów obwodowych, gdzie stymulowały odrost włókien nerwowych. Ponadto, implantacja włókien kolagenowych zawierających sekwencję RGD do uszkodzonych szczurzych nerwów obwodowych spowodowała wydzielanie czynników troficznych, proliferację komórek Schwanna, mielinację aksonów i tworzenie włókien nerwowych w początkowych dniach regeneracji. W szczurzym modelu uszkodzenia rdzenia nerwowego, polimery modyfikowane sekwencjami RGD zapewniły optymalne i stabilne rusztowanie umożliwiające odrost aksonów i nerwów. Produkty zawierające motyw RGD byłe również wykorzystane jako konjugat z peptydarni penetrującymi błonę komórkową (ang. cell-penetrating peptides, CPP) w celu przekroczenia bariery BBB. W szczurzym modelu ogniskowego udaru niedokrwiennego wykazano, że dootrzewnowo podany konjugat RGD-penetratyna skutecznie przenikał przez BBB do uszkodzonej półkuli mózgu, redukując tym samym obrzęk penumbry. Analiza mechanizmu molekularnego wykazała istotny wpływ produktów zawierających motyw RGD na sygnalizację zewnątrzkomórkową i stymulację angiogenezy.

RGD-zależne integryny pełnią kluczową rolę w transdukcji sygnału w przestrzeni synaptycznej. Jednak pomimo wielu danych eksperymentalnych, wciąż nieznane są szczegóły mechanizmów neuroprotekcji i neuroregeneracji, w które zaangażowane są zarówno integryny, jak i białka ECM, posiadające motyw RGD. Ze względu na udział integryn w długotrwałych procesach fizjologicznych, takich jak stan zapalny i apoptoza, nie wydaje się, żeby samo blokowanie tych receptorów było wystarczające do zapewnienia efektu terapeutycznego. Stąd konieczność prowadzenia badań podstawowych, mających na celu poznanie molekularnych podstaw tych mechanizmów. W ostatnich latach zwrócono uwagę na istotny wpływ peptydów zawierających motyw RGD na stymulację, proliferację, różnicowanie i migrację neuralnych komórek macierzystych (ang. neural stem cells, NSC). Wykazano, że biomateriały funkcjonalizowane peptydem RGD skutecznie promują przyleganie NSC do podłoża oraz ich dojrzewanie. Podobnie, rusztowania polimerowe, zawierające w swojej strukturze czynniki neurotroficzne i motywy RGD, powodują immobilizację ludzkich NSC, umożliwiając ich różnicowanie.

Jak wspomniano, w chorobach neurouszkodzeniowych, zachodzi cały szereg jednocześnie lub następczo po sobie działających procesów, których bezpośrednim lub pośrednim efektem jest śmierć komórek nerwowych, glejowych i innego rodzaju (Fig. 2A). Dysregulacja procesów biochemicznych i elektrochemicznych spowodowana uszkodzeniem przejawia się deprywacją energetyczną, stresem oksydacyjnym oraz acydozą, i w ogólnym przypadku prowadzi do ekscytotoksyczności. Proces ten jest wynikiem niekontrolowanej aktywacji wapniowo-zależnej receptorów glutaminianowych, objawiającym się akumulacją glutaminianu w przestrzeni synaptycznej i samonapędzającym się pobudzaniem neuronów. Techniki in vitro modelujące takie procesy są opisane w literaturze. Zastosowanie całej serii takich technik lub ich modyfikacji w ramach jednej, wieloczynnikowego sposobu/metody diagnostycznej, niosłoby dodatkowe korzyści ekonomiczne i merytoryczne (Fig. 2B). W naszym modelu przewidujemy zastosowanie i analizę skutków sześciu czynników uszkodzeniowych, obejmujących: deprywację glukozy, częściowe zahamowanie oddychania komórkowego i stres oksydacyjny (azydek sodu), oraz ekscytotoksyczność (indukowana kwasem glutaminowym (obejmująca także zwiększenie wewnątrzkomórkowego stężenia jonów wapnia), NMDA, kwasem kainowym) i zakwaszenie (inaczej acydoza, pH 6,35 spowodowane podwyższonym stężeniem mleczanu sodu). Połączenie pojedynczych technik jest wydajniejsze niż każda z nich stosowana tylko pojedynczo i pozwala uniknąć wystąpienia różnych problemów eksperymentalnych. Konieczność wielokrotnego powtarzania izolacji komórek z mózgu może powodować zmienność biologiczną na tle rozwojowym i chemicznym między sesjami i badaniami. Z kolei, zastosowana przez nas kompozycja w tym samym badaniu sześciu równoległych pomiarów odpowiedzi fizjologicznych na 6 czynników uszkodzeniowych kluczowych o uszkodzeniach OUN dla jednej partii (grupy o dokładnie tych samych cechach) wyizolowanych komórek, stanowi uproszczony model in vitro chorób neurouszkodzeniowych, będący swoistą i wydajną

PL 238 941 Β1 wieloczynnikową metodą badawczą. Zastosowanie równoległe aż 6 czynników uszkodzeniowych stanowi istotne udoskonalenie i nowość technologiczną.

Celem wynalazku jest dostarczenie nowych związków pozwalających na uzyskiwanie konkatamerycznych białek polisygnałowych, złożonych z monomerycznych jednostek peptydowych o zastosowaniu w medycynie regeneracyjnej.

Istotą wynalazku są związki chemiczne o działaniu przeciwuszkodzeniowym i/lub neuroprotekcyjnym o wzorach - sekwencje przedstawione są w postaci standardowych jednoliterowych skrótów aminokwasów:

H2N-RGD-amid

H₂N-RGD-RGD-amid

H₂N-RGD-RGD-RGD-amid acetyl-RGD-RGD-RGD-amid

H₂N-RGD-RGD-RGD-RGD-amid

H₂N-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-amid

H₂N-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-amid

H₂N-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-amid

H₂N-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-amid

H₂N-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-amid

H₂N-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-amid

IMSRSSP-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-PRRA (skrót RGD1), (skrót RGD2), (skrót RGD3), (skrót Ac-RGD3) (skrót RGD4), (skrót RGD5), (skrót RGD6), (skrót RGD7), (skrót RGD8), (skrót RGD9), (skrót RGD10-PM), (skrót RGD10-PS).

Wzory strukturalne:

RGD1:

PL 238 941 Β1

RGD3:

Ac-RGD3:

RGD4:

PL 238 941 Β1

RGD5:

RGD6:

RGD7:

RGD8:

RGD9:

PL 238 941 Β1

RGDIO-PM:

RGDIO-PS:

Wynalazek dotyczy zastosowania medycznego ww. związków.

Sposób oznaczania aktywności związków chemicznych o działaniu przeciwuszkodzeniowym i/lub neuroprotekcyjnym określonych powyżej na poziomie komórkowym, obejmował:

- deprywację glukozy

- inhibicję oddychania komórkowego przez azydek sodu

- acydozę poprzez zakwaszenie pH 6,35 mleczanem sodu

- ekscytotoksyczność wywołaną NMDA

- ekscytotoksyczność wywołaną kwasem glutaminowym

- ekscytotoksyczność wywołaną kwasem kainowym względem badanych komórek pobudliwych i/lub niepobudliwych.

Opisano analizę aktywności związków chemicznych oraz zestaw do oznaczania aktywności związków chemicznych o działaniu przeciwuszkodzeniowym i/lub neuroprotekcyjnym. Zestawień zawiera:

a) związek chemiczny wybrany spośród: RGD1; RGD2; RGD3; RGD4; AcRGD3, RGD10-PM; RGD10-PS, korzystnie RGD1,

b) komórki pobudliwe i/lub niepobudliwe w formie umożliwiającej hodowlę jednorodną lub hodowlę z mieszanym typem komórek,

c) pożywki umożliwiające wykonanie pomiarów testów przeżywałności hodowli komórkowej na różne stężenia badanego/testowanego związku oraz pomiary żywotności komórek po działaniu 6 czynników uszkodzeniowych i/lub neurotoksycznych, z tym że zakwaszenie/acydoza uzyskiwana jest przez pożywkę o pH 6,45 i działanie mleczanu sodu w stężeniu 200 mM lub innym zoptymalizowanym dla danego typu komórek, deprywacja energetyczno-oddechowa/deprywacja glukozy i stres oksydacyjny indukowany azydkiem sodu w stężeniu 10 mM lub innym zoptymalizowanym dla danego typu komórek i ekscytotoksyczność indukowana na 3 sposoby: 400 μΜ kwas glutaminowy, 800 μΜ NMDA i 800 μΜ kwas kainowy lub innych stężeniach zoptymalizowanych dla danego typu komórek.

Opis figur:

Fig. 1 - przedstawia schematycznie przebieg głównych zmian po uszkodzeniach ośrodkowego układu nerwowego.

Fig. 2 - przedstawia: (2A) schematycznie zjawiska zachodzące na poziomie molekularnym i komórkowym podczas różnorodnych uszkodzeń w obrębie ośrodkowego układu nerwowego oraz (2B) modelowane w niniejszym zgłoszeniu patentowym czynniki uszkodzeniowe umożliwiające przesiewowe a jednocześnie szczegółowe badanie na poziomie molekularnym i komórkowym efektywności nowych substancji w naprawie neuronów i komórek glejowych. Dalej wynalazek pokazano na:

Fig. 3 - przedstawia chromatogram HPLC peptydu RGD1.

Fig. 4 - przedstawia widmo ESI MS RGD1.

Fig. 5 - przedstawia chromatogram HPLC peptydu RGD2.

Fig. 6 - przedstawia widmo ESI MS peptydu RGD2.

PL 238 941 B1

Fig. 7 - przedstawia chromatogram HPLC peptydu RGD3.

Fig. 8 - przedstawia widmo ESI MS peptydu RGD3.

Fig. 9 - przedstawia chromatogram HPLC peptydu RGD4.

Fig. 10 - przedstawia widmo ESI MS peptydu RGD4.

Fig. 11 - przedstawia chromatogram HPLC peptydu RGD10-PM.

Fig. 12 - przedstawia widmo ESI MS peptydu RGD10-PM.

Fig. 13 - przedstawia elektroforezę żelową (A) i kapilarną (B) peptydu RGD10-PS. Opisy dla żelu A: M-marker masy, RGD10-PS-Ubq-hybrydowe białko peptydu RGD10-PS z ubikwityną, RGD10-PS - peptyd IMSRSSPRGDRGDRGDRGDRGDRGDRGDRGDRGDRGDPRRA odcięty od ubikwityny. Barwienie Coomassie.

Fig. 14 - przedstawia chromatogram HPLC peptydu AcRGD3.

Fig. 15 - przedstawia widmo ESI MS peptydu AcRGD3.

Fig. 16 - przedstawia sekwencję nukleotydową kasety wraz z zaznaczonymi rejonami funkcjonalnymi, zawierającej gen kodujący Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGD10 oraz eksprymowaną sekwencję aminokwasową fuzyjnego białka.

Fig. 17 - przedstawia sekwencję nukleotydową kasety wraz z zaznaczonymi rejonami funkcjonalnymi, zawierającej gen kodujący Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGDGG10 oraz eksprymowaną sekwencję aminokwasową fuzyjnego białka.

Fig. 18 - przedstawia mapę genetyczną ekspresyjnego konstruktu plazmidowego oraz sekwencję nukleotydową i aminokwasową z zaznaczonymi modułami funkcjonalnymi pET28amutSapIKASETARGD.

Fig. 19 - przedstawia mapę genetyczną ekspresyjnego konstruktu plazmidowego oraz sekwencję nukleotydową i aminokwasową z zaznaczonymi modułami funkcjonalnymi pET28amutSapIKASETARGD.

Fig. 20 - przedstawia mapę genetyczną ekspresyjnego konstruktu plazmidowego oraz sekwencję nukleotydową i aminokwasową z zaznaczonymi modułami funkcjonalnymi pET28amutSapIKASETARGDGG.

Fig. 21 - przedstawia mapę genetyczną ekspresyjnego konstruktu plazmidowego oraz sekwencję nukleotydową i aminokwasową z zaznaczonymi modułami funkcjonalnymi pET28amutSapIKASETARGDGG.

Fig. 22 - przedstawia białka His6-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGD10 oraz His6-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGDGG10.

22A) przedstawia wynik elektroforezy białek w warunkach denaturujących (SDS-PAGE, żel barwiony Coomassie Brilliant Blue) próbek pobranych z ekstraktów komórkowych oraz frakcji chromatograficznych preparatyki His6-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGD10, o przewidzianej bioinformatycznie masie cząsteczkowej 16,2 kDa, zgodnie z ujawnioną sekwencją aminokwasową (SEQ. 2). Ścieżka M oznacza wzorce masy cząsteczkowej białek: albumina krwi bydlęcej 66 kDa, owoalbumina 40 kDa, anhydraza węglanowa 29 kDa, sojowy inhibitor trypsyny 20/21 kDa, cytochrom C 12 kDa, aprotynina 6,5 kDa; ścieżka unb, niezwiązane białka komórkowe; w2, białka obecne w płukaniu kolumny; e3-6, frakcje elucji z kolumny.

22B) przedstawia wynik elektroforezy białek w warunkach denaturujących SDS-PAGE, w 12,5% żelu poliakrylamidowym Tris-Trycyna, z próbek pobranych z ekstraktów komórkowych oraz frakcji chromatograficznych preparatyki His6-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGDGG10 o przewidzianej bioinformatycznie masie cząsteczkowej 17,3 kDa. Ścieżka unb, niezwiązane białka komórkowe; w2, białka obecne w buforze po płukaniu kolumny; e3-6, frakcje elucji z kolumny.

