PL240860B1

PL240860B1 - Sposób otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów i sposób immobilizacji mikroorganizmów w takim nośniku ksantanowym

Info

Publication number: PL240860B1
Application number: PL433032A
Authority: PL
Inventors: Anna Dzionek; Danuta Wojcieszyńska; Urszula Guzik
Original assignee: Univ Slaski
Priority date: 2020-02-26
Filing date: 2020-02-26
Publication date: 2022-06-20
Also published as: PL433032A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów i sposób immobilizacji mikroorganizmów w takim nośniku ksantanowym.

Ze stanu techniki znane są sposoby otrzymywania gumy ksantanowej, jej modyfikacji w celu pozyskiwania nośnika o lepszych właściwościach dla potrzeb farmacji, przemysłu spożywczego lub kosmetycznego.

Ze stanu techniki znane są procedury immobilizacji mikroorganizmów związane z zastosowaniem różnych nośników i substancji sieciujących.

Przykładowo z opisu US4954443A znana jest metoda immobilizacji enzymów i mikroorganizmów, wykorzystująca między innymi gumę ksantanową i jony metali. Zastosowane w procedurze warunki znacząco jednak ograniczają przeżywalność mikroorganizmów, jeżeli nie cechują się one wyjątkowymi właściwościami (np. termofilne i oporne na metale ciężkie). Jest to duża niedogodność tej metody.

W opisie US4377637A ujawniono sposób produkcji gumy ksantanowej z wykorzystaniem szczepów z rodzaju Xanthomonas.

W opisie US5595892A ujawniono sposób produkcji gumy ksantanowej i jej oczyszczania, w wyniku którego otrzymuje się produkt o doskonałych właściwościach lepkości i przejrzystości.

Ulepszoną procedurę produkcji gumy ksantanowej ujawniono w opisie EP2413714A1. Patent dotyczy produkcji gumy ksantanowej przez szczepy z gatunku Xanthomonas campestris w zoptymalizowanych warunkach, w wyniku czego uzyskuje się gumę ksantanową o ulepszonych właściwościach reologicznych i wysokiej zawartości kwasu pirogronowego, umożliwiających jej zastosowanie w przemyśle spożywczym i paszowym.

Znany jest także opis US20100174062A1 ujawniający sposób sieciowania gumy ksantanowej z wykorzystaniem promieniowania α, β, γ, X oraz UV.

Znany jest także opis EP1997000894 ujawniający usieciowany nośnik ksantanowy o ulepszonych właściwościach. Rozwiązanie dotyczy modyfikowanej i usieciowanej gumy ksantanowej o właściwościach pożądanych w kosmetyce do lepszej dyspersji bioaktywnych cząstek.

Znany jest opis US4994276A dotyczący wykorzystania gumy ksantanowej w farmacji. Rozwiązanie to dotyczy wykorzystania gumy ksantanowej w formulacji leków o przedłużonym uwalnianiu.

Znany jest opis US4954443A dotyczący wykorzystania gumy ksantanowej jako nośnika w immobilizacji substancji czynnych, w tym mikroorganizmów. Stosowana procedura zawiera między innymi takie elementy jak stosowanie roztworów metali, w tym metali ciężkich, które dla szczepów bardziej wrażliwych mogą być zabójcze, oraz wysokiej temperatury. Niedogodnością tej metody są trudne warunki w postaci wysokiej temperatury i stosowania roztworów metali, wpływające niekorzystnie na przeżycie mikroorganizmów i ograniczające wykorzystanie otrzymanego nośnika z żywymi mikroorganizmami w procesach wymagających ich aktywności.

Z opisu wynalazku CN104894099A znana jest procedura immobilizacji bakterii w celu ich zastosowania w procesach uzdatniania wody na złożonym granulacie zawierającym węgiel aktywny, ziemię okrzemkową, kwas chitozanowy, diatomit, bentonit, dwutlenek krzemu, alkohol poliwinylowy i alginian sodu.

Z opisu wynalazku US4148689A znana jest procedura immobilizacji mikroorganizmów w hydrofilowej matrycy żelowej. Rozwiązanie to dotyczy immobilizacji mikroorganizmów w nośniku żelowym zawierającym polialkohol winylowy, żelatynę i karboksymetylocelulozę oraz tetraalkoksysilan.

