PL240860B1

PL240860B1 - Method of preparing a carrier for immobilization of living microorganisms

Info

Publication number: PL240860B1
Application number: PL433032A
Authority: PL
Inventors: Anna Dzionek; Danuta Wojcieszyńska; Urszula Guzik
Original assignee: Univ Slaski
Priority date: 2020-02-26
Filing date: 2020-02-26
Publication date: 2022-06-20
Also published as: PL433032A1

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów i sposób immobilizacji mikroorganizmów w takim nośniku ksantanowym.The present invention relates to a method for the preparation of a carrier for the immobilization of living microorganisms and a method for the immobilization of microorganisms in such a xanthan carrier.

Ze stanu techniki znane są sposoby otrzymywania gumy ksantanowej, jej modyfikacji w celu pozyskiwania nośnika o lepszych właściwościach dla potrzeb farmacji, przemysłu spożywczego lub kosmetycznego.The prior art knows methods for the preparation of xanthan gum and its modification in order to obtain a carrier with better properties for the needs of the pharmaceutical, food or cosmetic industry.

Ze stanu techniki znane są procedury immobilizacji mikroorganizmów związane z zastosowaniem różnych nośników i substancji sieciujących.Procedures for the immobilization of microorganisms involving the use of various carriers and cross-linkers are known in the art.

Przykładowo z opisu US4954443A znana jest metoda immobilizacji enzymów i mikroorganizmów, wykorzystująca między innymi gumę ksantanową i jony metali. Zastosowane w procedurze warunki znacząco jednak ograniczają przeżywalność mikroorganizmów, jeżeli nie cechują się one wyjątkowymi właściwościami (np. termofilne i oporne na metale ciężkie). Jest to duża niedogodność tej metody.For example, US4954443A discloses a method of enzyme and microorganism immobilization using, inter alia, xanthan gum and metal ions. However, the conditions used in the procedure significantly limit the survival of microorganisms, if they do not have exceptional properties (e.g. thermophilic and resistant to heavy metals). This is a major disadvantage of this method.

W opisie US4377637A ujawniono sposób produkcji gumy ksantanowej z wykorzystaniem szczepów z rodzaju Xanthomonas.US4377637A discloses a method of producing xanthan gum using strains of the genus Xanthomonas.

W opisie US5595892A ujawniono sposób produkcji gumy ksantanowej i jej oczyszczania, w wyniku którego otrzymuje się produkt o doskonałych właściwościach lepkości i przejrzystości.US5595892A discloses a method of producing xanthan gum and purifying it, resulting in a product with excellent viscosity and clarity properties.

Ulepszoną procedurę produkcji gumy ksantanowej ujawniono w opisie EP2413714A1. Patent dotyczy produkcji gumy ksantanowej przez szczepy z gatunku Xanthomonas campestris w zoptymalizowanych warunkach, w wyniku czego uzyskuje się gumę ksantanową o ulepszonych właściwościach reologicznych i wysokiej zawartości kwasu pirogronowego, umożliwiających jej zastosowanie w przemyśle spożywczym i paszowym.An improved procedure for the production of xanthan gum is disclosed in EP2413714A1. The patent concerns the production of xanthan gum by Xanthomonas campestris strains under optimized conditions, resulting in xanthan gum with improved rheological properties and high pyruvic acid content, enabling its use in the food and feed industries.

Znany jest także opis US20100174062A1 ujawniający sposób sieciowania gumy ksantanowej z wykorzystaniem promieniowania α, β, γ, X oraz UV.Also known is US20100174062A1 disclosing a method of cross-linking xanthan gum using α, β, γ, X and UV radiation.

Znany jest także opis EP1997000894 ujawniający usieciowany nośnik ksantanowy o ulepszonych właściwościach. Rozwiązanie dotyczy modyfikowanej i usieciowanej gumy ksantanowej o właściwościach pożądanych w kosmetyce do lepszej dyspersji bioaktywnych cząstek.EP1997000894 is also known, which discloses a cross-linked xanthan support with improved properties. The solution concerns a modified and cross-linked xanthan gum with properties desired in cosmetics for better dispersion of bioactive particles.

Znany jest opis US4994276A dotyczący wykorzystania gumy ksantanowej w farmacji. Rozwiązanie to dotyczy wykorzystania gumy ksantanowej w formulacji leków o przedłużonym uwalnianiu.US4994276A is known for the pharmaceutical use of xanthan gum. This solution concerns the use of xanthan gum in the formulation of sustained release drugs.

Znany jest opis US4954443A dotyczący wykorzystania gumy ksantanowej jako nośnika w immobilizacji substancji czynnych, w tym mikroorganizmów. Stosowana procedura zawiera między innymi takie elementy jak stosowanie roztworów metali, w tym metali ciężkich, które dla szczepów bardziej wrażliwych mogą być zabójcze, oraz wysokiej temperatury. Niedogodnością tej metody są trudne warunki w postaci wysokiej temperatury i stosowania roztworów metali, wpływające niekorzystnie na przeżycie mikroorganizmów i ograniczające wykorzystanie otrzymanego nośnika z żywymi mikroorganizmami w procesach wymagających ich aktywności.US4954443A is known about the use of xanthan gum as a carrier in the immobilization of active substances, including microorganisms. The applied procedure includes, inter alia, elements such as the use of metal solutions, including heavy metals, which may be lethal for more sensitive strains, and high temperature. The disadvantage of this method is the difficult conditions in the form of high temperature and the use of metal solutions, adversely affecting the survival of microorganisms and limiting the use of the obtained support with living microorganisms in processes requiring their activity.

Z opisu wynalazku CN104894099A znana jest procedura immobilizacji bakterii w celu ich zastosowania w procesach uzdatniania wody na złożonym granulacie zawierającym węgiel aktywny, ziemię okrzemkową, kwas chitozanowy, diatomit, bentonit, dwutlenek krzemu, alkohol poliwinylowy i alginian sodu.The invention description CN104894099A describes a procedure for immobilizing bacteria for use in water treatment processes on a composite granulate containing activated carbon, diatomaceous earth, chitosanic acid, diatomite, bentonite, silicon dioxide, polyvinyl alcohol and sodium alginate.

