PL243573B1 - Koniugat metotreksatu i glukozy do zastosowania w zapobieganiu lub leczeniu chorób autoimmunologicznych - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest koniugat metotreksatu i glukozy do zastosowania w zapobieganiu lub leczeniu chorób autoimmunologicznych, w szczególności reumatoidalnego zapalenia stawów lub łuszczycy.

Description

Opis wynalazku

Leki modyfikujące przebieg choroby (DMARD) są powszechnie stosowane w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów i łuszczycy. Metotreksat (MTX) do dzisiaj stosowany jest jako lek pierwszego lub drugiego rzutu w terapii chorych z reumatoidalnym zapaleniem stawów (RZS) lub łuszczycą, pomimo iż korzystne efekty leczenia uzyskuje się jedynie u 1/3 chorych. Głównym czynnikiem ograniczającym skuteczność leczenia jest toksyczność wywołana ogólnoustrojowym działaniem MTX. Szacuje się, iż około 30% pacjentów przerywa terapię z powodu wysokiej toksyczności związku już w pierwszym roku trwania leczenia. Z uwagi na ten problem, potrzebne są nowe, odpowiednio zaprojektowane związki, które rozwiążą problem braku metod terapeutycznych charakteryzujących się wysoką skutecznością i niską toksycznością.

W celu uzyskania wysokiej skuteczności oraz zmniejszenia toksyczności MTX, zaprojektowano związek, w którym glukoza połączona jest ze związkiem terapeutycznym poprzez linker. Glukoza jest korzystnym bioenergetycznym i syntetycznym substratem dla szybko proliferujących komórek zapalnych. Hipoteza oparta jest na podstawie obserwacji specyficznych biochemicznych i patofizjologicznych cech charakterystycznych dla komórek w chorobach autoimmunologicznych, takich jak podwyższone zapotrzebowanie komórek hiperproliferujących na glukozę lub nadekspresja transporterów z rodziny GLUT [Zhang, Z. et al. Differential glucose requirement in skin homeostasis and injury identifies a therapeutic target for psoriasis. Nature Medicine. 24, 617-627 (2018)].

Zakłada się, że koniugacja powszechnie znanego cytostatyku z glukozą poprzez rozszczepialny łącznik może wykazać zwiększoną biodostępność i selektywność oraz zmniejszoną toksyczność, a także zapoczątkować innowacyjną metodę leczenia chorób autoimmunologicznych [Makuch, S. et al. Glycoconjugation as a Promising Treatment Strategy for Psoriasis. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. May 2020, 373 (2) 204-212].

Efekty uboczne

MTX jest obecnie dostępny w postaci roztworu do iniekcji lub tabletek do podawania doustnego. Chociaż jest to zdecydowanie jeden z najskuteczniejszych leków w terapii łuszczycy i reumatoidalnego zapalenia stawów, ograniczenia wynikające z właściwości farmakologicznych ograniczają stosowanie MTX i skutkują niewystarczającą odpowiedzią kliniczną. Biodostępność MTX w małych dawkach jest prawie całkowita, ale w wyższych dawkach spada do jedynie 10-20%. MTX jest szybko eliminowany z krążenia poprzez nerki (okres półtrwania w osoczu 5-8 godzin) co skutkuje niskim stężeniem leku w tkankach docelowych, np. w naskórku oraz zapalnie zmienionych stawach. Głównym powodem dyskontynuacji leczenia MTX nie jest brak skuteczności, lecz wysoka toksyczność. Najczęściej występują objawy toksyczności żołądkowo-jelitowej, takie jak zapalenie jamy ustnej, nudności i dolegliwości brzuszne. Chociaż dokładne mechanizmy toksyczności nadal nie są jasne, niektóre skutki uboczne są bezpośrednio związane z oddziaływaniem MTX na główne szlaki metaboliczne. 7-OH-MTX, główny metabolit MTX, jest trudno rozpuszczalny w wodzie i w dużych dawkach może przyczyniać się do toksycznego działania na nerki. Powyższe działania niepożądane ograniczają stosowanie MTX w wyższych dawkach.

