PL244280B1 - Sonda oligonukleotydowa do wykrywania obecności RNA i jej zastosowania - Google Patents
Sonda oligonukleotydowa do wykrywania obecności RNA i jej zastosowania Download PDFInfo
- Publication number
- PL244280B1 PL244280B1 PL436020A PL43602020A PL244280B1 PL 244280 B1 PL244280 B1 PL 244280B1 PL 436020 A PL436020 A PL 436020A PL 43602020 A PL43602020 A PL 43602020A PL 244280 B1 PL244280 B1 PL 244280B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- sars
- cov
- rna
- detecting
- virus
- Prior art date
Links
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 title claims abstract description 7
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 title claims abstract description 7
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims abstract description 27
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 7
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L magnesium sulphate Substances [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 6
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- ULGGZAVAARQJCS-UHFFFAOYSA-N 11-sulfanylundecan-1-ol Chemical compound OCCCCCCCCCCCS ULGGZAVAARQJCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 229910021397 glassy carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 description 1
- 208000034657 Convalescence Diseases 0.000 description 1
- 241000494545 Cordyline virus 2 Species 0.000 description 1
- 244000309467 Human Coronavirus Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940009100 aurothiomalate Drugs 0.000 description 1
- XJHSMFDIQHVMCY-UHFFFAOYSA-M aurothiomalic acid Chemical compound OC(=O)CC(S[Au])C(O)=O XJHSMFDIQHVMCY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- VXIHRIQNJCRFQX-UHFFFAOYSA-K disodium aurothiomalate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(S[Au])C([O-])=O VXIHRIQNJCRFQX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004377 microelectronic Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920000128 polypyrrole Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 229960001315 sodium aurothiomalate Drugs 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Sonda oligonukleotydowa do wykrywania obecności RNA wybrana z grupy obejmującej sekwencje numer od SEQ. ID 1 do SEQ. ID 24 oraz zestaw takich sond wykorzystywany do wykrywania w próbkach biologicznych i środowiskowych obecności RNA wirusa SARS-CoV-2. Przedmiotem zgłoszenia jest także zastosowanie sond lub ich zestawu do wykrywania obecności RNA wirusa SARS-CoV-2 w reakcji qPCR oraz jako część biologiczna do funkcjonalizacji czujników do wykrywania obecności RNA wirusa SARS-CoV-2 opartych na metodach elektrochemicznych.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sonda oligonukleotydowa do wykrywania obecności RNA, jej zastosowanie do wykrywania in vitro obecności RNA wirusa SARS-CoV-2 oraz jej zastosowanie jako części biologicznej do funkcjonalizacji czujników, mające zastosowanie m.in. w diagnostyce medycznej.
SARS-CoV-2 jest wirusem należącym do rodziny Coronaviridae, rodzaju Betacoronavirus, którego materiał genetyczny stanowi ssRNA o dodatniej polaryzacji. SARS-CoV-2 był przyczyną pandemii zapoczątkowanej w grudniu 2019 roku w mieście Wuhan w prowincji Hubei we wschodnich Chinach.
Ze względu na średnio ok. 7-dniowy (przeciętnie od 3 do 7 dni, maksymalnie 14 dni) okres wylęgania COVID-19, wczesne rozpoznanie zakażenia wirusem SARS-CoV-2 wyłącznie na podstawie objawów klinicznych jest niemożliwe. Diagnostyka COVID-19 polega więc na bezpośrednim wykryciu wirusa w materiale biologicznym pochodzącym od pacjenta.
Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), rozpoznanie COVID-19 wymaga potwierdzenia obecności materiału genetycznego wirusa w próbce pobranej z dróg oddechowych pacjenta. Zalecane są w tym celu testy polegające na amplifikacji kwasów nukleinowych (NAAT), do których należy RT-PCR (ang. reverse transcriptase polymerase chain reaction) [1]. Zatem zgodnie z zaleceniami WHO oraz Europejskiego Centrum ds. Zapobiegania i Kontroli Chorób (ECDC), metodą potwierdzenia zakażenia wirusem SARS-CoV-2 jest pozytywny wynik wykrycia RNA wirusa techniką łańcuchowej reakcji polimerazy z detekcją w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) (ang. reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction) z zastosowaniem starterów i sond specyficznych dla dwóch różnych regionów wirusowego RNA w materiale pochodzącym z dróg oddechowych pacjenta. Przykładowy czas reakcji RT-qPCR wynosi ok. 45-60 minut [2, 3], nie licząc czasu potrzebnego na izolację wirusowego RNA, który może wynosić nawet do 2 godzin [3].