Z opisu wynalazku US4148689A znana jest procedura immobilizacji mikroorganizmów w hydrofilowej matrycy żelowej. Rozwiązanie to dotyczy immobilizacji mikroorganizmów w nośniku żelowym zawierającym polialkohol winylowy, żelatynę i karboksymetylocelulozę oraz tetraalkoksysilan.From the description of the invention US4148689A, a procedure for immobilizing microorganisms in a hydrophilic gel matrix is known. This solution concerns the immobilization of microorganisms in a gel carrier containing polyvinyl alcohol, gelatin and carboxymethylcellulose and tetraalkoxysilane.

Opis wynalazku US5093253A ujawnia zastosowanie gumy gellan jako nośnika do pułapkowania komórek mikroorganizmów. Metoda ta zakłada przygotowanie mieszaniny gumy gellan w formie żelowej oraz mikroorganizmów i utwardzanie jej dwu- lub jednowartościowymi kationami. Uzyskane tą metodą kulki składają się w 25-50% z mikroorganizmów, 1,2-1,8% z gumy gellan oraz zawierają dodatkowo 0,1-0,4 M MgSO4. Ze względu jednak na zastosowaną metodę sieciowania dwuwartościowymi kationami, produkt ten, w systemie bioremediacyjnym ulega szybkiemu rozpadowi. Wynika to z faktu, że w ściekach znajduje się znaczna ilość jonów, które wypierają dwuwartościowe kationy z nośników.Description of the invention US5093253A discloses the use of gellan gum as a carrier for trapping microbial cells. This method involves preparing a mixture of gellan gum in the form of a gel and microorganisms and hardening it with divalent or monovalent cations. The balls obtained by this method consist of 25-50% microorganisms, 1.2-1.8% gellan gum and additionally contain 0.1-0.4 M MgSO4. However, due to the method of cross-linking with divalent cations, this product quickly decomposes in a bioremediation system. This is due to the fact that there is a significant amount of ions in the wastewater that displace divalent cations from carriers.

Opis wynalazku US20160032270A1 ujawnia metody enkapsulacji komórek w różnych nośnikach, które poddawane są procesom żelowania, sieciowania lub polimeryzacji. Procesy te zakładają sieciowanie nośników po uprzednim wymieszaniu ich z mikroorganizmami. Rozwiązanie to, może skutkować znacznym obniżeniem aktywności komórek ze względu na możliwe toksyczne działanie związków sieciujących lub warunków reakcji.Description of the invention US20160032270A1 discloses methods of encapsulating cells in various supports which are subjected to gelling, cross-linking or polymerization processes. These processes assume cross-linking of carriers after mixing them with microorganisms. This solution can result in a significant decrease in cell activity due to possible toxic effects of the cross-linkers or reaction conditions.

PL 240 860 B1PL 240 860 B1

W literaturze, przykładowo Ahmad, S. A., Shamaan, N. A., Arif, N. M, Koon, G. B., Shukor, M. Y. A., & Syed, M. A. (2012). Enhanced phenol degradation by immobilised Acinetobacter sp. strain AQ5NOL 1. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 28(1), 347-352, autorzy przedstawiają metodę immobilizacji bakterii w gumie gellan usieciowanej CaCl2. Zakłada ona wstępne usieciowanie gumy gellan 0,06% roztworem CaCl2 w temperaturze 75°C, ochłodzenie mieszaniny do 45°C, dodanie komórek bakteryjnych i ciągłe mieszanie aż do równomiernego rozprowadzenia mikroorganizmów w gumie gellan. W kolejnym etapie mieszaninę wkrapla się do oleju rzepakowego wzbogaconego surfaktantem (polisorbat 80) w celu uformowania kulek i przenosi je do 0,1% roztworu CaCl2 aby przeprowadzić kolejny proces sieciowania. Uzyskany tym sposobem biopreparat testowany był w warunkach monokulturowych pod kątem zdolności do biodegradacji fenolu. Zaobserwowano, że przez 33 dni immobilizowane komórki zachowały pełne zdolności degradacyjne, jednak autorzy nie przedstawili badań dotyczących wytrzymałości nośnika.In the literature, for example, Ahmad, S. A., Shamaan, N. A., Arif, N. M, Koon, G. B., Shukor, M. Y. A., & Syed, M. A. (2012). Enhanced phenol degradation by immobilized Acinetobacter sp. Strain AQ5NOL 1. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 28 (1), 347-352, the authors present a method of bacterial immobilization in CaCl2 cross-linked gellan gum. It involves pre-crosslinking of gellan gum with 0.06% CaCl2 solution at a temperature of 75 ° C, cooling the mixture to 45 ° C, adding bacterial cells and continuous mixing until the microorganisms are evenly distributed in the gellan gum. In the next step, the mixture is added dropwise to surfactant-enriched rapeseed oil (polysorbate 80) to form beads and transferred to 0.1% CaCl2 solution to carry out another cross-linking process. The biopreparation obtained in this way was tested in monoculture conditions for the biodegradability of phenol. It was observed that for 33 days the immobilized cells retained their full degradation capacity, however, the authors did not present any studies on the strength of the carrier.

Celem twórców niniejszego wynalazku było opracowanie nośnika na bazie modyfikowanej gumy ksantanowej, oraz sposobu immobilizacji mikroorganizmów na takim nośniku, z eliminacją wad rozwiązań znanych ze stanu techniki.The aim of the present inventors was to develop a carrier based on a modified xanthan gum, and a method of immobilizing microorganisms on such a carrier, eliminating the disadvantages of the prior art solutions.

Dotychczas, w bioremediacji stosuje się takie nośniki jak alginian, poli(alkohol winylowy), chitozan, bądź ich modyfikacje. Ze względu jednak na bardzo zróżnicowane i dynamicznie zmieniające się warunki środowiskowe w systemach bioremediacyjnych (zarówno abiotyczne jak i biotyczne), wyżej wymienione nośniki nie wykazują stabilności oraz odpowiedniej wytrzymałości mechanicznej, a po modyfikacjach zwiększających ich wytrzymałość wykazują także działanie toksyczne dla mikroorganizmów. Zaistniała potrzeba opracowania nowego sposobu otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów, o właściwościach umożliwiających jego zastosowanie w bioremediacji.So far, bioremediation uses such carriers as alginate, polyvinyl alcohol, chitosan, or their modifications. However, due to the very diverse and dynamically changing environmental conditions in bioremediation systems (both abiotic and biotic), the above-mentioned carriers do not show stability and adequate mechanical strength, and after modifications increasing their strength, they also exhibit toxic effects for microorganisms. There was a need to develop a new method of obtaining a carrier for the immobilization of living microorganisms with properties enabling its use in bioremediation.