Opis wynalazku US5093253A ujawnia zastosowanie gumy gellan jako nośnika do pułapkowania komórek mikroorganizmów. Metoda ta zakłada przygotowanie mieszaniny gumy gellan w formie żelowej oraz mikroorganizmów i utwardzanie jej dwu- lub jednowartościowymi kationami. Uzyskane tą metodą kulki składają się w 25-50% z mikroorganizmów, 1,2-1,8% z gumy gellan oraz zawierają dodatkowo 0,1-0,4 M MgSO4. Ze względu jednak na zastosowaną metodę sieciowania dwuwartościowymi kationami, produkt ten, w systemie bioremediacyjnym ulega szybkiemu rozpadowi. Wynika to z faktu, że w ściekach znajduje się znaczna ilość jonów, które wypierają dwuwartościowe kationy z nośników.

Opis wynalazku US20160032270A1 ujawnia metody enkapsulacji komórek w różnych nośnikach, które poddawane są procesom żelowania, sieciowania lub polimeryzacji. Procesy te zakładają sieciowanie nośników po uprzednim wymieszaniu ich z mikroorganizmami. Rozwiązanie to, może skutkować znacznym obniżeniem aktywności komórek ze względu na możliwe toksyczne działanie związków sieciujących lub warunków reakcji.

PL 240 860 B1

W literaturze, przykładowo Ahmad, S. A., Shamaan, N. A., Arif, N. M, Koon, G. B., Shukor, M. Y. A., & Syed, M. A. (2012). Enhanced phenol degradation by immobilised Acinetobacter sp. strain AQ5NOL 1. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 28(1), 347-352, autorzy przedstawiają metodę immobilizacji bakterii w gumie gellan usieciowanej CaCl2. Zakłada ona wstępne usieciowanie gumy gellan 0,06% roztworem CaCl2 w temperaturze 75°C, ochłodzenie mieszaniny do 45°C, dodanie komórek bakteryjnych i ciągłe mieszanie aż do równomiernego rozprowadzenia mikroorganizmów w gumie gellan. W kolejnym etapie mieszaninę wkrapla się do oleju rzepakowego wzbogaconego surfaktantem (polisorbat 80) w celu uformowania kulek i przenosi je do 0,1% roztworu CaCl2 aby przeprowadzić kolejny proces sieciowania. Uzyskany tym sposobem biopreparat testowany był w warunkach monokulturowych pod kątem zdolności do biodegradacji fenolu. Zaobserwowano, że przez 33 dni immobilizowane komórki zachowały pełne zdolności degradacyjne, jednak autorzy nie przedstawili badań dotyczących wytrzymałości nośnika.

Celem twórców niniejszego wynalazku było opracowanie nośnika na bazie modyfikowanej gumy ksantanowej, oraz sposobu immobilizacji mikroorganizmów na takim nośniku, z eliminacją wad rozwiązań znanych ze stanu techniki.

Dotychczas, w bioremediacji stosuje się takie nośniki jak alginian, poli(alkohol winylowy), chitozan, bądź ich modyfikacje. Ze względu jednak na bardzo zróżnicowane i dynamicznie zmieniające się warunki środowiskowe w systemach bioremediacyjnych (zarówno abiotyczne jak i biotyczne), wyżej wymienione nośniki nie wykazują stabilności oraz odpowiedniej wytrzymałości mechanicznej, a po modyfikacjach zwiększających ich wytrzymałość wykazują także działanie toksyczne dla mikroorganizmów. Zaistniała potrzeba opracowania nowego sposobu otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów, o właściwościach umożliwiających jego zastosowanie w bioremediacji.

Powyższy cel realizuje sposób otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów, którego istotą jest to, że gumę ksantanową rozpuszcza się w roztworze chlorku litu (LiCl) o stężeniu 10^-3 M, przy proporcji gumy do roztworu mieszczącej się w zakresie 20-33 g/L, po czym do mieszaniny dodaje się czynnik sieciujący w postaci dihydrazydu kwasu adypinowego (ADH) w ilości 10 g/L (gram/litr mieszaniny) oraz aktywator gumy ksantanowej w postaci chlorowodorku 1-etylo-3[3-dimetyloamino]propylokarbodiimidu (EDCl) w ilości od 20 do 30 g/L, korzystnie 25 g/L (gram/litr mieszaniny) i sieciuje się ją do momentu uzyskania usieciowanej gumy ksantanowej, po czym dializuje się ją usuwając niezwiązane cząsteczki dihydrazydu kwasu adypinowego (ADH) oraz chlorowodorku 1-etylo-3[3-dimetyloamino]propylokarbodiimidu (EDCI) i suszy w temperaturze do 70°C usuwając nadmiar wody.