Aby poprawić skuteczność leku, konieczne jest opracowanie ukierunkowanych terapii, które umożliwią zwiększony wychwyt substancji aktywnej przez komórki zapalne w porównaniu z normalnymi komórkami. W ostatnich latach przeprowadzono wiele badań w celu przezwyciężenia tych ograniczeń przy użyciu nowych systemów dostarczania leków. Systemy te zapewniają wiele korzyści, takich jak ulepszone bezpieczeństwo i skuteczność leków, poprawienie biodostępności, przedłużenie działania leku w tkance docelowej oraz poprawa stabilności związków terapeutycznych (ochrona przed degradacją chemiczną i enzymatyczną).

Właściwości metaboliczne komórek zapalnych różnią się istotnie od właściwości komórek prawidłowych. Różnice te stwarzają możliwość opracowania nowych związków, które zapewnią wysokie powinowactwa do zmienionych chorobowo komórek. Jedna z obiecujących strategii ukierunkowanych na różnice metaboliczne komórek zmienionych zapalnie, to sprzęganie glukozy z lekiem. Podejście to wykorzystuje zwiększone zapotrzebowanie na glukozę przez synowiocyty podobne do fibroblastów (RZS) lub hiperproliferujący naskórek (łuszczyca) w porównaniu z normalną tkanką oraz nadekspresję transporterów glukozy (GLUT) w tych chorobowo zmienionych tkankach [Zhang, Z. et al. Differential glucose requirement in skin homeostasis and injury identifies a therapeutic target for psoriasis. Nature Medicine. 24, 617-627 (2018); Makuch, S. et al. Glycoconjugation as a Promising Treatment Strategy for Psoriasis. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. May 2020, 373 (2) 204-212; Garcia

PL 243573 BI

-Carbonell, R. et al. Critical Role of Glucose Metabolism in Rheumatoid Arthritis Fibroblast-like Synoviocytes. Arthritis & rheumatology (Hoboken, N.J.) vol. 68,7 (2016): 1614-26]. Koniugaty te zaprojektowane tak, aby były rozpoznawane przez specyficzne receptory GLUT, i wchłaniane preferencyjnie przez zmienione chorobowo komórki.

Celem wynalazku jest zapewnienie leku, który nadawałby się do leczenia i zapobiegania chorobom autoimmunologicznym. W szczególności pożądane jest, aby lek ten wykazywał lepszą swoistość niż metotreksat, a także pozwalał na przezwyciężenie lekooporności i przedłużoną aktywność w krwiobiegu.

Istota wynalazku

Nieoczekiwanie, tak określony problem techniczny został rozwiązany w niniejszym wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest koniugat metotreksatu i glukozy o wzorze:

do zastosowania w zapobieganiu lub leczeniu chorób autoimmunologicznych.

Korzystnie, chorobą autoimmunologiczną jest reumatoidalne zapalenie stawów lub łuszczyca.

Szczegółowy opis wynalazku

Przedmiot wynalazku przedstawiono w przykładzie wykonania i na załączonych figurach rysunku, gdzie:

na figurze 1 przedstawiono przeżywalność komórek SW982 stymulowanych TNF-a po traktowaniu ΜΤΧ oraz Glu-ΜΤΧ 10 μΜ przez 48 h, test MTT. *istotność statystyczna pomiędzy próbą a kontrolą (p <0,05).

na figurze 2 przedstawiono przeżywalność komórek HaCaT stymulowanych TNF-a po traktowaniu ΜΤΧ oraz Glu-ΜΤΧ 10 μΜ przez 48 h, test MTT. *istotność statystyczna pomiędzy próbą a kontrolą (p <0,05).

na figurze 3 przedstawiono przeżywalność niestymulowanych komórek HaCaT po traktowaniu ΜΤΧ oraz Glu-ΜΤΧ 10 pM przez 48 h, test MTT. *istotność statystyczna pomiędzy próbą a kontrolą (p <0,05).

na figurze 4 przedstawiono poziom TNF-a, IL-17 oraz IL-23 po traktowaniu egzogennym TNF-a oraz ΜΤΧ lub Glu-ΜΤΧ (pg/ml). *istotność statystyczna pomiędzy próbą a kontrolą (p <0,05).