Powyższy cel realizuje sposób otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów, którego istotą jest to, że gumę ksantanową rozpuszcza się w roztworze chlorku litu (LiCl) o stężeniu 10^-3 M, przy proporcji gumy do roztworu mieszczącej się w zakresie 20-33 g/L, po czym do mieszaniny dodaje się czynnik sieciujący w postaci dihydrazydu kwasu adypinowego (ADH) w ilości 10 g/L (gram/litr mieszaniny) oraz aktywator gumy ksantanowej w postaci chlorowodorku 1-etylo-3[3-dimetyloamino]propylokarbodiimidu (EDCl) w ilości od 20 do 30 g/L, korzystnie 25 g/L (gram/litr mieszaniny) i sieciuje się ją do momentu uzyskania usieciowanej gumy ksantanowej, po czym dializuje się ją usuwając niezwiązane cząsteczki dihydrazydu kwasu adypinowego (ADH) oraz chlorowodorku 1-etylo-3[3-dimetyloamino]propylokarbodiimidu (EDCI) i suszy w temperaturze do 70°C usuwając nadmiar wody.The above objective is achieved by the method of obtaining a carrier for the immobilization of living microorganisms, the essence of which is that xanthan gum is dissolved in a lithium chloride (LiCl) solution with a concentration of ^10-3 M, with the ratio of gum to solution in the range of 20-33 g / L and then adipic acid dihydrazide (ADH) cross-linking agent (ADH) in the amount of 10 g / L (gram / liter of the mixture) and xanthan gum activator in the form of 1-ethyl-3 [3-dimethylamino] propylcarbodiimide hydrochloride (EDCl) are added to the mixture in an amount of 20 to 30 g / L, preferably 25 g / L (gram / liter of the mixture) and crosslinked until a cross-linked xanthan gum is obtained, after which it is dialyzed to remove unbound adipic acid dihydrazide (ADH) and 1-hydrochloride hydrochloride. ethyl-3- [3-dimethylamino] propylcarbodiimide (EDCI) and dried up to 70 ° C to remove excess water.

Korzystnie, rozpuszczanie gumy ksantanowej w roztworze chlorku litu (LiCl) prowadzi się w temperaturze pokojowej, najlepiej 24°C.Preferably, dissolving xanthan gum in lithium chloride (LiCl) solution is carried out at room temperature, preferably 24 ° C.

Korzystnie, rozpuszczanie gumy ksantanowej w roztworze chlorku litu (LiCl) prowadzi się intensywnie mieszając, najlepiej na mieszadle magnetycznym.Preferably, the dissolution of the xanthan gum in the lithium chloride (LiCl) solution is carried out by vigorous stirring, preferably with a magnetic stirrer.

Korzystnie, rozpuszczanie gumy ksantanowej w roztworze chlorku litu (LiCl) prowadzi się w czasie 1 h.Preferably, dissolving the xanthan gum in the lithium chloride (LiCl) solution is carried out within 1 hour.

Korzystnie, rozpuszczanie gumy ksantanowej w roztworze chlorku litu (LiCl) prowadzi się w pH 7,6.Preferably, the dissolution of the xanthan gum in the lithium chloride (LiCl) solution is carried out at a pH of 7.6.

Korzystnie, sieciowanie prowadzi się intensywnie mieszając, najlepiej na mieszadle magnetycznym.Preferably, the cross-linking is carried out with vigorous stirring, preferably with a magnetic stirrer.

Korzystnie, sieciowanie prowadzi się przez 24 h.Preferably, cross-linking is carried out for 24 hours.

Korzystnie, sieciowanie prowadzi się w temperaturze pokojowej, najlepiej 24°C.Preferably, cross-linking is carried out at room temperature, preferably 24 ° C.

Korzystnie, sieciowanie prowadzi się w pH 7,6.Preferably, the cross-linking is carried out at a pH of 7.6.

Korzystnie, dializowanie prowadzi się stosując membranę celulozową (MWCO), najlepiej 12000 - 14000 D.Preferably, dialysis is carried out using a cellulose membrane (MWCO), preferably 12,000-14,000 D.

Korzystnie, suszenie prowadzi się w temperaturze 70°C przez 2 h, na suszarce.Preferably, drying is carried out at 70 ° C for 2 hours in a dryer.

Powyższy cel realizuje także sposób immobilizacji mikroorganizmów w nośniku ksantanowym otrzymanym sposobem określonym powyżej, którego istotą jest to, że do usieciowanej, zdializowanej i pozbawionej nadmiaru wody gumy ksantanowej, dodaje się zawiesinę mikroorganizmów w soli fizjologicznej w stosunku objętościowym 10:1 i całość worteksuje się do momentu otrzymania mieszaniny gumy ksantanowej z równomiernie rozprowadzoną zawiesiną mikroorganizmów.The above object is also realized by the method of immobilizing microorganisms in the xanthan carrier obtained by the method defined above, the essence of which is that a suspension of microorganisms in physiological saline in a volume ratio of 10: 1 is added to the cross-linked, dialyzed and water-free xanthan gum, and the whole is vortexed to the moment of obtaining a mixture of xanthan gum with an evenly distributed suspension of microorganisms.

Korzystnie, worteksowanie prowadzi się w czasie 30 s.Preferably, vortexing is performed during 30 seconds.

Korzystnie, po worteksowaniu mieszaninę kształtuje się i utwardza w roztworze chlorku dopaminy w ilości od 2 g/L do 15 g/L, najlepiej 5 g/L, rozpuszczonej w 10 mM Tris-HCl.Preferably, after vortexing, the mixture is shaped and cured in a dopamine chloride solution of 2 g / L to 15 g / L, preferably 5 g / L, dissolved in 10 mM Tris-HCl.

