PL245377B1 - Związek-marker diagnostyczny raka nerki, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka nerki, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego - Google Patents

Związek-marker diagnostyczny raka nerki, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka nerki, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego Download PDF

Info

Publication number
PL245377B1
PL245377B1 PL440976A PL44097622A PL245377B1 PL 245377 B1 PL245377 B1 PL 245377B1 PL 440976 A PL440976 A PL 440976A PL 44097622 A PL44097622 A PL 44097622A PL 245377 B1 PL245377 B1 PL 245377B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
compound
formula
abz
kidney cancer
gly
Prior art date
Application number
PL440976A
Other languages
English (en)
Other versions
PL440976A1 (pl
Inventor
Adam LESNER
Adam Lesner
Natalia Gruba
Original Assignee
Urteste Spolka Akcyjna
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Urteste Spolka Akcyjna filed Critical Urteste Spolka Akcyjna
Priority to PL440976A priority Critical patent/PL245377B1/pl
Priority to AU2023256464A priority patent/AU2023256464A1/en
Priority to IL316412A priority patent/IL316412A/en
Priority to JP2024561822A priority patent/JP2025513350A/ja
Priority to US18/857,796 priority patent/US20250270617A1/en
Priority to CA3249634A priority patent/CA3249634A1/en
Priority to CN202380035326.5A priority patent/CN119072484A/zh
Priority to KR1020247038558A priority patent/KR20250007581A/ko
Priority to EP23729873.2A priority patent/EP4511383A1/en
Priority to PCT/PL2023/050026 priority patent/WO2023204721A1/en
Publication of PL440976A1 publication Critical patent/PL440976A1/pl
Publication of PL245377B1 publication Critical patent/PL245377B1/pl
Priority to MX2024012634A priority patent/MX2024012634A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57525—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the liver or pancreas
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
    • G01N2800/7028—Cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest nowy związek chemiczny - marker diagnostyczny — do zastosowania medycznego, dokładniej w diagnostyce nowotworowej, w szczególności w diagnostyce raka nerki. Przedmiotem zgłoszenia jest także sposób in vitro wykrywania aktywności enzymatycznej obecnej w płynie ustrojowym osobnika, w szczególności pochodzącej z komórek raka nerki, z użyciem takiego związku. Przedmiotem zgłoszenia jest ponadto sposób in vitro diagnozowania raka nerki, z użyciem takiego związku, zestaw zawierający taki związek oraz zastosowanie takiego związku do wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej dla raka nerki i zastosowanie takiego związku do diagnozowania raka nerki. Przedmiotem zgłoszenia jest także taki związek do zastosowania jako marker diagnostyczny raka nerki oraz sposób leczenia raka nerki obejmujący etap przeprowadzania sposobu diagnozowania raka nerki jak określono powyżej z zastosowaniem takiego związku.

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest nowy związek chemiczny - marker diagnostyczny do zastosowania medycznego, dokładniej w diagnostyce nowotworowej, w szczególności w diagnostyce raka nerki. Przedmiotem wynalazku jest także sposób in vitro wykrywania aktywności enzymatycznej obecnej w płynie ustrojowym osobnika, w szczególności pochodzącej z komórek raka nerki, z użyciem takiego związku, sposób in vitro diagnozowania raka nerki, z użyciem takiego związku, zestaw zawierający taki związek, taki związek do zastosowania medycznego, dokładniej do zastosowania do wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej dla raka nerki, taki związek do zastosowania do diagnozowania raka nerki oraz taki związek do zastosowania jako marker diagnostyczny raka nerki.
Stan techniki
W roku 2020 na świecie na raka nerki zachorowało ponad 430 tys. pacjentów i był on czternastym z najczęstszych diagnozowanych nowotworów złośliwych na świecie. Rak nerki jest nowotworem stosunkowo rzadkim i stanowi 2,4% nowych rozpoznań wśród guzów litych w na świecie. Nowotwory złośliwe nerki dzielą się na pierwotne oraz wtórne, a najczęstszym z nich jest rak nerkowokomórkowy (RCC), który stanowi około 90% wszystkich złośliwych nowotworów nerek. RCC stanowi heterogenną grupę zmian, które różnią się między sobą zarówno strukturą histologiczną, jak i objawami klinicznymi oraz zmianami molekularnymi. Najczęstszym podtypem histologicznym jest rak jasnokomórkowy nerki (clear cell renal cell carcinoma - ccRCC) stanowiący 70-80% wszystkich raków tego narządu, będący jednocześnie najbardziej agresywnym z podtypów, o największym odsetku obecności inwazji miejscowej, przerzutów oraz najwyższej śmiertelności. We wczesnym stadium zaawansowania raka nerki, chorobie nie towarzyszą dolegliwości bólowe ani inne charakterystyczne objawy. Ponad 30% pacjentów z RCC ma przerzuty w chwili rozpoznania, a u 30% pacjentów z RCC ograniczonym do narządu przerzuty powstają już po leczeniu miejscowym. RCC wciąż pozostaje wyzwaniem diagnostycznym i leczniczym. U większości chorych rak ten wykrywany jest przypadkowo jako zmiana ogniskowa w czasie badań obrazowych (Rtg, TK, RM) wykonywanych intencjonalnie lub z innych powodów.
