PL245078B1 - Zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej genu dnaE Mycoplasma pneumoniae, sposób wykrywania bakterii Mycoplasma pneumoniae, sposób wykrywania infekcji bakterią Mycoplasma pneumoniae oraz zestaw do wykrywania infekcji bakterią Mycoplasma pneumoniae - Google Patents
Zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej genu dnaE Mycoplasma pneumoniae, sposób wykrywania bakterii Mycoplasma pneumoniae, sposób wykrywania infekcji bakterią Mycoplasma pneumoniae oraz zestaw do wykrywania infekcji bakterią Mycoplasma pneumoniae Download PDFInfo
- Publication number
- PL245078B1 PL245078B1 PL433269A PL43326920A PL245078B1 PL 245078 B1 PL245078 B1 PL 245078B1 PL 433269 A PL433269 A PL 433269A PL 43326920 A PL43326920 A PL 43326920A PL 245078 B1 PL245078 B1 PL 245078B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- mycoplasma pneumoniae
- primers
- sequence
- seq
- detecting
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Pierwszym przedmiotem wynalazku jest zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej genu DnaE bakterii Mycoplasma pneumoniae. Drugim przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania bakterii Mycoplasma pneumoniae. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania infekcji wywołanej bakterią Mycoplasma pneumoniae. Czwartym przedmiotem wynalazku jest zestaw do wykrywania infekcji wywołanej bakterią Mycoplasma pneumoniae.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej genu dnaE Mycoplasma pneumoniae, sposób wykrywania bakterii Mycoplasma pneumoniae, sposób wykrywania infekcji bakterią Mycoplasma pneumoniae oraz zestaw do wykrywania infekcji bakterią Mycoplasma pneumoniae. Wynalazek ma zastosowanie w diagnostyce medycznej.
Mycoplasma pneumoniae należy do bakterii atypowych, charakteryzujących się brakiem ściany komórkowej. Poza tym bakterie atypowe zalicza się do patogenów wewnątrzkomórkowych, wykorzystujących energię w postaci ATP z komórek gospodarza.
Mycoplasma pneumoniae stanowi jedną z najczęstszych przyczyn infekcji górnych i dolnych dróg oddechowych; uważa się, że jest odpowiedzialna za około 40% pozaszpitalnych zapaleń płuc (CAP Community Acquired Pneumoniae) u dzieci oraz w grupie osób starszych. Ze względu na brak ściany komórkowej, bakterie te są oporne na antybiotyki β-laktamowe (najczęściej stosowana grupa antybiotyków w pierwszym rzucie leczenia), co stanowi jedną z głównych trudności w leczeniu infekcji wywołanych przez Mycoplasma pneumoniae. Kolejną trudność stanowi proces diagnostyczny infekcji wywołanych przez Mycoplasma pneumoniae. Bakterie atypowe wymagają specyficznych warunków wzrostu (linie komórkowe lub specjalistyczne podłoża), co znacząco utrudnia wykrycie bakterii w materiale biologicznym klasycznymi metodami mikrobiologicznymi. Z kolei metody serologiczne cechują się niską czułością, generując szereg wyników fałszywie ujemnych spowodowanych głównie okienkiem serologicznym (opóźnienie we wzroście miana przeciwciał klasy IgM) lub przejściem infekcji w fazę przewlekłą (wzrost miana przeciwciał w klasie IgA).
Stąd istnieje konieczność opracowania nowych, szybszych, czulszych i bardziej specyficznych metod diagnostyki infekcji wywołanych przez Mycoplasma pneumoniae, co pozwoli znacznie przyspieszyć skuteczne leczenie infekcji. Badania molekularne, polegające na wykryciu specyficznych fragmentów genomu bakterii Mycoplasma pneumoniae, stanowią jedne z najszybszych, najczulszych i najbardziej specyficznych metod diagnostyki patogenów. Idealnym rozwiązaniem byłby test opracowany na potrzeby podstawowych jednostek opieki zdrowotnej, przy pierwszym kontakcie pacjenta z lekarzem, umożliwiający szybkie wykonanie badania diagnostycznego (w czasie nieprzekraczającym 15 min), co pozwoli na dobranie terapii celowanej.