Synteza

Dotychczas nie zaproponowano syntezy proleku metotreksatu o strukturze glikokoniugatu. Projektowany pralek zawiera D-glukozę połączoną poprzez difunkcyjny linker z metotreksatem. Połączenie difunkcyjnego linkera z cukrem i metotreksatem zaplanowano tak, aby po wprowadzeniu proleku do komórki nadekspresjonującej transportery GLUT następowało uwolnienie ΜΤΧ w reakcjach hydrolizy wiązania glikozydowego i amidowego katalizowanej przez enzymy hydrolityczne glikozylohydrolazy i peptydazy. Substrat cukrowy to tetra-O-acetylo-3-azydopropylo β-D-glukozyd. Przejściowy substrat, pochodna metotreksatu to diamid, produkt reakcji propargiloaminy z grupami karboksylowymi. Przy planowaniu syntezy glikokoniugatu przyjęto szereg założeń, które decydujących o efektywności metody. I tak z uwagi na obserwowaną izomeryzację reszty kwasu glutaminowego w reakcjach funkcjonalizacji grup karboksylowych ten etap utworzenia wiązania amidowego zaplanowano w reakcji kondensacji katalizowanej przez karbodiimid w obecności 1-hydroksybenztriazolu. Łączenie substratów zaplanowano w reakcji 1,3-dipolarnej cykloaddycji azydku do terminalnego wiązania potrójnego z utworzeniem triazyny. W wariancie opracowanym przez Sharplesa jest to powszechnie stosowana metoda otrzymywania proleków. Końcowym etapem syntezy jest odacylowanie jednostki cukrowej. Konwencjonalna metoda to reakcja alkoholizy katalizowana przez metanolan sodowy w warunkach opisanych przez Zemplena. W dobranych warunkach deprotekcja cukru nie prowadziła do lizy wiązania amidowego. Produkt wydzielono metodą chromatografii kolumnowej.

Szczegółową syntezę proleku przedstawiono poniżej.

PL 243573 BI

Przykład 1

Synteza chemiczna

□IC, HOBT

DMF, DCM

Sposób otrzymywania proleku metotreksatu obejmuje:

1) synteza amidu- rozpuszczenie ΜΤΧ w bezwodnym DMF, ogrzewanie w temperaturze od 20°C do 30°C, do rozpuszczenia ΜΤΧ, dodanie chlorku metylenu do otrzymania nasyconego roztworu ΜΤΧ, a następnie schłodzenie do temperatury 00 C, dodanie N,N-diizopropylokarbodiimidu (DIC), 1-hydoksybenzotriazolu (HOBT) i propargiloaminy, Stosunek molowy MTX/DIC/HOBT/ amina wynosi 1/1.2/0,5/2,2. Reakcję amidowania prowadzono w temperaturze pokojowej mieszając zawartość naczynia przez 10 dni. Następnie po zatężeniu mieszaniny reakcyjnej wydzielono produkt metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym.

2) synteza glikokoniugatu w 1,3-dipolarnej cykloaddycji: - wydzielony, chromatograficznie czysty diamid rozpuszczono w mieszaninie alkohol izopropylowy/ THF (1/1; obj./obj.). Do uzyskanego roztworu dodano 3-azydopropylo tetra-O-acetylo-8-D-glukopiranozyd i mieszano do uzyskania żółtego roztworu. Następnie dodano wodny roztwór askorbinianu sodowego i wodny roztwór siarczanu miedzi II. Reakcję prowadzono w temp pokojowej przez 24 godziny. Po zakończeniu reakcji (pełne przereagowanie diamidu) odsączono osad, przesącz zatężono, produkt wydzielono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym.