22C) z próbek preparatyki His6-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGDGG10, wykonanej w warunkach kontrolnych, tj. bez indukcji hodowli IPTG. Ścieżka M, wzorce masy cząsteczkowej białek; ścieżka unb, niezwiązane białka komórkowe; w2, białka obecne w buforze po płukaniu kolumny; e3-6, frakcje elucji z kolumny.

Fig. 23 - przedstawia białko Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGD10.

Fig. 24 - przedstawia białko Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGDGG10.

Fig. 25 - przedstawia wynik trawienia białka Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGDGG10 enzymem YUH1.

Fig. 26 - przedstawia dwie techniki ilościowej oceny białek.

Fig. 27 - przedstawia schemat powielania syntetycznego odcinka DNA kodującego 10-mer RGD i 10-mer RGDGG.

PL 238 941 B1

Fig. 28 - przedstawia kierunkowe powielanie odcinka DNA, kodującego moduł RGD*10, za pomocą systemu enzymatyczno-wektorowego.

Fig. 29 - przedstawia mapy genetyczne konstruktów wektorów powielających, oznaczonych jako pET21d+_mutSapIRGD_20-100, zawierających wklonowane poli-10-mer-RGD, zawierające 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 kopii modułu kodującego peptyd RGD, o masach cząsteczkowych:

8,6 kDa, 12,0 kDa, 15,4 kDa, 18,7 kDa, 22,1 kDa, 25,5 kDa, 28,9 kDa, 32,3 kDa, 35,6 kDa.

Fig. 30 - przedstawia mapy genetyczne konstruktów wektorów powielających, oznaczonych jako pET21d+_mutSapIRGD_20-100, zawierających wklonowane poli-10-mer-RGD, zawierające 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 kopii modułu kodującego peptyd RGD, o masach cząsteczkowych:

Fig. 31 - przedstawia mapy genetyczne konstruktów wektorów powielających, oznaczonych jako pET21d+_mutSapIRGD_20-100, zawierających wklonowane poli-10-mer-RGD, zawierające 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 kopii modułu kodującego peptyd RGD, o masach cząsteczkowych:

Fig. 32 - przedstawia mapy genetyczne konstruktów wektorów powielających, oznaczonych jako pET21d+_mutSapIRGD_20-100, zawierających wklonowane poli-10-mer-RGD, zawierające 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 kopii modułu kodującego peptyd RGD, o masach cząsteczkowych:

Fig. 33 - przedstawia mapy genetyczne konstruktów wektorów powielających, oznaczonych jako pET21d+_mutSapIRGD_20-100, zawierających wklonowane poli-10-mer-RGD, zawierające 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 kopii modułu kodującego peptyd RGD, o masach cząsteczkowych:

Fig. 34 - przedstawia mapy genetyczne konstruktów wektorów powielających, oznaczonych jako pET21d+_mutSapIRGD_20-100, zawierających wklonowane poli-10-mer-RGD, zawierające 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 kopii modułu kodującego peptyd RGD, o masach cząsteczkowych:

Fig. 35 - przedstawia mapy genetyczne konstruktów wektorów powielających, oznaczonych jako pET21d+_mutSapIRGD_20-100, zawierających wklonowane poli-10-mer-RGD, zawierające 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 kopii modułu kodującego peptyd RGD, o masach cząsteczkowych:

Fig. 36 - przedstawia mapy genetyczne konstruktów wektorów powielających, oznaczonych jako pET21d+_mutSapIRGD_20-100, zawierających wklonowane poli-10-mer-RGD, zawierające 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 kopii modułu kodującego peptyd RGD, o masach cząsteczkowych:

Fig. 37 - przedstawia mapy genetyczne konstruktów wektorów powielających, oznaczonych jako pET21d+_mutSapIRGD_20-100, zawierających wklonowane poli-10-mer-RGD, zawierające 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 kopii modułu kodującego peptyd RGD, o masach cząsteczkowych:

Fig. 38 - przedstawia sekwencje Seq. 1; Seq. 2, Seq. 3, Seq. 4.

Fig. 39 - przedstawia reprezentatywne obrazy mikroskopowe uwidaczniania białek znacznikowych (epitopów) metodą immunocytochemiczną w komórkach izolowanych z mózgu szczura w pierwotnej hodowli neuralnej po pierwszym dniu hodowli in vitro. Panel górny (seria A): mała strzałka pokazuje komórkę dającą pozytywną reakcję na białko GFAP (zdjęcie A1) charakterystyczne dla astrocytów (komórek glejowych), zaś grot dużej strzałki wskazuje komórki posiadające białko DCX (dabulkortynę) (zdjęcie A2) charakterystyczne dla młodych neuronów (neuroblastów), barwienie Hoechst (zdjęcie A3) uwidacznia wszystkie komórki widoczne w polu widzenia.

Panel środkowy (seria B): pokazuje komórki wskazane grotem dużej strzałki, które przechodzą podziały komórkowe uwidocznione przez obecność białka Ki67 dla części okresu proliferacji (zdjęcie B2) oraz pokazuje wybrane komórki astrocytów wskazane małą strzałką aktualnie nie przechodzących podziałów komórkowych (zdjęcie B2). Panel dolny (seria C): przedstawia komórki neuralne wykazujące reaktywność immunocytochemiczną dla komórek prekursorowych poprzez obecność białka znacznikowego SOX2, wśród których są komórki o aktywności podziałowej jak komórki u dołu zdjęcia C1. Widoczne są także inne komórki (nieprekursorowe, niereaktywne na Sox2) wykazujące takie podziały komórkowe (wskazane grotem dużej strzałki na zdjęciu C2). Wniosek z obserwacji: w hodowli pierwotnej komórek neuralnych izolowanych z rozwijającej się kory mózgowej szczurów w pierwszym dniu hodowli jest duża różnorodność typów komórek o różnej aktywności proliferacyjnej.

PL 238 941 B1

Fig. 40 - przedstawia detekcję immunocytochemiczną charakterystycznych białek znacznikowych dla różnych współwystępujących populacji komórkowych w czternastym dniu hodowli in vitro (14 DIV): o złożonej prawidłowej morfologii dojrzałych astrocytów wykazujących obecność typowego dla nich białka GFAP, a także dojrzałych neuronów, wykazujących obecność charakterystycznego dla nich białka NeuN. W hodowli można wyróżnić komórki przechodzące podziały komórkowe, wykazujące immunoreaktywność dla białka Ki67 oraz komórek niedzielących się niewykazujących takiej immunoreaktywności. W hodowli w dniu 14, bez działania czynnika uszkodzeniowego, nie obserwuje się komórek przechodzących proces śmierci komórkowej (komórki niereaktywne dla białka kaspazy 3).

Fig. 41 - przedstawia odpowiedzi hodowli neuralnej na różne natężenie czynnika uszkodzeniowego w postaci deprywacji glukozy; na tej podstawie wyselekcjonowano działanie deprywacji przez 1 godzinę (słupek oznaczony szarym kolorem) do dalszych badań umożliwiający żywotność hodowli neuralnej na poziomie 70% do testowania neuroprotekcyjnego działania badanych peptydów.

Fig. 42 - przedstawia odpowiedzi hodowli neuralnej na różne natężenie działania czynnika uszkodzeniowego w postaci inhibicji oddychania komórkowego (stres oksydacyjny); na tej podstawie wyselekcjonowano działanie azydku sodu w stężeniu 10 mM (słupek oznaczony szarym kolorem) do dalszych badań umożliwiający żywotność hodowli neuralnej na poziomie około 65% do testowania neuroprotekcyjnego działania badanych peptydów.

Fig. 43 - przedstawia odpowiedzi hodowli neuralnej na różne natężenie czynnika uszkodzeniowego w postaci zakwaszenia pożywki (acydoza); na tej podstawie wyselekcjonowano działanie mleczanu sodu w stężeniu 200 mM (słupek oznaczony szarym kolorem) do dalszych badań umożliwiający żywotność hodowli neuralnej na poziomie około 70% do testowania neuroprotekcyjnego działania badanych peptydów.

Fig. 44 - przedstawia odpowiedzi hodowli neuralnej na różne natężenie czynnika uszkodzeniowego w postaci nadmiernego pobudzenia neuronów (ekscytotoksyczność) wywołaną kwasem glutaminowym); na tej podstawie wyselekcjonowano działanie kwasu glutaminowego w stężeniu 400 μM (słupek oznaczony szarym kolorem) do dalszych badań umożliwiający żywotność hodowli neuralnej na poziomie około 70% do testowania neuroprotekcyjnego działania badanych peptydów.

Fig. 45 - przedstawia odpowiedzi hodowli neuralnej na różne natężenie czynnika uszkodzeniowego w postaci nadmiernego pobudzenia neuronów (ekscytotoksyczność) wywołaną NMDA); na tej podstawie wyselekcjonowano działanie NMDA w stężeniu 800 μΜ (słupek oznaczony szarym kolorem) do dalszych badań umożliwiający żywotność hodowli neuralnej na poziomie około 70% do testowania neuroprotekcyjnego działania badanych peptydów.

Fig. 46 - przedstawia odpowiedzi hodowli neuralnej na różne natężenie czynnika uszkodzeniowego w postaci nadmiernego pobudzenia neuronów (ekscytotoksyczność) wywołaną kwasem kainowym; na tej podstawie wyselekcjonowano działanie kwasu kainowego w stężeniu 800 μΜ (słupek oznaczony szarym kolorem) do dalszych badań umożliwiający żywotność hodowli neuralnej na poziomie około 70% do testowania neuroprotekcyjnego działania badanych peptydów.

Fig. 47 - przedstawia wpływ peptydu RGD1 na przeżywalność hodowli neuralnej. Obserwowano brak cytotoksycznego działania peptydu RGD1 we wszystkich badanych stężeniach. Peptydem odniesienia (referencyjnym) jest peptyd TAT w stężeniu 50 μΜ oznaczony szarym słupkiem.

Fig. 48 - przedstawia wpływ peptydu RGD2 na przeżywalność hodowli neuralnej. Obserwowano bardzo niską cytotoksyczność peptydu RGD2 we wszystkich badanych stężeniach. Peptydem odniesienia (referencyjnym) jest peptyd TAT w stężeniu 50 μΜ oznaczony szarym słupkiem.

Fig. 49 - przedstawia wpływ peptydu RGD3 na przeżywalność hodowli neuralnej. Obserwowano niską cytotoksyczność peptydu RGD3. Peptydem odniesienia (referencyjnym) jest peptyd TAT w stężeniu 50 μΜ oznaczony szarym słupkiem.

Fig. 50 - przedstawia wpływ peptydu RGD4 na przeżywalność hodowli neuralnej. Peptydem odniesienia (referencyjnym) jest peptyd TAT w stężeniu 50 μM oznaczony szarym słupkiem.

Fig. 51 - przedstawia wpływ peptydu AcRGD1 na przeżywalność hodowli neuralnej. Peptydem odniesienia (referencyjnym) jest peptyd TAT w stężeniu 50 μΜ oznaczony szarym słupkiem.

Fig. 52 - przedstawia wpływ peptydu AcRGD3 na przeżywalność hodowli neuralnej. Peptydem odniesienia (referencyjnym) jest peptyd TAT w stężeniu 50 μΜ oznaczony szarym słupkiem.

Fig. 53 - przedstawia wpływ peptydu RGD10-PM, uzyskanego przez syntezę chemiczną, na przeżywalność hodowli neuralnej. Peptydem odniesienia (referencyjnym) jest peptyd TAT w stężeniu 50 μΜ oznaczony szarym słupkiem.

PL 238 941 B1

Fig. 54 - przedstawia wpływ peptydu RGD10-PS, uzyskanego przez syntezę biologiczną, na przeżywalność hodowli neuralnej. Peptydem odniesienia (referencyjnym) jest peptyd TAT w stężeniu 50 μΜ oznaczony szarym słupkiem.

Fig. 55 - przedstawia aktywność peptydu dzenia neurologicznego.

Fig. 56 - przedstawia aktywność peptydu dzenia neurologicznego.

Fig. 57 - przedstawia aktywność peptydu dzenia neurologicznego.

Fig. 58 - przedstawia aktywność peptydu dzenia neurologicznego.

RGD1

RGD2

RGD3

RGD4 wieloczynnikowym wieloczynnikowym wieloczynnikowym wieloczynnikowym modelu modelu modelu modelu in in in in vitro vitro vitro vitro uszkouszkouszkouszko-

Fig. 59 - przedstawia aktywność peptydu AcRGDI w wieloczynnikowym modelu in vitro uszkodzenia neurologicznego.

Fig. 60 - przedstawia aktywność peptydu AcRGD3 w wieloczynnikowym modelu in vitro uszkodzenia neurologicznego.

Fig. 61 - przedstawia aktywność peptydu RGD10-PM, uzyskanego przez syntezę chemiczną, w wieloczynnikowym modelu in vitro uszkodzenia neurologicznego.

Fig. 62 - przedstawia aktywność peptydu RGD10-PS, uzyskanego przez syntezę biologiczną, w wieloczynnikowym modelu in vitro uszkodzenia neurologicznego.