PL 240 860 B1PL 240 860 B1

Korzystnie, kształtowanie prowadzi się dozując 0,05 ml mieszaniny, najlepiej za pomocą strzykawki insulinowej.Preferably, shaping is done with 0.05 ml of the mixture, preferably with an insulin syringe.

Korzystnie, kształtowanie prowadzi się do momentu uzyskania walca o średnicy od 4 mm do 8 mm i wysokości od 6 mm do 8 mm, najlepiej o średnicy 5 mm i wysokości 7 mm.Preferably, the shaping is carried out until a cylinder with a diameter of 4 mm to 8 mm and a height of 6 mm to 8 mm is obtained, preferably 5 mm in diameter and 7 mm in height.

Korzystnie, w trakcie utwardzania mieszaninę poddaje się wytrząsaniu do momentu utwardzenia nośnika i zwiększenia jego wytrzymałości mechanicznej.Preferably, during hardening, the mixture is shaken until the support is cured and its mechanical strength is increased.

Korzystnie, wytrząsanie prowadzi się od 4 h do 10 h, najlepiej przez 6 h, z prędkością od 25 rpm do 35 rpm, najlepiej 30 rpm.Preferably, shaking is for 4 h to 10 h, preferably 6 h, at a speed of 25 to 35 rpm, preferably 30 rpm.

Korzystnie, po utwardzeniu, nośnik przynajmniej dwa razy płucze się w 10 mM roztworze Tris-HCl.Preferably, after curing, the support is rinsed at least twice in a 10 mM Tris-HCl solution.

Korzystnie, po płukaniu, nośnik przenosi się do roztworu soli fizjologicznej i utrzymuje w temperaturze 4°C.Preferably, after rinsing, the carrier is transferred to a physiological saline solution and kept at 4 ° C.

Do tej pory nośnik ksantanowy wykorzystywany był głównie do kapsułkowania substancji czynnych. Nie można było go skutecznie stosować w immobilizacji żywych mikroorganizmów, ze względu na drastyczne warunki chemiczne konieczne do sieciowania gumy ksantanowej, które to warunki powodowały śmierć mikroorganizmów. Sposób otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów według wynalazku wyeliminował warunki drastyczne dla organizmów żywych, przez obniżenie wysokiej temperatury w trakcie rozpuszczania, sieciowania (przykładowo z 90°C) do temperatury pokojowej, oraz zachowanie pH roztworu na poziomie 7,6 podczas procesu sieciowania, co jest jego niewątpliwą zaletą. Zaletą jest także temperatura suszenia do 70°C. Sposób według wynalazku może być skutecznie stosowany w immobilizacji żywych mikroorganizmów.Until now, the xanthan carrier has mainly been used for the encapsulation of active ingredients. It could not be used effectively in the immobilization of living microorganisms due to the drastic chemical conditions necessary for the cross-linking of xanthan gum which resulted in the death of the microorganisms. The method of obtaining the carrier for immobilization of living microorganisms according to the invention eliminated drastic conditions for living organisms by lowering the high temperature during dissolution, cross-linking (for example from 90 ° C) to room temperature, and keeping the pH of the solution at 7.6 during the cross-linking process, which is its unquestionable advantage. The drying temperature up to 70 ° C is also an advantage. The method according to the invention can be effectively used in the immobilization of living microorganisms.

Nośnik do immobilizacji żywych mikroorganizmów według wynalazku spełnia warunki do zastosowania go w systemach bioremediacyjnych. Usieciowana sposobem według wynalazku guma ksantanowa stanowi doskonały materiał do pułapkowania w niej żywych mikroorganizmów. Przeprowadzenie dializy skutkuje usunięciem wszystkich toksycznych związków w wyniku czego, immobilizowane mikroorganizmy wykazują 99% stopień przeżywalności procesu immobilizacji. Ze względu na jej plastyczność możliwe jest równomierne rozprowadzenie w niej komórek mikroorganizmów. Poprzez utwardzenie polidopaminą uzyskany biopreparat zyskuje dodatkową wytrzymałość mechaniczną i możliwość uformowania stałego kształtu. Utworzona dodatkowa powłoka polidopaminowa sprawia, że powierzchnia biokatalizatora jest gładka i nie-biodegradowalna, w wyniku czego autochtoniczna mikroflora systemów bioremediacyjnych nie skolonizuje jej oraz nie doprowadzi do wypływu immobilizowanych mikroorganizmów. Jednocześnie, nośnik umożliwia swobodną dyfuzję, co sprawia, że możliwa jest wymiana substancji pomiędzy unieruchomionymi mikroorganizmami a środowiskiem zewnętrznym.The carrier for the immobilization of living microorganisms according to the invention meets the conditions for its use in bioremediation systems. Xanthan gum cross-linked according to the invention is an excellent material for trapping live microorganisms therein. Performing dialysis results in the removal of all toxic compounds, and as a result, the immobilized microorganisms show a 99% survival rate of the immobilization process. Due to its plasticity, it is possible to evenly distribute the cells of microorganisms in it. By hardening with polydopamine, the obtained biopreparation gains additional mechanical strength and the possibility of forming a permanent shape. The created additional polydopamine coating makes the surface of the biocatalyst smooth and non-biodegradable, as a result of which the autochthonous microflora of bioremediation systems will not colonize it and will not lead to the outflow of immobilized microorganisms. At the same time, the carrier allows free diffusion, which makes it possible to exchange substances between the immobilized microorganisms and the external environment.

Sposób otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów został opisany w poniższych przykładach realizacji, oraz na rysunku, na którym Fig. 1 przedstawia schemat sposobu otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów w przykładzie realizacji V, a Fig. 2 przedstawia nośnik do immobilizacji żywych mikroorganizmów otrzymany sposobem według wynalazku, w najkorzystniejszych proporcjach wymiarowych.The method of obtaining the support for immobilization of living microorganisms is described in the following examples and in the drawing, in which Fig. 1 shows a diagram of the method of obtaining the support for immobilization of living microorganisms in the embodiment V, and Fig. 2 shows the support for immobilization of living microorganisms obtained by the method according to the invention, in the most advantageous dimensional proportions.