Rokowanie jest uzależnione od stopnia rozwoju nowotworu. Bardzo istotna jest wczesna diagnostyka. 75% pacjentów, u których wykryto chorobę we wczesnym stadium przeżywa 5 lat i dłużej.
Nie ma żadnego badania laboratoryjnego, w tym również „markera nowotworowego”, ani zestawu badań, które pozwalałyby na wczesne i pewne rozpoznanie raka nerki. W celu efektywnej diagnostyki stosowane są metody obrazowania takie jak zdjęcie rentgenowskie, tomografia komputerowa, rezonans magnetyczny lub pozytonowy rezonans magnetyczny, a w dalszej kolejności biopsja guza. Niewielka populacja pacjentów (5-10%) wykazuje zmiany w ekspresji określonych genów co predysponuje tę grupę do testów genetycznych. Wiadomo, że proces inicjacji, wzrostu i przerzutowania komórek nowotworu złośliwego przebiega przy udziale wielu czynników, w tym wielu enzymów, w szczególności enzymów hydrolitycznych, zwłaszcza proteolitycznych. Takie enzymy katalizują rozpad enzymatyczny (hydrolityczny lub proteolityczny) białek i peptydów na niniejsze ich fragmenty. Proces ten umożliwia komórkom nowotworowym rozrost przez kolonizację nowych tkanek, wzmożenie procesu tworzenia naczyń krwionośnych (angiogenezy), co umożliwia efektywne dostarczanie substancji odżywczych do guza nowotworowego. Ponadto, enzymy te powstają także w wyniku obumierania komórek zdrowych na skutek procesu rozrostu guza. Wszystkie te procesy tworzą charakterystyczny i swoisty profil aktywności enzymatycznej (proteolitycznej) komórek nowotworowych, charakterystyczny dla guza nowotworowego.
Znane są w dziedzinie chromogeniczne cząsteczki peptydowe, które ulegają rozpadowi enzymatycznemu na mniejsze fragmenty z powstaniem zmiany lub wzrostu zabarwienia badanego roztworu. Ten efekt chromogeniczny jest następstwem uwalniania chromoforu (np. 4-anilidu lub kwasu 2-amino-benzoesowego) z chromogenicznej cząsteczki peptydowej.
Tego typu chromogeniczne cząsteczki peptydowe i ich zastosowania znane są, przykładowo, z publikacji autorstwa Erlanger BF, Kokowsky N, Cohen W., “The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin”, Arch Biochem Biophys., listopad 1961 ; 95:271-8 oraz Hojo K, Maeda M, Iguchi S, Smith T, Okamoto H, Kawasaki K. Amino acids and peptides. XXXV. “Facile preparation of p-nitroanilide analogs by the solid-phase method”, Chem Pharm Bull (Tokyo), listopad 2000; 48(11): 1740-4.
Jak dotąd nie opisano jednak zastosowania tej klasy związków w diagnostyce raka nerki. W stanie techniki znane są także sposoby otrzymywania peptydów chromogenicznych polegające na przyłącza
PL 245377 Β1 niu poszczególnych elementów składowych w odpowiednich warunkach czasowych i stechiometrycznych. Taki proces przyłączania składa się z kolejnych etapów, w których poszczególne elementy (pochodne aminokwasowe) są przyłączane, pozostałości odmywane i kolejno grupy ochronne usuwane i ponownie przemywane. Taki cykl powtarzany jest dla każdej reszty aminokwasowej. Otrzymany peptyd oddzielany jest od żywicy poprzez reakcję w warunkach kwasowych. Kolejno roztwór oddzielany jest od żywicy w procesie sączenia, a następnie z otrzymanego roztworu peptyd wytrącany jest rozpuszczalnikiem niepolarnym.