Fig. 63 - przedstawia schemat prowadzenia hodowli organotypowych skrawków hipokampa ex vivo i eksperymentu mającego na celu badanie potencjału neuroprotekcyjnego związków bioaktywnych. Do 8-dniowej hodowli dodawano jodek propidyny (PI) i przeprowadzano wstępną ocenę skrawków w mikroskopie fluorescencyjnym w celu eliminacji uszkodzonych skrawków. Po usunięciu PI, wraz ze świeżą pożywką dodawano czynnik indukujący ekscytotoksyczność - NMDA w stężeniu 100 μM, który usuwano po 3 godzinach oraz związek bioaktywny, który był obecny w pożywce do końca doświadczenia. Obserwację końcową prowadzono po 24 godzinach od rozpoczęcia eksperymentu, po wcześniejszym dodaniu PI dla uwidocznienia martwych komórek analizowanych następnie pod mikroskopem fluorescencyjnym. Procent komórek martwych (pozytywnych w barwieniu jodkiem propidyny) liczono za pomocą wzoru:

% komórek pozytywnych PI = (intensywność fluorescencji skrawka[FI]/max[FI]) χ 100%, zaś maksymalne uszkodzenie, czyli max[FI] wyznaczono działając na skrawki hipokampa NMDA w stężeniu 250 μM.

Fig. 64 - przedstawia bezpośredni efekt neuroprotekcyjny (przeciwuszkodzeniowy) peptydu RGD1 na żywe skrawki ex vivo z mózgu szczura. Pokazano reprezentatywne żywe skrawki zawierające ważne struktury mózgu zwane hipokampem w hodowli organotypowej poddane działaniu czynnika powodującego masową śmierć neuronów (NMDA w stężeniu 100 μΜ), gdzie obumierające neurony widoczne są jako czarne punkty po barwieniu jodkiem propidyny, a pierwotne obrazy z mikroskopu fluorescencyjnego zostały zamienione na wersje negatywowe:

A) przykład skrawka kontrolnego (z podaniem soli fizjologicznej zamiast NMDA),

B) przykład skrawka 24 godziny po działaniu przez 3 godziny czynnika uszkodzeniowego 100 μM NMDA,

C) przykład skrawka po działaniu przez 3 godziny czynnika uszkodzeniowego 100 μM NMDA a następnie działaniu przez 24 godziny roztworu 100 μΜ RGD1. Wyraźnie widoczne potwierdzenie neuroprotekcyjnego (przeciwuszkodzeniowego) działania peptydu RGD1 na żywych skrawkach z mózgu szczura w modelu uszkodzenia neurologicznego (ekscytotoksycznego).

Fi g. 65 - przedstawia analizę ilościową porównania badania śmiertelności komórek w żywych skrawkach ex vivo z mózgu szczura po działaniu czynnika uszkodzeniowego (NMDA w stężeniu 100 μΜ) oraz po wyraźnie neuroportekcyjnym działaniu peptydu RGD1 badanego w różnych stężeniach. Przedstawiono również porównanie, że działanie samego peptydu RGD1 (100 μM) nie wywierało negatywnego efektu na ilościowe pomiary śmiertelności komórek w porównaniu do hodowli kontrolnej, bez działania tego peptydu i czynnika urządzeniowego. Należy zwrócić uwagę na istotne statystycznie różnice śmiertelności między grupą z samym uszkodzeniem NMDA a grupami z uszkodzeniem i RGD1 w stężeniu 10 i 100 μΜ (Tukey’s Multiple Comparison Test, wartość P<0,05).

Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania.

PL 238 941 B1

P r z y k ł a d 1

Synteza chemiczna peptydów RGD.

Peptydy RGD1, RGD2, RGD3, RGD4, RGD10-PM i AcRGD3 zostały zsyntezowane na nośniku stałym, metodą Fmoc za pomocą syntezatora automatycznego z użyciem żywicy amidowej TentaGel S RAM. W trakcie syntezy acetylowanych analogów peptydów, odpowiednie peptydylożywice acetylowano N-acetyloimidazolem w dimetyloformamidzie (DMF) przez godzinę. Po syntezie peptydy odszczepiono z peptydylożywicy za pomocą 98% kwasu trifluorooctowego (TFA) i wytrącono zimnym eterem dietylowym. Surowe peptydy oczyszczano za pomocą preparatywnego HPLC z wykorzystaniem kolumny Maisch C-18 o wymiarach 250 χ 40 mm, wielkość ziaren 10 μm. Stosowano liniowy gradient acetonitrylu (ACN) z 0,08% dodatkiem TFA. Szybkość przepływu fazy ruchomej wynosiła 25 ml/min. Poszczególne frakcje analizowano przy pomocy analitycznego HPLC wykorzystując kolumnę Phenomenex Kinetex XB-C18, o wymiarach 150 χ 4,6 mm, wielkość ziaren 5 μm. Dla wszystkich peptydów stosowano gradient 0-20% ACN (z 0,08% dodatkiem TFA) w 30 min z przepływem 1 ml/min. Po oczyszczaniu peptydy zliofilizowano, a następnie umieszczono je w roztworze 0,01 M HCl w celu wymiany jonów z trifluorooctanowych na jony chlorkowe i ponownie zliofilizowano. Oczyszczone peptydy scharakteryzowano przy pomocy analitycznego HPLC oraz spektrometrii mas ESI wykorzystując spektrometr mas.

Charakterystykę uzyskanych peptydów pokazują Fig. 3-15. Chromatogramy HPLC pokazują czystość peptydów. Wszystkie zsyntezowane metodą syntezy na stałym nośniku peptydy miały >95% czystości. Natomiast spektrometria mas (ESI MS) pokazuje prawidłową tożsamość struktury peptydu oraz jego homogenność. Na widmach masowych widać sygnały odpowiadające jonom pseudomolekularnym (M+H)+ lub naładowanym w różnym stopniu (+2, +3, +4) danego peptydu.

P r z y k ł a d 2

Sposób uzyskiwania konkatamerycznych białek polisygnałowych, pochodnych peptydu RGD do celów pro-regeneracyjnych, wektory DNA do realizacji tego sposobu oraz białka polisygnałowe poli-RGD.

Przedmiotem wynalazku jest sposób uzyskiwania białek polisygnałowych, składających się ze spolimeryzowanego peptydu RGD i jego pochodnych o właściwościach pro-regeneracyjnych, wektory DNA do realizacji tego sposobu, biosyntetyzowane i izolowane białka polisygnałowe, procedury izolowania oraz peptydowe jednostki monomeryczne, użyte do konstrukcji białek polisygnałowych. Uzyskiwane zgodnie z wynalazkiem białka mogą znaleźć szereg zastosowań w regeneracji komórek, tkanek i narządów. Białka polisygnałowe mogą zawierać m.in. multimery hormonów peptydowych lub biologicznie czynne fragmenty białek sygnałowych, stymulujących procesy regeneracji tkanek. Białka polisygnałowe, umieszczone w ranie, mogą bezpośrednio stymulować proces regeneracji lub stopniowo uwalniać pod wpływem autodegradacji lub proteaz organizmu znajdujących się w ranie, biologicznie czynne peptydy, stymulujące regenerację.

Konstrukcję białek polisygnałowych wykonano stosując metody projektowania bioinformatycznego zoptymalizowanych genów, syntezy chemicznej kodującego DNA, klonowania molekularnego do bakterii Escherichia coli oraz zastrzeżonej technologii kierunkowego, enzymatyczno-wektorowego powielania odcinka DNA, z zachowaniem ciągłości kodowanej Otwartej Ramki Odczytu, kodującej konstruowane konkatameryczne białko polisygnałowe. Technologia opisuje również konstrukcję nanostruktur biologicznych w postaci opłaszczonych na drodze genetycznej białkami polisygnałowymi rekombinantowych bakteriofagów. Ww. technologia, jest przedmiotem patentu PL 228341 B (BioVentures Institute Sp. z o.o.).

P r z y k ł a d 3

Schemat realizacji sposobu według wynalazku.

Wyselekcjonowany bioaktywny peptyd RGD o działaniu przeciwuszkodzeniowym i/lub neuroprotekcyjnym, został poddany dalszym procedurom powielania na poziomie DNA, a w wyniku translacji uzyskanych konkatamerycznych genów, również został powielony na poziomie translacji in vivo w formie konkatamerycznego białka. Peptyd RGD został powielony w 2 wariantach: (i) RGD oraz (ii) RGDGG. Wariant RGDGG zawierał 2 dodatkowe reszty G. Założono, że te 2 powtarzające się reszty G tworzą nieustrukturyzowane segmenty polipeptydu pomiędzy segmentami RGD, stymulują motyw RGD do autonomicznego formowania struktury bioaktywnej oraz jego większej ekspozycji i dostępności w roztworze. Powielenie ww. motywów dokonano na 2 sposoby: (i) na poziomie syntezy chemicznej oraz (ii) z zastosowaniem ww. opatentowanej technologii powielania enzymatyczno-wektorowego in vitro/in vivo [Skowron i in. 2014-2017]. Stosując syntezę chemiczną możliwe jest

PL 238 941 B1 otrzymanie typowo jedynie 5-10 kopii powielonego odcinka DNA w konkatamerze. Stosując technologię wektorowo-enzymatyczną możliwe jest uzyskanie do 500 kopii powielonego odcinka DNA w konkatamerze. Konstrukcję białek polisygnałowych RGD przeprowadzono zatem stosując kombinację obu metod, w celu uzyskania spektrum klonowanych konkatamerów o różnej ilości kopii jednostek monomerycznych. W podejściu (i) zastosowano wielomodułową konstrukcję fuzyjnego białka polisygnałowego RGD i RGDGG, zawierającego następujące moduły: (a) znacznik Hiss - sześciu reszt histydyny na N-końcu celem zastosowania wysokowydajnej metody izolowania rekombinantowego białka chromatografią metalopowinowactwa; (b) znacznik c-Myc w celu zastosowania wysokoczułej detekcji rekombinantowego białka dedykowanymi przeciwciałami anty-c-Myc; (c) znacznik aminokwasowy WYY, celem usprawnienia detekcji rekombinantowego białka w świetle UV oraz podczas barwienia żeli elektroforetycznych; (d) ubikwitynę na N-końcu projektowanego białka, za znacznikami Hiss i c-Myc. Białko ubikwityna jest stosowane jako partner fuzyjny w celu poprawienia poziomu ekspresji fuzyjnych białek, obniżenia toksyczności białek, poprawienia ich stabilności in vivo. Ubikwitynę można opcjonalnie odciąć proteolitycznie od wyizolowanego białka fuzyjnego, stosując rekombinantowy enzym drożdżowa hydrolaza ubikwitynowa-Hiss (oznaczony dalej jako YUH1). Układ ten pozwala na odcięcie ubikwityny i poprzedzających ją sekwencji aminokwasowych bez pozostawienia dodatkowych reszt aminokwasowych w domenie białka fuzyjnego, zawierającej białko polisygnałowe; (e) białko polisygnałowe 10-mer RGD lub 10-mer RGDGG. W podejściu (ii) zastosowano powielanie odcinka DNA, kodującego 10-mer RGD i 10-mer RGDGG za pomocą wektora powielająco-ekspresyjnego, endonukleazy Sapl oraz ligazy DNA jak ujawniono w opisach patentowych opisujących technologię jak np.: PL228341, US 10874735, EP 15738474.4. Uzyskane konkatamery wyższego rzędu klonowano: (1) w miejsca Sapl wektora powielająco-ekspresyjnego, tworzącego fuzję białka polisygnałowego ze znacznikiem Hiss oraz (2) do wektora powielająco-ekspresyjnego, do którego uprzednio wklonowano syntetyczny segment DNA, zawierający zaprojektowany gen, kodujący białko fuzyjne Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe. Wektor ten posiada wewnętrzne miejsca Sapl, których ułożenie jest zaprojektowane w taki sposób, że cięcie DNA Sapl uwalnia białko polisygnałowe, pozostawiając kasetę Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna w wektorze. Po wklonowaniu konkatamerów wyższego rzędu, następuje ich fuzja z kasetą Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna, tworząc nowe białko fuzyjne, zawierające ww. kasetę oraz zwiększone ilości kopii jednostek monomerycznych RGD lub RGDGG w przyłączonych białkach polisygnałowych.

P r z y k ł a d 4

Projekt i klonowanie molekularne białek fuzyjnych, zawierających ubikwitynę, znaczniki peptydowe oraz białko polisygnałowe RGD10 i RGDGG10.

W przykładowej realizacji zaprezentowanej na Fig. 16, 17, 18, 19 zaprojektowano kasety DNA, zawierające moduł powielający Sapl oraz zoptymalizowane pod względem użycia kodonów w bakterii Escherichia coli syntetyczne geny, kodujące białka fuzyjne: Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGD10 (DNA ujawniony jako Seq. 1, kodowane białko ujawnione jako Seq. 2) oraz Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGDGG10 (DNA ujawniony jako Seq. 3, kodowane białko ujawnione jako Seq. 4) w bakterii Escherichia coli.