Uzupełnieniem monitorowania zakażenia wirusem SARS-CoV-2 oraz rekonwalescencji pacjenta chorego na COVID-19 są półilościowe testy serologiczne (immunoenzymatyczne), które wykrywają specyficzne przeciwciała skierowane przeciwko cząsteczkom wirusa [1, 5]. Ograniczeniem testów serologicznych jest czas pojawiania się przeciwciał, który wynosi (w zależności od klasy przeciwciała) nawet do 3 tygodni od zakażenia (ok. 10 dni od wystąpienia objawów choroby) [4, 6]. Jednak po tym czasie miano przeciwciał istotnie wzrasta i wówczas czułość diagnostyczna osiąga wartość dla przeciwciał ogólnie 89,6%, w tym dla IgM 73,3% oraz IgG 54,1% podczas gdy testy wykrywające RNA wirusa charakteryzowały się czułością diagnostyczną rzędu 54,0% 8-14 dni od wystąpienia objawów choroby, zaś 15 do 39 dni od wystąpienia choroby wartości te wynosiły odpowiednio: 100%, 94,3% i 79,8% przy czułości diagnostycznej 45,5% dla testów opartych na wykrywaniu RNA [5]. Należy zaznaczyć, że czas wykonania testu immunoenzymatycznego to najczęściej 120 minut.
Dodatkowo stosowane są jakościowe testy kasetkowe bazujące na reakcji immunochromatograficznej i polegające na stwierdzeniu lub wykluczeniu obecności przeciwciał bez informacji o ich poziomie (jak ma to miejsce w testach immunoenzymatycznych). Test ten zajmuje 10-20 min, jednak charakteryzuje się różną czułością i swoistością, zależnie od producenta [7, 8].
Ponieważ ludzkie koronawirusy, do których zalicza się SARS-CoV-2 przenoszą się drogą kropelkową, ważnym aspektem wydaje się możliwość oznaczania obecności wirusa w ślinie. Badania pacjentów hospitalizowanych z powodu COVID-19 potwierdziły obecność wirusowego RNA w ślinie 11 z 12 (91,7%) przebadanych osób [9]. Potwierdzono jednocześnie, że u 33 osób z wynikiem negatywnym (brak RNA wirusa w materiale pobranym z nosogardzieli) badanie obecności RNA wirusa w ślinie również dało wynik negatywny [9]. Moreira i wsp. wskazują, że czułość reakcji RT-PCR dla próbek śliny (bez specyfikacji w stosunku do miejsca pobrania materiału wynosi 83,9% [10]. Powyższe dane wskazują, że ślina może być dobrym materiałem diagnostycznym do wykrywania RNA wirusa SARS-CoV-2.
Diaz-Gonzalez i wsp. opisali dwa bioczujniki DNA do wykrywania 30-merowej sekwencji unikalnej dla wirusa SARS. W opisanych badaniach wykorzystano elektrody węglowe drukowane metodą sitodruku (SPCE) [11]. Natomiast Escosura-Muniz i wsp. wykorzystali elektrody z węgla szklistego oraz opisali zastosowanie aurotiomalanu sodu jako znacznika elektroaktywnego w bioczujniku hybrydyzacji DNA [12]. W rozwiązaniu według wynalazku stosuje się elektrodę złota, inną sekwencję oligonukleotydową, inną metodę pomiaru oraz inny sposób modyfikacji elektrody.
Z dokumentacji zgłoszenia RU2720713 znany jest zestaw 12 oligonukleotydów, mających zastosowanie jako startery do reakcji RT-PCR. Sekwencja oligonukleotydowa sondy według wynalazku oraz tych ujawnionych w zgłoszeniu RU2720713 nie pokrywają się. W przeciwieństwie do ujawnionego rozwiązania, zgłaszane rozwiązanie nie wymaga przeprowadzenia reakcji amplifikacji, a wykrywanie obecności RNA wirusa SARS-CoV-2 przeprowadzane jest w oparciu o pomiar zmiany pojemności elektrycznej.
