PL242602B1 - Sposób wytwarzania (-)-izomeru 3-hydroksy-3-butyloftalidu - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania (-)-izomeru 3-hydroksy-3-butyloftalidu o wzorze 2. Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania enzymów pochodzących z komórek szczepu Aspergillus candidus AM 386, następuje addycja cząsteczki wody do wiązania podwójnego w łańcuchu bocznym 3-n-butylidenoftalidu. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania (-)-izomeru-3-hydroksy-3-butyloftalidu o wzorze 2 przedstawionym na rysunku.

Metoda, według wynalazku może znaleźć zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym do wytwarzania leku o działaniu neuroprotekcyjnym.

Ftalidy są metabolitami wtórnymi roślin z rodziny selerowatych (León A., Del-Angel M., Avila J.L., Delgado G. Phthalides: Distribution in Nature, Chemical Reactivity, Synthesis, and Biological Activity. Progress in the Chemistry of Organic Natural Products 2017, 104, 127-246).

3-n-Butyloftalid wykazuje pozytywny wpływ na poprawę stanu pacjentów po udarze niedokrwiennym mózgu (Jia J.; Wei C.; Liang J.; Zhou A.; Zuo X.; Song H.; Wu L.; Chen X.; Chen S.; Zhang J., Wu J., Wang K., Chu L., Peng D., Lv P., Guo H., Niu X., Chen Y., Dong W., Han X., Fang B., Peng M., Li D., Jia Q., Huang L. The Effects of DL-3-n-Butylphthalide in Patients with Vascular Cognitive Impairment without Dementia Caused by Subcortical Ischemic Small Vessel Disease: A Multicentre, Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Trial. Alzheimer’s & Dementia, 2016, 12, 89-99). Stwierdzono, że 3-n-butylidenoftalid ogranicza wzrost zmian nowotworowych (Kan W.L.T., Cho C.H.; Rudd, J.A.; Lin, G. Study of the Anti-Proliferative Effects and Synergy of Phthalides from Angelica Sinensis on Colon Cancer Cells. Journal of Ethnopharmacology 2008, 120, 36-43; Tsai N.M., Chen Y.L., Lee C.C., Lin P.C., Cheng Y.L. Chang W.L., Lin S.Z., Harn H.J. The natural compound n-butylidenephthalide derived from Angelica sinensis inhibits malignant brain tumor growth in vitro and in vivo. J. Neurochem 2006, 99, 1251-1262). Znana jest także aktywność przeciwdrobnoustrojowa ftalidów, między innymi przeciw dermatofitom oraz drożdżom z rodzaju Candida (Pannek J., Gach J., Boratyński F., Olejniczak T. Antimicrobial Activity of Extracts and Phthalides Occurring in Apiaceae Plants: Antimicrobial Activity of Phthalides. Phytother. Res. 2018, 32, 1459-1487).

Znana jest metoda mikrobiologicznego wytwarzania 3-hydroksy-3-butyloftalidu poprzez transformację 3-n-butyloftalidu z użyciem szczepu Cunninghamella blakesleana ATCC9244 (Diao X. i wsp. Metabolism and Pharmacokinetics of 3-n-Butylphthalide (NBP) in Humans: The Role of Cytochrome P450s and Alcohol Dehydrogenase in Biotransformation. Drug Metab. Dispos. 2013, 41, 430-444). Brak jest doniesień literaturowych o otrzymywaniu (-)-izomeru 3-hydroksy-3-butyloftalidu metodami biotransformacji poprzez hydratację 3-n-butylidenoftalidu w hodowlach płynnych.

Szczep Aspergillus candidus AM 386, został wyizolowany z nasion bawełny w czerwcu 1978 r., charakteryzuje się kremowo-białą, watowatą, obfitą grzybnią, barwi podłoże na jasno-oliwkowo. Szczep jest corocznie przeszczepiany i hodowany na pożywce Capek o pH=5,6 w temperaturze 27°C. Tempo wzrostu 5 dni. Szczep po oznaczeniu Aspergillus candidus AM 386 przechowywany jest w temperaturze 8°C w kolekcji Katedry Chemii Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu, ul. C. K. Norwida 25 50-375 Wrocławiu, opisano jego zastosowanie był do mikrobiologicznego rozdziału racemicznego octanu 1-fenyloetylu (Boratyński F. i wsp. Microbial Kinetic Resolution of Aroma Compounds Using Solid-State Fermentation. Catalysts 2018, 8, 28, 1-12).

