PL240524B1

PL240524B1 - Nanokoniugat diglicynowej pochodnej [60]fullerenu z gemcytabiną, sposób jego otrzymywania oraz jego zastosowanie.

Info

Publication number: PL240524B1
Application number: PL428457A
Authority: PL
Inventors: Maciej Serda; Paweł Nalepa; Robert Gawecki; Anna Mrozek-Wilczkiewicz; Robert Musioł
Original assignee: Univ Slaski
Priority date: 2018-12-31
Filing date: 2018-12-31
Publication date: 2022-04-19
Also published as: PL428457A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest nanokoniugat diglicynowej pochodnej [60]fullerenu z gemcytabiną, o strukturze przedstawionej we Wzorze 2, oraz sposób jego otrzymywania, który polega na tym, że diglicynową pochodną [60]fullerenu (1 ekwiwalent) o strukturze przedstawionej na Wzorze 1. Istotę wynalazku stanowi również zastosowanie nanokoniugatu diglicynowej pochodnej [60]fullerenu z gemcytabiną, o strukturze przedstawionej na Wzorze 2, do wytwarzania leku o działaniu przeciwnowotworowym, wykorzystywanego w leczeniu nowotworów trzustki lub nowotworów piersi.

Description

PL 240 524 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nanokoniugat diglicynowej pochodnej [60]fullerenu z gemcytabiną, sposób jego otrzymywania oraz jego zastosowanie.

Dużym problemem badawczym dla współczesnych naukowców zajmujących się tematyką chemii medycznej jest synteza skutecznych leków przeciwnowotworowych, działających selektywnie na nowotwór trzustki i piersi. Obecnie gemcytabiną jest standardem w leczeniu raka trzustki, a także pomocniczo w przypadku nowotworów piersi i jajników. Farmaceutyk ten należy do szerokiej grupy antymetabolitów pirymidyny, wpływających na zatrzymanie replikacji DNA komórki i prowadzących do tzw. programowej śmierci apoptozy. Niestety skuteczność tego polarnego leku w przypadku przerzutujących stadiów nowotworu trzustki jest wysoce niesatysfakcjonująca, co wynika bezpośrednio z jego szybkiego metabolizmu do nieaktywnej formy monofosforanu, a także rozkładu gemcytabiny przez nukleazy. W związku z tym prowadzone są intensywne badania nad nowymi nanoterapeutykami oraz nanoformulacjami, jak również selektywnymi metodami dostarczania gemcytabiny do tkanek nowotworowych, co wyraża się między innymi w zgłoszeniach patentowych i udzielonych patentach, przykładowo US8044034B2 oraz US20170319482A1, opisujących odpowiednio formulacje liposomowe oraz skwalenowe gemcytabiny.

Dotychczas nie ujawniono bezpośrednich połączeń kowalencyjnych [60]fullerenu lub pochodnych z gemcytabiną. Tymczasem takie połączenie może wykazywać pożądane cechy obu substancji, to jest aktywność leku ze zdolnością fullerenów do lokalizacji w obrębie guza. Zaletą takiego układu jest możliwość wykorzystania nanocząsteczkowych pochodnych fullerenów jako nośniki dla cząsteczek różnych leków. Struktura takiej możliwej do wykorzystania pochodnej diglicynowej [60]fullerenu jest przedstawiona na Wzorze 1.

Istotę wynalazku stanowi nanokoniugat diglicynowej pochodnej [60]fullerenu z gemcytabiną, o strukturze przedstawionej na Wzorze 2. Nanokoniugat ten charakteryzuje się wysoką rozpuszczalnością w wodzie oraz silnym działaniem przeciwnowotworowym, potwierdzonym na liniach komórkowych nowotworu trzustki AsPC-1, PAN-02 oraz nowotworu piersi MCF-7. Powyższy nanoterapeutyk może być wykorzystany do otrzymywania kompozycji farmaceutycznych, skutecznych w leczeniu chorób nowotworowych, a zwłaszcza nowotworów trzustki lub piersi.