3) metanoliza - odacylowanie uzyskany glikokoniugat rozpuszczono w alkoholu metylowym (5 ml) dodano roztwór metanolanu sodowego w metanolu (1 ml), mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut, dodano kationit w formie wodorowej do neutralizacji roztworu, odsączono kationit, przemyto metanolem, przesącze zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując koniugat, pralek metotreksatu, chromatograficznie czysty w postaci żółtego osadu.

Opisane reakcje prowadzono chroniąc naczynia reakcyjne przed światłem.

Etap I: Synteza propargiloamidowej pochodnej metotreksatu

DIC, HOBT

DMF, DCM

Metotreksat (500 mg, 1.10 mmol) rozpuszczono w bezwodnym DMF (10 ml) i bezwodnym DCM (2 ml). Kolbę zabezpieczono przed światłem i umieszczono w łaźni wodno-lodowej. Do mieszaniny reakcyjnej w temperaturze 0°C wkroplono DIC (210 μΙ, 1.34 mmol), dodano HOBT (77 mg, 0.57 mmol), a następnie propargiloaminę (155 μΙ, 2.42 mmol). Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej przez 10 dni. Po przerwaniu reakcji zawartość kolby zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (elucja gradientem układu CHCI₃:CH₃OH, 50:1 do 10:1), otrzymując żółty osad (407 mg, 70%;t.t.: 105°C, = 16c= 1.0, DMSO)).

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.80-2.05 (m, 2H, 2xCHmtx), 2.07-2.24 (m, 2H, CH₂mtx), 3.06 (m, 1H, CH), 3.16 (m, 1H, CH), 3.22 (s, 3H, CH₃mtx), 3.80-3.85 (m, 4H, 2xCH₂), 4.33 (m, 1H, CHmtx), 4.80 (s, 2H, CH₂mtx), 6.78-6.85 (m, 4H, 2xH-PHmtx, NH₂mtx), 7.63 (bs, 1H, ΝΗμτχ), 7.72-7.77 (m, 2H, 2xH-PHmtx), 7.85 (bs, 1H, ΝΗμτχ), 8.09 (m, 1H, ΝΗμτχ), 8.23-8.31 (m, 2H, 2xNH), 8.58 (s, 1H, H-7mtx).

¹³ C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 27.36, 27.76, 27.94, 31.77, 38.87, 52.90, 54.82, 72.81, 72.83, 81.13, 81.17, 110.92, 110.99, 121.17, 121.46, 128.90, 128.97, 146.61, 149.06, 150.82, 152.54,160.82, 162.64, 166.07, 171.38, 171.58.

HRMS (ESI-TOF): obliczono dla C₂₆H₂8Nio0₃ ([M+H]⁺): m/z 529.2424, oznaczono: m/z 529.2421.

PL 243573 BI

Etap II: Synteza glikokoniugatu, pochodnej metotreksatu

Otrzymaną w poprzednim etapie propargiloamidową pochodną metotreksatu (407 mg, 0.77 mmol) oraz azydek cukrowy (643 mg, 1.54 mmol) rozpuszczono w mieszaninie rozpuszczalników i-PrOH (6 ml) oraz THF (6 ml). W dwóch fiolkach przygotowano układy katalityczne: askorbinian sodu (123 mg, 0.62 mmol) rozpuszczony w H2O (3 ml) i CUSO4 5H2O (77 mg, 0.31 mmol) rozpuszczony w H2O (3 ml), zmieszano je ze sobą i wprowadzono do mieszaniny reakcyjnej. Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej przez 24 h. Po zakończeniu reakcji zawartość kolby zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (elucja gradientem układu CHCI₃:CH₃OH, 20:1 do 5:1), otrzymując żółty osad (724 mg, 69%; t.t.: 114°C, ag³ = -6 (c= 1.0, DMSO).