W przykładowej realizacji zaprezentowanej na Fig. 20, 21, 22, 23 zrealizowano klonowanie syntetycznych genów do wektora komercyjnego pET28(+), posiadający silny, hybrydowy promotor transkrypcji T7-lac, przekształcając wektor pET28(+) w wektor ekspresyjno-powielający, niosący zaprojektowane syntetyczne geny w konfiguracji optymalnej odległości od promotora T7-lac oraz sygnałów startu translacji ang. Ribosome Binding Site i kodonu ATG. Jako rekombinantowego gospodarza do biosyntezy skonstruowanych syntetycznych genów zastosowano laboratoryjny szczep ekspresyjny Escherichia coli BL21 Star (DE3). Sekwencję nukleotydową kasety wraz z zaznaczonymi rejonami funkcjonalnymi, zawierającej gen kodujący Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGD10 oraz eksprymowaną sekwencję aminokwasową fuzyjnego białka przedstawia Fig. 16. Sekwencję nukleotydową kasety wraz z zaznaczonymi rejonami funkcjonalnymi, zawierającej gen kodujący Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGDGG10 oraz eksprymowaną sekwencję aminokwasową fuzyjnego białka przedstawia Fig. 17. Kasety zostały poddane trawieniu enzymami Ncol oraz Xhol umożliwiając kierunkowe klonowanie segmentu DNA do wektora pET28(+) trawionego Ncol oraz Xhol. Zastosowano sposób łączenia DNA wektora i DNA kodujących kaset przez ligazę DNA bakteriofaga T4 w sposób, znamienny tym, że nastąpiło precyzyjne połączenie sygnałów startu transkrypcji i translacji wektora pET28a(+) z odcinkami kodującymi Otwarte Ramki Odczytu ORF, kodującymi białka fuzyjne: Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGD10 oraz Fiss-c-Myc-WYY

PL 238 941 B1

-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGDGG10. Uzyskaną mieszaninę ligacyjną poddano transformacji do bakterii Escherichia coli DH5a. Uzyskane klony posłużyły do izolowania plazmidowego DNA, który poddano analizie restrykcyjnej oraz sekwencjonowaniu DNA. Wybrano konstrukty plazmidowe pET28amutSapIKASETARGD oraz pET28amutSapIKASETARGDGG o właściwej sekwencji, zawierający niezmienione w stosunku do zaprojektowanych in silico kaset (a zatem nie zawierające niechcianych mutacji) sekwencje genów kodujących białka fuzyjne His6-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGD10 oraz His6-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGDGG10 oraz tranformowano je do szczepu ekspresyjnego, dedykowanego do wektora pET28a(+), uzyskując klony Escherichia coli BL21Star(DE3)[pET28amutSapIKASETARGD] oraz Escherichia coli BL21Star(DE3)[pET28amutSapIKASETARGDGG]. Fig. 18 i 19 przedstawia mapę genetyczną ekspresyjnego konstruktu plazmidowego oraz sekwencję nukleotydową i aminokwasową z zaznaczonymi modułami funkcjonalnymi pET28amutSapIKASETARGD. Fig. 20 i 21 przedstawia mapę genetyczną ekspresyjnego konstruktu plazmidowego oraz sekwencję nukleotydową i aminokwasową z zaznaczonymi modułami funkcjonalnymi pET28amutSapIKASETARGDGG.

P r z y k ł a d 5

Ekspresja klonowanych w bakterii Escherichia coli BL21Star(DE3) genów, kodujących białka fuzyjne His6-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGD10 oraz His6-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGDGG10.

Ujawnione w Przykładzie 2 skonstruowane klony Escherichia coli BL21Star(DE3)[pET28amutSapIKASETARGD] oraz Escherichia coli BL21Star(DE3)[pET28amutSapIKASETARGDGG] poddano przykładowej realizacji ekspresji genetycznej za pomocą eksperymentów transformacji bakterii Escherichia coli BL21Star(DE3), a następnie hodowli rekombinantowych bakterii w temperaturze 30°C na modyfikowanym do celów wysokiej ekspresji podłożu mikrobiologicznym 2xYT medium o składzie na 1 L (w wodzie destylowanej): Tryptone, 16 g; ekstrakt drożdżowy, 10 g; NaCl 5 g, pH 7,2 doprowadzone NaOH; bezpośrednio przed użyciem pożywki dodatek 20 ml sterylnego roztworu 1 M glukozy. Po osiągnięciu gęstości optycznej hodowli OD = 1 i indukcji ekspresji genu za pomocą 1 mM izopropylotiogalaktozydu (IPTG), hodowle prowadzono przez kolejne 4 godziny. Eksperymenty ekspresji genetycznej prowadzono w skali pilotażowej w 50 ml pożywki mikrobiologicznej, a następnie w skali preparatywnej w 1 L pożywki. W przykładowej realizacji zaprezentowanej na Fig. 22 białka His6-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGD10 oraz His6-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGDGG10 zostały izolowane z rekombinantowych komórek Escherichia coli z zastosowaniem następujących etapów: (i) odwirowano komórki przez 20 minut, przy przyspieszeniu kątowym 12 000 g w 4°C, następnie zawieszono biomasę komórek w buforze do lizy [50 mM fosforan sodu, pH 7,4, 300 mM NaCl, 0,75 mg/ml lizozymu z jaja kurzego, 2,5 μg/ml deoksyrybonukleazy 1, 0,1 mM inhibitor proteaz PMSF] w ilości 2% wyjściowej objętości hodowli rekombinantowych bakterii i inkubowano przez 10 minut w temperaturze 22°C; (ii) zastosowano dezintegrację ultradźwiękową z chłodzeniem zawiesiny komórek w łaźni lodowej i odwirowaniem bateryjnego debris; (iii) naniesiono supernatant na kolumnę do chromatografii metalopowinowactwa Talon [GE Healthcare Life Sciences, USA], zawierającą immobilizowane jony Co²⁺. Białka hybrydowe His6-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGD10 oraz His6-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGDGG10 zawierają znacznik His6, umożliwiający wysoce specyficzne wiązanie tych białek do kolumny Talon i uzyskanie bardzo wysokiego stopnia oczyszczenia. Kolumnę Talon, zrównoważoną w buforze T [50 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4, 300 mM NaCl] i zawierającą zaadsorbowane białka hybrydowe płukano 10 objętościami kolumny buforem W [50 mM fosforan sodu, pH 7,4, 300 mM NaCl; 10 mM imidiazol] a następnie eluowano 10 objętościami kolumny buforem E [50 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4, 300 mM NaCl; 150 mM imidiazol]. Fig. 22A; Fig. 22B; Fig. 22C. Porównanie obu preparatyk, ujawnionych na Fig. 22BC wykazuje masywną ekspresję rekombinantowego białka His6-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGDGG10 o przewidzianej bioinformatycznie masie cząsteczkowej 17,3 kDa, zgodnie z ujawnioną sekwencją aminokwasową (Seq. 4), a nieobecnego lub obecnego w śladowych ilościach w preparatyce kontrolnej. Izolowane białka fuzyjne zamrażano w ciekłym azocie, a następnie przechowywano w temperaturze -80°C. Celem ostatecznej weryfikacji tożsamości rekombinantowych białek His6-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGD10 oraz His6-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGDGG10 zostały poddane analizie immunologicznej za pomocą przeciwciał specyficznych wobec znaczników His6 oraz c-Myc, stosując metodę Western Blotting. W przykładowej realizacji zaprezentowanej na Fig. 23 białko His6-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGD10 oraz zaprezentowanej na Fig. 24 białko His6-c-Myc-WYY-Ubikwityna

PL 238 941 B1

-białko polisygnałowe RGDGG10, zostały poddane elektroforezie SDS-PAGE w 12,5% żelu poliakrylamidowym Tris-Trycyna, a następnie przeniesione metodą elektrotransferu w buforze TW [25 mM Tris, 192 mM glicyna, pH 8,3, 20% metanol, 0,04% SDS] na membranę PVDF. Po zakończonym transferze, membrana została zablokowana buforem TBST [50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20] z dodatkiem 5% odtłuszczonego mleka w proszku, poprzez łagodne wytrząsanie przez 2 godziny w temperaturze 4°C, przepłukana buforem TBST poprzez wytrząsanie 10 minut a następnie poddana reakcji z pierwszorzędowymi przeciwciałami króliczymi anty-Hiss (VTTF Sp. z o.o., Polska), stosując rozcieńczenie 1:5000 przez 18 godzin w 4°C, wytrząsając w buforze TBST. Niezwiązane przeciwciała zostały wypłukane przez 3-krotne wytrząsanie membrany przez 10 minut w buforze TBST. Związane przeciwciała królicze poddano reakcji ze sprzęgniętymi z enzymem alkaliczną fosfatazą drugorzędowymi kozimi przeciwciałami anty-króliczymi, zastosowanymi w rozcieńczeniu 1:10 000 w buforze TBST, wytrząsając membranę przez 1 godzinę w 22°C. Niezwiązane przeciwciała anty-królicze zostały wypłukane przez 3-krotne wytrząsanie membrany przez 10 minut w buforze TBST. W celu wizualizacji membrana została poddana reakcji z substratami chromogenicznymi Sigma fast BCiP/NBT (Sigma, USA) dla fosfatazy alkalicznej, wywoływane, dającymi nierozpuszczalny produkt o zabarwieniu fioletowo-niebieskim w miejscu kontaktu ze związanymi sprzęgniętymi przeciwciałami kozimi. Na Fig. 23 ścieżka M przedstawia wzorzec masy cząsteczkowej białek PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (ThermoFisher, USA); K, białko kontrolne o masie cząsteczkowej 130 kDa, zawierające znacznik His6; Apl, lizat komórkowy nanoszony na kolumnę Talon; w2, płukanie kolumny buforem W; e3, e4, e5, elucja związanych do kolumny Talon białek buforem E. Reakcję barwną wykazały prążki białkowe, odpowiadające oczekiwanej masie cząsteczkowej białek Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGD10 oraz Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwitynabiałko polisygnałowe RGDGG10. W przykładowej realizacji zaprezentowanej na Fig. 24 wykonano analogiczną procedurę do zaprezentowanej na Fig. 23, za wyjątkiem zastosowania przeciwciał pierwszorzędowych króliczych anty-c-Myc w rozcieńczeniu 1:1000 (Novus Biologicals, USA). Na Fig. 24 ścieżka M przedstawia wzorzec masy cząsteczkowej białek; Apl, lizat komórkowy nanoszony na kolumnę Talon; w2, płukanie kolumny buforem W; e3, e4, elucja związanych do kolumny Talon białek buforem E. Reakcję barwną wykazały prążki białkowe, odpowiadające oczekiwanej masie cząsteczkowej białka Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGDGG10 oraz niewielkiej ilości dimerów tych białek, wykrytych na membranie ze względu na większą czułość przeciwciał c-Myc. Obecność dimerów wynika prawdopodobnie z dużej ilości reszt G w powtarzających się regularnie motywach RGD i RGDGG, a tym samym ułatwionych interakcji interm olekularnych. Właściwość ta jest pożądana w przypadku zastosowania białek polisygnałowych w medycynie regeneracyjnej, gdyż uformowanie takiej supramolekularnej struktury obniża szybkość dyfuzji kompleksów białek polisygnałowych poza obszar aplikacji leku.

P r z y k ł a d 6

Odcinanie proteolityczne ubikwityny i znaczników peptydowych od białek polisygnałowych. Izolowanie i analiza odciętych białek polisygnałowych.

Preparaty białek Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGD10 oraz Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGDGG10 oczyszczone jak wskazano w Przykładzie 3 dializowano wobec buforu reakcyjnego enzymu YUH1 [50 mM fosforan potasu, pH 7,4, 300 mM NaCl], celem przeprowadzenia procedury odcinania segmentu polipeptydowego Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna od białek polisygnałowych. W przykładowej realizacji zaprezentowanej na Fig. 25 ujawniono wynik trawienia białka Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGDGG10 enzymem YUH1, stosując proporcję enzymu do substratu 1:10 (ww.) oraz prowadzono reakcję trawienia przez 16 godzin w temperaturze 4°C. Na ścieżce M wskazano standardy masy cząsteczkowej białek; 1, białko His6-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGDGG10; 2, białko Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGDGG10 trawione YUH1. Ścieżka 2 wskazuje na wydajne trawienie białka fuzyjnego Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna-białko polisygnałowe RGDGG10. Ocena wydajności następuje na podstawie zaniku formy nietrawionej oraz powstawania N-terminalnej domeny Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna. Nie jest możliwe ilościowa ocena uwalnianego białka polisygnałowego RGDGG10 oraz białko polisygnałowe RGD10 ze względu na brak reszt aminokwasów aromatycznych w sekwencjach ww. białek, których obecność jest konieczna do wybarwiania białek Coomassie Brilliant Blue na żelach elektroforetycznych SDS-PAGE. Stąd też białka polisygnałowe nie są bezpośrednio obserwowalne na żelach SDS-PAGE. Odcięte białko polisygnałowe RGDGG10 o masie cząsteczkowej 5,5 kDa oraz białko polisygnałowe RGD10 o masie cząsteczkowej 4,4 kDa oczyszczano, stosując etapy: (i) chroma

PL 238 941 B1 tografię metalopowinowactwa na kolumnach Talon, zrównoważonych w buforze T [50 mM fosforan sodu, pH 7,4, 300 mM NaCl], zastosowaną w celu związania odciętej N-terminalnej domeny Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna oraz niestrawionej porcji białka fuzyjnego; (ii) frakcjonowanie ultrafiltracyjne, poprzez sekwencyjne zastosowanie kolumienki wirowniczej z filtrem o wartości odcięcia 10 kDa (Vivaspin Turbo 15, Sartorius, Niemcy) - usuwającego enzym YUH1 o masie cząsteczkowej 26 kDa oraz (iii) zastosowanie kolumienki wirowniczej z filtrem o wartości odcięcia 3 kDa (Amicon Ultra 0,5 mL, MWCO 3 kDa, Millipore, USA), zatrzymującym odcięte białko polisygnałowe RGDGG10 o masie cząsteczkowej oraz białko polisygnałowe RGD10. Ultrafiltrację wykonano w wirówce o przyśpieszeniu kątowym 4000 g. Izolowane białka fuzyjne przechowywano: (i) poprzez zamrażanie w ciekłym azocie, a następnie umieszczenie w temperaturze -80°C lub (ii) poprzez liofilizację po uprzedniej wymianie buforu T na bufor L [50 mM węglan amonu, pH 7,4]. Ze względu na brak możliwości ilościowego i proporcjonalnego wybarwienia prążków białkowych białka polisygnałowego RGDGG10 i białka polisygnałowego RGD10 na żelach SDS-PAGE, zastosowano dwie techniki ilościowej oceny białek, ujawnione na Fig. 11 i 26: (i) wysokosprawną chromatografię sączenia molekularnego (SEC), wykonaną w buforze PBS [10 mM Na₂HPO4, 1,8 mM KH2PO4/ 2,7 mM KCI, 137 mM NaCl, pH 7,4] na kolumnie Superdex Peptide PC 3.2/300 (GE Healthcare, USA) oraz HPLC wykonaną na kolumnie C18. Obie techniki wykazują czystość białka powyżej 90%. Pik pojawiający się w 3. minucie elucji z kolumny C18 (Jupiter C18, 5 mm, 300 A, Phenomenex, USA) odpowiada pozycji elucji soli zawartych w preparacie białka polisygnałowego.