Korzystnie, rozpuszczanie gumy ksantanowej w roztworze chlorku litu (LiCl) prowadzi się w temperaturze pokojowej, najlepiej 24°C.

Korzystnie, rozpuszczanie gumy ksantanowej w roztworze chlorku litu (LiCl) prowadzi się intensywnie mieszając, najlepiej na mieszadle magnetycznym.

Korzystnie, rozpuszczanie gumy ksantanowej w roztworze chlorku litu (LiCl) prowadzi się w czasie 1 h.

Korzystnie, rozpuszczanie gumy ksantanowej w roztworze chlorku litu (LiCl) prowadzi się w pH 7,6.

Korzystnie, sieciowanie prowadzi się intensywnie mieszając, najlepiej na mieszadle magnetycznym.

Korzystnie, sieciowanie prowadzi się przez 24 h.

Korzystnie, sieciowanie prowadzi się w temperaturze pokojowej, najlepiej 24°C.

Korzystnie, sieciowanie prowadzi się w pH 7,6.

Korzystnie, dializowanie prowadzi się stosując membranę celulozową (MWCO), najlepiej 12000 - 14000 D.

Korzystnie, suszenie prowadzi się w temperaturze 70°C przez 2 h, na suszarce.

Powyższy cel realizuje także sposób immobilizacji mikroorganizmów w nośniku ksantanowym otrzymanym sposobem określonym powyżej, którego istotą jest to, że do usieciowanej, zdializowanej i pozbawionej nadmiaru wody gumy ksantanowej, dodaje się zawiesinę mikroorganizmów w soli fizjologicznej w stosunku objętościowym 10:1 i całość worteksuje się do momentu otrzymania mieszaniny gumy ksantanowej z równomiernie rozprowadzoną zawiesiną mikroorganizmów.

Korzystnie, worteksowanie prowadzi się w czasie 30 s.

Korzystnie, po worteksowaniu mieszaninę kształtuje się i utwardza w roztworze chlorku dopaminy w ilości od 2 g/L do 15 g/L, najlepiej 5 g/L, rozpuszczonej w 10 mM Tris-HCl.

PL 240 860 B1

Korzystnie, kształtowanie prowadzi się dozując 0,05 ml mieszaniny, najlepiej za pomocą strzykawki insulinowej.

Korzystnie, kształtowanie prowadzi się do momentu uzyskania walca o średnicy od 4 mm do 8 mm i wysokości od 6 mm do 8 mm, najlepiej o średnicy 5 mm i wysokości 7 mm.

Korzystnie, w trakcie utwardzania mieszaninę poddaje się wytrząsaniu do momentu utwardzenia nośnika i zwiększenia jego wytrzymałości mechanicznej.

Korzystnie, wytrząsanie prowadzi się od 4 h do 10 h, najlepiej przez 6 h, z prędkością od 25 rpm do 35 rpm, najlepiej 30 rpm.

Korzystnie, po utwardzeniu, nośnik przynajmniej dwa razy płucze się w 10 mM roztworze Tris-HCl.

Korzystnie, po płukaniu, nośnik przenosi się do roztworu soli fizjologicznej i utrzymuje w temperaturze 4°C.

Do tej pory nośnik ksantanowy wykorzystywany był głównie do kapsułkowania substancji czynnych. Nie można było go skutecznie stosować w immobilizacji żywych mikroorganizmów, ze względu na drastyczne warunki chemiczne konieczne do sieciowania gumy ksantanowej, które to warunki powodowały śmierć mikroorganizmów. Sposób otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów według wynalazku wyeliminował warunki drastyczne dla organizmów żywych, przez obniżenie wysokiej temperatury w trakcie rozpuszczania, sieciowania (przykładowo z 90°C) do temperatury pokojowej, oraz zachowanie pH roztworu na poziomie 7,6 podczas procesu sieciowania, co jest jego niewątpliwą zaletą. Zaletą jest także temperatura suszenia do 70°C. Sposób według wynalazku może być skutecznie stosowany w immobilizacji żywych mikroorganizmów.