Istotę wynalazku stanowi również sposób otrzymywania nanokoniugatu diglicynowej pochodnej [60]fullerenu z gemcytabiną, o strukturze przedstawionej na Wzorze 2, który to sposób przedstawiony jest na Schemacie 1 i polega na tym, że diglicynową pochodną [60]fullerenu, ekwiwalent, o strukturze przedstawionej na Wzorze 1 rozpuszcza się w mieszaninie wody albo buforu koniugacyjnego w postaci wodnego roztworu kwasu 2-(N-morfolino)-etanosulfonowego o stężeniu poniżej 20%, korzystnie 10%, z dodatkiem od 1 do 5 ekwiwalentów chlorowodorku gemcytabiny w stosunku masowym do diglicynowej pochodnej [60]fullerenu oraz od 1 do 5 ekwiwalentów roztworu koniugacyjnego w stosunku masowym do diglicynowej pochodnej [60]fullerenu, a otrzymaną mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze od 10 do 50°C, korzystnie w temperaturze pokojowej, w czasie nie krótszym niż 12 godzin, po czym otrzymany nanokoniugat oczyszcza się metodą dializy z wykorzystaniem membran o odpowiednim odcięciu masy, korzystnie 1000 Da.

Korzystnie, jako roztwór koniugacyjny stosuje się roztwór następujących rozpuszczonych w buforze koniugacyjnym związków koniugujących: chlorowodorek N-(3-dimetylaminopropylo)-N’-etylokarbodiimidu (EDCI) oraz korzystnie N-hydroksy imid kwasu bursztynowego (NHS), które mogą być podane w czasie koniugacji jednocześnie lub też oddzielnie.

Diglicynowa pochodna [60]fullerenu o strukturze przedstawionej na Wzorze 1 stanowiąca związek wyjściowy do otrzymania pochodnej zastrzeganej w niniejszym zgłoszeniu oraz sposób jej otrzymywania są przedstawione w równoległym zgłoszeniu tego samego zgłaszającego o nr zgłoszenia P.428469.

Istotę wynalazku stanowi również zastosowanie nanokoniugatu diglicynowej pochodnej [60]fullerenu z gemcytabiną, o strukturze przedstawionej na Wzorze 2, do wytwarzania leku o działaniu przeciwnowotworowym, wykorzystywanego w leczeniu nowotworów trzustki lub nowotworów piersi.

Rozwiązanie według wynalazku zostanie lepiej zobrazowane na poniższych przykładach oraz na rysunku, na którym na wzorze 1 przedstawiono pochodną diglicynową [60]fullerenu; na wzorze 2 - nanokoniugat pochodnej diglicynowej [60]fullerenu z gemcytabiną; na schemacie 1 - przebieg sposobu otrzymywania nanokoniugatu diglicynowej pochodnej [60]fullerenu z gemcytabiną; na fig. 1 - widmo masowe ESI-MS nanokoniugatu C60-gemcytabina, według Wzoru 2 z charakterystycznym pikiem przy 2690 m/z, dla jonizacji dodatniej i napięcia 50 V (obliczona masa nanokoniugatu C60-gemcytabina

PL 240 524 B1

[M+Na]⁺ wynosi 2690 Da); natomiast w Tabeli 1 - profil cytotoksyczności nanokoniugatu C60-gemcytabina dla nowotworów trzustki i piersi.

P r z y k ł a d 1

Otrzymywanie nanokoniugatu diglicynowej pochodnej [60]fullerenu z gemcytabiną.

Jako buforu do reakcji koniugacji gemcytabiny z prekursorem diglicynowym używano 10% wodnego roztworu kwasu 2-(N-morfolino)-etanosulfonowego (MES). W celu przeprowadzenia reakcji koniugacji rozpuszczono 0,397 g MES w 3,97 ml wody i wymieszano zawartość. Następnie odważono chlorowodorek N-(3-dimetylaminopropylo)-N’-etylokarbodiimidu (EDCI) (6,60 mg, 34,4 μmol), N-hydroksyimid kwasu bursztynowego (NHS) (3,96 mg, 34,4 μmol) oraz chlorowodorek gemcytabiny (GEM) (10,32 mg, 34,4 μmol). Do powyższych reagentów dodano 2 ml 10% roztworu MES i mieszano zawartość przez 5 minut na mieszadle magnetycznym. Następnie tak przygotowany roztwór dodawano do fiolki reakcyjnej (10 ml), w której znajdowała się diglicynowa pochodna [60]fullerenu (30,00 mg, 13,8 μmol). Po 15 minutach mieszania w temperaturze pokojowej fiolkę z mieszaniną reakcyjną okryto folią aluminiową i pozostawiono na mieszadle magnetycznym na czas 94 h. Wytworzony w ten sposób nanokoniugat oczyszczano, stosując technikę dializy z zastosowaniem membrany celulozowej o odcięciu masy 1000 Da. W tym celu, zawartość naczynia reakcyjnego przeniesiono do woreczka dializacyjnego (Spectrum Labs, USA), a następnie przepłukując fiolkę wodą, uzupełniono zawartość woreczka dializacyjnego. Rozpoczęto dializę trwającą 10 dób. Po tym okresie przelano zawartość woreczka dializacyjnego (przepłukując go wodą) do kolby 50 ml, odparowano większość rozpuszczalnika, a powstały produkt poddano liofilizacji. Otrzymano w ten sposób 29,42 mg (78,6%) nanokoniugatu pochodnej diglicynowej [60]fullerenu z gemcytabiną w postaci brązowego ciała stałego. Ponadto, obecność oraz czystość chromatograficzną finalnego nanokoniugatu potwierdzono przy użyciu techniki spektrometrii masowej ESI-MS oraz analizy HPLC.