Sekwencja aktywna peptydu zawierającego dziesięciokrotnie powieloną sekwencję RGD (zawierający dodatkowo flanujące na N- i C-końcu sekwencje wynikające z procedury otrzymywania biotechnologicznego)

IMSRSSPRGDRGDRGDRGDRGDRGDRGDRGDRGDRGDPRRA (dalej oznaczanej jako RGD10-PS), otrzymany w procesie biotechnologicznym z bakteryjnego systemu ekspresji.

P r z y k ł a d 7

Konstrukcja białek polisygnałowych wyższego rzędu: reakcja powielania DNA, kodujących 10-mery RGD i klonowanie molekularne konkatamerów wyższego rzędu do wektora powielająco-ekspresyjnego.

Jak wskazano w Przykładzie 3, konstrukcja białek polisygnałowych o zwiększonej ilości kopii monomerów RGD i RGDGG wymaga zastosowania opatentowanej technologii powielania DNA i konstrukcji konkatamerycznych białek (Skowron i in. 2014-2017). Fig. 27 ujawnia schemat powielania syntetycznego odcinka DNA kodującego 10-mer RGD i 10-mer RGDGG. Klonowane kasety DNA, kodujące białka polisygnałowe, wskazane w Przykładzie 1, trawiono endonukleazą restrykcyjną SapI w taki sposób, że wycięto z wektorów pET28amutSapIKASETARGD oraz pET28amutSapIKASETARGDGG ich fragmenty, zawierające się pomiędzy konwergentnie skierowanymi sekwencjami DNA rozpoznawanymi przez SapI, pozostawiając ich segmenty kodujące N-terminalnej domeny Hiss-c-Myc-WYY-Ubikwityna w wektorach. Trawienie DNA wektorów wykonano w 50 μ! buforu S [20 mM Tris-octan, pH 7,9, 50 mM octan potasu, 10 mM octan magnezu, 100 μg/ml albuminy bydlęcej] w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Wycięte fragmenty kodujące 10-mer RGD oraz 10-mer RGDGG były opatrzone na końcach 5’ jednoniciowymi odcinkami DNA: CCC i GGG, pozwalającymi na uporządkowaną ligację odcinków DNA w tylko jednej orientacji z zachowaniem ciągłości Otwartej Ramki Odczytu, kodującej multimery RGD i RGDGG wyższego rzędu. Wycięte fragmenty rozdzielano z zastosowaniem elektroforezy w 2% żelu agarozowym w buforze TBE (220 mM Tris, 180 kwas borowy, 5 mM EDTA, pH 8,3) oraz izolowano z żelu metodą elektroelucji. Oczyszczone fragmenty poddano ligacji ligazą bakteriofaga T4, kontrolując czas reakcji w zakresie 5 minut do 2 godzin w temperaturze 22°C. Produkty ligacji poddano elektroforezie w 1,5% żelu agarozowym w buforze TBE i wycięto z żelu konkatamery monomerów RGD i RGDGG o liczbie kopii 20 i więcej. DNA izolowano z wyciętych fragmentów żelu i ligowano do wektora powielającego pET21d+_mutSapI, przeciętego endonukleazą restrykcyjną Sapl. Wektor powielający pET21d+_mutSapI posiada silny promotor transkrypcji T7-lac, rejony inicjacji translacji, moduł powielający, zawierający segment: znacznik Hiss-Sapl-Smal-Sapl.

Klonowane do tego wektora konkatamery nie tworzą fuzji z ubikwityną i rejonem WYY, jedynie ze znacznikiem Hiss. Fig. 28 ujawnia wyniki elektroforezy agarozowej w 1,5% żelu agarozowym w buforze TBE uzyskanych w wyniku powielania konkatamerów DNA poli-10-mer-RGD. Ścieżka M, marker wielkości DNA 100 bp (Thermofisher Scientific SM0321); ścieżka S, konkatamery DNA, zawierające wzrastające ilości kopii modułu RGD10.

PL 238 941 B1

Fig. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 ujawniają mapy genetyczne konstruktów wektorów powielających, oznaczonych jako pET21d+_mutSapIRGD_20-100, zawierających wklonowane poli-10-merRGD, zawierające 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 kopii modułu kodującego peptyd RGD, o masach cząsteczkowych: 8,6 kDa, 12,0 kDa, 15,4 kDa, 18,7 kDa, 22,1 kDa, 25,5 kDa, 28,9 kDa, 32,3 kDa, 35,6 kDa.

P r z y k ł a d 8

Sposób uzyskiwania i prowadzenia pierwotnych neuralnych (czyli neuronalnych i glejowych) hodowli komórek kory mózgowej.

Pierwotne neuralne hodowle korowe otrzymano z embrionów w wieku embrionalnym E18.5 szczurów stada Wistar. W tym celu ciężarne samice poddano anestezji i uśmiercono w komorze z dwutlenkiem węgla. W niektórych wypadkach eutanazję zwierząt przeprowadzono przy użyciu izofluranu. Z wyizolowawnych mózgów embrionów wycięto tkanki kory i przemyto je buforem HBSS, suplementowanym mieszaniną penicyliny i streptomycyny i HEPES. Następnie tkankę kory poddano trypsynizacji przez 10 minut w 37°C i homogenizowano mechanicznie w celu rozdrobnienia tkanki do formy zawiesiny pojedynczych komórek. Następnie komórki wirowano przy obrotach 300 rcf przez 4 minuty, zawieszono ponownie w HBSS i przeliczono w komorze Burkera w celu uzyskania gęstości zawiesiny komórkowej takiej samej we wszystkich doświadczeniach. Komórki przeniesiono do pożywki hodowlanej z Neurobasal lub Neurobasal-A suplementowanej 1 mM pirogronianem sodu, ze stężeniem końcowym glukozy 12,5 mM, suplementowanej B27 do stężenia 2%, L-glutaminą do 200 mM, kwasem glutaminowym do 10 mM, mieszaniną penicyliny/streptomycyny do 1% i wysiano na płytkach hodowlanych 24-dołkowych pokrytych poli-D-lizyną w liczbie 200 000 komórek/dołek. Hodowle neuralne (hodowle komórek nerwowych lub komórek glejowych lub mieszanina obu typów) inkubowano przez 14-15 dni w atmosferze 5% CO2 (95% powietrze, wilgotność 98%, 37°C). We wszystkich eksperymentach używano hodowli w 14-15 dniu in vitro.

P r z y k ł a d 9

Sposób charakteryzowania komórek w pierwotnej hodowli neuralnej metodą analizy detekcji immunocytochemicznej w celu wykazania różnorodności komórkowej.

W celu przeprowadzenia analizy jakościowej uzyskanych hodowli pierwotnych, komórki w pierwszym dniu in vitro (1 DIV) i czternastym dniu in vitro (14 DIV) utrwalono 4% paraformaldehydem, przemyto PBS i prowadzono immunocytochemiczną metodę charakteryzowania uzyskanych komórek stosując wysokospecyficzne przeciwciała diagnostyczne dla uwidocznienia populacji: neuronów (neuronów wczesnych - DCX i późnych - NeuN), astrocytów (GFAP), komórek macierzystych (SOX2), komórek dzielących się (Ki67) oraz komórek apoptotycznych (kaspaza 3). Zastosowano następujące przeciwciała pierwszorzędowe: królicze wykrywające GFAP (Dako Z0334, w stężeniu 1:1000), mysie wykrywające GFAP (Sigma G3893, w stężeniu 1:300), królicze wykrywające DCX (Abeam ab18723, w stężeniu 1:500), mysie NeuN (Millipore MAB11144, w stężeniu 1:300), kozie wykrywające SOX2 (SantaCruz sc17320, w stężeniu 1:500), królicze wykrywające Ki67 (Abeam ab16667, w stężeniu 1:200), królicze wykrywające kaspazę 3 (CST 9664, w stężeniu 1:125); oraz przeciwciała drugorzędowe wszystkie ośle (Jackson Immunoresearch): z fluoroforem Alexa488 oraz Alexa594 wykrywające przeciwciała królicze, z fluoroforem Alexa488 oraz Alexa594 wykrywające przeciwciała mysie, z fluoroforem Alexa488 oraz Alexa594 wykrywające przeciwciała kozie. Efekty immunodetekcji obrazowano w mikroskopie epifluorescencyjnym, zbierano systemem komputerowej analizy obrazu i przetwarzano obrazy fluorescencyjne na wersje negatywowe (ciemne pola wskazują wysoką zawartość uwidacznianego białka). Jednoczesne uwidacznianie białek znacznikowych z wykorzystaniem drugorzędowych przeciwciał sprzężonych z różnymi fluoroforami wzbudzanymi światłem o różnej długości fali pozwalało na złożone analizy współwystępowania lub określenia braku znaczników w tych samych komórkach (w odniesieniu do nieselektywnego barwnika komórkowego Hoechst). Reprezentatywne obrazy mikroskopowe po dniu 1 hodowli przedstawiono na Fig. 39, zaś analizy lokalizacji znaczników w hodowli dojrzałej, w 14 dniu hodowli in vivo, przedstawiono na Fig. 40. Na podstawie analiz mikroskopowych wykazano, że w hodowli pierwotnej komórek neuralnych izolowanych z rozwijającej się kory mózgowej szczurów nie tylko w pierwszym dniu hodowli, ale również w dniu czternastym, jest duża różnorodność typów komórek o różnej aktywności proliferacyjnej i ten model in vitro dobrze reprezentuje różnorodność populacji neuralnych in vivo. Analizy wykazały obecność m.in. neuroblastów (niedojrzałych neuronów, immunopozytywna reakcja na DCX) oraz neuronów (NeuN) i astrocytów (GFAP), obserowowano też liczne komórki ze znacznikiem komórek macierzystych (SOX2) i komórek dzielących się (Ki67). Jednocześnie w dniu

PL 238 941 B1 hodowli, bez działania czynników uszkodzeniowych nie obserwuje się komórek przechodzących proces śmierci komórkowej (brak w nich reakcji na kaspazę 3 w metodzie immunocytochemicznej).

P r z y k ł a d 10

Sposób uzyskania wieloczynnikowego modelu uszkodzenia neurologicznego do badania in vitro skuteczności neuroprotekcyjnej i przeciwuszkodzeniowej potencjalnych substancji farmakologicznie czynnych.

Przedmiotem wynalazku jest sposób diagnozowania neuroprotekcyjnego działania peptydów w modelu kilku czynników współwystępujących podczas zaburzeń neurouszkodzeniowych. Model in vitro uszkodzenia neurologicznego zoptymalizowano dla 14-15-dniowej pierwotnej neuralnej hodowli komórek izolowanych bezpośrednio z kory mózgowej otrzymanych z embrionów szczura Wistar i może być stosowany z powodzeniem dla innych typów komórek. Model opiera się na ekspozycji komórek na czynniki uszkodzeniowe, modelujące dysfunkcje biochemiczne i neurochemiczne obecne przy schorzeniach i urazach układu nerwowego. Model zawiera równoległe użycie silnych czynników uszkodzeniowych takich jak zakwaszenie, czyli acydozę, deprywację energetyczno-oddechową (deprywację glukozy i stres oksydacyjny indukowany azydkiem sodu) i ekscytotoksyczność indukowaną niezależnie kwasem glutaminowym, NMDA i kwasem kainowym. Warunki uszkodzeniowe zoptymalizowano w taki sposób, aby siła działania czynnika uszkodzeniowego powodowała w każdym przypadku spadek o 30-40% odpowiedzi diagnozowanych testem CellTiterBlue (fluorofor CTB w modyfikowanym teście biochemicznym typu MTT) oceny żywotności komórek na podstawie mierzalnej oceny funkcji metabolicznych mitochondriów. W tym celu komórki inkubowano z czynnikiem fluorescencyjnym CTB przez 1-4 godziny w 37°C (5% CO2). Sam test przeżywalności zoptymalizowano uprzednio na płytkach 96-dołkowych pokrytych poli-D-lizyną. Mechanizm molekularny testu zakłada konwersję rezazuryny (kolor ciemnoniebieski) do rezorufiny (kolor różowy) w mitochondriach żywych komórek. Intensywność fluorescencji czynnika CTB mierzona jest spektrofluorymetrycznie (560ex/590em) i jest proporcjonalna do liczby żywych komórek. Próbki komórek kontrolnych (niczym nie traktowanych) stanowiły 100% żywotności a sygnały z pozostałych dołków były odnoszone względem kontroli i prezentowane jako średnia ± SD. Analiza statystyczna obejmowała test ANOVA z wartością p<0,05 uznawaną za statystycznie istotną. Każdy eksperyment wykonany został co najmniej trzykrotnie.