P r z y k ł a d realizacji IE xample of implementation I

Sposób otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów rozpoczyna się od rozpuszczenia gumy ksantanowej w ilości 20 g/L - 33 g/L (każda wartość z tego przedziału) w 1 L roztworu chlorku litu (LiCl) o stężeniu 10^-3 M i intensywnego mieszania na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej około 24°C. Po około 1 h mieszania, do mieszaniny dodaje się czynnik sieciujący dihydrazyd kwasu adypinowego (ADH) w ilości 10 g/L oraz aktywator gumy ksantanowej - chlorowodorek 1-etylo-3[3-dimetyloamino]propylokarbodiimidu (EDCl) w ilości 25 g/L i pozostawia na mieszadle na około 24 h w temperaturze pokojowej, najlepiej około 24°C. Całość procedury prowadzona jest w pH 7,6, kontrolowanym pH-metrem.The method of obtaining the carrier for the immobilization of living microorganisms begins with dissolving xanthan gum in the amount of 20 g / L - 33 g / L (each value from this range) in 1 L of a lithium chloride (LiCl) solution with a concentration of 10 ^-3 M and intensive stirring for magnetic stirrer at room temperature around 24 ° C. After about 1 hour of stirring, the adipic acid dihydrazide (ADH) cross-linking agent (ADH) in the amount of 10 g / L and the xanthan gum activator - 1-ethyl-3 [3-dimethylamino] propylcarbodiimide hydrochloride (EDCl) in the amount of 25 g / L are added to the mixture. and is left on a mixer for about 24 h at room temperature, preferably about 24 ° C. The entire procedure is carried out at a pH of 7.6, controlled with a pH meter.

Następnie przeprowadza się dializę uzyskanej usieciowanej gumy ksantanowej z zastosowaniem membrany celulozowej MWCO 12000 - 14000 D w celu usunięcia niezwiązanych cząsteczek ADH oraz EDCl, które wykazują toksyczny wpływ na mikroorganizmy w zastosowanym stężeniu.The resulting cross-linked xanthan gum is then dialyzed with a MWCO 12000-14000 D cellulose membrane to remove unbound ADH and EDCl molecules which are toxic to the microorganisms at the concentration used.

Aby usunąć nadmiar wody, usieciowana guma ksantanowa poddawana jest następnie suszeniu na suszarce, w temperaturze do 70°C, najlepiej 70°C przez około 2 h.To remove excess water, the cross-linked xanthan gum is then dried in an oven at up to 70 ° C, preferably 70 ° C for about 2 hours.

Do tak przygotowanej gumy ksantanowej dodaje się zawiesinę mikroorganizmów w soli fizjologicznej w stosunku objętościowym 10:1 i worteksuje przez 30 s, aby równomiernie rozprowadzić mikroorganizmy w nośniku (Fig. 2).To the xanthan gum prepared in this way, a suspension of microorganisms in saline in a 10: 1 volume ratio is added and vortexed for 30 seconds to evenly distribute the microorganisms in the carrier (Fig. 2).

PL 240 860 B1PL 240 860 B1

Finalny kształt nośnika zawierającego immobilizowane żywe mikroorganizmy uzyskuje się poprzez dozowanie 0,05 ml mieszaniny za pomocą strzykawki insulinowej do roztworu chlorku dopaminy, najlepiej w ilości od 2 g/L do 15 g/L (każda wartość z tego przedziału), rozpuszczonej w 10 mM TrisHCl, i wytrząsanie od 4 h do 10 h (każda wartość z tego przedziału), najlepiej 6 h, przy od 25 rpm do 35 rpm, najlepiej 30 rpm. Zapewnia to dodatkowe utwardzenie nośnika i zwiększenie jego wytrzymałości mechanicznej.The final shape of the carrier containing the immobilized live microorganisms is obtained by dosing 0.05 ml of the mixture with an insulin syringe into the dopamine chloride solution, preferably in an amount from 2 g / L to 15 g / L (each value in this range), dissolved in 10 mM TrisHCl, and shaking for 4 h to 10 h (any value in this range), preferably 6 h, at 25 rpm to 35 rpm, preferably 30 rpm. This ensures additional hardening of the carrier and an increase in its mechanical strength.

W ostatnim etapie, nośnik z mikroorganizmami jest płukany dwukrotnie albo nawet trzykrotnie, w 10 mM roztworze Tris-HCl i przeniesiony do roztworu soli fizjologicznej. W takiej formie może być przechowywany w temperaturze 4°C.In the last step, the carrier with the microorganisms is washed twice or even three times in a 10 mM Tris-HCl solution and transferred to a physiological saline solution. In this form it can be stored at 4 ° C.

W wyniku opisanego powyżej postępowania, otrzymuje się nośnik do immobilizacji żywych mikroorganizmów, składający się z wody w ilości od 97% do 99% (każda wartość z tego przedziału), najlepiej 98%, gumy ksantanowej 1 usieciowanej dihydrazydem kwasu adypinowego (ADH) w ilości od 0,4% do 0,6% (każda wartość z tego przedziału), najlepiej 0,5% oraz żywych komórek mikroorganizmów 2 w ilości od 0,4% do 2,6% (każda wartość z tego przedziału), najlepiej 1,5% oraz powłoki polidopaminowej (<0,01%).As a result of the procedure described above, the carrier for the immobilization of living microorganisms is obtained, consisting of water in the amount of 97% to 99% (each value from this range), preferably 98%, xanthan gum 1 cross-linked with adipic acid dihydrazide (ADH) in the amount of 0.4% to 0.6% (each value in this range), preferably 0.5%, and 2 viable microbial cells in an amount of 0.4% to 2.6% (each value in this range), preferably 1 , 5% and a polydopamine coating (<0.01%).