W dokumentacji zgłoszenia CN111351931 ujawniono elektrodę funkcjonalizowaną przeciwciałem lub antygenem. W zależności od tego, czy do elektrody zostanie przyłączone przeciwciało czy antygen, wykrywana jest obecność immunogennych fragmentów wirusa (np. białek powierzchniowych: N, S) lub przeciwciał specyficznych dla użytego w czujniku antygenu. Dodatkowo zastosowano warstwę polimeru przewodzącego polipirolu. Część biologiczna użyta do funkcjonalizacji jest odmienna od przedstawionej w zgłaszanym rozwiązaniu, w którym występuje syntetyczny oligonukleotyd i docelowo czujnik wykrywa obecność RNA wirusa SARS-CoV-2 bez dodatku takiego polimeru.
Z dokumentacji zgłoszenia RU2731390 znany jest zestaw oligonukleotydów z przeznaczeniem do wykorzystania w reakcji qPCR. Rozwiązanie według wynalazku nie wymaga przeprowadzenia reakcji amplifikacji, w przeciwieństwie do ujawnionego rozwiązania, zgodnie z którym zestaw starterów ma być docelowo użyty w reakcji qPCR. W zgłaszanym rozwiązaniu wykrywanie obecności RNA wirusa SARSCoV-2 przeprowadzane jest w oparciu o pomiar zmiany pojemności elektrycznej. Sekwencja oligonukleotydowa sondy według wynalazku oraz tych przedstawionych w zgłoszeniu RU2731390 nie pokrywają się.
Z kolei w dokumentacji zgłoszenia RU2727054 ujawniono zestaw oligonukleotydów mający zastosowanie do wykrywania materiału genetycznego wirusa w reakcji PCR. Sekwencja oligonukleotydowa sondy według wynalazku oraz tych przedstawionych w dokumentacji zgłoszenia RU2727054 nie pokrywają się.
Problem techniczny, jaki rozwiązuje wynalazek to opracowanie rozwiązania do prostej i szybkiej analizy obecności materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce, bez konieczności przeprowadzenia reakcji amplifikacji i niewymagającej udziału wykwalifikowanego personelu.
Sonda oligonukleotydowa do wykrywania obecności RNA według wynalazku charakteryzuje się tym, że stanowi sekwencję 5'-TGA TGA ACA GTT TAG GTG AAA CTG ATC TGG C-3'.
Korzystnie sonda wykorzystywana jest do wykrywania w próbkach biologicznych i środowiskowych obecności RNA wirusa SARS-CoV-2.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie sondy wyznakowanej od końca 5' odpowiednią cząsteczką fluorescencyjną, a od końca 3' cząsteczką wygaszacza do wykrywania in vitro obecności RNA wirusa SARS-CoV-2 w reakcji qPCR.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie sondy jako części biologicznej do funkcjonalizacji czujników do wykrywania obecności RNA wirusa SARS-CoV-2 opartych na metodach elektrochemicznych.
Wynalazek zapewnia wykrycie RNA wirusa bez konieczności przeprowadzenia reakcji amplifikacji. Metoda opiera się na hybrydyzacji syntetycznej sondy do fragmentu sekwencji nukleotydowej genomu wirusa SARS-CoV-2, co pozwala na wykrycie jego obecności w próbce w wysoce specyficzny sposób.
Wynalazek został bliżej objaśniony w przykładzie wykonania (poniżej) oraz na rysunku, na którym Fig. 1 przedstawia pojemność [nF] czystej złotej elektrody przed modyfikacją (1); oraz po jej funkcjonalizacji (2) przy pomocy przyłączonej kowalencyjnie sondy zawierającej sekwencję 5'-TGA TGA ACA GTT TaG GTG AAA CtG ATC TGG C-3', a Fig. 2 przedstawia pojemności [nF] sfunkcjonalizowanej elektrody po zanurzeniu jej w roztworach zawierających RNA wirusa SARS-CoV-2 w stężeniach odpowiednio od lewej: 0 cp/μL= 0 kopii/μΕ; 10Λ1 cp/μL= 10 kopii/μΕ; 10Λ6 cp/μL= 1 000 000 kopii/μL.
Przykład 1
Zastosowanie elektrody i kowalencyjnie przyłączonej do niej syntetycznej modyfikowanej sondy oligonukleotydowej zawierającej specyficzną sekwencję 5'-TGA TGA ACA GTT TAG GTG AAA CtG ATC TGG C-3'. Sonda poprzez hybrydyzację z komplementarnym do niej fragmentem genomu wirusa SARS-CoV-2 pozwala na specyficzne wykrycie jego obecności w próbce.