1) Optymalizacja natężenia działania deprywacji glukozy jako czynnika neurouszkodzeniowego dla uzyskania sposobu do określania skuteczności przeciwuszkodzeniowej i/lub neuroprotekcyjnej potencjalnych substancji farmakologicznie czynnych

W celu optymalizacji warunków deprywacji glukozy, z płytek z komórkami usunięto pożywkę hodowlaną, komórki natychmiast przemyto 300 μl PBS (pH 7,4) i inkubowano z 500 μl pożywki pozbawionej glukozy i pirogronianu sodu (Neurobasal-A, opisany powyżej) w standardowych warunkach przez 10, 30 minut i 1, 2, 3 godziny. Każda płytka zawierała komórki kontrolne inkubowane w standardowej pożywce hodowlanej (ze stężeniem glukozy 12,5 mM). Po odpowiednim czasie we wszystkich dołkach zamieniono pożywkę bez glukozy na świeżą pożywkę standardową (500 μl). Komórki hodowano w standardowych warunkach i po 20 godzinach zmierzono przeżywalność hodowli. Jak przedstawiono na Fig. 41, na tej podstawie wyselekcjonowano działanie deprywacji przez 1 godzinę (słupek oznaczony szarym kolorem) do dalszych badań umożliwiający przy stosowaniu czynnika uszkodzeniowego utrzymanie żywotności hodowli neuralnej na poziomie około 70% do późniejszego testowania neuroprotekcyjnego działania badanych peptydów.

2) Optymalizacja natężenia inhibicji oddychania komórkowego indukowanej azydkiem sodu jako czynnika neurouszkodzeniowego dla uzyskania sposobu do określania skuteczności przeciwuszkodzeniowej i/lub neuroprotekcyjnej potencjalnych substancji farmakologicznie czynnych Inhibicja oddychania komórkowego (stres oksydacyjny) była modelowana poprzez inkubację komórek z azydkiem sodu w różnych stężeniach. W tym celu z płytek z komórkami usunięto pożywkę hodowlaną, przemyto natychmiast 300 μl HBSS i inkubowano w pożywce hodowlanej zawierającej azydek sodu w stężeniach 1, 5, 10, 20 i 50 mM przez 1 godzinę w standardowych warunkach. Po inkubacji pożywkę wymieniono na standardową (500 μl) i inkubowano komórki w standardowych warunkach przez 20 godzin, po czym zmierzono przeżywalność hodowli. Jak przedstawiono na Fig. 42, na tej podstawie wyselekcjonowano działanie azydku sodu w stężeniu 10 mM (słupek oznaczony szarym kolorem) do dalszych badań, umożliwiający przy stosowaniu takiego czynnika uszkodzeniowego utrzymanie żywotności hodowli neuralnej na poziomie około 65-70% do późniejszego testowania neuroprotekcyjnego działania badanych peptydów.

PL 238 941 B1

3) Optymalizacja natężenia acydozy z pH 6,35 i działania mleczan sodu jako czynnika neurouszkodzeniowego dla uzyskania sposobu do określania skuteczności przeciwuszkodzeniowej i/lub neuroprotekcyjnej potencjalnych substancji farmakologicznie czynnych

W celu ustalenia warunków acydozy konieczne było zoptymalizowanie pH i stężenia mleczanu sodu. Po usunięciu pożywki hodowlanej i przemyciu 300 μl PBS (pH 7,4) komórki inkubowano w 500 μl Neurobasal o pH: 7,4 (kontrola), 6,5, 6,35, 5,55, 5,2 i 4,6 (ustanowione przy użyciu 0,1 M HCl). Stężenie mleczanu sodu optymalizowano analogicznie, poprzez inkubację komórek w pożywce zawierającej mleczan sodu w stężeniach 50, 200 i 1000 mM. Na koniec zmierzono efekt synergistyczny obu czynników. Po godzinnej inkubacji wymieniono pożywkę na standardową i inkubowano komórki przez 20 godzin. Jak przedstawiono na Fig. 43, na tej podstawie wyselekcjonowano działanie mleczanu sodu w stężeniu 200 mM (słupek oznaczony szarym kolorem) do dalszych badań umożliwiający przy stosowaniu takiego czynnika uszkodzeniowego utrzymanie żywotności hodowli neuralnej na poziomie około 70% do późniejszego testowania neuroprotekcyjnego działania badanych peptydów.

4) Optymalizacja natężenia ekscytotoksyczności indukowanej NMDA, kwasem glutaminowym i kwasem kainowym jako trzech czynników neurouszkodzeniowych dla uzyskania sposobów do określania skuteczności przeciwuszkodzeniowej i/lub neuroprotekcyjnej potencjalnych substancji farmakologicznie czynnych

Ekscytotoksyczność optymalizowano przy niezależnym użyciu trzech typowych modeli: nadmiar kwasu glutaminowego, NMDA i kwas kainowy. Wszystkie próbki czynników ekscytotoksycznych przygotowano tuż przed eksperymentem w pożywkach hodowlanych w stężeniach: 400, 800, 1200, 1600, 2000 μM. Przed podaniem czynników, z płytek usunięto pożywkę hodowlaną, przepłukano komórki 300 μl PBS (pH 7,4) a następnie inkubowano je przez 1 godzinę z czynnikami ekscytotoksycznymi w warunkach standardowych. Komórki inkubowano z każdym czynnikiem oddzielnie. Następnie wymieniono pożywki i inkubowano komórki przez następne 20 godzin w standardowych warunkach. Jak przedstawiono odpowiednio na Fig. 44, 45 i 46, na tej podstawie wyselekcjonowano działanie kwasu glutaminowego w stężeniu 400 μM, NMDA w stężeniu 800 μM oraz kwasu kainowego w stężeniu 800 μM (słupki oznaczone szarym kolorem na Fig. 44, 45 i 46) do dalszych badań umożliwiając przy stosowaniu dla takiej intensywności czynników uszkodzeniowych utrzymanie żywotności hodowli neuralnej na poziomie około 70% do późniejszego testowania neuroprotekcyjnego działania badanych peptydów.

P r z y k ł a d 11

Sposób prowadzenia testów przeżywalności pierwotnej hodowli neuralnej oraz wyniki pomiarów wpływu peptydów poliRGD na przeżywalność hodowli neuralnej.

Żywotność hodowli neuralnej mierzono ilościowo przy użyciu testu CellTiterBlue (CTB, patrz Przykład 10). Intensywność fluorescencji czynnika CTB mierzono spektrofluorymetrycznie (560ex/590em) i jest proporcjonalna do liczby żywych komórek. Próbki komórek kontrolnych (niczym nietraktowanych) stanowiły 100% żywotności a sygnały z pozostałych dołków były odnoszone względem kontroli i prezentowane jako średnia ± SD. Analiza statystyczna obejmowała test ANOVA z wartością p<0,05 uznawaną za statystycznie istotną. Każdy eksperyment wykonany został co najmniej trzykrotnie.

Wpływ peptydów poliRGD na przeżywalność pierwotnej neuralnej hodowli korowej testowano poprzez 20-godzinną ekspozycję komórek na każdy peptyd rozpuszczony w pożywce hodowlanej w stężeniu (1, 10, 100, 250 μM) i inkubację w standardowych warunkach (5% CO2, 95% powietrze, wilgotność 98%, 37°C). Wyjątkiem był peptyd RGD10-PS, który testowano w stężeniach: 0,05, 0,1, 0,25, 1, 2,5, 5, 10, 25 μM, i inkubowano w warunkach opisanych powyżej. Jako referencję stosowano roztwór peptydu TAT w stężeniu 50 μM. Testy przeprowadzano na płytkach 24-dołkowych pokrytych poli-D-lizyną w objętości roboczej 500 μl/dołek. Odpowiednie roztwory peptydów sporządzono w taki sposób, aby w każdym dołku z komórkami wymienić nie więcej niż 50 μl pożywki, włączając w to dołki z komórkami kontrolnymi (nietraktowane peptydem). Każde stężenie peptydu testowano w czterech dołkach.

Pomiary prowadzono w odniesieniu do peptydu porównawczego (referencyjnego) Tat(4957)NH2 (oznaczanego jako TAT) w stężeniu 50 μM.

W przypadku pomiarów przeżywalności komórek w próbkach kontrolnych (bez dodawanego peptydu), w celu zachowania optymalnych warunków, wymieniano odpowiednie objętości pożywki na nową pożywkę. Z odczytów testu CellTiterBlue dla tych prób uzyskano wartość średnią oznaczaną jako 100%, którą stosowano później jako wartość referencyjną (odniesienia) dla pomiarów tych testów w przypadku zastosowania poszczególnych czynników uszkodzeniowych. Podkreślić należy, że dla

PL 238 941 B1 każdego czynnika uszkodzeniowego uzyskiwano odrębną wartość referencyjną, oznaczaną jako 100% w ramach tej samej sesji pomiarowej i tych samych warunków, co w przypadku stosowanych analogów RGD.

Na podstawie przeprowadzonej analizy ilościowej uzyskanych pomiarów spektrofluorymetrycznych wykazano generalnie brak cytotoksycznego działania (lub co najwyżej niewielkie działania cytotoksyczne w pojedynczych przypadkach) dla testowanych stężeń dla peptydów:

RGD1 (Fig. 47), RGD2 (Fig. 48), RGD3 (Fig. 49), RGD4 (Fig. 50), AcRGD3 (Fig. 52), RGD10-PM (Fig. 53), RGD10-PS (Fig. 54).

P r z y k ł a d 12

Neuroprotekcyjny wpływ peptydów RGD in vivo w modelu uszkodzenia neurologicznego.

Wpływ neuroprotekcyjny peptydów RGD badano w modelu in vivo uszkodzenia neurologicznego, w skład którego wchodziły: deprywacja glukozy (Neurobasal-A bez dodatku glukozy, którą w każdym innym przypadku używano w stężeniu 12,5 mM), acydoza (Neurobasal o pH 6,35, mleczan sodu w stężeniu 200 mM), stres oksydacyjny (azydek sodu w stężeniu 10 mM) i ekscytotoksyczność (kwas glutaminowy w stężeniu 400 μM, NMDA w stężeniu 800 μM i kwas kainowy w stężeniu 800 μM), analizowane niezależnie. W tym celu wykorzystano 14-15-dniowe pierwotne komórki neuralne, hodowane na płytkach 24-dołkowych pokrytych poli-D-lizyną w standardowej pożywce (Neurobasal, stężenie glukozy 12,5 mM, 500 μl/dołek). Aktywność każdego peptydu analizowano na dwóch płytkach 24-dołkowych, z zastosowaniem w każdej po trzy czynniki uszkodzeniowe (po 6 dołków na dany czynnik): pierwsza - deprywację glukozy, stres oksydacyjny i acydozę, druga - trzy induktory ekscytotoksyczności. Na każdej płytce obecnych było co najmniej sześć dołków z komórkami kontrolnymi. Trzy dołki z każdego rzędu z danym czynnikiem uszkodzeniowym przeznaczono do późniejszej inkubacji (po ekspozycji przez 1 godzinę na czynnik uszkodzeniowy) w świeżej pożywce, natomiast pozostałe trzy - do analogicznej inkubacji w pożywce z danym peptydem.

Wszystkie czynniki uszkodzeniowe przygotowano bezpośrednio przed eksperymentem. Sterylne roztwory peptydów RGD1, RGD2, RGD3, RGD4, RGD10-PM oraz AcRGD3 przyrządzono w pożywce hodowlanej w stężeniu 100 μM. Próbkę RGD10-PS przyrządzono w stężeniu 1 μg/ml. Próbkę referencyjną peptydu TAT przyrządzono w stężeniu 50 μM (wybrane na podstawie własnej optymalizacji). Jak wspomniano, przed podaniem peptydu, wszystkie komórki poddano 1-godzinnej ekspozycji na czynniki uszkodzeniowe w standardowych warunkach (5% CO2, 37°C). W tym celu, w przypadku stresu oksydacyjnego i ekscytotoksyczności, wymieniono 250 μ! w każdym dołku i dodano odpowiednie czynniki do ich końcowego stężenia, jak opisano powyżej. W przypadku deprywacji glukozy i acydozy, cała objętość pożywki została wymieniona na pożywkę zawierającą dany czynnik uszkodzeniowy, po uprzednim przemyciu komórek 300 μl sterylnego PBS. Po 1-godzinnej inkubacji czynniki uszkodzeniowe zostały całkowicie usunięte i przemyto komórki 300 μ! PBS. Następnie, jak wyjaśniono powyżej, jedną połowę dołków z komórkami inkubowano w świeżej pożywce, a drugą połowę komórek - w pożywce z peptydem. Po 20-godzinnej inkubacji w standardowych warunkach przeprowadzono test przeżywalności, opisany powyżej. Wszystkie peptydy badano w co najmniej trzech powtórzeniach każdorazowo dla nowej partii izolowanych komórek. Statystykę przeprowadzono w sposób analogiczny do poprzednich eksperymentów.

