PL243572B1 - Glikokoniugatowa pochodna metotreksatu i glukozy oraz sposób jej otrzymywania i jej zastosowanie w leczeniu i zapobieganiu nowotworom - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest nowa glikokoniugatowa pochodna metotreksatu i glukozy oraz sposób jej otrzymywania oraz jej zastosowanie w leczeniu i zapobieganiu nowotworom, korzystnie w leczeniu i zapobieganiu nowotworom wybranym spośród: raka skóry, raka jelita grubego, raka piersi, raka żołądka, mięsaka i raka płuc.

Description

Opis wynalazku

Celowane proleki to nowoczesne podejście mające na celu zmniejszenie niepożądanych skutków chemioterapii nowotworowej, spowodowanych nieselektywnym działaniem leków na tkanki ludzkie. W szeroko zakrojonych badaniach analogów leków przeciwnowotworowych sprawdzone i powszechnie stosowane w terapii substancje aktywne wiąże się poprzez linker z substancją, ligandem wykazującym powinowactwo do receptorów błonowych, nadekspresjonowanych w komórkach nowotworowych. Jako substancję aktywną wytypowano metotreksat.

Metotreksat (MTX) jest dobrze znanym i szeroko scharakteryzowanym środkiem przeciwnowotworowym, chemicznie odpowiednim do koniugacji z peptydami. Związek ten jest silnym inhibitorem enzymu reduktazy dihydrofolianowej, który odpowiada za recykling 7,8-dihydrofolianu do jego zredukowanej, fizjologicznie aktywnej postaci 6-(R)-tetrahydrofolianu. Chociaż MTX nie wpływa na wszystkie typy nowotworów, ten środek cytotoksyczny jest z powodzeniem stosowany w chemioterapii od ponad 4 dekad. Poszukując silniejszych analogów MTX, wykazano, że w łańcuchu bocznym jego ugrupowania kwasu glutaminowego można dokonać pewnych zmian bez utraty aktywności. Odnotowano również utrzymanie aktywności w pozycji t-karboksylowej jego reszty kwasu glutaminowego. To sprawia, że MTX nadaje się do sprzęgania nawet z dużymi „nośnikami”, takimi jak węglowodany. Te koniugaty mogą zachować aktywność antyfolianów podobną do MTX, a następnie być skierowane do komórek nowotworowych, które mają specyficzne receptory dla części cukrowej koniugatu.

Metotreksat (MTX) jest antymetabolitem kwasu foliowego, który wiąże się z receptorem kwasu foliowego na powierzchni komórek nowotworowych i odgrywa ważną rolę w celowaniu. Jest powszechnie stosowany w leczeniu różnych nowotworów złośliwych. Jest również powszechnie stosowanym lekiem przeciwreumatycznym. MTX ma również wiele wad w zastosowaniu medycznym, które mogą zwiększać toksyczność czynności wątroby i nerek, a ponieważ według mechanizmu działania leku działa on raczej na cytoplazmę komórek nowotworowych niż na jądro, hamuje on DNA komórek nowotworowych poprzez hamowanie reduktazy dihydrofolianowej.

MTX jest obecnie formułowany jako roztwory do iniekcji i tabletki do podawania doustnego. Chociaż jest to zdecydowanie jeden z najskuteczniejszych leków w leczeniu różnych guzów i reumatoidalnego zapalenia stawów, pewne ograniczenia zmniejszają stosowanie MTX. Właściwości farmakokinetyczne MTX są niezadowalające i mogą skutkować niewystarczającą odpowiedzią kliniczną. Biodostępność MTX w małych dawkach jest prawie całkowita, ale w dużych dawkach wynosi 10-20%. Duże ilości podanego MTX są wydalane przez nerki w krótkim czasie, co skutkuje krótkim okresem półtrwania w osoczu wynoszącym 5-8 godzin i niskim stężeniem leku w tkankach docelowych, np. w guzach, stawach objętych stanem zapalnym itp. Ogólnie głównym powodem odstawienia MTX nie jest brak skuteczności, ale jego toksyczność. Częściej występują objawy toksyczności żołądkowo-jelitowej, takie jak zapalenie jamy ustnej, nudności i dolegliwości brzuszne. Chociaż dokładne mechanizmy toksyczności nadal nie są jasne, niektóre skutki uboczne były bezpośrednio związane z zaangażowaniem MTX w szlaki metaboliczne. 7-OH-MTX, główny metabolit MTX, jest słabiej rozpuszczalny w wodzie i po podaniu dużych dawek leku może przyczyniać się do toksycznego działania na nerki. Te skutki uboczne ograniczają maksymalną dawkę, jaką można podać. W związku z rosnącą częstością występowania nowotworów nieustannie poszukuje się skutecznych terapii, w tym modyfikacji leków klasycznych, które pozwoliłyby zmniejszyć ich działania uboczne, jednocześnie zwiększając skuteczność terapeutyczną.

Aby poprawić skuteczność leku, konieczne jest opracowanie ukierunkowanych terapii, które umożliwią zwiększony wychwyt substancji aktywnej przez komórki rakowe w porównaniu z normalnymi komórkami [Srinivasarao M, Low PS. Ligand-Targeted Drug Delivery. Chemical Reviews. 2017; 117(19):12133-64]. W ostatnich latach przeprowadzono wiele badań w celu przezwyciężenia tych ograniczeń przy użyciu nowych systemów dostarczania leków. Systemy te oferują wiele korzyści, takich jak ulepszone bezpieczeństwo i skuteczność leków, poprawienie biodostępności, przedłużenie działania leku w tkance docelowej oraz poprawa stabilności środków terapeutycznych przed degradacją chemiczną i enzymatyczną.