W chińskim zgłoszeniu patentowym CN101665826A ujawniono zastosowanie techniki LAMP do detekcji Mycoplasma pneumoniae w zastosowaniach klinicznych. Rozwiązanie obejmuje wykrywanie produktów amplifikacji, prowadzonej w czasie jednej godziny, według jednego ze sposobów: odwirowanie, aż do uzyskania białego osadu, dodanie barwnego wywoływacza oraz elektroforezę na żelu agarozowym. W chińskich zgłoszeniach patentowych CN101665827A, CN102618655A, CN107236798A, CN106282381A. Sposoby opisane w tych zgłoszeniach wymagają do 30 do 90 min na przeprowadzenie reakcji amplifikacji. Natomiast z opisu innego chińskiego zgłoszenia patentowego, CN108642196A, czas potrzebny na reakcję amplifikacji wynosi 16, przy kolejne 20 min konieczne do dezaktywacji polimerazy. W kolejnym chińskim zgłoszeniu patentowym CN105349672A ujawniony sposób detekcji produktów amplifikacji obejmuje rejestrację sygnału fluorescencyjnego (SYBR Green, kalceina). Reakcję amplifikacji można przeprowadzić wg rozwiązania w 13, przy czym czas optymalny wynosi 60 min. Minimalne stężenie DNA M. Pneumoniae, które umożliwia wykrycie, to 1.5*710’7 ng^L. W innym chińskim zgłoszeniu patentowym CN105238860A ujawniono zastosowania dwóch sposobów detekcji produktów reakcji amplifikacji, prowadzonej w czasie 45 min. Pierwszy ze sposobów obejmuje dodanie do mieszaniny poreakcyjnej kalceiny i obserwację zmiany barwy. Natomiast drugi jest oparty na obserwacji różnic w zmętnieniu przed i po reakcji bez dodatku kalceiny. Podobnie w następnym chińskim zgłoszeniu patentowym CN103276083A wynik reakcji, na którą potrzeba 60 min, jest oznaczy metodą turbidymetryczną. W kolejnym chińskim zgłoszeniu patentowym CN109609603A opisano sposób wykr ywania Metoda wykrywania genu P1, swoistego Mycoplasma pneumoniae poprzez połączenie amplifikacji izotermicznej (LAMP) nanoczujnika. Wykrywanie produktów amplifikacji, w czasie 60 min, według tej metody, ukierunkowanej na gen P1, prowadzi się za pomocą nanoczujnika. Metoda ma zakres czułości 60 ng600 fg zawartości DNA w mieszaninie reakcyjnej. W następnym chińskim zgłoszeniu patentowym CN104818333A został ujawniony zestaw primer'ów m.in. do przeprowadzania reakcji amplifikacji metodą LAMP i detekcji Mycoplasma pneumoniae, przy czym są one umieszczone chipie mikrofluidycznym, przy czym reakcja amplifikacji zajmuje 50 min, a liczba kopii wynosi 5*102/μΗ Również w chińskim zgłoszeniu patentowym CN109666752A wykorzystano metodę LAMP, z tym że etap amplifikacji zajmuje 20-30 min do godziny, przy czym rezultat reakcji w jest oznaczany metodą turbidymetryczną.
Podobnie w kanadyjskim zgłoszeniu patentowy CA2461950A1 reakcję hybrydyzacji z sondą prowadzi się w czasie 30 min zawartość, po której następuje hydroliza w wobec odczynnika zasadowego w czasie 10 min. Natomiast reakcja amplifikacji jest prowadzona w czasie 40 min. Amerykański opis patentowy US10233504B2 ujawnia zestawy primer'ów do zastosowania w reakcji LAMP do wykrywania M. pneumoniae. Reakcja amplifikacji jest prowadzona w czasie od 30 do 60 min i zostaje przerwana przez inkubację materiału genetycznego w czasie 2-10 min oraz w temperaturze 80-95°C. Natomiast produkty reakcji mogą być wykrywane poprzez obserwację fluorescencji (kalceina). Natomiast w japońskim zgłoszeniu patentowym JP2006158220A reakcja amplifikacji (LAMP) jest prowadzona w czasie 60 m in, przy minimalnej zawartości 0,01 pg DNA bakteryjnego, co odpowiada ilości 12 bakterii w próbce. Postęp reakcji jest monitorowany poprzez pomiar zmętnienia roztworu reakcyjnego (turbidymetria).
Metoda LAMP została przykładowo ujawniona w opisach patentowych WO0028082, WO0224902. Wspomniane zgłoszenia patentowe w większości przypadków nie opisują natomiast jaka jest czułość i limit detekcji bakterii Mycoplasma pneumoniae. Metoda detekcji w części wymienionych zgłoszeń patentowych nie pozwala na ilościowy pomiar, a detekcja jest rodzaju end-point, z wykorzystaniem żelu agarozowego lub innych znaczników bazujących na zmianie barwy mieszaniny reakcyjnej w przypadku dodatniego wyniku reakcji amplifikacji (Hydroxy-Naphthol-Blue, Calceine). Część zgłoszeń patentowych realizowana jest w technologii Real-Time, umożliwiającą ilościowy pomiar. Jednak wciąż opracowane i opisane zestawy nie mają zastosowania w diagnostyce typu POC (point of care), a ich główne zastosowanie dotyczy laboratoriów.
Nadal więc istnieje potrzeba zapewnienia takiego zestawu starterów wykorzystywanych w celu diagnostyki Mycoplasma pneumoniae z wykorzystaniem metody LAMP, przeznaczony do zastosowania w przychodniach podstawowej opieki medycznej, który umożliwia detekcję bakterii o bardzo niskim limicie detekcji (> 5 kopii/pJ) w krótkim czasie (< 15 min). Nieoczekiwanie powyższy problem rozwiązał prezentowany wynalazek.