W stanie techniki nie są znane jednakże ani chromogeniczne związki peptydowe odpowiednie do swoistego i wczesnego diagnozowania raka nerki, ani sposoby ich otrzymywania.
W dziedzinie istnieje zatem pilne zapotrzebowanie na „marker nowotworowy” raka nerki, który pozwalałby na wczesne, czułe i swoiste rozpoznanie raka nerki w sposób nieinwazyjny i wiarygodny oraz na sposoby diagnostyczne i sposoby leczenia wykorzystujące taki marker diagnostyczny.
Celem wynalazku jest zatem dostarczenia nowego, swoistego markera diagnostycznego raka nerki oraz sposobów diagnostycznych wykorzystujących taki marker do bezinwazyjnego, szybkiego, czułego, swoistego, wczesnego wykrywania raka nerki, który byłby odpowiedni także do badań przesiewowych, a także sposobów leczenia wykorzystujących taki marker. Cele te zrealizowano dzięki wynalazkom zdefiniowanym w załączonych zastrzeżeniach patentowych, przy czym korzystne ich warianty zostały zdefiniowane w zastrzeżeniach zależnych.
Krótki opis wynalazku
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest związek o wzorze 1:
XI '-Leu2-Pro3-Gly4-Thr5-X26 (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę Cl lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę C2 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym związek ten ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Leu-Pro-Gly-Thr-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnału optycznego poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.
Taki związek według wynalazku ulega korzystnie rozpadowi hydrolitycznemu, korzystniej proteolitycznemu.
Korzystnie w związku według wynalazku para cząsteczek C1 i C2 jest wybrana jest z grupy składającej się z: kwasu 2-aminobeznoesowego (ABZ)/kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego (ANB), (ABZ)/pNA, ABZ/ANB-NH2, ABZ/DNP, ABZ/EDDNP, EDANS/DABCYL, TAM/DANSYL, ABZ/Tyr(3-NO2), korzystniej parę C1 i C2 stanowi (ABZ)/pNA lub ABZ/ANB-NH2.
Korzystnie związek według wynalazku stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-pNA (wzór 3).
Korzystniej związek według wynalazku ulega rozpadowi hydrolitycznemu z powstaniem następującego fragmentu 1: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-OH oraz fragmentu 2: ANB-NH2.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób in vitro wykrywania aktywności enzymatycznej obecnej w płynie ustrojowym osobnika pochodzącej z komórek raka nerki, obejmujący:
a) kontaktowanie próbki płynu ustrojowego ze związkiem o wzorze 1:
X11 -Leu24>ro3-Gly4-Thr5-X26 (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę C1 lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę C2 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym wspomniany związek ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Leu-Pro-Gly-Thr-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2), i
b) wykrywanie mierzalnego sygnału optycznego, który powstaje poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.
W takim sposobie wykrywania aktywności enzymatycznej według wynalazku aktywność enzymatyczną stanowi korzystnie aktywność hydrolityczna, korzystniej aktywność proteolityczna.
PL 245377 Β1
W takim sposobie wykrywania aktywności enzymatycznej według wynalazku jako wspomniany związek korzystnie stosuje się związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-pNA (wzór 3).
W takim sposobie wykrywania aktywności enzymatycznej według wynalazku jako wspomniany płyn ustrojowy stosuje się mocz, korzystnie mocz ludzki.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób in vitro diagnozowania raka nerki, w którym wykrywa się obecność lub nieobecność raka nerki u osobnika poprzez pomiar w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego aktywności enzymatycznej swoistej dla raka nerki, przy czym brak wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na nieobecność raka nerki, zaś obecność wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na obecność raka nerki, i przy czym do pomiaru wspomnianej aktywności enzymatycznej stosuje się związek o wzorze 1:
Xl’-Leu2-Pro3-Gly4-Thr5-X26 (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę C1 lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę C2 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym wspomniany związek ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Leu-Pro-Gly-Thr-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnału optycznego poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.
W takim sposobie wykrywania/diagnozowania raka nerki według wynalazku wykrywanie aktywności enzymatycznej przeprowadza się sposobem wykrywania aktywności enzymatycznej jak określono powyżej.
W takim sposobie wykrywania/diagnozowania raka nerki według wynalazku wspomnianą próbkę płynu ustrojowego korzystnie inkubuje się ze wspomnianym związkiem w buforze pomiarowym o pH obojętnym lub pH zasadowym, korzystnie fizjologicznym, w zakresie proporcji 1:2 do 1:10 korzystnie 1:5 próbki do buforu pomiarowego.