Nośnik do immobilizacji żywych mikroorganizmów według wynalazku spełnia warunki do zastosowania go w systemach bioremediacyjnych. Usieciowana sposobem według wynalazku guma ksantanowa stanowi doskonały materiał do pułapkowania w niej żywych mikroorganizmów. Przeprowadzenie dializy skutkuje usunięciem wszystkich toksycznych związków w wyniku czego, immobilizowane mikroorganizmy wykazują 99% stopień przeżywalności procesu immobilizacji. Ze względu na jej plastyczność możliwe jest równomierne rozprowadzenie w niej komórek mikroorganizmów. Poprzez utwardzenie polidopaminą uzyskany biopreparat zyskuje dodatkową wytrzymałość mechaniczną i możliwość uformowania stałego kształtu. Utworzona dodatkowa powłoka polidopaminowa sprawia, że powierzchnia biokatalizatora jest gładka i nie-biodegradowalna, w wyniku czego autochtoniczna mikroflora systemów bioremediacyjnych nie skolonizuje jej oraz nie doprowadzi do wypływu immobilizowanych mikroorganizmów. Jednocześnie, nośnik umożliwia swobodną dyfuzję, co sprawia, że możliwa jest wymiana substancji pomiędzy unieruchomionymi mikroorganizmami a środowiskiem zewnętrznym.

Sposób otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów został opisany w poniższych przykładach realizacji, oraz na rysunku, na którym Fig. 1 przedstawia schemat sposobu otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów w przykładzie realizacji V, a Fig. 2 przedstawia nośnik do immobilizacji żywych mikroorganizmów otrzymany sposobem według wynalazku, w najkorzystniejszych proporcjach wymiarowych.

P r z y k ł a d realizacji I

Sposób otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów rozpoczyna się od rozpuszczenia gumy ksantanowej w ilości 20 g/L - 33 g/L (każda wartość z tego przedziału) w 1 L roztworu chlorku litu (LiCl) o stężeniu 10^-3 M i intensywnego mieszania na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej około 24°C. Po około 1 h mieszania, do mieszaniny dodaje się czynnik sieciujący dihydrazyd kwasu adypinowego (ADH) w ilości 10 g/L oraz aktywator gumy ksantanowej - chlorowodorek 1-etylo-3[3-dimetyloamino]propylokarbodiimidu (EDCl) w ilości 25 g/L i pozostawia na mieszadle na około 24 h w temperaturze pokojowej, najlepiej około 24°C. Całość procedury prowadzona jest w pH 7,6, kontrolowanym pH-metrem.

Następnie przeprowadza się dializę uzyskanej usieciowanej gumy ksantanowej z zastosowaniem membrany celulozowej MWCO 12000 - 14000 D w celu usunięcia niezwiązanych cząsteczek ADH oraz EDCl, które wykazują toksyczny wpływ na mikroorganizmy w zastosowanym stężeniu.

Aby usunąć nadmiar wody, usieciowana guma ksantanowa poddawana jest następnie suszeniu na suszarce, w temperaturze do 70°C, najlepiej 70°C przez około 2 h.

Do tak przygotowanej gumy ksantanowej dodaje się zawiesinę mikroorganizmów w soli fizjologicznej w stosunku objętościowym 10:1 i worteksuje przez 30 s, aby równomiernie rozprowadzić mikroorganizmy w nośniku (Fig. 2).

PL 240 860 B1

Finalny kształt nośnika zawierającego immobilizowane żywe mikroorganizmy uzyskuje się poprzez dozowanie 0,05 ml mieszaniny za pomocą strzykawki insulinowej do roztworu chlorku dopaminy, najlepiej w ilości od 2 g/L do 15 g/L (każda wartość z tego przedziału), rozpuszczonej w 10 mM TrisHCl, i wytrząsanie od 4 h do 10 h (każda wartość z tego przedziału), najlepiej 6 h, przy od 25 rpm do 35 rpm, najlepiej 30 rpm. Zapewnia to dodatkowe utwardzenie nośnika i zwiększenie jego wytrzymałości mechanicznej.

W ostatnim etapie, nośnik z mikroorganizmami jest płukany dwukrotnie albo nawet trzykrotnie, w 10 mM roztworze Tris-HCl i przeniesiony do roztworu soli fizjologicznej. W takiej formie może być przechowywany w temperaturze 4°C.