Pierwszym przedmiotem wynalazku jest zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej genu dnaE Mycoplasma pneumoniae, znamienne tym, że zawierają zestawy starterów wewnętrznych o następujących sekwencjach nukleotydowych a) i b), a także zestawy starterów zewnętrznych zawierający następujące sekwencje nukleotydowe c) i d) a także zestaw sekwencji starterów loop:
a) sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 3 lub sekwencja odwrotna i komplementarna połączona lub nie mostkiem TTTT z sekwencją nukleinową SEQ ID NO: 5 lub sekwencja odwrotna i komplementarna
b) sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 4 lub sekwencja odwrotna i komplementarna połączona lub nie mostkiem TTTT z sekwencją nukleinową SEQ ID NO: 6 lub sekwencja odwrotna i komplementarna
c) sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 1 lub sekwencja odwrotna i komplementarna
d) sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 2 lub sekwencja odwrotna i komplementarna przy czym zestaw sekwencji starterów loop zawiera sekwencje nukleinowe zawierające się albo odwrotne i komplementarne do genu dnaE Mycoplasma pneumoniae o numerach SEQ ID NO: 7 i SEQ ID NO: 8.
Drugim przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania bakterii Mycoplasm a pneumoniae, charakteryzujący się tym, że powiela się wybrany region sekwencji nukleinowej genomu bakterii z wykorzystaniem zestawu starterów jak w pierwszym przedmiocie wynalazku, przy czym metodą powielania jest metoda LAMP. Równie korzystnie sposób wg wynalazku charakteryzuje się tym, że powielanie prowadzi się przy profilu temperaturowym: 67,5°C, 40 min. Korzystniej sposób wg wynalazku charakteryzuje się tym, że reakcję typu end-point prowadzi się przy profilu temperaturowym 80°C, 5 min.
Trzecim przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania infekcji bakterią Mycoplasma pneumoniae, charakteryzujący się tym, że obejmuje sposób wykrywania jak zdefiniowano w drugim przedmiocie wynalazku.
Czwartym przedmiotem wynalazku jest zestaw do wykrywania infekcji bakterią Mycoplasma pneumoniae, charakteryzujący się tym, że zawiera zestaw starterów jak zdefiniowano w pierwszym przedmiocie wynalazku. Równie korzystnie zestaw wg wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera 5,0 pl WarmStart LAMP Master Mix (NEB). Najkorzystniej zestaw wg wynalazku charakteryzuje się tym, zawiera startery do powielania, jak zdefiniowano w zastrz. 1 i w zastrz. 2, przy czym startery m ają następujące stężenia: 0,12 pM F3, 0,12 pM B3, 0,93 pM FIP, 0,93 pM BIP, 0,23 pM LoopF, 0,23 pM LoopB; BSA - 0,25 mg/ml; D-(+)-Trehalose dihydrate - 6%; znacznik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA - EvaGreen <1X albo Fluorescent Dye w ilości <0,5 ul albo GreenFluorescent Dye w ilości <1 ul albo Syto-13 <16 μΜ lub SYTO-82 <16 μΜ albo inny barwnik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA w stężeniu niewykazującym inhibicji reakcji amplifikacji.
Zaletą zestawów starterów, według wynalazku, do detekcji Mycoplasma pneumoniae, a także metody detekcji infekcji Mycoplasma pneumoniae i sposobu detekcji produktów amplifikacji jest możliwość ich użycia w diagnostyce medycznej w miejscu opieki nad pacjentem (POC) w docelowym zastosowaniu na przenośnym analizatorze genetycznym. Liofilizacja mieszanin reakcyjnych według wynalazku umożliwia przechowywanie zestawów diagnostycznych w temperaturze pokojowej, nie zmniejszając parametrów diagnostycznych testów. Z kolei użycie barwnika fluorescencyjnego do detekcji produktu amplifikacji zwiększa czułość metody, pozwala na obniżenie limitu detekcji (do 5 kopii^l), a także umożliwia ilościowy pomiar bakterii w próbce badanej.
Przykładowe realizacje wynalazku przedstawiono na rysunkach, na których fig. 1 przedstawia charakterystykę czułości metody, gdzie specyficzny sygnał uzyskano z matrycą: Amplirun® Mycoplasma Pneumoniae DNA Control, (Vircell Microbiologist) w zakresie 1 000 - 5 kopii^l, brak natomiast produktu w NTC; Fig. 1: Linia 1.: marker mas (Quick-Load® Purple 100 bp DNA Ladder, NewEngland Biolabs); linia 2.: NTC; linia 3.: 5 kopii MP; linia 4.: 10 kopii MP; linia 5.: 20 kopii MP; linia 6.: 25 kopii MP; Linia 7.: 50 kopii MP; linia 8.: 100 kopii MP; linia 9.: 1000 kopii MP.
Fig. 2 ilustruje czułość metody wg wynalazku mierzonej przez nastawienie serii rozcieńczeń standardu Amplirun® Mycoplasma Pneumoniae DNA Control, (Vircell Microbiologist) w zakresie 1 000 5 kopii^l standardu DNA, gdzie przyrost produktu mierzono w czasie rzeczywistym. Wyniki detekcji Mycoplasma pneumoniae w czasie rzeczywistym przedstawiono w tabeli nr 1, podając minimalny czas niezbędny do wykrycia sygnału fluorescencji.