P r z y k ł a d 2

Otrzymywanie nanokoniugatu diglicynowej pochodnej [60]fullerenu z gemcytabiną.

Reakcję koniugacji prowadzono w podwójnie dejonizowanej wodzie. W tym celu odważono chlorowodorek N-(3-dimetylaminopropylo)-N’-etylokarbodiimidu (EDCI) (13,2 mg, 68,8 μmol), N-hydroksyimid kwasu bursztynowego (NHS) (7,92 mg, 68,8 μmol) oraz chlorowodorek gemcytabiny (GEM) (20,64 mg, 68,8 μmol). Do powyższych reagentów dodano 3 ml wody i mieszano zawartość przez 5 minut na mieszadle magnetycznym. Następnie tak przygotowany roztwór dodawano do fiolki reakcyjnej (10 ml), w której znajdowała się diglicynową pochodna [60]fullerenu (30,00 mg, 13,8 μmol). Po 15 minutach mieszania w temperaturze pokojowej fiolkę z mieszaniną reakcyjną okryto folią aluminiową i pozostawiono na mieszadle magnetycznym na czas 5 dni. Wytworzony w ten sposób nanokoniugat oczyszczano, stosując technikę dializy z zastosowaniem membrany celulozowej o odcięciu masy 1000 Da. Rozpoczęto dializę trwającą 10 dób. Po tym okresie przelano zawartość woreczka dializacyjnego (przepłukując go wodą) do kolby 50 ml, odparowano większość rozpuszczalnika, a powstały produkt poddano liofilizacji. Otrzymano w ten sposób nanokoniugat pochodnej [60]fullerenu z gemcytabiną, w postaci brązowego ciała stałego o wydajności powyżej 50%. Ponadto, obecność oraz czystość chromatograficzną finalnego nanokoniugatu potwierdzono przy użyciu techniki spektrometrii masowej ESIMS oraz analizy HPLC.

P r z y k ł a d 3

Działanie cytotoksyczne względem komórek nowotworów trzustki (linie komórkowe Panc-1, AsPC-1, PAN-02) oraz nowotworu piersi (linia komórkowa MCF-7).

Cytotoksyczność nanokoniugatu diglicynowej pochodnej [60]fullerenu z gemcytabiną oznaczano wobec komórek ludzkiego nowotworu trzustki Panc-1 oraz AsPC-1, mysiego nowotworu trzustki PAN-O2 oraz komórek ludzkiego nowotworu piersi MCF-7. W tym celu wysiewano komórki nowotworowe - 9 tysięcy komórek/dołek (po 100 μL/dołek) i umieszczono płytki na 24 godziny w cieplarce. Aplikacja związku: rozpuszczono związek w medium hodowlanym w celu przygotowania roztworów o następujących stężeniach: 0,1 mg/ml oraz 1 mg/ml, a następnie dodano do każdego dołka po 200 μL odpowiedniego roztworu. Następnie, po 24 godzinach przeprowadzono test oznaczający cytotoksyczność (MTS). Wyniki testów biologicznych przedstawiono w Tabeli 1. W wyniku przeprowadzonych eksperymentów stwierdzono cytotoksyczności badanej pochodnej dla linii PAN-02 oraz MCF-7. Przedstawione wyniki badań wskazują, iż powyższy rozpuszczalny w wodzie nanokoniugat może znaleźć zastosowanie do otrzymywania leków do efektywnego leczenia nowotworów piersi oraz trzustki.