Finalny kształt nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów to walec o średnicy od 4 mm do 6 mm (każda wartość z tego przedziału), najlepiej 5 mm oraz wysokości od 6 mm do 8 mm (każda wartość z tego przedziału), najlepiej 7 mm. Nie wyklucza to jednak innych kształtów, ani innych wymiarów nośnika.The final shape of the support for immobilization of living microorganisms is a cylinder with a diameter of 4 mm to 6 mm (each value in this range), preferably 5 mm, and a height of 6 mm to 8 mm (each value in this range), preferably 7 mm. However, this does not exclude other shapes or dimensions of the carrier.

P r z y k ł a d realizacji IIExample of implementation II

Sposób otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów jak w przykładzie realizacji I, przy czym rozpoczyna się od rozpuszczenia gumy ksantanowej w ilości 20 g/L w 1 L roztworu chlorku litu (LiCl) o stężeniu 10^-3 M i intensywnego mieszania na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej około 24°C. Po około 1 h mieszania, do mieszaniny dodaje się czynnik sieciujący dihydrazyd kwasu adypinowego (ADH) w ilości 10 g/L oraz aktywator gumy ksantanowej - chlorowodorek 1-etylo-3[3-dimetyloamino]propylokarbodiimidu (EDCI) w ilości 25 g/L i pozostawia na mieszadle na około 24 h w temperaturze pokojowej, najlepiej około 24°C. Całość procedury prowadzona jest w pH 7,6 kontrolowanym pH-metrem.The method of obtaining a carrier for the immobilization of living microorganisms as in the embodiment I, starting with dissolving 20 g / L xanthan gum in 1 L of a 10 ^-3 M lithium chloride (LiCl) solution and intensive stirring on a magnetic stirrer at a temperature of room temperature around 24 ° C. After about 1 hour of stirring, the adipic acid dihydrazide (ADH) cross-linking agent (ADH) in the amount of 10 g / L and the xanthan gum activator - 1-ethyl-3 [3-dimethylamino] propylcarbodiimide hydrochloride (EDCI) in the amount of 25 g / L are added to the mixture. and is left on a mixer for about 24 h at room temperature, preferably about 24 ° C. The entire procedure is carried out at a pH of 7.6 with a controlled pH meter.

Finalny kształt nośnika zawierającego immobilizowane żywe mikroorganizmy uzyskuje się poprzez dozowanie 0,05 ml mieszaniny za pomocą strzykawki insulinowej do roztworu chlorku dopaminy, najlepiej w ilości 2 g/L, rozpuszczonej w 10 mM Tris-HCl, i wytrząsanie przez 10 h przy 25 rpm. Zapewnia to dodatkowe utwardzenie nośnika i zwiększenie jego wytrzymałości mechanicznej.The final shape of the carrier containing the immobilized live microorganisms is obtained by dispensing 0.05 ml of the mixture with an insulin syringe into the dopamine chloride solution, preferably in the amount of 2 g / L, dissolved in 10 mM Tris-HCl, and shaking for 10 h at 25 rpm. This ensures additional hardening of the carrier and an increase in its mechanical strength.

W ostatnim etapie, nośnik z mikroorganizmami jest dwukrotnie płukany w 10 mM roztworze TrisHCl i przeniesiony do roztworu soli fizjologicznej. W takiej formie może być przechowywany w temperaturze 4°C.In the last step, the microorganism carrier is washed twice in 10 mM TrisHCl solution and transferred to physiological saline. In this form it can be stored at 4 ° C.

W wyniku opisanego powyżej postępowania, otrzymuje się nośnik do immobilizacji żywych mikroorganizmów, składający się z wody w ilości 97%, gumy ksantanowej 1 usieciowanej dihydrazydem kwasu adypinowego (ADH) w ilości 0,4%, żywych komórek mikroorganizmów 2 w ilości 2,6% oraz powłoki polidopaminowej (<0,01%).As a result of the above-described procedure, a vehicle for the immobilization of living microorganisms is obtained, consisting of water in the amount of 97%, xanthan gum 1 cross-linked with adipic acid dihydrazide (ADH) in the amount of 0.4%, living cells of microorganisms 2 in the amount of 2.6% and a polydopamine coating (<0.01%).

Finalny kształt nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów to walec o średnicy 5 mm oraz wysokości 7 mm.The final shape of the support for immobilization of living microorganisms is a cylinder with a diameter of 5 mm and a height of 7 mm.

P r z y k ł a d realizacji IIIExample of implementation III

Sposób otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów jak w przykładzie realizacji I, przy czym rozpoczyna się od rozpuszczenia gumy ksantanowej w ilości 33 g/L w 1 L roztworu chlorku litu (LiCl) o stężeniu 10^-3 M i intensywnego mieszania na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej około 24°C. Po około 1 h mieszania, do mieszaniny dodaje się czynnik sieciującyThe method of obtaining a carrier for the immobilization of living microorganisms as in the embodiment I, starting with dissolving xanthan gum in the amount of 33 g / L in 1 L of lithium chloride (LiCl) solution with a concentration of ^10-3 M and intensive stirring on a magnetic stirrer at a temperature of room temperature around 24 ° C. After about 1 hour of stirring, the crosslinker is added to the mixture

PL 240 860 B1 dihydrazyd kwasu adypinowego (ADH) w ilości 10 g/L oraz aktywator gumy ksantanowej - chlorowodorek 1-etylo-3[3-dimetyloamino]propylokarbodiimidu (EDCl) w ilości 25 g/L i pozostawia na mieszadle na około 24 h w temperaturze pokojowej, najlepiej około 24°C. Całość procedury prowadzona jest w pH 7,6 kontrolowanym pH-metrem.Adipic acid dihydrazide (ADH) in the amount of 10 g / L and xanthan gum activator - 1-ethyl-3 [3-dimethylamino] propylcarbodiimide hydrochloride (EDCl) in the amount of 25 g / L and left on the mixer for about 24 h at room temperature, preferably around 24 ° C. The entire procedure is carried out at a pH of 7.6 with a controlled pH meter.

Aby usunąć nadmiar wody, usieciowana guma ksantanowa poddawana jest następnie suszeniu na suszarce w temperaturze do 70°C, najlepiej 70°C przez około 2 h.To remove excess water, the cross-linked xanthan gum is then dried in an oven at up to 70 ° C, preferably 70 ° C, for about 2 hours.