Fig. 3 oraz 4 ilustrują specyficzność metody według wynalazku ze standardowymi matrycami szeregu patogenów potencjalnie obecnych w badanym materiale biologicznym jako naturalna flora fizjologiczna, mogących być wynikiem ko-infekcji lub które posiadają zbliżone sekwencje genomowe. Fig 3: Linia 1: marker mas (Quick-Load® Purple 100 bp DNA Ladder, NewEngland Biolabs); Linia 2 i 3: Mycoplasma genitalium; Linia 4 i 5: Klebsiella pneumoniae; Linia 6 i 7: Bordetella pertussis; Linia 8 i 9: Streptococcus pyogenes; Linia 10 i 11: Staphylococcus aureus wrażliwy na metycylinę (MSSA); Linia 12 i 13: Staphylococcus aureus oporny na metycylinę (MRSA); Linia 14 i 15: Enterococcus faecalis; Linia 16 i 17: Enterococcus faecium; Linia 18 i 19: Pseudomonas aeruginosa; Linia 20 i 21: Moraxella catarrhalis; Linia 22 i 23: Acinetobacter baumannii; Linia 24 i 25: Listeria monocytogenes; Linia 26 i 27: Legionella pneumophila; Linia 28 i 29: Mycoplasma hominis; Linia 30 i 31: Haemophilus ducreyi; Linia 32 i 33: Escherichia coli; Linia 34 i 35: Ureoplasma urealyticum; Linia 36 i 37: Campylobacter jejuni; Linia 38 i 39: Candida albicans; Linia 40 i 41: Haemophilus influenzae; Linia 42 i 43: Chlamydiophila pneumoniae; Linia 44 i 45: Mycoplasma pneumoniae; Linia 46, 47, 48, 49: NTC; Linia 50: marker mas (Quick-Load® Purple 100 bp DNA Ladder, NewEngland Biolabs).
Fig. 4 Linia 1: marker mas (Quick-Load® Purple 100 bp DNA Ladder, NewEngland Biolabs); linia 2 i 3: NTC; linia 4 i 5: ludzkie DNA; linia 6 i 7: Mycoplasma pneumoniae.
P rzykład 1 Sekwencje starterów
Sekwencje specyficznych oligonukleotydów wykorzystywanych do detekcji materiału genetycznego Mycoplasma pneumoniae z wykorzystaniem technologii LAMP przedstawiono i scharakteryzowano poniżej.
1. Sekwencja oligonukleotydu MP dnaE F3: 5' GCTATTACAAGAGTTAAACGCAC 3' stanowi sekwencję identyczną z genem DnaE Mycoplasma pneumoniae (nić 5'-3'), który od strony 3' końca sąsiaduje ze starterem F2.
2. Sekwencja oligonukleotydu MP dnaEB3: 5' GTCGATAACTTTATTGACGGTAA 3' stanowi komplementarny fragment genu DnaE Mycoplasma pneumoniae (nić 5'-3') oddalona o 169 nukleotydów od końca 3' oligonukleotydu 1.
3. Sekwencja oligonukleotydu MP dnaEF2: 5' ACGGCATTATTGTGGAAGTG 3' stanowi sekwencję identyczną z genem dnaE Mycoplasma pneumoniae (nić 5'-3') bezpośrednio przylegająca do końca 3' oligonukleotydu 1.
4. Sekwencja oligonukleotydu MP dnaEB2: 5' CGCTCATCAAAGCCCTTG 3' stanowi komplementarny fragment genu dnaE Mycoplasma pneumoniae (nić 5'-3') oddalona o 149 nukleotydy od końca 3' oligonukleotydu 1.
5. Sekwencja oligonukleotydu MP dnaEF1c: 5' CAGCTAAAAACAACTCATCCCAGTC 3' stanowi komplementarny fragment genu dnaE Mycoplasma pneumoniae (nić 5'-3') oddalona o 49 nukleotydów od końca 3' oligonukleotydu 1.
6. Sekwencja oligonukleotydu MP dnaE B1 c: 5' TGCGGTTAAAGCTAAGACTCACAG 3' stanowi sekwencję identyczną z genem DnaE Mycoplasma pneumoniae (nić 5'-3') oddalona o 83 nukleotydy od końca 3' oligonukleotydu 1.
7. Sekwencja oligonukleotydu MP dnaE LoopF: 5' AGCGGCTTGGTTTCAATCG 3'
8. Sekwencja oligonukleotydu MP dnaELoopB: 5' AAACCTCGTGGAATACTTAGTGGC 3'
Sekwencje oligonukleotydów F1c i F2 zostały korzystnie połączone mostkiem TTTT i wykorzystane w postaci FIP.
Sekwencje oligonukleotydów B1c i B2 zostały korzystnie połączone mostkiem TTTT i wykorzystane w postaci BIP
Przykład 2
Metoda amplifikacji genu dnaE Mycoplasma pneumoniae z wykorzystaniem oligonukleotydów scharakteryzowanych w przykładzie 1 w technologii LAMP o następującym składzie mieszaniny reakcyjnej.
5,0 gl WarmStart LAMP 2X Master Mix
0,12 gM F3
0,12 gM B3
0,93 gM FIP
0,93 gM BIP
0,23 gM LoopF
0,23 gM LoopB
BSA - 0,25 mg/ml
D-(+)-Trehalose dihydrate - 6%
Znacznik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA - EvaGreen <1X lub Fluorescent dye 50X (New England Biolabs) w ilości 0,5 ul lub GreenFluorescent Dye (Lucigen) w ilości <1 ul lub Syto13 <16 gM lub SYTO-82 <16 gM lub inny barwnik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA w stężeniu niewykazującym inhibicji reakcji amplifikacji.