Ή NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.87-1.91 (m, 2H, 2xCH₂mtx), 1.92, 1.98, 2.01, 2.02 (4s, 24H, 8xCH₃CO), 2.11-2.24 (m, 2H, CH₂mtx), 3.21 (s, 3H, CH₃mtx), 3.84-3.93 (m, 2H, CH2NH), 3.97 (ddd, 2H, J = 2.4 Hz, J = 4.9 Hz, J = 9.8 Hz, 2xH-5_giu), 4.03 (dd, 2H, J = 2.4 Hz, J = 12.3 Hz, 2xH-6a_gi_u), 4.05-4.12 (m, 2H, CH2NH), 4.17 (dd, 2H, J = 4.9 Hz, J = 12.3 Hz, 2xH-6b_gi_u), 4.22-4.32 (m, 4H, 2xCH₂O), 4.36 (m, 1 H, CHmtx), 4.42-4.54 (m, 4H, 2xCH₂N), 4.72 (dd~t, 2H, J = 8.2 Hz, J = 9.4 Hz 2xH-2_gi_u), 4.79 (s, 2H, CH₂mtx), 4.82 (d, 2H, J = 8.2 Hz, 2xH-1_gi_u), 4.89 (dd~t, 2H, J = 9.4 Hz, J = 9.4 Hz, 2xH-3_giu), 5.22 (dd~t, 2H, J = 9.4 Hz, J = 9.8 Hz, 2xH-4_gi_u), 6.65 (bs, 2H, NH₂mtx), 6.81 (m, 2H, 2xH-PHmtx), 7.74 (m, 2H, NH₂mtx), 7.78 (m, 2H, 2xH-PHmtx), 8.08 (m, 1H, ΝΗμτχ), 8.26-8.38 (m, 2H, 2xNH), 8.56 (s, 2H, 2xH5triaz), 8.59 (s, 1H, H-7mtx).

¹³ C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 20.19, 20.22, 20.34, 20.47, 27.55, 31.91, 34.15, 38.89, 49.11, 53.08, 54.83, 61.62, 67.38, 68.08, 70.52, 70.64, 71.91,99.13, 110.99, 121.21, 121.41, 122.98, 128.96, 144.67, 146.16, 149.10, 150.86, 154.71, 162.55, 162.66, 166.09, 168.95, 169.23, 169.48, 170.02, 171.62, 171.76.

HRMS (ESI-TOF): obliczono dla C58H74NieO2₃ ([M+H]⁺): m/z 1363.5181, oznaczono: m/z 1363.5137.

Odważoną porcję otrzymanego glikokoniugatu (300 mg, 0.22 mmol) rozpuszczono w metanolu (20 ml), a następnie dodano 1 M roztwór metanolanu sodu w metanolu (600 μΙ, 0.6 mmol). Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej przez 3 h. Po zakończeniu reakcji zawartość kolby zneutralizowano za pomocą żywicy jonowymiennej Amberlyst-15, którą następnie odsączono, a przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując odbezpieczony glikokoniugat w postaci żółtego osadu (183 mg, 81%; t.t.: 107-108°C, ag³ = = 42 (c = 1.0, DMSO).

Ή NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.85-2.10 (m, 2H, 2xCHmtx), 2.13-2.28 (m, 2H, CH₂mtx), 3.21 (s, 3H, CH₃mtx), 2.93-3.01 (m, 2H, 2xH-2giu), 3.03-3.08 (m, 2H, 2xH-4giu), 3.09-3.16 (m, 4H, 2xH-₃giu, 2xH-5giu), 3.39-3.49 (m, 2H, 2xH-6a_Giu), 3.63-3.70 (m, 2H, 2xH-6b_Giu), 3.83-3.93 (m, 4H, CH2NH), 4.01-4.10 (m, 4H, 2xCH₂), 4.19-4.24 (m, 2H, CH2), 4.25-4.32 (m, 4H, 2xH-1giu, 2xCH₂), 4.38 (m, 1H, CHmtx), 4.47-4.56 (m, 4H, 4xOH), 4.78 (s, 2H, CH₂mtx), 6.60 (bs, 2H, NH₂mtx), 6.81 (m, 2H, 2xH-PHmtx), 7.66 (bs, 2H, NH₂mtx), 7.74 (m, 2H, 2xH-PHmtx), 8.15 (m, 1H, ΝΗμτχ), 8.32-8.44 (m, 2H, 2xNH), 8.47 (s, 2H, 2xH-5triaz), 8.56 (s, 1H, H-7mtx).