Etapy przygotowania sfunkcjonalizowanej elektrody:
1) wymieszać i pobrać 200-400 μΕ zawiesiny TCEP-agaroza (Tris(2-karboksyetyl)fosfina immobilizowana na agarozie), zwirować (10 000-12 000 rpm/10 sek.), usunąć supernatant, trzykrotnie przepłukać osad 300-500 μΕ buforu 100 μΜ - 1xTE-MgSO4 (o składzie 1 μΜ TrisHCI, 0.1 μΜ EDTA, 100 μΜ MgSO4), za każdym razem odwirowując (10 000-12 000, 10 sek.) i usuwając bufor,
2) 50-100 μΕ 10 μΜ roztworu sondy dodać do 100-200 μΕ TCEP-agaroza po płukaniu i wytrzą- sać przez 1-2 h w temperaturze pokojowej (ok. 25°C),
3) oczyszczenie elektrody z zanieczyszczeń nieorganicznych przy pomocy roztworu o składzie 25% H2O2, 50 mM H2SO4. (umieścić elektrodę w roztworze na 10-15 min i następnie spłukać ultraczystą wodą),
4) elektrodę umieścić w 100 μM - 1xTE-MgSO4 na 10-20 sek., wyjąć,
5) elektrodę umieścić w ultraczystej wodzie na 10-20 sek., wyjąć,
6) nanieść 50-100 μL roztworu 5'-HS-ssDNA-3' (przygotowanego w punkcie 2) na elektrodę i pozostawić na 12-24 h w temperaturze pokojowej (ok. 25°C) w zamkniętym pojemniku,
7) elektrodę umieścić w 100 μM - 1xTE-MgSO4 na 10-20 sek.,
8) elektrodę umieścić w ultraczystej wodzie na 10-20 sek.,
9) elektrodę umieścić w 5 μM roztworze MCU (11-Merkapto-1-undekanol) na 45-60 min w temperaturze pokojowej (ok. 25°C),
10) elektrodę umieścić w ultraczystej wodzie na 10-20 sek.
Tak utworzona elektroda jest gotowa do użycia.
Procedura przygotowania elektrody wg Wang L, Veselinovic M, Yang L, Geiss BJ, Dandy DS, Chen T. A sensitive DNA capacitive biosensor using interdigitated electrodes, Biosensors and Bioelectronics 87 (2017) 646-653.
Oczyszczanie elektrody wg Fischer LM, Tenje M, Heiskanen AR, Masuda N, Castillo J, Bentien A, Emneus J, Jakobsen MH, Boisen A. Gold cleaning methods for electrochemical detection applications, Microelectronic Engineering 86 (2009), 1282-1285.
Pomiary na elektrodzie:
(i) - pomiar pojemności elektrody niezmodyfikowanej, (ii) - pomiar pojemności elektrody z przyłączoną warstwą biologiczną, (iii) - pomiar pojemności elektrody z przyłączoną warstwą biologiczną zanurzoną w buforze (o składzie 1 μM Tris-HCI, 0,1 μM EDTA, 100 μM MgSO4) zawierającym RNA wirusa SARS-CoV-2.
Przykład 2
Sonda oligonukleotydowa zawierająca specyficzną sekwencję 5'-TGA TGA ACA GTT TAG GTG AAA CTG ATC TGG C-3' od końca 5' wyznakowana jest odpowiednią cząsteczką fluorescencyjną przykładowo 6-FAM (6-karboksyfluoresceina), a od końca 3' cząsteczką wygaszacza przykładowo BHQ-1 (Black Hole Quencher), zaś obecność RNA wirusa SARS-CoV-2 wykrywa się w reakcji qPCR.
Piśmiennictwo:
1. World Health Organization. Laboratory testing for coronavirus disease (COVID-19) in suspected human cases: interim guidance. 19 March 2020, https://apps.who.int/iris/han- dle/10665/331501.
2. Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DKW, BleickerT, Brunink S, Schneider J, Schmidt ML, Mulders DGJC, Haagmans BL, van der Veer B, van den Brink S, Wijsman L, Goderski G, Romette J-L, Ellis J, Zambon M, Peiris M, Goossens H, Reusken C, Koopmans MPG, Drosten C. Detection of 2019 novel coronavirus (2019nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020, 25(3):pii=2000045. doi:10.2807/15607917.ES.2020.25.3.2000045.