Claims

a d 4

Działanie cytotoksyczne względem ludzkich fibroblastów linii NHDF.

Cytotoksyczność nanokoniugatu diglicynowej pochodnej [60]fullerenu oznaczano wobec komórek fibroblastów linii NHDF. Wysiewano komórki - 8 tysięcy komórek/dołek (po 100 μL/dołek) i umieszczono płytki na 24 godziny w cieplarce. Aplikacja związku: rozpuszczono związek w medium hodowlanym w celu przygotowania roztworów o następujących stężeniach: 0,1 mg/ml oraz 1 mg/ml, a następnie dodano do każdego dołka po 200 μL odpowiedniego roztworu. Następnie, po 24 godzinach przeprowadzono test oznaczający cytotoksyczność (MTS). Wyniki testów przedstawiono w Tabeli 1. W wyniku przeprowadzonych eksperymentów stwierdzono brak cytotoksyczności badanej pochodnej w w/w zakresie stężeń na danych liniach komórkowych. Przedstawione wyniki badań są szczególnie interesujące, gdyż wskazują że otrzymany nanokoniugat diglicynowej pochodnej [60]fullerenu działa selektywnie względem komórek nowotworowych będąc nietoksycznym dla komórek prawidłowych w badanym zakresie stężeń.

P r z y k ł a d 5

Zastosowanie nanokoniugatu diglicynowej pochodnej [60]fullerenu z gemcytabiną, o strukturze przedstawionej na Wzorze 2, do wytwarzania leku (kompozycji farmaceutycznej) o działaniu przeciwnowotworowym.

Kompozycję farmaceutyczną w postaci roztworu przygotowano rozpuszczając 0,25 mg nanokoniugatu diglicynowej pochodnej [60]fullerenu z gemcytabiną w 3 ml wody oczyszczonej, i rozcieńczając w wodnym roztworze buforu fosforanowego do 100 ml.

Tak otrzymaną kompozycją można stosować w terapii przeciwnowotworowej prowadzonej dla nowotworów piersi oraz trzustki.

Zastrzeżenia patentowe

1. Nanokoniugat diglicynowej pochodnej [60]fullerenu z gemcytabiną, o strukturze przedstawionej na Wzorze 2.
2. Sposób otrzymywania nanokoniugatu diglicynowej pochodnej [60]fullerenu z gemcytabiną, o strukturze przedstawionej na Wzorze 2, znamienny tym, że diglicynową pochodną [60]fullerenu, ekwiwalent, o strukturze przedstawionej na Wzorze 1 rozpuszcza się w mieszaninie wody albo buforu koniugacyjnego w postaci wodnego roztworu kwasu 2-(N-morfolino)-etanosulfonowego o stężeniu poniżej 20%, korzystnie 10%, z dodatkiem od 1 do 5 ekwiwalentów chlorowodorku gemcytabiny w stosunku masowym do diglicynowej pochodnej [60]fullerenu oraz od 1 do 5 ekwiwalentów roztworu koniugacyjnego w stosunku masowym do diglicynowej pochodnej [60]fullerenu, a otrzymaną mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze od 10 do 50°C, korzystnie w temperaturze pokojowej, w czasie nie krótszym niż 12 godzin, po czym otrzymany nanokoniugat oczyszcza się metodą dializy z wykorzystaniem membran o odpowiednim odcięciu masy, korzystnie 1000 Da.
3. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że jako roztwór koniugacyjny stosuje się roztwór następujących rozpuszczonych w buforze koniugacyjnym związków koniugujących: chlorowodorek N-(3-dimetylaminopropylo)-N’-etylokarbodiimidu (EDCI) oraz korzystnie N-hydroksyimd kwasu bursztynowego (NHS), które mogą być podane w czasie koniugacji jednocześnie lub też oddzielnie.
4. Zastosowanie nanokoniugatu diglicynowej pochodnej [60]fullerenu z gemcytabiną, o strukturze przedstawionej na Wzorze 2, do wytwarzania leku o działaniu przeciwnowotworowym, wykorzystywanego w leczeniu nowotworów trzustki lub nowotworów piersi.