¹³ C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 30.24, 31.99, 34.21,34.31, 38.62, 48.31,49.31,51.01, 54.55, 60.77, 66.99, 69.71, 73.00, 76.35, 76.73, 102.66, 110.74, 111.70, 120.34, 121.54, 123.25, 128.76, 144.35, 145.70, 148.86, 150.88, 154.88, 162.39, 162.55, 165.58, 171.57, 172.61.

HRMS (ESI-TOF): obliczono dla C42H58N16O15 ([M+H]+): m/z 1027.4346, oznaczono: m/z 1027.5416.

Rezultaty przeprowadzonych badań wskazują, że opracowana cząsteczka wykazuje silne działania hamujące wzrost chorobowo zmienionych komórek na sprawdzonym modelu RZS i łuszczycy zbliżone do działania MTX in vitro. Ponadto wyniki dowodzą, że opracowany związek wykazuje niższe powinowactwo do zdrowych komórek niż MTX. Przeprowadzone wyniki badań in vivo dowodzą, że związek charakteryzuje się korzystnym profilem bezpieczeństwa, nie wywołując ogólnoustrojowej toksyczności nawet w dawkach istotnie wyższych niż MTX (dawki ekwiwalentne).

Przykład 2. Analiza aktywności biologicznej koniugatu według wynalazku na modelach komórkowych reumatoidalnego zapalenia stawów (RZS) oraz łuszczycy

Analiza cytotoksyczności związku Glu-MTX w porównaniu z wolnym MTX za pomocą testu MTT

Metodyka - test MTT

Do badań wykorzystano opracowane modele komórkowe reumatoidalnego zapalenia stawów (ludzkie synowiocyty, stymulowane czynnikiem martwicy nowotworu (TNF-a), linia SW982) [Khansai, M., Phitak, T., Klangjorhor, J. et al. Effects of sesamin on primary human synovial fibroblasts and SW982 cell line induced by tumor necrosis factor-alpha as a synovitis-like model. BMC Complement Altern Med 17, 532 (2017)] oraz łuszczycy (ludzkie keratynocyty, stymulowane TNF-a, linia HaCaT) [Wu S, Zhao M, Sun Y, Xie M, Le K, Xu M, Huang C. The potential of Diosgenin in treating psoriasis: Studies from HaCaT keratinocytes and imiquimod-induced murine model. Life Sci. 2020 Jan 15; 241:117115].

Komórki SW982 oraz HaCaT w ilości 10 x 10³ komórek na studzienkę wysiano na płytkę 96-studzienkową. Następnego dnia, komórki inkubowano z TNF-a w dawce 10 ng/ml w celu wywołania stanu zapalnego. Po upływie 24 h, komórki potraktowano MTX lub Glu-MTX w dawce 10 μM i inkubowano przez 48 h. Po 48 godzinach inkubacji zlano pożywkę i dodano 100 μl roztworu żółtego rozpuszczalnego bromku 3-(4,5-dimetylo-2-tiazolilo)-2,5-difenylo-2H-tetrazoliowego (MTT) w stężeniu 0,5-1 mg/ml. Po 4 godzinach inkubacji zlano roztwór MTT i podano 50 μl/studzienkę DMSO. Po 3 godzinach gęstość optyczną rozpuszczonego formazanu analizowano kolorymetrycznie w czytniku płytek BioTek.