3. Wang D, Hu B, Hu C, Zhu F, Liu X, Zhang J, Wang B, Xiang H, Cheng Z, Xiong Y, Zhao Y, Li Y, Wang X, Peng Z. Clinical Characteristics of 138 Hospitalized Patients With 2019 Novel Coronavirus-lnfected Pneumonia in Wuhan, China. JAMA. 2020; 323(11):10611069. doi:10.1001/jama.2020.1585.
4. Yam WC, Chan KH, Poon LL, Guan Y, Yuen KY, Seto WH, Peiris JSM. Evaluation of reverse transcription-PCR assays for rapid diagnosis of severe acute respiratory syndrome associated with a novel coronavirus. J Clin Microbiol. 2003; 41(10):4521-4524. doi:10.1128/jcm.41.10.4521-4524.2003.
5. Zhao J, Yuan Q, Wang H, Liu W, Liao X, Su Y, Wang X, Yuan J, Li T, Li J, Qian S, Hong C, Wang F, Liu Y, Wang Z, He Q, Li Z, He B, Zhang T, Fu Y, Ge S, Liu L, Zhang J, Xia N, Zhang Z. Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients of novel coronavirus disease 2019. Clin Infect Dis. 28 March 2020, ciaa344. doi:10.1093/cid/ciaa344.
6. Liu L, Liu W, Zheng Y, Jiang X, Kou G, Ding J, Wang Q, Huang Q, Ding Y, Ni W, Wu W, Tang S, Tan L, Hu Z, Xu W, Zhang Y, Zhang B, Tang Z, Zhang X, Li H, Rao Z, Jiang H, Ren X, Wang S, Zheng S. A preliminary study on serological assay for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in 238 admitted hospital patients. Microbes and Infection 2020; 22(4-5):206-211. doi:10.1016/j.micinf.2020.05.008.
7. Nowość! Szybki test do wykrywania przeciwciał na koronawirusa 2019-nCOV. BioMaxima. https://biomaxima.com/100-szybkie-testy.html. (data dostępu on-line 15.07.2020).
8. Test na koronawirusa SARS-CoV-2 IgM/lgG. OneDayClinic. https://www.onedaycli- nic.pl/testy-covid19/ (data dostępu on-line 15.07.2020).
9. To KKW, Tsang OTY, Yip CC-Y, Chan KH, Wu TC, Chan JMC, Leung WS, Chik TSH, Choi CYC, Kandamby DH, Lung DC, Tam AR, Poon RWS, Fung AYF, Hung IFN, Cheng VCC, Chan JFW, Yuen KY. Consistent Detection of 2019 Novel Coronavirus in Saliva. Clin Infect Dis. 2020;ciaa149. doi:10.1093/cid/ciaa149.
10. Moreira VM, Mascarenhas P, Machado V, Botelho J, Mendes JJ, Taveira N, Almeida MG. Diagnosis of SARS-Cov-2 Infection by RT-PCR Using Specimens Other Than Naso- and Oropharyngeal Swabs: A Systematic Review and Meta-Analysis. Diagnostics. 2021; 11(2):363. doi:10.3390/diagnostics11020363.
11. Diaz-Gonzalez M, de la Escosura-Muniz A, Gonzalez-Garcia MB, Costa-Garcia A. DNA hybridization biosensors using polylysine modified SPCEs. Biosens Bioelectron. 2008; 23(9):1340-6. doi:10.1016/j.bios.2007.12.001.
12. de la Escosura-Muniz A, Gonzalez-Garcia MB, Costa-Garcia A. DNA hybridization sensor based on aurothiomalate electroactive label on glassy carbon electrodes. Biosens Bioelectron. 2007; 22(6):1048-54. doi:10.1016/j.bios.2006.04.024.
Claims (4)
1. Sonda oligonukleotydowa do wykrywania obecności RNA, znamienna tym, że stanowi sekwencję 5'-TGA TGA ACA GTT TAG GTG AAA CTG ATC TGG C-3'.
2. Sonda według zastrz. 1, znamienna tym, że wykorzystywana jest do wykrywania w próbkach biologicznych i środowiskowych obecności RNA wirusa SARS-CoV-2.