W wyniku opisanego powyżej postępowania, otrzymuje się nośnik do immobilizacji żywych mikroorganizmów, składający się z wody w ilości od 97% do 99% (każda wartość z tego przedziału), najlepiej 98%, gumy ksantanowej 1 usieciowanej dihydrazydem kwasu adypinowego (ADH) w ilości od 0,4% do 0,6% (każda wartość z tego przedziału), najlepiej 0,5% oraz żywych komórek mikroorganizmów 2 w ilości od 0,4% do 2,6% (każda wartość z tego przedziału), najlepiej 1,5% oraz powłoki polidopaminowej (<0,01%).

Finalny kształt nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów to walec o średnicy od 4 mm do 6 mm (każda wartość z tego przedziału), najlepiej 5 mm oraz wysokości od 6 mm do 8 mm (każda wartość z tego przedziału), najlepiej 7 mm. Nie wyklucza to jednak innych kształtów, ani innych wymiarów nośnika.

P r z y k ł a d realizacji II

Sposób otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów jak w przykładzie realizacji I, przy czym rozpoczyna się od rozpuszczenia gumy ksantanowej w ilości 20 g/L w 1 L roztworu chlorku litu (LiCl) o stężeniu 10^-3 M i intensywnego mieszania na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej około 24°C. Po około 1 h mieszania, do mieszaniny dodaje się czynnik sieciujący dihydrazyd kwasu adypinowego (ADH) w ilości 10 g/L oraz aktywator gumy ksantanowej - chlorowodorek 1-etylo-3[3-dimetyloamino]propylokarbodiimidu (EDCI) w ilości 25 g/L i pozostawia na mieszadle na około 24 h w temperaturze pokojowej, najlepiej około 24°C. Całość procedury prowadzona jest w pH 7,6 kontrolowanym pH-metrem.

Finalny kształt nośnika zawierającego immobilizowane żywe mikroorganizmy uzyskuje się poprzez dozowanie 0,05 ml mieszaniny za pomocą strzykawki insulinowej do roztworu chlorku dopaminy, najlepiej w ilości 2 g/L, rozpuszczonej w 10 mM Tris-HCl, i wytrząsanie przez 10 h przy 25 rpm. Zapewnia to dodatkowe utwardzenie nośnika i zwiększenie jego wytrzymałości mechanicznej.

W ostatnim etapie, nośnik z mikroorganizmami jest dwukrotnie płukany w 10 mM roztworze TrisHCl i przeniesiony do roztworu soli fizjologicznej. W takiej formie może być przechowywany w temperaturze 4°C.

W wyniku opisanego powyżej postępowania, otrzymuje się nośnik do immobilizacji żywych mikroorganizmów, składający się z wody w ilości 97%, gumy ksantanowej 1 usieciowanej dihydrazydem kwasu adypinowego (ADH) w ilości 0,4%, żywych komórek mikroorganizmów 2 w ilości 2,6% oraz powłoki polidopaminowej (<0,01%).

Finalny kształt nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów to walec o średnicy 5 mm oraz wysokości 7 mm.

P r z y k ł a d realizacji III

Sposób otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów jak w przykładzie realizacji I, przy czym rozpoczyna się od rozpuszczenia gumy ksantanowej w ilości 33 g/L w 1 L roztworu chlorku litu (LiCl) o stężeniu 10^-3 M i intensywnego mieszania na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej około 24°C. Po około 1 h mieszania, do mieszaniny dodaje się czynnik sieciujący

PL 240 860 B1 dihydrazyd kwasu adypinowego (ADH) w ilości 10 g/L oraz aktywator gumy ksantanowej - chlorowodorek 1-etylo-3[3-dimetyloamino]propylokarbodiimidu (EDCl) w ilości 25 g/L i pozostawia na mieszadle na około 24 h w temperaturze pokojowej, najlepiej około 24°C. Całość procedury prowadzona jest w pH 7,6 kontrolowanym pH-metrem.

Aby usunąć nadmiar wody, usieciowana guma ksantanowa poddawana jest następnie suszeniu na suszarce w temperaturze do 70°C, najlepiej 70°C przez około 2 h.