Właściwości metaboliczne komórek złośliwych różnią się znacznie od właściwości komórek prawidłowych, co zapewnia potencjał ukierunkowanego metabolizmu komórkowego w celu poprawy selektywności leków przeciwnowotworowych. Jedna ze strategii ukierunkowanych na różnice metaboliczne komórek nowotworowych, to sprzęganie glukozy z lekiem. Wykorzystuje się zwiększone zapotrzebowanie glukozy przez guzy lite w porównaniu ze spożyciem przez zdrową tkankę, po raz pierwszy zaobserwowane przez Otto Warburga w pierwszej połowie XX wieku. Aby ułatwić zaspokojenie zwiększonego

PL 243572 BI zapotrzebowania na glukozę, w wielu komórkach nowotworowych obserwuje się podwyższony poziom transporterów glukozy (GLUT). Złośliwe komórki wykazują do 12 razy wyższą aktywność GLUT niż normalne komórki. Koniugaty te są zaprojektowane tak, aby były rozpoznawane przez specyficzne receptory GLUT i wchłaniane przez komórki rakowe z większą szybkością niż przez zdrowe komórki [Calvaresi EC, Hergenrother PJ. Glucose conjugation for the specific targeting and treatment of cancer. Chem Sci. 2013; 4:2319-33],

Glikokoniugaty ΜΤΧ zostały opracowane w celu poprawy swoistości leku, przezwyciężenia lekooporności i przedłużenia jego zatrzymywania się w krwiobiegu. Selektywne celowanie wymaga nie tylko szlaku wychwytu zależnego od nośnika, ale także blokowania innych szlaków, takich jak bierna dyfuzja.

W przypadku metotreksatu strategia syntezy proleku koncentrowała się na opracowaniu metod dostarczania środka terapeutycznego przy użyciu koniugatu polimer-lek. Tak preparowane leki wielkocząsteczkowe mają tę zaletę, że zwiększają siłę działania, jednocześnie zmniejszając oporność na terapię i toksyczne działanie obecnych leków przeciwnowotworowych [L. Abdulrahman, O. Bakare, M. Abdulrahman, The Chemical Approach of Methotrexate Targeting Frontiers in Biomedical Sciences Vol. 1, nr 2, 2016, str. 50-73],

W zgłoszeniu P. 426731 przedstawiono glikokoniugatową pochodną metotreksatu i glukozy, w której D-glukoza poprzez linker połączona jest z grupami aminowymi leku. Jednak, proponowana tam pochodna oraz sposób jej otrzymywania nie są pozbawione mankamentów. Wydajność oczekiwanego produktu nie przekraczała kilkunastu procent. Uzyskanie preparatu o wysokiej czystości wymaga prowadzenia kilkakrotnego oczyszczania metodą chromatografii. Otrzymany związek jest bardzo wrażliwy na działanie promieniowania oraz temperaturę, co znacząco wpływa na jego stabilność.

Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze 1 do zastosowania w chemioterapii.

___ν„___nh₂ ch₃ Ń.

ΗΟ^Ί

HO·

HC^ HO wzór 1

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze 1 do stosowania w leczeniu i zapobieganiu nowotworom.

Korzystnie, związek do stosowania według wynalazku, otrzymany jest do stosowania w leczeniu i zapobieganiu nowotworom wybranym spośród: raka skóry, raka jelita grubego, raka piersi, raka żołądka, mięsaka i raka płuc.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania związku o wzorze 1, charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące etapy:

a) prowadzi się reakcję metotreksatu z N-propargiloaminą, korzystnie w obecności N,N-diizopropylokarbodiimidu (DIC) i 1-hydoksybenzotriazolu (HOBT), a następnie z mieszaniny reakcyjnej izoluje się diamid, związek o wzorze 2:

CHj N.

wzór 2

PL 243572 BI

b) prowadzi się reakcję propargiloamidowej pochodnej metotreksatu o wzorze 2 z azydkiem cukrowym o wzorze 3:

OAC

wzór 3 korzystnie w obecności askorbinianu sodu i siarczanu miedzi, a następnie z mieszaniny reakcyjnej izoluje się związek o wzorze 4:

wzór 4

c) prowadzi się reakcję odbezpieczania glikokoniugatu o wzorze 4 w roztworze metanolanu sodu w metanolu i izoluje związek o wzorze 1.

W sposobie według wynalazku korzystnie w etapie a) reakcję prowadzi się w mieszaninie zawierającej metotreksat (ΜΤΧ), Ν,Ν-diizopropylokarbodiimid (DIC), 1-hydoksybenzotriazol (HOBT) i N-propargiloaminę, w stosunku molowym MTX/DIC/HOBT/propargiloamina wynoszącym 1/1,1/0,5/2,2.

W sposobie według wynalazku korzystnie w etapie a) metotreksat rozpuszcza się w mieszaninie DMF i DCM.

W sposobie według wynalazku w etapie a) związek o wzorze 2 izoluje się techniką chromatografii kolumnowej, korzystnie na żelu krzemionkowym stosując jako eluent układ CHCIsOHsOH w stosunku objętościowym od 50:1 do 10:1.

W sposobie według wynalazku etapie b) związek o wzorze 4 izoluje się techniką chromatografii kolumnowej, korzystnie na żelu krzemionkowym stosując jako eluent układ CHCIsOHsOH w stosunku objętościowym od 20:1 do 5:1.

W sposobie według wynalazku w etapie b) związek o wzorze 2 rozpuszcza się w mieszaninie alkohol izopropylowy/THF o stosunku objętościowym 1/1.

W sposobie według wynalazku w etapie c) glikokoniugat o wzorze 4 rozpuszcza się w alkoholu metylowym.

W sposobie według wynalazku w etapie c) prowadzi się neutralizację mieszaniny reakcyjnej stosując kationit w formie wodorowej.

W sposobie według wynalazku w etapie c) reakcję prowadzi się chroniąc naczynia reakcyjne przed światłem.

Innym przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze 2.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze 4.