Stężenie DMSO w badanych próbach nie przekroczyło 0,2%.

Ponieważ żywe komórki powodują redukcję MTT do formazanu, gęstość optyczna (GO) jest najwyższa w studzienkach kontrolnych (K), które stanowiły 100% przeżywalności komórek. Przeżywalność w studzienkach inkubowanych ze związkiem (Z) wyliczano na podstawie wzoru:

X= 100% x GO Z/GO K

Wyniki testu MTT

Badania przeżywalności komórek za pomocą testu MTT wykazały, że związek Glu-MTX działa cytotoksycznie in vitro. Na Figurach 1 oraz 2 przedstawiono wyniki badania oceny przeżywalności (IC50) dla stymulowanych TNF-a linii SW982 oraz HaCaT, na które oddziaływano samym metotreksatem lub pochodną glukoza-metotreksat (Glu-MTX). Działanie cytotoksyczne koniugatu metotreksatu z glukozą jest zbliżone do działania niezmodyfikowanego metotreksatu. Test wykonano również na niestymulowanej linii HaCaT, będącej odpowiednikiem ludzkich keratynocytów bez stanu zapalnego. Wyniki wskazują, iż na modelu komórkowym bez stanu zapalnego, metotreksat wywołuje znacznie większą cytotoksyczność w przeciwieństwie do Glu-MTX, który wykazuje się wysoką selektywnością, działając dużo słabiej na komórki zdrowe. W badaniu zastosowano: Glu-MTX 10 μM, Metotreksat 10 μM; inkubacja 48 godzin; analiza MTT. Podane wyniki stanowią wartość średnią z 3 powtórzeń.

Ocena poziomu cytokin oraz stanu zapalnego komórek SW982 oraz HaCaT po traktowaniu Glu-MTX oraz wolnym MTX za pomocą testu MILLIPLEX

Metodyka - test MILLIPLEX

Komórki w ilości 350 000 komórek/studzienkę wysiano na płytki 6-studzienkowe, w objętości 1000 μl. Następnego dnia, komórki inkubowano z TNF-a w dawce 10 ng/ml w celu wywołania stanu zapalnego. Po upływie 24 h, komórki potraktowano MTX lub Glu-MTX w dawce 10 μM i inkubowano przez 48 h. Po inkubacji ze związkiem, supernatant zebrano i przeniesiono do sterylnych probówek typu Eppendorf,

PL 243573 BI z hodowli komórkowej i zmierzono jego poziomy IL-6, IL-8 i IL-1 β za pomocą testu MILLIPLEX MAP Humań Cytokine, zgodnie z zaleceniami producenta.

Wyniki testu MILLIPLEX

Badanie poziomu cytokin TNF-a, IL-17 oraz IL-23 za pomocą testu MILLIPLEX MAP Humań Cytokine na modelu komórkowym RZS (linia SW982) oraz łuszczycy (linia HaCaT), wykazało, że związek Glu-ΜΤΧ w znacznym stopniu zmniejsza poziom cytokin pełniących kluczową rolę w rozwoju stanu zapalnego w chorobach autoimmunologicznych. Na Figurze 4 przedstawiono poziom cytokin TNF-a, IL17 oraz IL-23 w pożywce hodowlanej linii SW982 oraz HaCaT po stymulacji egzogennym TNF-a (10 ng/ml) oraz traktowaniu ΜΤΧ 10 μΜ lub Glu-ΜΤΧ 10 pM. Podane wyniki stanowią wartość średnią z 3 powtórzeń.

Claims (2)

1. Koniugat metotreksatu i glukozy o wzorze:

do stosowania w zapobieganiu lub leczeniu chorób autoimmunologicznych.

2. Koniugat do zastosowania według zastrz. 1, przy czym chorobą autoimmunologiczną jest reumatoidalne zapalenie stawów lub łuszczyca.