Finalny kształt nośnika zawierającego immobilizowane żywe mikroorganizmy uzyskuje się poprzez dozowanie 0,05 ml mieszaniny za pomocą strzykawki insulinowej do roztworu chlorku dopaminy w ilości 15 g/L, rozpuszczonej w 10 mM Tris-HCl, i wytrząsanie przez 4 h przy 35 rpm. Zapewnia to dodatkowe utwardzenie nośnika i zwiększenie jego wytrzymałości mechanicznej.The final shape of the carrier containing the immobilized live microorganisms is obtained by dispensing 0.05 ml of the mixture with an insulin syringe into the 15 g / L dopamine chloride solution, dissolved in 10 mM Tris-HCl, and shaking for 4 h at 35 rpm. This ensures additional hardening of the carrier and an increase in its mechanical strength.

W ostatnim etapie, nośnik z mikroorganizmami jest trzykrotnie płukany w 10 mM roztworze TrisHCl i przeniesiony do roztworu soli fizjologicznej. W takiej formie może być przechowywany w temperaturze 4°C.In the last step, the microorganism carrier is washed three times with 10 mM TrisHCl solution and transferred to physiological saline. In this form it can be stored at 4 ° C.

W wyniku opisanego powyżej postępowania, otrzymuje się nośnik do immobilizacji żywych mikroorganizmów, składający się z wody w ilości 99%, gumy ksantanowej 1 usieciowanej dihydrazydem kwasu adypinowego (ADH) w ilości 0,6%, żywych komórek mikroorganizmów 2 w ilości 0,4% oraz powłoki polidopaminowej (<0,01%).As a result of the procedure described above, a vehicle for the immobilization of living microorganisms is obtained, consisting of water in the amount of 99%, xanthan gum 1 cross-linked with adipic acid dihydrazide (ADH) in the amount of 0.6%, living cells of microorganisms 2 in the amount of 0.4% and a polydopamine coating (<0.01%).

Finalny kształt nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów to walec o średnicy 4 mm oraz wysokości 8 mm.The final shape of the support for immobilization of living microorganisms is a cylinder with a diameter of 4 mm and a height of 8 mm.

P r z y k ł a d realizacji IVExample of implementation IV

Sposób otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów jak w przykładzie realizacji I, przy czym rozpoczyna się od rozpuszczenia gumy ksantanowej w ilości 26,5 g/L w 1 L roztworu chlorku litu (LiCl) o stężeniu 10^-3 M i intensywnego mieszania na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej około 24°C. Po około 1 h mieszania, do mieszaniny dodaje się czynnik sieciujący dihydrazyd kwasu adypinowego (ADH) w ilości 10 g/L oraz aktywator gumy ksantanowej - chlorowodorek 1-etylo-3[3-dimetyloamino]propylokarbodiimidu (EDCl) w ilości 25 g/L i pozostawia na mieszadle na około 24 h w temperaturze pokojowej, najlepiej około 24°C. Całość procedury prowadzona jest w pH 7,6 kontrolowanym pH-metrem.The method of obtaining a carrier for the immobilization of living microorganisms as in the embodiment I, starting with dissolving 26.5 g / L xanthan gum in 1 L of a 10 ^-3 M lithium chloride (LiCl) solution and intensive stirring on a magnetic stirrer at room temperature around 24 ° C. After about 1 hour of stirring, the adipic acid dihydrazide (ADH) cross-linking agent (ADH) in the amount of 10 g / L and the xanthan gum activator - 1-ethyl-3 [3-dimethylamino] propylcarbodiimide hydrochloride (EDCl) in the amount of 25 g / L are added to the mixture. and is left on a mixer for about 24 h at room temperature, preferably about 24 ° C. The entire procedure is carried out at a pH of 7.6 with a controlled pH meter.

Aby usunąć nadmiar wody, usieciowana guma ksantanowa poddawana jest następnie suszeniu w temperaturze do 70°C, najlepiej 70°C przez około 2 h.To remove excess water, the cross-linked xanthan gum is then dried at up to 70 ° C, preferably 70 ° C for about 2 hours.

Finalny kształt nośnika zawierającego immobilizowane żywe mikroorganizmy uzyskuje się poprzez dozowanie 0,05 ml mieszaniny za pomocą strzykawki insulinowej do roztworu chlorku dopaminy w ilości 5 g/L, rozpuszczonej w 10 mM Tris-HCl, i wytrząsanie przez 6 h przy 30 rpm. Zapewnia to dodatkowe utwardzenie nośnika i zwiększenie jego wytrzymałości mechanicznej.The final shape of the carrier containing the immobilized live microorganisms is obtained by dispensing 0.05 ml of the mixture with an insulin syringe into the dopamine chloride solution in the amount of 5 g / L, dissolved in 10 mM Tris-HCl, and shaking for 6 h at 30 rpm. This ensures additional hardening of the carrier and an increase in its mechanical strength.

W wyniku opisanego powyżej postępowania, otrzymuje się nośnik do immobilizacji żywych mikroorganizmów, składający się z wody w ilości 98%, gumy ksantanowej 1 usieciowanej dihydrazydem kwasu adypinowego (ADH) w ilości 0,5%, żywych komórek mikroorganizmów 2 w ilości 1,5% oraz powłoki polidopaminowej (<0,01%).As a result of the procedure described above, a vehicle for the immobilization of living microorganisms is obtained, consisting of water in the amount of 98%, xanthan gum 1 cross-linked with adipic acid dihydrazide (ADH) in the amount of 0.5%, living cells of microorganisms 2 in the amount of 1.5% and a polydopamine coating (<0.01%).

Finalny kształt nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów to walec o średnicy 6 mm oraz wysokości 6 mm.The final shape of the support for immobilization of living microorganisms is a cylinder with a diameter of 6 mm and a height of 6 mm.