Wyniki przeciwuszkodzeniowego i/lub neuroprotekcjnego działania peptydów poliRGD przedstawiają wykresy Fig. 55-62. Peptydy RGD wykazują wybiórcze właściwości ochronne na działanie poszczególnych czynników uszkodzeniowych. Należy zaznaczyć, że w przypadku RGD1 taka aktywność jest widoczna w odniesieniu do wszystkich metod uszkodzenia.

20-godzinna inkubacja w 100 μM roztworze RGD1 skutkuje znaczącym wzrostem żywotności hodowli neuralnej wobec wszystkich badanych czynników uszkodzeniowych. W wypadku pozostałych peptydów obserwowano istotne właściwości neuroprotekcyjne wobec niektórych czynników uszkodzeniowych.

P r z y k ł a d 13

Potwierdzenie skuteczności przeciwuszkodzeniowego działania peptydu RGD1 bezpośrednio w skrawkach mózgu ex vivo poddanych ekscytotoksyczności wywołanej przez NMDA.

Model ex vivo uszkodzenia neurologicznego w szczurzych skrawkach hipokampalnych

Potencjalną aktywność neuroprotekcyjną/przeciwuszkodzeniową peptydów RGD zweryfikowano na przykładzie peptydu RGD1, którego działanie badano bezpośrednio w szczurzych skrawkach hipokampalnych (czyli zawierających hipokamp), poddanych działaniu czynnika uszkodzeniowego w postaci NMDA. Zastosowanie tego agonisty receptora glutaminianowego indukuje kaskadę proce

PL 238 941 B1 sów uszkodzeniowych w skrawkach hipokampa, czyli struktury mózgu odpowiedzialnej m.in. za uczenie i pamięć przestrzenną oraz powstawanie emocji u ludzi i innych ssaków, co może być wykorzystane jako czuły model do badania farmakologicznego efektu leków i substancji osłonowych. Skrawki hipokampalne uzyskano z osesków P7 szczurów stada Wistar i prowadzono jako hodowle organotypowe według zmodyfikowanej metody Stoppiniego. W tym celu, oseski poddano dekapitacji, hipokampy zostały starannie wyizolowane z mózgów i za pomocą urządzenia typu Tissue Chopper uzyskano z nich skrawki tkankowe o grubości 400 μm. Skrawki hodowano na płytkach 6-dołkowych z wkładkami hodowlanymi (4 skrawki/wkładka, MILLICELL CM Millipore o porach 0,4 μm i średnicy 30 mm), w pożywce zawierającej 50% Neurobasal, 22% HBSS suplementowanej w 25% surowicą końską i w 2% B27, 1M HEPES; glukoza 5 mg/ml; w 1% penicyliny i streptomycyny. Hodowlę rozpoczynano w pożywce z 25% surowicą końską, którą stopniowo (w trakcie kolejnych dni) zastępowano pożywką bez surowicy. Hodowle prowadzono przez 8 dni w warunkach 36°C i w atmosferze 5% CO2 zgodnie ze schematem przedstawionym na Fig. 63. W ósmym dniu hodowli przeprowadzano badanie neuroprotekcyjnego działania peptydów RGD (Fig. 64 i 65). W tym celu skrawki dzielono na cztery grupy doświadczalne:

grupa 1) kontrola - skrawki hodowane w pożywce bez surowicy oraz bez NMDA i bez testowanego peptydu;

grupa 2) kontrola + badany peptyd - skrawki hodowane w pożywce bez surowicy wraz z testowanym peptydem (badanie toksyczność peptydu);

grupa 3) NMDA - skrawki hodowane w pożywce bez surowicy z czynnikiem uszkadzającym (100 μM NMDA), który po 3 h był usuwany;

grupa 4) NMDA + badany peptyd - skrawki hodowane w pożywce bez surowicy z czynnikiem uszkadzającym (100 μM NMDA) oraz testowanym peptydem, po 3 h inkubacji NMDA usuwano i do końca doświadczenia pozostawał sam peptyd.

Ocena uszkodzenia neurologicznego i neuroprotekcyjnego działania peptydu RDG1 w skrawkach z mózgu szczurów

Skrawki we wszystkich czterech grupach wybarwiono ~1 μM jodkiem propidyny (znakującym martwe komórki) i inkubowano przez 30 minut w celu eliminacji martwych skrawków. Następnie hodowle hipokampalne w grupie 4 poddano ekspozycji na mieszaninę 100 μM NMDA i RGD1 w trzech stężeniach: 1, 10, 100 μM (w dniu doświadczenia, peptydy były zawieszane w autoklawowanej wodzie, a następnie filtrowane i trzymane na lodzie w 4°C), po czym inkubowano skrawki w standardowych warunkach przez 3 godziny. Po tym czasie we wszystkich grupach zmieniano pożywkę w celu usunięcia zawartości NMDA poprzez całkowitą wymianę pożywki na pożywkę bez surowicy i zawierającą RGD1 w odpowiednich stężeniach. Skrawki następnie inkubowano przez 24 godziny, po czym na 30 minut przed końcową detekcją oceny uszkodzenia ponownie je wybarwiono dodając 6 μM jodku propidyny w celu uwidocznienia komórek uszkodzonych oraz oceny efektu neuroprotekcyjnego peptydu RGD1 i wszystkie skrawki poddano analizie ilościowej przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego i systemu do komputerowej analizy obrazu. Śmiertelność komórek w skrawku obliczano jako stosunek intensywności fluorescencji danego skrawka i maksymalnej fluorescencji, która w tym przypadku została uzyskana po potraktowaniu skrawków kontrolnych 250 μM NMDA.

Na przykładowych zdjęciach skrawków hipokampalnych na Fig. 64 widać różnicę gęstości wybarwionych punktów fluorescencyjnych odpowiadających niskiej śmiertelności neuronów w warunkach kontrolnych (a) i wysokiej śmiertelności po zastosowaniu 100 μM NMDA (b). Pomiary gęstości obumierających komórek dowodzą neuroprotekcyjnych i/lub przeciwuszkodzeniowych właściwości peptydu RGD1 w modelu ex vivo ekscytotoksyczności występującej m.in. w uszkodzeniach udarowych mózgu. Jak wykazano na Fig. 65, peptyd RGD1 nie wykazuje istotnej toksyczności w tym modelu a ponadto działa ochronnie w stężeniu 10 i 100 μM.

P r z y k ł a d 14

Zestaw do sposobu oznaczania in vitro aktywności przeciwuszkodzeniowej i/lub neuroprotekcyjnej związków chemicznych w komórkach hodowli neuralnej, który zawiera 6 czynników uszkodzeniowych w zjawiskach nagłych uszkodzeń układu nerwowego kręgowców w tym człowieka oraz związek referencyjny do uzyskania sposobu porównania odpowiedzi biologicznych i fizjologicznych badanych komórek.

Zestaw służy do oznaczania in vitro aktywności przeciwuszkodzeniowej i/lub neuroprotekcyjnej związków chemicznych względem komórek pochodzących z hodowli neuralnej lub nieneuralnej. W rozszerzonych doświadczeniach z powodzeniem stosowano proponowany zestaw diagnostyczny

PL 238 941 B1 do badania aktywności przeciwuszkodzeniowej w innych rodzajach komórek niż neurony, np. wzbogacane hodowle astrocytów. Opisywany zestaw umożliwia oznaczanie własności przeciwuszkodzeniowych i/lub neuroprotekcyjnych w szerokiej puli różnych komórek mogących uczestniczyć w sytuacji klinicznej i badań przedklinicznych w naprawie uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego. Wykazano potencjał regeneracyjny szerokiej gamy komórek różnego pochodzenia, wśród nich wykazano udział w naprawie uszkodzeń OUN dla komórek macierzystych, tkankowo-specyficznych komórek macierzystych (zarówno progenitorów jak i prekursorów), progenitorów, prekursorów, młodocianych (niedojrzałych form) oraz dojrzałych form aktywnych i nieaktywnych: neuronów, astrocytów, oligodendrocytów, mikrogleju, gleju nabłonka węchowego, adipocytów, komórek układu krwiotwórczego i odpornościowego i inne oraz może obejmować komórki indukowane do własności pluripotentnych w sposób naturalny (w tym tzw. Very Small Embryonic Like (VSEL) Stem Cells i inne) oraz indukowane w sposób stymulowany przez człowieka (w tym tzw. indukowane komórki pluripotentne, z ang. induced pluripotent stem (iPS) cells i inne) oraz nieograniczony co do gatunku zwierząt z których pochodzi, w tym nieograniczony do komórek ssaków oraz człowieka. Takie pozytywne przykłady dotyczą także hodowli nie tylko pierwotnych, także na liniach komórkowych, przede wszystkim dobrym przykładem są stosunkowo liczne publikacje dotyczące zastosowania różnych grup komórek na zwierzętach i u człowieka (komórek pochodzenia własnego lub obcego) w naprawie uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego.

Stąd w zakresie komórek dla których możliwe jest zastosowanie opisywanego zestawu do sposobu oznaczania in vitro aktywności neuroprotekcyjnej i/lub przeciwuszkodzeniowej są również komórki nie będące neuronami. W zakresie niniejszego wynalazku dla komórek pubudliwych, (w tym neuronów) zakładamy zastosowanie co najmniej 4 spośród 6 czynników uszkodzeniowych naśladujących na poziomie komórkowym kluczowe naturalne procesy zachodzące podczas nagłych uszkodzeń układu nerwowego. Dla komórek niepobudliwych w zakresie ochrony patentowej zakładamy zastosowanie 3 spośród 6 opisanych czynników uszkodzeniowych (np. badanie zjawi sk ekscytotoksyczności wywołanych kaninianem, glutaminianem lub NMDA dla komórek niepobudliwych nie musi być słuszne).

W zestawie powinien być używany związek referencyjny (inaczej traktowany też jako związek porównawczy lub kalibrujący) dający pozytywne odpowiedzi wobec stosowanych czynników uszkodzeniowych. W szczególności związek referencyjny powinien umożliwiać uzyskanie względem kontroli (komórek nie poddanych działaniu pojedynczych czynników uszkodzeniowych) co najmniej 4 pozytywnych istotnie statystycznie pomiarów spośród kompletu 6 czynników uszkodzeniowych in vitro dla komórek pobudliwych (np. neuronów). Przykładem takiego związku mogą być niektóre peptydy, w tym doskonałym przykładem jest peptyd RGD1 w stężeniu 100 μM będący również w zakresie niniejszego zastrzeżenia patentowego (Fig. 55), który daje istotne statystycznie zmiany w przeciwuszkodzeniowym działaniu dla wszystkich 6 czynników uszkodzeniowych in vitro. Dla związku referencyjnego używanego do komórek niepobudliwych można zakładać istotne statystycznie zmiany dla co najmniej 3 spośród kompletu 6 czynników, tym bardziej, że końcowy powszechny test CTB (modyfikowany test biochemiczny MTT) opisywany jest przede wszystkim dla określania żywotności komórek niepobudliwych.

Zastosowanie zestawu do sposobu oznaczania in vitro aktywności przeciwuszkodzeniowej i/lub neuroprotekcyjnej związków chemicznych w komórkach hodowli neuralnej, ale możliwe jest także dla komórek w hodowli nieneuralnej, obejmuje hodowle jednorodne lub mieszane różnych typów i źródła pochodzenia komórek kręgowców w tym komórek człowieka.

Zawiesina komórek stosowanych w zestawie może zawierać 1a) świeżo izolowane komórki ze struktur biologicznych od zwierząt (zwłaszcza ssaków) lub w ścisłym reżimie czasu z tkanki pochodzącej z materiału ludzkiego z biopsji lub post mortem umożliwiające założenie hodowli pierwotnej mieszanej lub 1b) po hodowli modyfikującej, czyli po zastosowaniu w dalszych etapach hodowli czynników selekcyjnych/różnicujących wzrost może zawierać tylko wybrane frakcje komórek (np. po dodaniu substancji cytostatycznej typu AraC według odpowiedniego schematu stosowania może być pozbawiona wszystkich komórek dzielących się) lub po dodaniu substancji suplementujących/wzbogacających pierwotne komórki mogą być różnicowane do innych typów nawet pierwotnie nieobecnych w mieszaninie komórkowej. Możliwe jest też zastosowanie 1c) świeżo izolowanych komórek selekcjonowanych na szybko ze struktur biologicznych na zasadzie własności fizycznych (np. w wirowaniu różnicującym według wielkości) lub własności biologicznych (zawierających selekcjonujące epitopy powierzchniowe lub wewnątrzkomórkowe umożliwiające selekcjonowanie technikami powinowactwa

PL 238 941 B1 biologicznego z użyciem selektywnych immunoglobulin sprzężonych z fluoroforami lub cząstkami magnetycznymi i rozdział w metodzie sortowania na podstawie sygnału fluorescencyjnego lub chromatografii kolumnowej powinowactwa biologicznego lub fizykochemicznego). Wreszcie mogą być stosowane 1d) zawiesiny komórkowe zmodyfikowane na podłożach stałych technikami biologii molekularnej np. indukowane komórki pluripotentne (iPS) uzyskanymi przez osobę/zespół dostarczający zestaw lub uzyskane z innego źródła. Zatem mogą byś stosowane 2a) pierwotne mieszaniny komórkowe lub 2b) mieszaniny ze wzbogaconą zawartością określonych subpopulacji lub 2c) hodowle jednorodne z jednym typem hodowanych komórek. Odrębnym rodzajem komórek stosowanych w zestawie mogą być 3) linie komórkowe, najczęściej o unieśmiertelnionej charakterystyce podziałowej populacji. Mogą być zastosowane 4a) komórki pobudliwe, charakteryzujące się przewodnictwem elektrycznym, np. dorosłe neurony, neuroblasty (młodociane neurony o odmiennej charakterystyce przewodnictwa jak dojrzałe neurony) i inne dające odpowiedzi fizjologiczne na czynniki pobudzeniowe, w tym czynniki ekscytotoksyczne, oraz 4b) komórki niepobudliwe nie dające odpowiedzi na czynniki ekscytotoksyczne a reagujące na czynniki ogólnego rodzaju, np. jak czynniki wpływające na procesy energetyczne i metaboliczne (deprywacja glukozy, częściowa deprywacja tlenowa/stres oksydacyjny, acydoza i działanie mleczanu).