Matryca DNA > 5 kopii/reakcję
Całkowita objętość reakcyjna dopełniona do 10 gl wodą wolną od DNaz i RNaz.
Znacznik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA - EvaGreen <1X lub Fluorescent dye 50X (New England Biolabs) w ilości 0,5 ul lub GreenFluorescent Dye (Lucigen) w ilości <1 ul lub Syto13 <16 gM lub SYTO-82 <16 gM lub inny barwnik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA w stężeniu niewykazującym inhibicji reakcji amplifikacji.
Matryca DNA g5 kopii/reakcję
Całkowita objętość reakcyjna dopełniona do 10 gl wodą wolną od DNaz i RNaz.
Przy kła d 3
Metoda amplifikacji genu dnaE Mycoplasma pneumoniae z wykorzystaniem oligonukleotydów scharakteryzowanych w przykładzie 1 w technologii LAMP o składzie mieszaniny reakcyjnej scharakteryzowanej w przykładzie 2 o następującym profilu temperaturowym:
1) 67,5°C, 40 min
2) korzystnie przy reakcjach typu end-point 80°C, 5 min.
P rzy kła d 4
Metoda amplifikacji i detekcji genu dnaE Mycoplasma pneumoniae z wykorzystaniem oligonukleotydów scharakteryzowanych w przykładzie 1 w technologii LAMP o składzie mieszaniny reakcyjnej scharakteryzowanej w przykładzie 2 o profilu temperaturowym scharakteryzowanym w przykładzie 3 i sposobie detekcji opisanym poniżej.
Użyty barwnik fluorescencyjny wykazujący zdolność odziaływania z dwuniciowym DNA dodany do mieszaniny reakcyjnej w ilości 0,5 gl EvaGreen 20X; 0,5 gl lub stężeniu <1X; <16 gM odpowiednio dla barwnika GreenFluorescent Dye (Lucigen); SYTO-13 i SYTO-82 przed rozpoczęciem reakcji, pomiar w czasie rzeczywistym i/lub typu end-point. Długość fali wzbudzenia w zakresie zbliżonym do barwnika FAM - 490-500 nm (optymalnie 494 nm) dla barwników EvaGreen; Fluorescent dye 50X (New England Biolabs), GreenFluorescent Dye (Lucigen); SYTO-13 oraz dla barwnika SYTO-82 535 nm (optymalnie 541 nm) długość fali emisji w zakresie 509-530 nm (optymalnie 518 nm) dla barwników EvaGreen; GreenFluorescent Dye (Lucigen); SYTO-13 oraz dla barwnika SYTO-82 556 nm (optymalnie 560 nm), sposób detekcji, czas rejestracji zmian począwszy od 8 minuty od rozpoczęcia reakcji dla Mycoplasma pneumoniae oraz kontroli negatywnej.
PL 245078 Β1
Przykład 5
Metoda przygotowania i liofilizacji odczynników do detekcji amplifikacji i detekcji genu dnaE Mycoplasma pneumoniae z wykorzystaniem oligonukleotydów scharakteryzowanych w przykładzie 1 w technologii LAMP o składzie mieszaniny reakcyjnej scharakteryzowanej w przykładzie 2 o profilu temperaturowym scharakteryzowanym w przykładzie 3 i sposobie detekcji opisanym w przykładzie 4.
Przykład 6 Opis procesu liofilizacji
Komponenty reakcji mieszano zgodnie ze składem opisanym w przykładzie 2, poza matrycą DNA, do całkowitej objętości 10 μΙ. Mieszaninę przeniesiono do probówek o pojemności 0,2 ml i poddano procesowi liofilizacji zgodnie z poniższymi parametrami.
Mieszanina umieszczona w probówkach została wstępnie schłodzona do -20°C przez 2 godzin. Następnie prowadzono proces liofilizacji w temperaturze -80°C przez 3 godzin pod ciśnieniem 5 2 mBar.
Przykład 7 Czułość metody
Czułość określono przez nastawienie serii rozcieńczeń standardu Amplirun® Mycoplasma Pneumoniae DNA Control, (Vircell Microbiologist); z minimalną ilością bakterii 5 kopii w mieszaninie reakcyjnej, gdzie przyrost produktu mierzono w czasie rzeczywistym - Figura 2 (RealTime-LAMP dla serii rozcieńczeń).
Czas, po którym możliwa jest detekcja emitowanej fluorescencji dla poszczególnych próbek przedstawiono w tabeli 1.
Scharakteryzowane startery umożliwiają detekcję bakterii Mycoplasma pneumoniae przez wykrycie fragmentu genu dnaE przy minimalnej ilości 5 kopii/mieszaninę reakcyjną.
Tabela 1 Czas niezbędny do detekcji fluorescencji dla poszczególnych rozcieńczeń standardu DNA Mycoplasma pneumoniae (Amplirun® Mycoplasma Pneumoniae
DNA Control, Vircell Microbiologist).
| Czas przekroczenia linii | |
| Próbka | bazowej fluorescencji [min] |
| MP NTC | Nieokreślony |
| MP 5 kopii | 11,77 |
| MP 10 kopii | 27, 14 |
| MP 20 kopii | 13, 15 |
| MP 25 kopii | 12,45 |
| MP 50 kopii | 11,13 |
| MP 100 kopii | 10,74 |
| MP 1 000 kopii | 8,05 |
Wyższość metody amplifikacji oraz oligonukleotydów scharakteryzowanych w niniejszym opisie patentowym nad testami bazującymi na technologii RealTime-LAMP polega na znacznie wyższej czułości, którą przedstawiono na figurze 1 oraz skróceniu czasu analiz przedstawionego na figurze tabeli 1.