Finalny kształt nośnika zawierającego immobilizowane żywe mikroorganizmy uzyskuje się poprzez dozowanie 0,05 ml mieszaniny za pomocą strzykawki insulinowej do roztworu chlorku dopaminy w ilości 15 g/L, rozpuszczonej w 10 mM Tris-HCl, i wytrząsanie przez 4 h przy 35 rpm. Zapewnia to dodatkowe utwardzenie nośnika i zwiększenie jego wytrzymałości mechanicznej.

W ostatnim etapie, nośnik z mikroorganizmami jest trzykrotnie płukany w 10 mM roztworze TrisHCl i przeniesiony do roztworu soli fizjologicznej. W takiej formie może być przechowywany w temperaturze 4°C.

W wyniku opisanego powyżej postępowania, otrzymuje się nośnik do immobilizacji żywych mikroorganizmów, składający się z wody w ilości 99%, gumy ksantanowej 1 usieciowanej dihydrazydem kwasu adypinowego (ADH) w ilości 0,6%, żywych komórek mikroorganizmów 2 w ilości 0,4% oraz powłoki polidopaminowej (<0,01%).

Finalny kształt nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów to walec o średnicy 4 mm oraz wysokości 8 mm.

P r z y k ł a d realizacji IV

Sposób otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów jak w przykładzie realizacji I, przy czym rozpoczyna się od rozpuszczenia gumy ksantanowej w ilości 26,5 g/L w 1 L roztworu chlorku litu (LiCl) o stężeniu 10^-3 M i intensywnego mieszania na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej około 24°C. Po około 1 h mieszania, do mieszaniny dodaje się czynnik sieciujący dihydrazyd kwasu adypinowego (ADH) w ilości 10 g/L oraz aktywator gumy ksantanowej - chlorowodorek 1-etylo-3[3-dimetyloamino]propylokarbodiimidu (EDCl) w ilości 25 g/L i pozostawia na mieszadle na około 24 h w temperaturze pokojowej, najlepiej około 24°C. Całość procedury prowadzona jest w pH 7,6 kontrolowanym pH-metrem.

Aby usunąć nadmiar wody, usieciowana guma ksantanowa poddawana jest następnie suszeniu w temperaturze do 70°C, najlepiej 70°C przez około 2 h.

Finalny kształt nośnika zawierającego immobilizowane żywe mikroorganizmy uzyskuje się poprzez dozowanie 0,05 ml mieszaniny za pomocą strzykawki insulinowej do roztworu chlorku dopaminy w ilości 5 g/L, rozpuszczonej w 10 mM Tris-HCl, i wytrząsanie przez 6 h przy 30 rpm. Zapewnia to dodatkowe utwardzenie nośnika i zwiększenie jego wytrzymałości mechanicznej.

W wyniku opisanego powyżej postępowania, otrzymuje się nośnik do immobilizacji żywych mikroorganizmów, składający się z wody w ilości 98%, gumy ksantanowej 1 usieciowanej dihydrazydem kwasu adypinowego (ADH) w ilości 0,5%, żywych komórek mikroorganizmów 2 w ilości 1,5% oraz powłoki polidopaminowej (<0,01%).

Finalny kształt nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów to walec o średnicy 6 mm oraz wysokości 6 mm.

PL 240 860 B1

P r z y k ł a d realizacji V

Sposób otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów jak w przykładzie realizacji I, przy czym rozpoczyna się od rozpuszczenia gumy ksantanowej w ilości 25 g/L w 1 L roztworu chlorku litu (LiCI) o stężeniu 10^-3 M i intensywnego mieszania na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej około 24°C. Po około 1 h mieszania, do mieszaniny dodaje się czynnik sieciujący dihydrazyd kwasu adypinowego (ADH) w ilości 10 g/L oraz aktywator gumy ksantanowej - chlorowodorek 1-etylo-3[3-dimetyloamino]propylokarbodiimidu (EDCl) w ilości 30 g/L i pozostawia na mieszadle na około 24 h w temperaturze pokojowej, najlepiej około 24°C. Całość procedury prowadzona jest w pH 7,6 kontrolowanym pH-metrem.

Finalny kształt nośnika zawierającego immobilizowane żywe mikroorganizmy uzyskuje się poprzez dozowanie 0,05 ml mieszaniny za pomocą strzykawki insulinowej do roztworu chlorku dopaminy w ilości 5 g/L, rozpuszczonej w 10 mM Tris-HCl, i wytrząsanie przez 6 h najlepiej przy 30 rpm. Zapewnia to dodatkowe utwardzenie nośnika i zwiększenie jego wytrzymałości mechanicznej.