Zgodnie z wynalazkiem pralek zawiera D-glukozę połączoną poprzez difunkcyjny linker z metotreksatem. Połączenie difunkcyjnego linkera z cukrem i metotreksatem zaplanowano tak, aby po wprowadzeniu proleku do komórki nowotworowej następowało uwolnienie ΜΤΧ w reakcjach hydrolizy wiązania glikozydowego i amidowego katalizowanej przez enzymy hydrolityczne glikozylohydrolazy i peptydazy. Substrat cukrowy to 3-azydopropylo tetra-O-acetylo-8-D-glukozyd. Przejściowy substrat, pochodna metotreksatu to diamid, produkt reakcji N-propargiloaminy z grupami karboksylowymi metotreksatu. Przy planowaniu syntezy glikokoniugatu przyjęto szereg założeń decydujących o efektywności metody. I tak z uwagi na obserwowaną izomeryzację reszty kwasu glutaminowego w reakcjach funkcjonalizacji grup karboksylowych ten etap utworzenia wiązania amidowego zaplanowano w reakcji kondensacji katalizowanej przez karbodiimid w obecności 1-hydroksybenztriazolu. Łączenie substratów za

PL 243572 BI planowano w reakcji 1,3-dipolarnej cykloaddycji azydku do terminalnego wiązania potrójnego z utworzeniem triazyny. Końcowym etapem syntezy jest odacylowanie jednostki cukrowej. Konwencjonalna metoda to reakcja alkoholizy katalizowana przez metanolan sodowy w warunkach opisanych przez Zemplena. W dobranych warunkach deprotekcja cukru nie prowadziła do lizy wiązania amidowego. Produkt wydzielono techniką chromatografii kolumnowej.

Przedmiot wynalazku przedstawiono w przykładzie wykonania i na załączonych figurach rysunku, gdzie:

na figurze 1 przedstawiono wpływ Glu-ΜΤΧ i metotreksatu na przeżywalność komórek SCC-25 (rak skóry), na figurze 2 przedstawiono wpływ Glu-ΜΤΧ i metotreksatu na przeżywalność komórek A427 (rak płuca), na figurze 3 przedstawiono wpływ Glu-ΜΤΧ i metotreksatu na przeżywalność komórek MCF-7 (rak piersi), na figurze 4 przedstawiono wpływ Glu-ΜΤΧ i metotreksatu na przeżywalność komórek MG-63 (mięsak kościopochodny), na figurze 5 przedstawiono wpływ Glu-ΜΤΧ i metotreksatu na przeżywalność komórek DLD-1 (rak jelita grubego), na figurze 6 przedstawiono wpływ Glu-ΜΤΧ i metotreksatu na przeżywalność zdrowych komórek ludzkich WI38 (fibroblasty), na figurze 7 przedstawiono wyniki analizy MS dla komórek nowotworowych raka piersi MCF-7, na figurze 8 przedstawiono wyniki analizy MS dla komórek nowotworowych raka płuc A427. Szczegółowo syntezę proleku przedstawiono na poniższym schemacie.

Przykład 1

Synteza chemiczna

Sposób otrzymywania proleku metotreksatu składa się z następujących etapów:

1) synteza amidu- rozpuszczenie ΜΤΧ w bezwodnym DMF, ogrzewanie w temperaturze od 20°C do 30°C, do rozpuszczenia ΜΤΧ, dodanie chlorku metylenu do otrzymania nasyconego roztworu ΜΤΧ, a następnie schłodzenie do temperatury 0°C, dodanie Ν,Ν-diizopropylokarbodiimidu (DIC), 1-hydroksybenzotriazolu (HOBT) i propargiloaminy, Stosunek molowy MTX/DIC/HOBT/ amina wynosi 1/1.2/0,5/2,2. Reakcję amidowania prowadzono w temperaturze pokojowej mieszając zawartość naczynia przez 10 dni. Następnie po zatężeniu mieszaniny reakcyjnej wydzielono produkt metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym.

2) synteza glikokoniugatu w 1,3-dipolarnej cykloaddycji: - wydzielony, chromatograficznie czysty diamid rozpuszczono w mieszaninie alkohol izopropylowy/THF (1/1; v/v). Do uzyskanego roztworu dodano 3-azydopropylo tetra-O-acetylo-8-D-glukopiranozyd i mieszano do uzyskania żółtego roztworu. Następnie dodano wodny roztwór askorbinianu sodowego i wodny roztwór siarczanu miedzi II. Reakcję prowadzono w temp pokojowej przez 24 godziny. Po zakończeniu reakcji (pełne przereagowanie diamidu) odsączono osad, przesącz zatężono, produkt wydzielono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym.

3) metanoliza- odacylowanie uzyskany glikokoniugat rozpuszczono w alkoholu metylowym (5 ml) dodano roztwór metanolanu sodowego w metanolu (1 ml), mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut, dodano kationit w formie wodorowej do neutralizacji roztworu, odsączono kationit, przemyto metanolem, przesącze zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując koniugat, pralek metotreksatu, chromatograficznie czysty w postaci żółtego osadu.

Opisane reakcje prowadzono chroniąc naczynia reakcyjne przed światłem.

PL 243572 BI

Etap I: Synteza N-propargiloamidu, pochodnej metotreksatu

HOOC ⁰

DIC, HOBT

DMF. DCM

Metotreksat (500 mg, 1.10 mmol) rozpuszczono w bezwodnym DMF (10 mL) i bezwodnym DCM (2 mL). Kolbę zabezpieczono przed światłem i umieszczono w łaźni wodno-lodowej. Do mieszaniny reakcyjnej w temperaturze 0°C wkroplono DIC (210 pL, 1.34 mmol), dodano HOBT (77 mg, 0.57 mmol), a następnie propargiloaminę (155 pL, 2.42 mmol). Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej przez 10 dni. Po przerwaniu reakcji zawartość kolby zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (elucja gradientem układu CHCIsOHsOH, 50:1 do 10:1), otrzymując żółty osad (407 mg, 70%; t.t.: 105°C, ag³ = 16 (c ⁼ 1.0, DMSO)).