PL 245078 Β1
Lista sekwencji <110> Genomtec S.A.
<120> Zestaw starterów do wykrywania bakterii Mycoplasma pneumoniae, sposób wykrywania Mycoplasma pneumoniae z wykorzystaniem zestawów starterów oraz zestaw do wykrywania Mycoplasma pneumoniae <170> Patentln version 3.5 <210> 1 MP dnaEF3 <211>24 <212> DNA <213> artificial <223> primer <400>1
GCTATTACAAGAGTTAAACGCAC 2 3 <210> 2 MP dnaEB3 <211>24 <212> DNA <213> artificial <223> primer <400>2
GTCGATAACTTTATTGACGGTAA 23 <210> 3 MP dnaEF2:
<211>24 <212> DNA <213> artificial
PL 245078 Β1 <223> primer <400>3
ACGGCATTATTGTGGAAGTG 20 <210> 4 MP dnaEB2 <211>24 <212> DNA <213> artificial <223> primer <400>4
CGCTCATCAAAGCCCTTG 18 <210> 5 MP cfnaEFlc <211>24 <212> DNA <213> artificial <223> primer <400>5
CAGCTAAAAACAACTCATCCCAGTC 25 <210> 6 MP ctoaEBlc <211> 24 <212> DNA <213> artificial <223> primer <400> 6
PL 245078 Β1
TGCGGTTAAAGCTAAGACTCACAG 24 <210> 7 MP dnaELoopF <211>24 <212> DNA <213> artificial <223> primer <400>7
AGCGGCTTGGTTTCAATCG 19 <210> 8 MP dnaELoopB <211>24 <212> DNA <213> artificial <223> primer <400>8
AAACCTCGTGGAATACTTAGTGGC 24 <210> 9 Gen dnaE Mycoplasma pneumoniae <211>
<212>
<213>
<223>
DNA gen <400> 9 atgaccagtc ccactagcct gagcactatg ccattaagct
121 catgctgacc aaaacccctc
181 tcgtgtcagg tgggcggtga
241 aaaacggcgc tcaataaggc agatcagctc aaaaaagaag gatgacggtg tgggattgct acttagtatt aaacagcaaa gggaaggact tcagttgcaa tttatccaaa ctcaatcttg tcaaaatagc ttgtggcact agaacatctt aaattgatca actcacaata tcccatagtg ctgtcccttt taagtgtttc ggtagattga cgctgttaac
PL 245078 Β1
301 ttttacctta aggaagttga cccaaagtta aagcgctatt gggatctaca cagtgcccta
361 gtcgattact atcaaacccg gttaaagcta gagcccaaag agcagggttt gacttactta
421 actgaaacac gaaagttaag tcctcaagta attgaacgct ttcagttggg tttagcgttt
481 actttagaag accagtattt tctacccagt ctcttaaact atccctgaat tagcccggca
541 attgaaaagg cagagctctg ttttgctact gaaaaattcc cagaagcttt aggatttttt
601 aaccaacaaa cgcattatgc aacctttaag agccggatta tgattccgat ccatgacctt
661 aagggtaatc cagtaggttt ttcggggcgt gcactgcaaa aaacggaaaa gattaaatac
721 aaaaacagtg cagaacacca gtggtttaag aagagtgaat tgttatttaa cttccaccgg
781 attgataaaa acacactaaa gctgtattta gttgagggtt acttcgatgt ctttgccctt
841 actagcgctg ggattggtga tgtagtgggc ttaatgggtt tagccttgag tgaaagccac
901 attattgcct ttcaacagca actaaaagcg ctagaaacag tggtcttggc actcgataat
961 gatacagcgg gtcacgatgc tacttttaag ctattacaag agttaaacgc acacggcatt
1021 attgtggaag tggtcgattg aaaccaagcc gcttacaaag actgggatga gttgttttta
1081 gctgaaggta gtgatgcggt taaagctaag actcacaggg ttttaaacct cgtggaatac
1141 ttagtggctt actttaaaac caagggcttt gatgagcgga ttaccgtcaa taaagttatc
1201 gacattatt.g cacaaaacca gaaagtaaca gctgacact.a gctttagccg c.tttttgtgt
1261 cagaaattac agcaattgtt gcaatacagt gatgtggaaa cactgttcac acaattacag
1321 cagcaaaagc tcaaagLaaa agLLaaLaaa acLacaacLL LLacccaaag agccccgaLL
1381 tacgaatcag tggttggtgt ggttgataat agttttagaa atgaatcgca gccggttgcc
1441 attaccaagg agtttttagt cgaaaacaac tgaaaggaga ccaaggaacg tgtatttcat
1501 gctgaaatct tcgcttacgt actgttagat aagcagtttt tagtcgaatt aaagcaatct
1561 gatttagatg aattgtttgc ttcattgcaa acaccgttgt ttgatgttgc cctttttatt
1621 gataaagcgc ggctttattg agctaaggtg caagagcctg attgggctgt gtttaacagt
1681 attttagggg aacaacaagc aatgtttcca acaacttttt tagcgcaaat taaggagttc
1741 tttttaaaca aatcactctc atatgaccct gaggattatg aggaagattt acagtttttt
1801 cggcaactaa ttgtgaaaca aaaagagctt ttaaaatatt ttaaaagcat ggttgagcac
1861 taa
Claims (8)
1. Zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej genu dnaE Mycoplasma pneumoniae, znamienny tym, że zawierają zestawy starterów wewnętrznych o następujących sekwencjach nukleotydowych a) i b), zestawy starterów zewnętrznych zawierający następujące sekwencje nukleotydowe c) i d) a także zestaw sekwencji starterów loop:
a) sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 3 lub sekwencja odwrotna i komplementarna połączona lub nie połączona mostkiem TTTT z sekwencją nukleinową SEQ ID NO: 5 lub sekwencja odwrotna i komplementarna
b) sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 4 lub sekwencja odwrotna i komplementarna połączona lub nie połączona mostkiem TTTT z sekwencją nukleinową SEQ ID NO: 6 lub sekwencja odwrotna i komplementarna
c) sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 1 lub sekwencja odwrotna i komplementarna oraz
d) sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 2 lub sekwencja odwrotna i komplementarna przy czym zestaw sekwencji starterów loop zawiera sekwencje nukleinowe zawierające się albo odwrotne i komplementarne do genu dnaE Mycoplasma pneumoniae o numerach SEQ ID NO: 7 i SEQ ID NO: 8.
2. Sposób wykrywania bakterii Mycoplasma pneumoniae, znamienny tym, że powiela się wybrany region sekwencji nukleinowej genomu bakterii z wykorzystaniem zestawu starterów jak zdefiniowano w zastrz. 1, przy czym metodą powielania jest metoda LAMP.
3. Sposób wg. zastrz. 2, znamienny tym, że w powielanie prowadzi się przy profilu temperaturowym:
- 67,5°C, 40 min
4. Sposób wg zastrz. 3, znamienny tym, że reakcję typu end-point prowadzi się przy profilu temperaturowym 80°C, 5 min.
PL 245078 Β1
5. Sposób wykrywania infekcji bakterią Mycoplasma pneumoniae, znamienny tym, że obejmuje sposób wykrywania jak zdefiniowano w zastrz. 2.
6. Zestaw do wykrywania infekcji bakterią Mycoplasma pneumoniae, znamienny tym, że zawiera zestaw starterów jak zdefiniowano w zastrz. 1.
7. Zestaw do wykrywania infekcji wg zastrz. 6, znamienny tym, że zawiera 5,0 μΙ WarmStart LAMP Master Mix (NEB).
8. Zestaw do wykrywania infekcji wg zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, zawiera startery do powielania, jak zdefiniowano w zastrz. 1, przy czym startery mają następujące stężenia: 0,12 μΜ F3, 0,12 μΜ B3, 0,93 μΜ FIP, 0,93 μΜ BIP, 0,23 μΜ LoopF, 0,23 μΜ LoopB; BSA 0,25 mg/ml; D-(+)-Trehalose dihydrate - 6%; znacznik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA - EvaGreen <1X albo Fluorescent Dye w ilości <0,5 ul albo GreenFluorescent Dye w ilości <1 ul albo Syto-13 <16 μΜ lub SYTO-82 <16 μΜ albo inny barwnik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA w stężeniu niewykazującym inhibicji reakcji amplifikacji.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL433269A PL245078B1 (pl) | 2020-03-17 | 2020-03-17 | Zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej genu dnaE Mycoplasma pneumoniae, sposób wykrywania bakterii Mycoplasma pneumoniae, sposób wykrywania infekcji bakterią Mycoplasma pneumoniae oraz zestaw do wykrywania infekcji bakterią Mycoplasma pneumoniae |
| US17/905,572 US12467083B2 (en) | 2020-03-17 | 2021-03-17 | Primer sets for detection of mycoplasma pneumoniae bacteria, method for detection of mycoplasma pneumoaniae infection, use of a primer set for detection of mycoplasma pneumoniae infection |
| PCT/PL2021/050016 WO2021187994A1 (en) | 2020-03-17 | 2021-03-17 | Primer sets for detection of mycoplasma pneumoniae bacteria, method for detection of mycoplasma pneumoaniae infection, use of a primer set for detection of mycoplasma pneumoniae infection |
| EP21772346.9A EP4121548A4 (en) | 2020-03-17 | 2021-03-17 | Primer sets for detection of mycoplasma pneumoniae bacteria, method for detection of mycoplasma pneumoaniae infection, use of a primer set for detection of mycoplasma pneumoniae infection |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL433269A PL245078B1 (pl) | 2020-03-17 | 2020-03-17 | Zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej genu dnaE Mycoplasma pneumoniae, sposób wykrywania bakterii Mycoplasma pneumoniae, sposób wykrywania infekcji bakterią Mycoplasma pneumoniae oraz zestaw do wykrywania infekcji bakterią Mycoplasma pneumoniae |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL433269A1 PL433269A1 (pl) | 2021-09-20 |
| PL245078B1 true PL245078B1 (pl) | 2024-05-06 |
Family
ID=77746075
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL433269A PL245078B1 (pl) | 2020-03-17 | 2020-03-17 | Zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej genu dnaE Mycoplasma pneumoniae, sposób wykrywania bakterii Mycoplasma pneumoniae, sposób wykrywania infekcji bakterią Mycoplasma pneumoniae oraz zestaw do wykrywania infekcji bakterią Mycoplasma pneumoniae |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US12467083B2 (pl) |