Claims

1. Sposób otrzymywania nośnika do immobilizacji żywych mikroorganizmów, znamienny tym, że gumę ksantanową rozpuszcza się w roztworze chlorku litu (LiCl) o stężeniu 10^-3 M, przy proporcji gumy do roztworu mieszczącej się w zakresie 20-33 g/L, po czym do mieszaniny dodaje się czynnik sieciujący w postaci dihydrazydu kwasu adypinowego (ADH) w ilości 10 g/L (gram/litr mieszaniny) oraz aktywator gumy ksantanowej w postaci chlorowodorku 1-etylo-3[3-dimetyloamino]propylokarbodiimidu (EDCl) w ilości od 20 do 30 g/L, korzystnie 25 g/L (gram/litr mieszaniny) i sieciuje się ją do momentu uzyskania usieciowanej gumy ksantanowej, po czym dializuje się ją usuwając niezwiązane cząsteczki dihydrazydu kwasu adypinowego (ADH) oraz chlorowodorku 1-etylo-3[3-dimetyloamino]propylokarbodiimidu (EDCl) i suszy w temperaturze do 70°C usuwając nadmiar wody.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rozpuszczanie gumy ksantanowej w roztworze chlorku litu (LiCl) prowadzi się w temperaturze pokojowej, najlepiej 24°C.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rozpuszczanie gumy ksantanowej w roztworze chlorku litu (LiCl) prowadzi się intensywnie mieszając, najlepiej na mieszadle magnetycznym.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rozpuszczanie gumy ksantanowej w roztworze chlorku litu (LiCl) prowadzi się w czasie 1 h.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rozpuszczanie gumy ksantanowej w roztworze chlorku litu (LiCl) prowadzi się w pH 7,6.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sieciowanie prowadzi się intensywnie mieszając, najlepiej na mieszadle magnetycznym.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sieciowanie prowadzi się najlepiej przez 24 h.

PL 240 860 B1

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sieciowanie prowadzi się w temperaturze pokojowej, najlepiej 24°C.

9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sieciowanie prowadzi się w pH 7,6.

10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dializowanie prowadzi się stosując membranę celulozową (MWCO), najlepiej 12000 - 14000 D.

11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że suszenie prowadzi się w temperaturze 70°C przez 2 h, na suszarce.

12. Sposób immobilizacji mikroorganizmów w nośniku ksantanowym otrzymanym sposobem określonym w zastrzeżeniu 1, znamienny tym, że do usieciowanej, zdializowanej i pozbawionej nadmiaru wody gumy ksantanowej, dodaje się zawiesinę mikroorganizmów w soli fizjologicznej w stosunku objętościowym 10:1 i całość worteksuje się do momentu otrzymania mieszaniny gumy ksantanowej z równomiernie rozprowadzoną zawiesiną mikroorganizmów.

13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że worteksowanie prowadzi się w czasie 30 s.

14. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że po worteksowaniu mieszaninę kształtuje się i utwardza w roztworze chlorku dopaminy w ilości od 2 g/L do 15 g/L, najlepiej 5 g/L, rozpuszczonej w 10 mM Tris-HCl.

15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że kształtowanie prowadzi się dozując 0,05 ml mieszaniny, najlepiej za pomocą strzykawki insulinowej.

16. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że kształtowanie prowadzi się do momentu uzyskania walca o średnicy od 4 mm do 8 mm i wysokości od 6 mm do 8 mm, najlepiej o średnicy 5 mm i wysokości 7 mm.

17. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że w trakcie utwardzania mieszaninę poddaje się wytrząsaniu do momentu utwardzenia nośnika i zwiększenia jego wytrzymałości mechanicznej.

18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że wytrząsanie prowadzi się od 4 h do 10 h, najlepiej przez 6 h, z prędkością od 25 rpm do 35 rpm, najlepiej przy 30 rpm.

19. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że po utwardzeniu, nośnik przynajmniej dwa razy płucze się w 10 mM roztworze Tris-HCl.

20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że po płukaniu, nośnik przenosi się do roztworu soli fizjologicznej i utrzymuje w temperaturze 4°C.