Ή NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.80-2.05 (m, 2H, 2xCHmtx), 2.07-2.24 (m, 2H, CH₂mtx), 3.06 (m, 1H, CH), 3.16 (m, 1 H, CH), 3.22 (s, 3H, CH₃mtx), 3.80-3.85 (m, 4H, 2xCH₂), 4.33 (m, 1H, CHmtx), 4.80 (s, 2H, CH₂mtx), 6.78-6.85 (m, 4H, 2xH-PHmtx, NH₂mtx), 7.63 (bs, 1H, ΝΗμτχ), 7.72-7.77 (m, 2H, 2xH-PHmtx), 7.85 (bs, 1H, ΝΗμτχ), 8.09 (m, 1H, ΝΗμτχ), 8.23-8.31 (m, 2H, 2xNH), 8.58 (s, 1H, H-7mtx).

¹³ C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 27.36, 27.76, 27.94, 31.77, 38.87, 52.90, 54.82, 72.81,72.83, 81.13, 81.17,110.92, 110.99, 121.17, 121.46, 128.90, 128.97, 146.61, 149.06, 150.82, 152.54, 160.82, 162.64, 166.07, 171.38, 171.58.

HRMS (ESI-TOF): obliczono dla C₂₆H₂8Nio0₃ ([M+H]⁺): m/z 529.2424, oznaczono: m/z 529.2421.

Etap II: Synteza glikokoniugatu, pochodnej metotreksatu

417,3675

NaAsc CuSO₄5H2O /PrOHrTHFiHjO (ν/νίν)

Otrzymaną w poprzednim etapie propargiloamidową pochodną metotreksatu (407 mg, 0.77 mmol) oraz azydek cukrowy (643 mg, 1.54 mmol) rozpuszczono w mieszaninie rozpuszczalników i- PrOH (6 ml) oraz THF (6 ml). W dwóch fiolkach przygotowano układy katalityczne: askorbinian sodu (123 mg, 0.62 mmol) rozpuszczony w H₂O (3 ml) i CuSO4-5H₂O (77 mg, 0.31 mmol) rozpuszczony w H₂O (3 ml), zmieszano je ze sobą i wprowadzono do mieszaniny reakcyjnej. Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej przez 24 h. Po zakończeniu reakcji zawartość kolby zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (elucja gradientem układu CHCIsOHsOH, 20:1 do 5:1), otrzymując żółty osad (724 mg, 69%; t.t.: 114°C, ag³ -6 (c = 1.0, DMSO).

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.87-1.91 (m, 2H, 2xCHmtx), 1.92, 1.98, 2.01, 2.02 (4s, 24H, 8xCH₃CO), 2.11-2.24 (m, 2H, CH₂mtx), 3.21 (s, 3H, CH₃mtx), 3.84-3.93 (m, 2H, CH₂NH), 3.97 (ddd, 2H, J = 2.4 Hz, J = 4.9 Hz, J = 9.8 Hz, 2xH-5_giu), 4.03 (dd, 2H, J = 2.4 Hz, J = 12.3 Hz, 2xH-6a_gi_u), 4.05-4.12 (m, 2H, CH₂NH), 4.17 (dd, 2H, J = 4.9 Hz, J = 12.3 Hz, 2xH-6b_gi_u), 4.22-4.32 (m, 4H, 2xCH₂O), 4.36 (m, 1H, CHmtx), 4.42-4.54 (m, 4H, 2xCH₂N), 4.72 (dd~t, 2H, J = 8.2 Hz, J = 9.4 Hz 2xH-2_gi_u), 4.79 (s, 2H, CH₂mtx), 4.82 (d, 2H, J = 8.2 Hz, 2xH-1_gi_u), 4.89 (dd~t, 2H, J = 9.4 Hz, J = 9.4 Hz, 2xH-3_giu), 5.22 (dd~t, 2H, J = 9.4 Hz, J = 9.8 Hz, 2xH-4_gi_u), 6.65 (bs, 2H, NH₂mtx), 6.81 (m, 2H, 2xH-PHmtx), 7.74 (m, 2H, NH₂mtx), 7.78 (m, 2H, 2xH-PHmtx), 8.08 (m, 1H, ΝΗμτχ), 8.26-8.38 (m, 2H, 2xNH), 8.56 (s, 2H, 2xH5triaz), 8.59 (s, 1H, H-7mtx).

¹³ C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 20.19, 20.22, 20.34, 20.47, 27.55, 31.91, 34.15, 38.89, 49.11, 53.08, 54.83, 61.62, 67.38, 68.08, 70.52, 70.64, 71.91,99.13, 110.99, 121.21, 121.41, 122.98, 128.96, 144.67, 146.16, 149.10, 150.86, 154.71, 162.55, 162.66, 166.09, 168.95, 169.23, 169.48, 170.02, 171.62, 171.76.

HRMS (ESI-TOF): obliczono dla C⁵⁸H⁷⁴N¹⁶O²³ ([M+H]⁺): m/z 1363.5191, oznaczono: m/z 1363.5137.

PL 243572 BI

Etap III: Metanoliza, usuwanie grup acetylowych

Odważoną porcję otrzymanego glikokoniugatu (300 mg, 0.22 mmol) rozpuszczono w metanolu (20 ml), a następnie dodano 1M roztwór metanolanu sodu w metanolu (600 μΙ, 0.6 mmol). Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej przez 3 h. Po zakończeniu reakcji zawartość kolby zneutralizowano za pomocą żywicy jonowymiennej Amberlyst-15, którą następnie odsączono, a przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując odbezpieczony glikokoniugat w postaci żółtego osadu (183 mg, 81%; t.t.: 107-108°C, ag³ = 42 (c = 1.0, DMSO).

