PL240558B1 - Biomateriał na bazie β-1,3-glukanu (kurdlanu) do regeneracji tkanki chrzęstnej i/lub kostnej oraz sposób jego wytwarzania - Google Patents

Claims (10)

1. PL 240 558 Β1

   Zdolność do wspierania żywotności ludzkich osteoblastów hFOB 1.19 in vitro w kontakcie pośrednim. Zdolność tą wyrażono jako procent żywotności komórek po 48-godz. inkubacji z ekstraktem pozyskanym z biomateriału kurdlanWPI wg normy ISO 10993-5:2009. Wynik na podstawie testu MTT. 102,98 ± 2,95% w porównaniu z komórkami kontrolnymi (osteoblastami ludzkimi traktowanymi płynem hodowlanym inkubowanym bez obecności materiału).

   Zdolność do wspierania żywotności ludzkich osteoblastów hFOB 1.19 in viiro w kontakcie bezpośrednim. Zdolność tą oceniono po 48-godz. inkubacji ludzkich osteoblastów na biomateriale kurdlan-WPI. Na podstawie przeprowadzonego barwienia różnicującego żywe/martwe komórki (zestaw Live/Dead Celi Double Staining Kit). Obserwacje mikroskopowe wykazały, że komórki rosnące na biomateriale kurdlan-WPI byty dobrze przyklejone do jego powierzchni i wykazywały wysoką żywotność komórki emitowały zieloną fluorescencję. Nie obserwowano komórek martwych, które emitowałyby czerwoną fluorescencję.

   Zdolność do wspierania procesów proliferacji osteoblastów ludzkich hFOB 1.19 w kontakcie bezpośrednim in vitro. Zdolność tą oceniono poprzez barwienie cytoszkietetu (barwnik - falloidyna) oraz jąder komórkowych (barwnik Hoechst33342) po 3- i 6- dniach od inokulacji ludzkich osteoblastów na biomateriale kurdlan-WPI. Obserwacje mikroskopowe wykazały, żc liczba osteoblastów ludzkich rosnących na biomateriale kurdlanWPI wzrastała w czasie. Zarówno po 3- jak i po 6- dniach inkubacji, komórki były dobrze rozpłaszczone, miały podłużny kształt i posiadały duże jądra oraz rozbudowany system cytoszkieletu, co świadczy o tym, że biomateriał kurdlan-WPI jest odpowiednim rusztowaniem do wzrostu komórek w warunkach in vitro.

   Przedstawione w Tabeli 1. wyniki wskazują, że wytworzony wg wynalazku biomateriał kurdlan-WPI, wykazuje korzystne właściwości mechaniczne i biologiczne. Wynalazek może znaleźć zastosowanie jako biomateriał implantacyjny w celu regeneracji ubytków chrzestnych i/lub kostnych.

   Zastrzeżenia patentowe

   1. Biomateriał na bazie β-1,3-glukanu (kurdlanu) znamienny tym, że stanowi go P-1,3-glukan (kurdlan) i izolat białka serwatkowego (WPI), gdzie proporcje składników względem 100 ml wodnego roztworu wynoszą: 6-20% (w/v), korzystnie 8% (w/v) - kurdlan i 20-50% (w/v), korzystnie 30% (w/v) - WPI.
2. 2. Biomateriał według zastrz. 1 znamienny tym, że jest wysterylizowany.
3. 3. Sposób wytwarzania biomateriału na bazie β-1,3-glukanu (kurdlanu) znamienny tym, że najpierw przygotowuje się w wodzie destylowanej 20-50% (w/v) roztwór izolatu białka serwatkowego (WPI), korzystnie 30% (w/v), i dodaje się go do β-1,3-glukanu (kurdlanu) w postaci proszku, tak aby stężenie kurdlanu względem roztworu WPI wynosiło 6-20% (w/v), korzystnie 8% (w/v), otrzymaną mieszaninę umieszcza się w formach i inkubuje przez 10-30 minut, korzystnie 15 minut w temperaturze 90-120°C, korzystnie 90°C, następnie otrzymany hydrożel kurdlan-WPI poddaje się chłodzeniu w temperaturze pokojowej.
4. 4. Sposób według zastrz. 3 znamienny tym, że otrzymany biomateriał sterylizuje się.
5. 5. Sposób według zastrz. 3 znamienny tym, że otrzymany mokry biomateriał sterylizuje się poprzez autoklawowanie.
6. 6. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że sterylizację mokrego materiału prowadzi się w temperaturze 121°C przez 15 minut.
7. 7. Sposób według zastrz. 3 znamienny tym, że otrzymany biomateriał poddaje się sterylizacji gazowej z wykorzystaniem tlenku etylenu, przy czym najpierw poddaje się zamrożeniu i suszeniu poprzez liofilizację.
8. 8. Sposób według zastrz. 6 znamienny tym, że zamrożenie materiału przeprowadza się w temperaturze od -5°C do -170°C, korzystnie -80°C, przez okres 2-5 dni, korzystnie 2 dni.
9. 9. Sposób według zastrz. 6 znamienny tym, że biomateriał suszy się poprzez liofilizację w czasie 15-30 godzin, korzystnie 19-26 godzin.
10. 10. Sposób według zastrz. 6 znamienny tym, że sterylizację suchego materiału prowadzi się tlenkiem etylenu (55°C) przez 3 godziny.