PL 240 860 B1PL 240 860 B1

P r z y k ł a d realizacji VExample of implementation V

Sposób otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów jak w przykładzie realizacji I, przy czym rozpoczyna się od rozpuszczenia gumy ksantanowej w ilości 25 g/L w 1 L roztworu chlorku litu (LiCI) o stężeniu 10^-3 M i intensywnego mieszania na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej około 24°C. Po około 1 h mieszania, do mieszaniny dodaje się czynnik sieciujący dihydrazyd kwasu adypinowego (ADH) w ilości 10 g/L oraz aktywator gumy ksantanowej - chlorowodorek 1-etylo-3[3-dimetyloamino]propylokarbodiimidu (EDCl) w ilości 30 g/L i pozostawia na mieszadle na około 24 h w temperaturze pokojowej, najlepiej około 24°C. Całość procedury prowadzona jest w pH 7,6 kontrolowanym pH-metrem.The method of obtaining a carrier for the immobilization of living microorganisms as in the embodiment I, starting with dissolving xanthan gum in the amount of 25 g / L in 1 L of lithium chloride (LiCl) solution with a concentration of ^10-3 M and intensive stirring on a magnetic stirrer at a temperature of room temperature around 24 ° C. After about 1 hour of stirring, the adipic acid dihydrazide (ADH) cross-linking agent (ADH) in the amount of 10 g / L and the xanthan gum activator - 1-ethyl-3 [3-dimethylamino] propylcarbodiimide hydrochloride (EDCl) in the amount of 30 g / L are added to the mixture. and is left on a mixer for about 24 h at room temperature, preferably about 24 ° C. The entire procedure is carried out at a pH of 7.6 with a controlled pH meter.

Finalny kształt nośnika zawierającego immobilizowane żywe mikroorganizmy uzyskuje się poprzez dozowanie 0,05 ml mieszaniny za pomocą strzykawki insulinowej do roztworu chlorku dopaminy w ilości 5 g/L, rozpuszczonej w 10 mM Tris-HCl, i wytrząsanie przez 6 h najlepiej przy 30 rpm. Zapewnia to dodatkowe utwardzenie nośnika i zwiększenie jego wytrzymałości mechanicznej.The final shape of the carrier containing the immobilized live microorganisms is obtained by dispensing 0.05 ml of the mixture with an insulin syringe into the dopamine chloride solution in the amount of 5 g / L, dissolved in 10 mM Tris-HCl, and shaking for 6 h, preferably at 30 rpm. This ensures additional hardening of the carrier and an increase in its mechanical strength.

Claims

1. The method of obtaining a carrier for the immobilization of living microorganisms, characterized in that xanthan gum is dissolved in a lithium chloride (LiCl) solution with a concentration of ^10-3 M, with the ratio of gum to the solution in the range of 20-33 g / L, and then adipic acid dihydrazide (ADH) cross-linking agent (ADH) in the amount of 10 g / L (gram / liter of the mixture) and xanthan gum activator in the form of 1-ethyl-3 [3-dimethylamino] propylcarbodiimide hydrochloride (EDCl) are added to the mixture in an amount from 20 to 30 g / L, preferably 25 g / L (gram / liter mixture) and crosslinked until a cross-linked xanthan gum is obtained, then dialyzed to remove unbound adipic acid dihydrazide (ADH) and 1-ethyl-3-hydrochloride [3-dimethylamino] propylcarbodiimide (EDCl) and dried up to 70 ° C to remove excess water.

2. The method according to p. The process of claim 1, wherein dissolving xanthan gum in the lithium chloride (LiCl) solution is carried out at room temperature, preferably 24 ° C.

3. The method according to p. A process as claimed in claim 1, characterized in that the dissolution of xanthan gum in the lithium chloride (LiCl) solution is carried out under intensive stirring, preferably on a magnetic stirrer.

4. The method according to p. The process of claim 1, wherein dissolving the xanthan gum in the lithium chloride (LiCl) solution is carried out for 1 hour.

5. The method according to p. The process of claim 1, wherein dissolving xanthan gum in the lithium chloride (LiCl) solution is carried out at a pH of 7.6.

6. The method according to p. The method of claim 1, characterized in that the cross-linking is carried out by intensive stirring, preferably on a magnetic stirrer.

7. The method according to p. The process of claim 1, wherein cross-linking is best carried out for 24 hours.

PL 240 860 B1

8. The method according to p. The process of claim 1, characterized in that the cross-linking is carried out at room temperature, preferably 24 ° C.

9. The method according to p. The process of claim 1, characterized in that the cross-linking is carried out at a pH of 7.6.

10. The method according to p. 2. The process of claim 1, wherein the dialysis is carried out using a cellulose membrane (MWCO), preferably 12,000 - 14,000 D.

11. The method according to p. The method of claim 1, characterized in that drying is carried out at a temperature of 70 ° C for 2 hours in a dryer.

12. A method of immobilizing microorganisms in a xanthan medium obtained by the method according to claim 1, characterized in that a suspension of microorganisms in saline in a 10: 1 volume ratio is added to the cross-linked, dialyzed and water-free xanthan gum, and the whole is vortexed until it is obtained. mixtures of xanthan gum with an evenly distributed suspension of microorganisms.

13. The method according to p. The process of claim 12, wherein the vortexing is performed during 30 s.

14. The method according to p. The process of claim 12, characterized in that, after vortexing, the mixture is shaped and cured in a dopamine chloride solution in an amount of 2 g / L to 15 g / L, preferably 5 g / L, dissolved in 10 mM Tris-HCl.

15. The method according to p. 14. The method of claim 14, wherein shaping is carried out by dispensing 0.05 ml of the mixture, preferably with an insulin syringe.

16. The method according to p. 14. The process of claim 14, characterized in that the shaping is carried out until a cylinder with a diameter of 4 mm to 8 mm and a height of 6 mm to 8 mm is obtained, preferably 5 mm in diameter and 7 mm in height.

17. The method according to p. 14. The process of claim 14, characterized in that, during curing, the mixture is shaken until the support is cured and its mechanical strength is increased.

18. The method according to p. 17. The process of claim 17, wherein the shaking is performed for 4 h to 10 h, preferably for 6 h, at a speed from 25 rpm to 35 rpm, preferably at 30 rpm.

19. The method according to p. The process of claim 14, wherein after curing, the support is rinsed at least twice in a 10 mM Tris-HCl solution.

20. The method according to p. The process of claim 19, wherein after rinsing, the carrier is transferred to a physiological saline solution and kept at 4 ° C.