Ή NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.85-2.10 (m, 2H, 2xCHmtx), 2.13-2.28 (m, 2H, CH₂mtx), 3.21 (s, 3H, CH₃mtx), 2.93-3.01 (m, 2H, 2xH-2giu), 3.03-3.08 (m, 2H, 2xH-4giu), 3.09-3.16 (m, 4H, 2xH-3giu, 2xH-5giu), 3.39-3.49 (m, 2H, 2xH-6a_Giu), 3.63-3.70 (m, 2H, 2xH-6b_Giu), 3.83-3.93 (m, 4H, CH₂NH), 4.014.10 (m, 4H, 2xCH₂), 4.19-4.24 (m, 2H, CH₂), 4.25-4.32 (m, 4H, 2xH-1giu, 2xCH₂), 4.38 (m, 1H, CHmtx), 4.47-4.56 (m, 4H, 4xOH), 4.78 (s, 2H, CH₂mtx), 6.60 (bs, 2H, NH₂mtx), 6.81 (m, 2H, 2xH-PHmtx), 7.66 (bs, 2H, NH₂mtx), 7.74 (m, 2H, 2xH-PHmtx), 8.15 (m, 1H, ΝΗμτχ), 8.32-8.44 (m, 2H, 2xNH), 8.47 (s, 2H, 2xH-5triaz), 8.56 (s, 1H, H-7mtx).

¹³ C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 30.24, 31.99, 34.21,34.31, 38.62, 48.31,49.31,51.01, 54.55, 60.77, 66.99, 69.71, 73.00, 76.35, 76.73, 102.66, 110.74, 111.70, 120.34, 121.54, 123.25, 128.76, 144.35, 145.70, 148.86, 150.88, 154.88, 162.39, 162.55, 165.58, 171.57, 172.61.

HRMS (ESI-TOF): obliczono dla C42H58N16O15 ([M+H]⁺): m/z 1027.4346, oznaczono: m/z 1027.5416.

Przykład 2

Analiza aktywności biologicznej in vitro związku GLU-ΜΤΧ w porównaniu z wolnym ΜΤΧ na liniach komórkowych nowotworów litych

Analiza cytotoksyczności związku według wynalazku (test MTT)

Komórki w ilości 5-10 χ 10³ komórek na studzienkę wysiano na płytkę 96-studzienkową. Po 24 godzinach zlano pożywkę hodowlaną i podano po 100 pl świeżej pożywki do studzienek kontrolnych oraz pożywkę z rozpuszczonymi w DMSO badanymi związkami do studzienek badanych. Płytki owinięto w folię i umieszczono w inkubatorze. Po 72 godzinach inkubacji zlano pożywkę i dodano 100 μΙ roztworu żółtego rozpuszczalnego bromku 3-(4,5-dimetylo-2-tiazolilo)-2,5-difenylo-2H-tetrazoliowego (MTT) w stężeniu 0,5-1 mg/ml. Po 4 godzinach inkubacji, roztwór MTT zlano i podano 50 μΙ/studzienkę DMSO. Po 3 godzinach gęstość optyczną rozpuszczonego formazanu analizowano kolorymetrycznie w czytniku płytek BioTek. Stężenie DMSO w badanych próbach nie przekroczyło 0,2%.

Ponieważ żywe komórki powodują redukcję MTT do formazanu, gęstość optyczna (GO) jest najwyższa w studzienkach kontrolnych (K), które stanowiły 100% przeżywalności komórek. Przeżywalność w studzienkach inkubowanych ze związkiem (Z) wyliczano na podstawie wzoru:

X= 100% x GO Z/GO K

Po dane wyniki stanowią wartość średnią z 3 powtórzeń analizy cytotoksyczności.

Badania oceny przeżywalności za pomocą testu MTT na liniach komórkowych licznych nowotworów, w tym: raka piersi, jelita grubego, płuc, skóry oraz mięsaka kości wykazały, że związek Glu-MTX działa cytotoksycznie in vitro. Na Figurach 1-6 oraz w Tabeli 1 pokazano porównawcze wyniki badania oceny przeżywalności (IC50) dla różnych linii komórek nowotworowych oraz zdrowych fibroblastów, na które oddziaływano samym metotreksatem lub pochodną według wynalazku glukoza-metotreksat (związek o wzorze 1). Działanie cytotoksyczne koniugatu metotreksatu z glukozą jest zbliżone do działania niezmodyfikowanego metotreksatu. W badaniu zastosowano: GLU-ΜΤΧ 10 μΜ, Metotreksat 10 μΜ; inkubacja 72 godzin; analiza MTT.

PL 243572 BI

Tabela 1

Związek	Wartości IC50 (μΜ) poszczególnych linii komórkowych
MCF-7 (pierś)	DLD-1 (jelito grube)	SCC25 (skóra)	A427 (płuco)	MG-63 (mięsak kości)	SW480 (jelito grube)	WI38 (zdrowe fibroblasty)
GLU- ΜΤΧ	16,24 ±0,2 2	9,81 ±0,32	71,42±2,1 2	7,35±0,0 6	79,15±0,44	6,8±0,36	52,15±1,22
ΜΤΧ	9,61±0,12	6,85±0,21	80,64±1,8 7	6,02±0,3 2	60,97±0,76	4,82±0,3 1	16,88±1,94

Analiza MS

Komórki w ilości 2,5 χ 10⁵ komórek/studzienkę wysiano na płytkę 6-studzienkową w 1 ml/studzienkę. Kiedy komórki osiągnęły 80% konfluencji, zlano pożywkę hodowlaną i podano odpowiednio po 1 ml na studzienkę świeżej pożywki do studzienek kontrolnych lub 1ml na studzienkę badaną pożywki z metotreksatem w stężeniu 10 μΜ lub pochodną metotreksatu w stężeniu 10 μΜ. Płytkę owinięto folią i inkubowano 2 godziny w inkubatorze. Po tym czasie zlano pożywkę, każdą studzienkę płukano 2x1 ml PBS o temperaturze pokojowej. Następnie, płytkę ułożono na lodzie i do każdej studzienki podano 500 pi mieszaniny 3:1 metanolu i ultraczystej wody o temperaturze -20°C. W każdej studzience kilkukrotnie pipetowano mieszaninę i pobrano ją do probówki. Następnie procedurę powtórzono i przygotowane próbki (każda o objętości 1 ml) włożono do zamrażarki niskotemperaturowej -80°C. Następnego dnia próbki zagęszczano w koncentratorze próżniowym do całkowitego wysuszenia próbki. Przed analizą do próbki dodano rozpuszczalnika do analizy MS (Xevo G2 Q-TOF MS). Na figurze 7 można zauważyć, że pole powierzchni dla ΜΤΧ w komórkach nowotworowych MCF7 rosnących z ΜΤΧ wynosi około 308 jednostek, a w przypadku zastosowania związku według wynalazku (określonego na fig. 7 jako 77_1) - 525, czyli jest około 1,7 razy mniejsze niż w przypadku koniugatu. Na figurze 8 analogicznie dla komórek A427, pole powierzchni dla ΜΤΧ jest 1,7 razy mniejsze w porównaniu do pola powierzchni koniugatu. Komórki nowotworowe, ze względu na nadekspresję transportera GLUT-1, efektywniej akumulują wewnątrzkomórkowe koniugat metotreksatu z glukozą (GLU-ΜΤΧ) po 2 godzinach, w porównaniu do wolnego metotreksatu.