Istotą wynalazku jest sposób otrzymywania (-)-izomeru 3-hydroksy-3-butyloftalidu polegający na tym, że do podłoża typowego dla wzrostu grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Aspergillus candidus AM 386. P po upływie co najmniej 5 dni, do hodowli dodaje się racemiczny 3-n-butylidenoftalid o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, przez co najmniej 8 dni. Kolejno produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,3 mg : 1 ml.

Korzystnie jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Korzystnie jest gdy transformację prowadzi się przez 10 dni.

Korzystnie także jest gdy oczyszczanie prowadzi się wykorzystując cienkowarstwową chromatografię w układzie faz odwróconych z eluentem acetonitryl: 1% kwas mrówkowy w stosunku objętościowym 7:3.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania enzymów pochodzących z komórek szczepu Aspergillus candidus AM 386, następuje addycja cząsteczki wody do wiązania podwójnego w łańcuchu bocznym 3-n-butylidenoftalidu. Uzyskany w ten sposób (-)-izomer 3-hydroksy-3-butyloftalidu wydzielany jest z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu). Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie (-)-izomeru 3-hydroksy-3-butyloftalidu, z wydajnością izolowaną na poziomie 45,4% w temperaturze pokojowej.

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

Przykład. Do kolby Erlenmajera o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 5 g peptonu i 15 g glukozy, wprowadza się szczep Aspergillus candidus AM 386. Po 5 dniach jego wzrostu dodaje się 150 mg 3-n-butylidenoftalidu o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm³ acetonu. Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 10 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się octanem etylu, zebraną warstwę górną osusza się nad bezwodnym siarczanem magnezu, a następnie odparowuje się rozpuszczalnik. Ekstrakt oczyszczany jest chromatograficznie, używając jako eluentu mieszaniny acetonitrylu i 1% kwasu mrówkowego w stosunku objętościowym 7:3.

Na tej drodze otrzymuje się (-)-izomer 3-hydroksy-3-butyloftalidu z wydajnością izolowaną równą 45,4% ([a]²⁵D= -2.4 (c = 1.0, CHCb).

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi:

¹H NMR: (400 MHz), δ (ppm), (CDCb): 0,86 (t, 3H, H-11, J=7,22 Hz), 1,14 (m, 1H, jeden z H-9), 1,30 (m, 2H, H-10), 1,38 (m, 1H, jeden z H-9), 2,07 (ddd, 1H, jeden z H-8, J=14,0, 11,8, 4,5 Hz), 2,20 (m, 1H, jeden z H-8), 7,56 (m, 2H, H-4, H-6), 7,70 (t, 1H, H-5, J=7,48 Hz), 7,81 (d, 1H, H-7, J=7,52 Hz).

¹³C NMR (101 MHz), δ (ppm), (CDCI3): 13,9 (C-11), 22,6 (C-10), 25,5 (C-9), 38,7 (C-8), 107,9 (C-3), 122,4 (C-4), 125,6 (C-7), 126,9 (C-12), 130,7 (C-6), 134,8 (C-5), 149,0 (C-13), 168,9 (C-1).

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania (-)-izomeru 3-hydroksy-3-butyloftalidu, znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla wzrostu grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Aspergillus candidus AM386, następnie po upływie co najmniej 5 dni do hodowli wprowadza się substrat, którym jest racemiczny 3-n-butylidenoftalid o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, przez co najmniej 8 dni, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,3 mg : 1 ml.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
4. 4. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że transformację prowadzi się przez 10 dni.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że oczyszczanie prowadzi się wykorzystując cienkowarstwową chromatografię w układzie faz odwróconych z eluentem acetonitryl: 1% kwas mrówkowy w stosunku objętościowym 7:3.