| EP (1) | EP4121548A4 (pl) |
| PL (1) | PL245078B1 (pl) |
| WO (1) | WO2021187994A1 (pl) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2001278935B2 (en) * | 2000-07-14 | 2007-03-22 | Replidyne, Inc. | Novel DNA polymerase iii holoenzyme delta subunit nucleic acid molecules and proteins |
| US10233504B2 (en) * | 2015-02-13 | 2019-03-19 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods and compositions for isothermal amplification and detection of mycoplasma pneumoniae |
| CN106282381B (zh) | 2016-09-30 | 2019-12-20 | 许昌学院 | 检测肺炎支原体的lamp引物组及其方法 |
| CN110408711A (zh) | 2018-04-27 | 2019-11-05 | 金华职业技术学院 | 一种早期快速诊断肺炎支原体的方法 |
| CN109666752A (zh) | 2019-02-02 | 2019-04-23 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 一种检测绵羊肺炎支原体的实时定量lamp引物组及试剂盒 |
-
2020
- 2020-03-17 PL PL433269A patent/PL245078B1/pl unknown
-
2021
- 2021-03-17 US US17/905,572 patent/US12467083B2/en active Active
- 2021-03-17 EP EP21772346.9A patent/EP4121548A4/en active Pending
- 2021-03-17 WO PCT/PL2021/050016 patent/WO2021187994A1/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20230125922A1 (en) | 2023-04-27 |
| EP4121548A1 (en) | 2023-01-25 |
| US12467083B2 (en) | 2025-11-11 |
| WO2021187994A1 (en) | 2021-09-23 |
| PL433269A1 (pl) | 2021-09-20 |
| EP4121548A4 (en) | 2024-07-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102482712B (zh) | 检测抗生素耐药细菌的方法和试剂盒 | |
| Wang et al. | A CRISPR-Cas12a-based platform facilitates the detection and serotyping of Streptococcus suis serotype 2 | |
| KR102258934B1 (ko) | 라임병 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트 | |
| EP2753629B1 (en) | Methods for detecting lyme disease | |
| ES2234680T3 (es) | Pcr multiplex para la deteccion de infecciones por ehec. | |
| US12467083B2 (en) | Primer sets for detection of mycoplasma pneumoniae bacteria, method for detection of mycoplasma pneumoaniae infection, use of a primer set for detection of mycoplasma pneumoniae infection | |
| EP4225951B1 (en) | Set of primers, composition of reagents and method of detecting atypical bacteria | |
| CN111183223B (zh) | mecA基因扩增用引物对、mecA基因检测试剂盒及mecA基因检测方法 | |
| US9234248B2 (en) | Simultaneous quantitative multiple primer detection of Clostridium difficile | |
| KR101742016B1 (ko) | 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 탐지용 올리고뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 키트 | |
| US20240200152A1 (en) | Primer set, reagent composition and method for the detection of methicillin-resistant staphylococcus aureus (mrsa) | |
| US20250277276A1 (en) | Amplification primer kit, a method for detecting a sexually transmitted bacterial infection, and a kit for detecting the infection | |
| US20250277275A1 (en) | Set of primers, composition of reagents and method of detecting atypical bacteria | |
| US20250163521A1 (en) | Primer set, reagent composition and method for the detection of neisseria meningitidis | |
| JP2023517464A (ja) | 微生物を検出するためのマルチプレックスｐｃｒ方法およびその使用 | |
| CN111004855A (zh) | 一种用于检测金黄色葡萄球菌的引物组合和试剂盒 | |
| KR102291584B1 (ko) | 반려동물 및 가축의 질병진단을 위한 분자진단 방법 | |
| KR101649306B1 (ko) | 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 탐지용 올리고뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 키트 | |
| WO2023027604A1 (en) | Set of primers for amplifying the nucleotide sequence of the reca gene of salmonella enterica sp. bacteria, method for detecting salmonella enterica sp. bacteria, method for detecting an infection caused by salmonella enterica sp. bacteria, and kit for detecting an infection caused by salmonella enterica sp. bacteria | |
| CN116790771A (zh) | 通过pcr检测样品中的支原体的方法和引物 | |
| CN117467779A (zh) | 基于高通量测序的细菌耐药基因检测的组合物及其用途 | |
| CN116121427A (zh) | 一种基于荧光rpa技术检测肠炎沙门氏菌的试剂盒及其应用 | |
| CN116287336A (zh) | 溶血葡萄球菌rpa-lfs检测引物探针组合及其应用 | |
| PL237232B1 (pl) | Zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej Borrelia burgdorferi, sposób wykrywania Borrelia burgdorferi, sposób diagnostyki boreliozy i zestaw do diagnostyki boreliozy | |
| WO2014175892A1 (en) | Rapid salmonella serotyping assay |