Przykład 3

Ocena in vivo profilu farmakokinetycznego koniugatu według wynalazku

Zbadano profil farmakokinetyczny będącej przedmiotem wynalazku pochodnej glukozowej metotreksatu (GMTX; wzór chemiczny: C42H58N16O15), w stosunku do profilu klasycznej formy tego leku (ΜΤΧ), po jednokrotnym podaniu dożylnym do żyły ogonowej. Podawane zwierzętom roztwory przygotowywano w dniu podania.

GMTX miał postać proszku o barwie pomarańczowej, nie posiadał zapachu. Związek przechowywano w temperaturze 4-8°C w zamkniętym oryginalnym opakowaniu.

GMTX podawano myszom dożylnie do żyły ogonowej, w dawce jednorazowej, w postaci roztworów (o stężeniach zapewniających podanie zwierzętom właściwych dawek) przygotowanych w 5%

DMSO i soli fizjologicznej w stosunku 1:20, w objętości nieprzekraczającej 0,2 cm³/mysz. Nośnik materiału badanego stanowił roztwór chlorku sodu do wstrzykiwać z dodatkiem DMSO (stosunek DMSO i soli fizjologicznej wynosił 1:20 - 5% DMSO).

Metotreksat (wzór chemiczny: C20H22N8O5; Nr CAS: 59-05-2) użyty w badaniu pochodził z firmy EBEWE Pharma Ges.m.b.H.Nfg. (Methotrexat-Ebewe, 100 mg/cm³), był w postaci koncentratu do sporządzania roztworu do infuzji.

Badanie przeprowadzono na 40 dojrzałych płciowo - nie młodszych niż 8 tygodni, ale nie starszych niż 12 tygodni, samcach myszy domowej (Mus musculus; szczep wsobny BALB/ccmdb) o masie ciała 18,05-20,80 g (różniącej się nie więcej niż ± 20%). Zwierzęta doświadczalne pochodziły z hodowli Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku, z Centrum Medycyny Doświadczalnej.

Wyboru zwierząt do badania dokonano na drodze doboru losowego w barierze hodowlanej. Przed przeniesieniem myszy z bariery hodowlanej do bariery eksperymentalnej lekarz weterynarii przeprowadził ocenę stanu zdrowia zwierząt w barierze hodowlanej celem ich kwalifikacji do eksperymentu. Myszy poddano 5-dniowej aklimatyzacji przed podaniem materiału badanego. W trakcie eksperymentu zwierzęta utrzymywano w statusie pozbawionym specyficznych patogenów (SPF; ang. specific pathogen free), w systemie indywidualnie wentylowanych klatek (IVC; model 1284 i 1285 firmy Tecniplast S.p.A, Włochy). Sprzęt i materiały wykorzystywane w badaniu poddano myciu oraz sterylizacji. Zwierzęta doświadczalne przez cały okres eksperymentu żywiono sterylną (dezynfekowaną nadtlenkiem wodoru) paszą bytową dla myszy (ssniff Spezialdiaten GmbH) i sterylną wodą pitną wolnymi od zanieczyszczeń. Myszy miały zapewniony nieograniczony dostęp do paszy i wody.

Myszom podawano drogą dożylną (i.v.) GMTX i MTX oraz pobierano krew (celem uzyskania osocza) w 4 punktach czasowych od iniekcji (po 1 h, 2 h, 4 h i 8 h), jak również w tzw. czasie 0 (pobranie krwi od zwierząt, którym nie podano ani MTX, ani GMTX). Badanie przeprowadzono na 40 samcach myszy szczepu BALB/ccmdb. Szesnastu samcom podano MTX w dawce 32,5 mg/kg m.c. (½ LD50 MTX dla myszy przy podaniu dożylnym, LD50 = 65 mg/kg m.c.). Kolejnym 16 samcom podano GMTX w dawce 400 mg/kg m.c. stanowiącej ½ MTD tego związku (wyznaczonej w badaniu własnym o kodzie T425/001/2020), a pozostałym 8 osobnikom nie podano ani MTX w formie klasycznej, ani jego glikokoniugatu (GMTX). Dwie godziny przed podaniem zwierzętom MTX lub GMTX odstawiono paszę, a po 30 minutach od podania zwierzęta miały ponownie dostęp do paszy.

MTX i GMTX podawano myszom w postaci roztworów przygotowanych do iniekcji odpowiednio o stężeniach 0,783 mg/0,2 cm³ i 9,04 mg/0,2 cm³.

Niezwłocznie po uśpieniu (podanie wziewne izofluranu), po upływie określonych czasów, tj. 0, 1, 2, 4 i 8 h, od każdego zwierzęcia pobrano krew w maksymalnej objętości do probówek z wersenianem dipotasu (K2-EDTA). Całkowite skrwawienie spowodowało śmierć zwierzęcia. Krew pełną odwirowano (3000 obrotów przez 15 minut) przy użyciu wirówki 5810R firmy Eppendorf AG (Niemcy) celem uzyskania osocza, które niezwłocznie zamrożono w probówkach typu Eppendorf w -80 ± 5°C.