Jednym z przykładów, nieorganiczającym zastosowania zestawu do sposobu oznaczania in vitro aktywności przeciwuszkodzeniowej i/lub neuroprotekcyjnej związków chemicznych, jest izolacja mieszaniny typów komórek z wybranych struktur rozwijającego się mózgowia lub rdzenia kręgowego szczurów, myszy lub innych ssaków, izolowanych w okresie przedurodzeniowym (prenatalnym), wczesnopourodzeniowym (neonatalnym) lub od osobników dorosłych. Tak też zastosowano w niniejszym zgłoszeniu patentowym, gdzie zastosowano: komórki świeżo izolowane bez modyfikacji z wybranych struktur mózgu szczura (1a) lub z modyfikacjami różnicującymi (1b), były to mieszaniny komórkowe (2a) lub populacje ze wzbogaconą zawartością określonych subpopulacji (neuronów po wyeliminowaniu na podłożach komórek dzielących się) (2b), były stosowane komórki pobudliwe jak neurony i neuroblasty (4a) w mieszaninie z komórkami niepobudliwymi jak astrocytami i innymi rodzajami komórek glejowych (4b).

Komórki w ramach zestawu są zastosowane w formie pierwotnej zawiesiny żywych komórek lub w głębokim zamrożeniu i po rozmrożeniu są w odpowiedniej gęstości hodowane w szalkach wielodołkowych na podłożach pokrytych lamininą lub poli-D-lizyną jak w opisanych wcześniejszych przykładach lub bez takiego pokrycia w „Pożywce N” (skład podany poniżej) lub w innych pożywkach. Możliwa jest opcjonalnie samodzielna izolacja komórek neuralnych ze struktur biologicznych, która odbywa się w „Pożywce D” zawierającej w sterylnej wodzie 10% Hank’s Balanced Salt Solution suplementowanej penicyliną i streptomycyną do końcowego stężenia 1% oraz 1% HEPES. Fragmenty tkankowe poddawane są działaniu „Pożywki E” o składzie pożywki D z dodatkiem 0,08% trypsyny i inkubowane od kilku do kilkunastu minut w 37°C w zależności od rodzaju tkanki. Po oddzielaniu komórek przez wirowanie i kilkukrotne przepłukanie „Pożywką D” komórki są hodowane zazwyczaj od 7 do 14 dni lub przez inny okres w odpowiedniej gęstości określonej na podstawie pomiarów mikroskopowych. Pożywki dla komórek neuralnych („Pożywka N”), w której na bazie Neurobasal znajduje się 2% B27, L-glutamina w stężeniu 200 mM, kwas glutaminowy w stężeniu do 10 mM i penicylina i streptomycyna 1%, z dodatkiem glukozy w stężeniu zależnym od rodzaju tkanki, z której izolowano komórki, zazwyczaj w stężeniu końcowym 12,5 mM i z dodatkiem lub bez dodatku pirogronianu sodu (zazwyczaj do końcowego stężenia 1 mM). Komórki wysiewa się na płytkach hodowlanych 24-dołkowych pokrytych poli-D-lizyną w liczbie 200 000 komórek/dołek lub na płytkach 96-dołkowych pokrytych poli-D-lizyną w liczbie 30 000 komórek/dołek. Hodowle neuralne (hodowle komórek nerwowych lub komórek glejowych lub mieszanina obu typów) lub komórki nieneuralne inkubuje się przez 14-15 dni zazwyczaj w atmosferze 5% CO2 (95% powietrze, wilgotność 98%, 37°C) lub innej.

Zestaw obejmuje wykonanie pomiarów testów przeżywalności hodowli komórkowej na różne stężenia badanego peptydu oraz pomiary żywotności po działaniu 6 czynników uszkodzeniowych i/lub neurotoksycznych.

Model zawiera równoległe użycie w oddzielnych dołkach z komórkami pochodzącymi z jednej izolacji silnych czynników uszkodzeniowych takich jak zakwaszenie, czyli acydozę (pH 6,45 i działanie mleczanu sodu w stężeniu 200 mM lub innym zoptymalizowanym dla danego typu komórek), deprywację energetyczno-oddechową (deprywację glukozy i stres oksydacyjny indukowany azydkiem sodu w stężeniu 10 mM lub innym zoptymalizowanym dla danego typu komórek) i ekscytotoksyczność (400 μM kwas glutaminowy, 800 μM NMDA i 800 μM kwas kainowy lub innych stężeniach zoptymaliPL 238 941 B1 zowanych dla danego typu komórek). Warunki uszkodzeniowe prowadzi się w taki sposób, aby siła działania czynnika uszkodzeniowego powodowała w każdym przypadku spadek o 30-40% odpowiedzi diagnozowanych testem CellTiterBlue (fluorofor CTB w modyfikowanym teście biochemicznym typu MTT) lub innym testem oceny żywotności komórek na podstawie mierzalnej oceny funkcji metabolicznych mitochondriów. W przypadku testu CTB komórki inkubuje się z czynnikiem fluorescencyjnym CTB przez 1-4 godziny w 37°C (5% CO2). Intensywność fluorescencji czynnika CTB mierzona jest spektrofluorymetrycznie (560ex/590em) i jest proporcjonalna do liczby żywych komórek. Próbki komórek kontrolnych (niczym nietraktowanych) stanowią 100% żywotności a sygnały z pozostałych dołków są odnoszone względem kontroli i prezentowane jako średnia ± SD.

W hodowlach kontrolnych prowadzi się hodowle bez dodatku badanej substancji, w hodowlach referencyjnych prowadzi się hodowlę z dodatkiem substancji referencyjnej, zazwyczaj jest nią peptyd RGD1 w stężeniu 100 μΜ lub innym ustalonym dla danego typu komórek.

Pozycje literaturowe do odczynników dla Przykładu 15

1. Brewer GJ, Cotman CW., Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density: advantages of a sandwich culture technique or low oxygen. Brain Res. 1989,494(1):65-74.

2. Brewer GJ, Torricelli JR, Evege EK, Price PJ., Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 1993;35(5):567-76.

Wszystkie wykorzystywane w zestawie substancje chemiczne mają czystość chemiczną co najmniej klasy ‘czyste do analizy’.

Podsumowanie

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wydajnego i wieloczynnikowego oznaczania i analizy aktywności przeciwuszkodzeniowych i/lub neuroprotekcyjnych związków o potencjalnej aktywności farmakologicznej, także synteza chemiczna i biotechnologiczna peptydów poliRGD oraz analogów peptydu RGD i wykazanie własności biologicznych (przeciwuszkodzeniowych i/lub neuroprotekcyjnych) tych związków po działaniu czynnikami uszkodzeniowymi.

Otrzymane peptydy wykazywały stabilność w warunkach fizjologicznych. Wprowadzenie modyfikacji n w postaci C-amidacji i N-acetylacji skutkuje zwiększoną odpornością związku na proteolizę, natomiast zwielokrotnienie sekwencji motywu RGD zazwyczaj zmniejsza jego aktywność, jednakże umożliwia wydłużone w czasie uwalnianie związku w organizmie. Zarówno synteza chemiczna na nośniku stałym, jak i produkcja biotechnologiczna zapewniły czystość, specyficzność i wydajność otrzymanych związków.

Jak opisano powyżej, motyw RGD jest istotnym elementem białek macierzy zewnątrzkomórkowej rozpoznawanych przez integryny i odpowiedzialnych m.in. za plastyczność synaptyczną i poprawne funkcjonowanie OUN, i jako takie mogą być stosowane jako neuroprotektanty. Peptyd z pojedyczym motywem RGD oraz peptydy poliRGD i ich analogi mogą okazać się skutecznym narzędziem w terapii chorób neurouszkodzeniowych w obliczu kosztownej produkcji leków opartych na strukturze białek ECM. Uszkodzenie układu nerwowego, zapoczątkowane przez mechaniczne przerwanie ciągłości naczyń krwionośnych i bariery krew-mózg prowadzi do szeregu zaburzeń metabolicznych i neurochemicznych, których ostatecznym wynikiem jest nadmierna, samostymulująca się pobudliwość neuronów oraz długotrwały stan zapalny. W przedmiotowym wynalazku proponujemy zestaw sześciu takich czynników neurouszkodzeniowych, jako wydajny sposób do efektywnego przesiewowego poszukiwania związków neuroprotekcyjnych i także szczegółowej analizy biologicznej aktywności potencjalnych farmakologicznie czynnych w uszkodzeniach ośrodkowego układu nerwowego na poziomie komórkowym. W celu wykazania neuroprotekcyjnych właściwości peptydów RGD, pierwotne hodowle neuralne uzyskane z kory mózgowej szczurów Wistar eksponowano w pierwszej kolejności na uszkodzenia a następnie poddano działaniu peptydu. Żaden z testowanych peptydów nie wykazywał znaczących efektów cytotoksycznych w badanych zakresach stężeń, podobnie jak związek referencyjny, którym w tym przypadku był peptyd TAT. Ponadto poszczególne badane peptydy poliRGD wykazały właściwości przeciwuszkodzeniowe i/lub neuroprotekcyjne w stosunku do wszystkich lub wybranych czynników uszkodzeniowych.

Peptyd RGD1 wykazał najszersze spektrum działania, co może być związane ze zwiększoną dostępnością sekwencji aktywnej, która w przypadku zwielokrotnionych analogów uwalnia się dopiero po skutecznej hydrolizie enzymatycznej. Z drugiej strony zastosowanie peptydów z powtórzonymi sekwencjami może zapewniać stabilność i kontrolowane uwalnianie w dłuższym czasie.

PL 238 941 B1

Jak dowiedziono w toku eksperymentów, większość peptydów poliRGD działa przeciwuszkodzeniowo i/lub neuroprotekcyjnie przeciw skutkom uszkodzenia spowodowanego ekscytotoksycznością. Jak wspomniano, ekscytotoksyczność pojawia się w następstwie deprywacji oddechowo-energetycznej i dysregulacji ekspresji receptorów integrynowych w błonie komórkowej. Te obserwacje zostały potwierdzone w zwierzęcym modelu udaru niedokrwiennego. Właściwości przeciwuszkodzeniowe analogów poliRGD są również widoczne w przypadku acydozy oraz stresu oksydacyjnego. Komórki nerwowe, a w szczególności neurony, są podatne na nadmierne zakwaszenie środowiska spowodowane obecnością kwasu mlekowego, czyli metabolitu oddychania beztlenowego, pojawiającego się jako skutek udaru. Patologiczne następstwa zarówno dysregulacji oddychania komórkowego, jak i stresu oksydacyjnego, będącego konsekwencją zaburzeń energetycznych w mitochondriach, mogą być złagodzone przez działanie peptydów poliRGD, ponieważ wyżej wspomniane procesy podlegają kontroli m.in. integryn modulowanych przez inne białka zawierające w swojej sekwencji motyw RGD znajdujących się w błonie komórkowej, co zostało z kolei potwierdzone w szczurzym modelu choroby Parkinsona. W celu zweryfikowania aktywności RGD1 w modelu ekscytotoksyczności ex vivo, peptyd ten podano do skrawków hipokampalnych szczura, traktowanych NMDA. Eksperyment ten dodatkowo dowiódł przeciwuszkodzeniowych i/lub neuroprotekcyjnych właściwości peptydu RGD1.

Przesłanki literaturowe sugerują, że duże białka zawierające natywne motywy RGD (inaczej jak w niniejszym zgłoszeniu, w którym badamy same peptydy RGD i ich powtórzenia i modyfikacje) prawdopodobnie działają poprzez integryny (aktywowane właśnie poprzez sekwencje RGD) obecne w kolcach dendrytycznych podczas reorganizacji cytoszkieletu w neuronach hipokampa zależnej od aktywacji receptorów NMDA i kinazy typu II zależnej od jonów wapnia i kalmoduliny (CaMKII).

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Związek chemiczny o działaniu przeciwuszkodzeniowym i/lub neuroprotekcyjnym, w którym rdzeń stanowi sekwencja RGD będąca sekwencją aminokwasową: Arg-Gly-Asp, przy czym związek stanowi następującą sekwencję: H2N-RGD-amid

H2N-RGD-RGD-amid

H2N-RGD-RGD-RGD-amid acetyl-RGD-RGD-RGD-amid H2N-RGD-RGD-RGD-RGD-amid H2N-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-amid H2N-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-amid H2N-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-amid H2N-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-amid H2N-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-amid H2N-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-amid lub IMSRSSP-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-RGD-PRRA.
2. Związek chemiczny określony w zastrz. 1 do zastosowania jako środek leczniczy o działaniu przeciwuszkodzeniowym i/lub neuroprotekcyjnym.