3. Zastosowanie sondy określonej zastrzeżeniem 1 albo 2 wyznakowanej od końca 5' odpowiednią cząsteczką fluorescencyjną, a od końca 3' cząsteczką wygaszacza, do wykrywania in vitro obecności RNA wirusa SARS-CoV-2 w reakcji qPCR.
4. Zastosowanie sondy określonej zastrzeżeniem 1 albo 2 jako części biologicznej do funkcjonalizacji czujników do wykrywania obecności RNA wirusa SARS-CoV-2 opartych na metodach elektrochemicznych.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL436020A PL244280B1 (pl) | 2020-11-19 | 2020-11-19 | Sonda oligonukleotydowa do wykrywania obecności RNA i jej zastosowania |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL436020A PL244280B1 (pl) | 2020-11-19 | 2020-11-19 | Sonda oligonukleotydowa do wykrywania obecności RNA i jej zastosowania |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL436020A1 PL436020A1 (pl) | 2022-05-23 |
| PL244280B1 true PL244280B1 (pl) | 2024-01-03 |
Family
ID=81710128
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL436020A PL244280B1 (pl) | 2020-11-19 | 2020-11-19 | Sonda oligonukleotydowa do wykrywania obecności RNA i jej zastosowania |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL244280B1 (pl) |
-
2020
- 2020-11-19 PL PL436020A patent/PL244280B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL436020A1 (pl) | 2022-05-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Patel et al. | Recent advances in biosensors for detection of COVID-19 and other viruses | |
| Karash et al. | Rapid detection of avian influenza virus H5N1 in chicken tracheal samples using an impedance aptasensor with gold nanoparticles for signal amplification | |
| Najjar et al. | A lab-on-a-chip for the concurrent electrochemical detection of SARS-CoV-2 RNA and anti-SARS-CoV-2 antibodies in saliva and plasma | |
| Zhang et al. | Multiplex quantitative detection of SARS-CoV-2 specific IgG and IgM antibodies based on DNA-assisted nanopore sensing | |
| Kailasa et al. | An overview of molecular biology and nanotechnology based analytical methods for the detection of SARS-CoV-2: promising biotools for the rapid diagnosis of COVID-19 | |
| Fani et al. | Future developments in biosensors for field‐ready SARS‐CoV‐2 virus diagnostics | |
| Naikoo et al. | Nanomaterials‐based sensors for the detection of COVID‐19: A review | |
| CN111537742B (zh) | 可用于检测新型冠状病毒的中和抗体的检测试剂盒 | |
| Mukhopadhyay et al. | Recent trends in analytical and digital techniques for the detection of the SARS-Cov-2 | |
| Georgas et al. | ACE2-based capacitance sensor for rapid native SARS-CoV-2 detection in biological fluids and its correlation with real-time PCR | |
| CN111273026B (zh) | 一种新型冠状肺炎病毒快速检测试纸条及其应用 | |
| Mohan et al. | Hemagglutinin gene based biosensor for early detection of swine flu (H1N1) infection in human | |
| Ekrami et al. | Potential diagnostic systems for coronavirus detection: a critical review | |
| CN114317837B (zh) | 一种用于检测病原体的多重pcr引物和探针组合及其应用 | |
| CN113195722B (zh) | 与基孔肯雅热病毒e2特异性结合的dna适体及其用途 | |
| Mishra et al. | Carbon-based biosensors: next-generation diagnostic tool for target-specific detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) | |
| Purohit et al. | Sampling and analytical techniques for COVID-19 | |
| Wang et al. | Amplification-free detection of Mycobacterium tuberculosis using CRISPR-Cas12a and graphene field-effect transistors | |
| TW201245452A (en) | Nucleic acid detection | |
| CN104726606A (zh) | 一种pcr酶联双杂交法检测病原微生物检测方法 | |
| PL244280B1 (pl) | Sonda oligonukleotydowa do wykrywania obecności RNA i jej zastosowania | |
| Nukazuka et al. | Electrical biosensing system utilizing ion-producing enzymes conjugated with aptamers for the sensing of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 | |
| Eissa | Diagnostic biosensors for coronaviruses and recent developments | |
| Wu et al. | Simple, fast and highly sensitive detection of gram-negative bacteria by A novel electrical biosensor | |
| Skevaki et al. | Microbiologic diagnosis of respiratory illness: practical applications |