Próbki osocza rozmrażano w temperaturze 6°C. Do 100 μl osocza dodawano po 10 μl standardu wewnętrznego (IS) o stężeniu 2 μM (koniugat 63/2). Następnie do probówek przeniesiono po 400 μl metanolu (-20°C) i całość wytrząsano przez 5 minut w temperaturze 6°C. W kolejnym etapie probówki wirowano (22000 ref, 4°C, 7 minut), a powstały supernatant przenoszono do polipropylenowych naczynek chromatograficznych i poddawano analizie LC-MS. Krzywa wzorcowa do oznaczeń MTX oraz GMTX została przygotowana w osoczu mysim. Stężenie MTX i GMTX w osoczu myszy oznaczono z wykorzystaniem spektrometru mas (Xevo G2 Q-TOF) sprzęgniętego z chromatografem cieczowym Acquity UPLC (LC-MS) firmy Waters. Pomiary MS prowadzono w trybie podwyższonej czułości (Sensitivity Mode) w polaryzacji dodatniej. W celu zapewnienia wysokiej dokładności pomiaru wartości m/z, zastosowano LockSpray - enkefalinę leucynową o stężeniu 50 pg/cm³, która była w sposób ciągły podawana do źródła jonów. Zastosowano następujące parametry pracy źródła jonów spektrometru masowego: Napięcie przyłożone do kapilary (kV) 0,5; Napięcie przyłożone do stożka (V) 15; Temperatura źródła jonów (°C) 125; Temperatura desolwatacji (°C) = 450; Przepływ gazu osłonowego (l/h) 65; Przepływ gazu desolwatacyjnego (l/h) 800.

Wyniki oznaczeń stężenia MTX i GMTX w osoczu myszy poddano analizie statystycznej z wykorzystaniem programu komputerowego Statistica 13. Wyniki wyrażono w postaci stężenia średniego (± odchylenie standardowe - SD) w poszczególnych punktach czasowych. Celem oceny zmian stężenia MTX i GMTX w osoczu w czasie do 8 h od podania dożylnego zastosowano nieparametryczny test Kruskala - Wallisa. Różnice uznaje się za znamienne statystycznie przy p < 0,05.

PL 243572 Β1

Analiza zmian stężeń ΜΤΧ i GMTX wykazała, że ΜΤΧ, jak i unikalna pochodna tego leku i glukozy - glikokoniugat metotreksatu są szybko eliminowane z krążenia ogólnego w ciągu pierwszych 4 h od podania dożylnego.

Ponadto eliminacja GMTX z krążenia ogólnego dwie godziny od podania dożylnego jest szybsza niż eliminacja ΜΤΧ. Eliminacja GMTX w porównaniu do wolnego ΜΤΧ po 2 h jest 6.58 razy szybsza. Wyniki przedstawiono w tabeli 2.

Tabela 2. Średnie stężenie ΜΤΧ oraz GMTX w nM po 1,2, 4, 8 godzinach po podaniu dożylnym w próbkach osocza myszy 'ΜΤΧ lh _8h '_GMTX ίϊΠαΜΤΧ 2h GMTX 4h ^!GMTX 8% ———ł— ——- ——- t— —— ——4—--—-— —i— —,

1740,6	330 i	20,7 i	71,6'	20884,7'	311,4!	62,5'	12,2 j
2164,91	298,71	29,41	20,31	23409,9)	1021,4|	54,1)	69,4i
2328,5 ί	222,8’	22,6)	7,2'	29781,6·	523,5J	55,6	33,5)
1672,4 j	311,4'	32, J	23,1!	36666,4*		39,9!	6,8
1976,6|	290,725	26,2!	30,55·	27685,65	618,7667)	53,025)	30,475
100,00%;	14,71%)	1,33%)	1,55%;	100,00%;	2,23%)	0,19%|	0,11%!

Przykład 4

Ocena toksyczności ostrej in vivo koniugatu według wynalazku

W badaniu oceniono toksyczność ostrej glikokoniugatu metotreksatu (GMTX) (jednorazowe podanie dożylne) z wyznaczeniem maksymalnej dawki tolerowanej (MTD).

Ocenę toksyczności ostrej GMTX przeprowadzono metodą większej - mniejszej dawki według procedury OECD nr 425, która uwzględnia dążenie do poprawy dobrostanu zwierząt i zasadę 3R (ang. Replacement - Zastąpienie, ang. Reduction - Redukcja, ang. Refinement- Udoskonalenie).

GMTX podawano myszom dożylnie do żyły ogonowej, w dawce jednorazowej, w postaci roztworów (o stężeniach zapewniających podanie zwierzętom właściwych dawek) przygotowanych w 5% DMSO w soli fizjologicznej w stosunku 1:20, w objętości nieprzekraczającej 0,2 cm³/mysz. Nośnik materiału badanego stanowił roztwór chlorku sodu do wstrzykiwać z dodatkiem DMSO (stosunek DMSO i soli fizjologicznej wynosił 1:20 - 5% DMSO). Materiał badany przechowywano przez okres trwania badania w oryginalnym opakowaniu w temperaturze 4-8°C. Roztwory GMTX, które podawano zwierzętom każdorazowo przygotowywano w dniu podania. Przygotowane roztwory materiału badanego i nośnika, podgrzewano do temp. 35°C bezpośrednio przed podaniem zwierzętom.

Badanie przeprowadzono na 14 dojrzałych płciowo - nie młodszych niż 8 tyg., ale nie starszych niż 12 tygodni, samicach (nierodzących i nieciężarnych) myszy domowej (Mus musculus; szczep wsobny BALB/ccmdb) o masie ciała 20,60-22,00 g (różniącej się nie więcej niż ± 20%). Zwierzęta doświadczalne pochodziły z hodowli Centrum Medycyny Doświadczalnej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku.

Zwierzęta kwalifikowano do badania na drodze doboru losowego w barierze hodowlanej. Przed przeniesieniem myszy z bariery hodowlanej do bariery eksperymentalnej lekarz weterynarii dokonał oceny stanu zdrowia zwierząt celem ich kwalifikacji do eksperymentu. Myszy poddano minimum 5-dniowej aklimatyzacji przed rozpoczęciem podawania nośnika lub materiału badanego. W trakcie doświadczenia kontrolowano śmiertelność myszy oraz prowadzono ogólne i szczegółowe obserwacje zwierząt w celu uchwycenia ewentualnych objawów działania toksycznego materiału badanego i nośnika. W doświadczeniu wykorzystano łącznie 14 myszy, w tym 11 zwierząt do oceny toksyczności ostrej GMTX i 3 osobniki do oceny toksykologicznej jego nośnika.

Zastosowano procedurę większej - mniejszej dawki oceny toksyczności ostrej polegającą na podawaniu pojedynczemu zwierzęciu materiału badanego w dawce jednorazowej niższej od oczekiwanej wartości LDso. W zależności od efektów uzyskanych po podaniu pierwszej dawki, kolejnemu osobnikowi podawano dawkę powiększoną lub pomniejszoną o stały współczynnik. Postępowanie to kontynuowano do osiągnięcia takiej dawki, której zwiększenie powodowało zgon, a obniżenie skutkowało przeżyciem 3 kolejnych zwierząt. Następnie prowadzono obserwację myszy codziennie przez 14 dni od podania, po czym zwierzęta poddano pełnemu badaniu sekcyjnemu z pobraniem krwi z serca w maksymalnej objętości oraz pobraniem materiału do badań histopatologicznych.

PL 243572 BI

U wszystkich myszy, którym podano materiał badany stwierdzono brak jakichkolwiek objawów toksyczności ostrej w okresie 14 dni od podania 800 mg GMTX/kg m.c. Zatem, MTD glukozowej pochodnej metotreksatu przy jednorazowym podaniu dożylnym jest większa niż 800 mg/kg m.c.

Uwzględniając fakt, iż MTD metotreksatu dla myszy szczepu BALB/c przy podaniu dożylnym wynosi 94 mg/kg m.c. [Moura JA, Valduga CJ, Tavares ER, Kretzer IF, Maria DA, Maranhao RC. Novel formulation of a methotrexate derivative with a lipid nanoemulsion. Int J Nanomedicine. 2011; 6:22852295.] w oparciu o wyniki przeprowadzonej oceny toksyczności ostrej dla GMTX, można stwierdzić, że nowa pochodna tego leku i glukozy - glukozowa pochodna metotreksatu charakteryzuje się mniejszą toksycznością ostrą niż klasyczna forma leku, ponieważ maksymalna tolerowana dawka GMTX to 800 mg/kg m.c. Wysoka dawka tolerowana stanowi największą korzyść w przypadku stosowania GMTX, ponieważ diametralnie pozwala zmniejszyć toksyczność ogólną preparatu przy zachowaniu jego działania, a tym samym zmniejszyć śmiertelność wywołaną toksycznością.

Claims (15)

1. Związek o wzorze 1

2. Związek o wzorze 1 do stosowania w medycynie.

3. Związek o wzorze 1 do stosowania w leczeniu i zapobieganiu

4. Związek do stosowania według zastrz. 3, znamienny tym, że nowotwór jest wybrany spośród: raka skóry, raka jelita grubego, raka piersi, raka żołądka, mięsaka i raka płuc.

5. Sposób otrzymywania związku o wzorze 1, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

a) prowadzi się reakcję metotreksatu z N-propargiloaminą, korzystnie w obecności N,N-diizopropylokarbodiimidu (DIC) i 1-hydoksyybenzotriazolu (HOBT), a następnie z mieszaniny reakcyjnej izoluje się diamid, związek o wzorze 2:

wzór 2

b) prowadzi się reakcję 1,3-dipolarnej cykloaddycji azydo-alkinowej N-propargiloamidu, pochodnej metotreksatu o wzorze 2 z azydkiem cukrowym o wzorze 3:

PL 243572 Β1

OAC

wzór 3 korzystnie w obecności askorbinianu sodu i siarczanu miedzi, a następnie z mieszaniny reakcyjnej izoluje się związek o wzorze 4:

wzór 4

c) prowadzi się reakcję odbezpieczania glikokoniugatu o wzorze 4 w roztworze metanolanu sodu w metanolu i izoluje związek o wzorze 1.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w etapie a) reakcję prowadzi się w mieszaninie zawierającej metotreksat (ΜΤΧ), Ν,Ν-diizopropylokarbodiimid (DIC), 1-hydoksybenzotriazol (HOBT) i N-propargiloaminę, w stosunku molowym MTX/DIC/HOBT/propargiloamina wynoszącym 1/1,1/0,5/2,2.

7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w etapie a) metotreksat rozpuszcza się w mieszaninie DMF i DCM.

8. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w etapie a) związek o wzorze 2 izoluje się metodą chromatografii kolumnowej, korzystnie na żelu krzemionkowym stosując jako eluent układ CHChOHsOH w stosunku objętościowym od 50:1 do 10:1.

9. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w etapie b) związek o wzorze 4 izoluje się metodą chromatografii kolumnowej, korzystnie na żelu krzemionkowym stosując jako eluent układ CHChOHsOH w stosunku objętościowym od 20:1 do 5:1

10. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w etapie b) związek o wzorze 2 rozpuszcza się w mieszaninie alkohol izopropylowy/THF/woda o stosunku objętościowym 1:1:1.

11. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w etapie c) glikokoniugat o wzorze 4 rozpuszcza się w alkoholu metylowym.

12. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w etapie c) prowadzi się neutralizację mieszaniny reakcyjnej stosując kationit w formie wodorowej.

13. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w etapie c) reakcję prowadzi się chroniąc naczynia reakcyjne przed światłem.

14. Związek o wzorze 2.

15. Związek o wzorze 4