W takim sposobie wykrywania/diagnozowania raka nerki według wynalazku wspomniany związek korzystnie stosuje się w stężeniu 0,1-10 mg/ml, w szczególności 0,25-7,5 mg/ml. Wtakim sposobie wykrywania/diagnozowania raka nerki według wynalazku jako wspomniany związek korzystnie stosuje się związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-ANB-Nhh lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-pNA.
W takim sposobie wykrywania/diagnozowania raka nerki według wynalazku jako wspomnianą próbkę korzystnie stosuje się próbkę moczu, korzystniej moczu ludzkiego.
Wtakim sposobie wykrywania/diagnozowania raka nerki według wynalazku pomiar wspomnianej aktywności enzymatycznej korzystnie obejmuje pomiar intensywności absorbancji w zakresie 300-500 nm, korzystniej 380-430 nm, w szczególności 405 nm, w czasie 40-60 minut, w temperaturze z przedziału 25-40°C, korzystniej 36-38°C.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto zestaw zawierający dowolny związek według wynalazku jak określono powyżej i bufor pomiarowy.
W takim zestawie według wynalazku związek korzystnie stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-pNA.
Przedmiotem wynalazku jest także dowolny związek według wynalazku jak określono powyżej do zastosowania do wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej dla raka nerki.
Przedmiotem wynalazku jest również dowolny związek według wynalazku jak określono powyżej do zastosowania do diagnozowania raka nerki.
Korzystnie w takim zastosowaniu diagnozowanie raka nerki obejmuje wykrywanie pierwotnego raka nerki, wykrywanie choroby resztkowej po resekcji chirurgicznej raka nerki i/lub wykrywanie wznowy raka nerki.
Korzystnie związek w takich zastosowaniach według wynalazku stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-pNA.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto dowolny związek według wynalazku jak określono powyżej do zastosowania jako marker diagnostyczny do wykrywania raka nerki.
Korzystnie taki związek do zastosowania jako marker diagnostyczny według wynalazku stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-ANB-Nhh lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-pNA.
Zgodnie z wynalazkiem opisano tu sposób leczenia raka nerki, w którym
a) wykrywa się obecność aktywności enzymatycznej swoistej dla raka nerki dowolnym sposobem jak określono powyżej w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego, i
b) gdy we wspomnianej próbce stwierdzi się występowanie wspomnianej aktywności enzymatycznej, podejmuje się leczenie raka nerki u osobnika.
W takim sposobie leczenia, po zakończeniu leczenia zgodnie z punktem b), można przeprowadzać monitorowanie wspomnianej aktywności enzymatycznej swoistej dla raka nerki w określonych odstępach czasu.
W takim sposobie leczenia jako próbkę można stosować próbkę moczu, na przykład moczu ludzkiego.
W takim sposobie leczenia jako wspomniany związek można stosować związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-pNA.
Szczegółowy opis wynalazku
Należy rozumieć, że niniejszy wynalazek jest zdefiniowany w załączonych zastrzeżeniach. Niniejszy opis ilustruje różne, nieograniczające, wykonania wynalazku i przykłady jego realizacji. Niniejszy wynalazek nie ogranicza się do jakiejkolwiek konkretnej metodologii, protokołu czy odczynników stosowanych do jego realizacji, o ile nie wskazano inaczej. Zastosowane pojęcia oraz określenia naukowe i techniczne mają znaczenia powszechnie znane i stosowane przez specjalistów w dziedzinie niniejszego wynalazku. Dla wyjaśnienia jednak następujące określenia i skróty zastosowane w opisie i zastrzeżeniach patentowych, należy rozumieć następująco:
Związek chromogeniczny lub inaczej cząsteczka chromogeniczna oznacza związek posiadający właściwości chromogeniczne. Właściwości chromogeniczne oznaczają zdolność związku do tworzenia produktu barwnego.
Związek fluorescencyjny lub inaczej cząsteczka fluorogeniczna oznacza związek posiadający właściwości fluorogeniczne. Właściwości fluorogeniczne oznaczają zdolność związku do tworzenia produktu emitującego fluorescencję.
NMP to N-metylopirolidon; DMF to dimetyloformamid; DCM to chlorek metylenu, inaczej dichlorometan; pNA to 4-nitroanilina, inaczej para-nitroanilina; ABZ to kwas 2-aminobeznoesowy, ANB-NH2 to amid kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego; Boc to grupa tert-butyloksykarbonylowa; Fmoc to grupa 9-fluorenylometoksykarbonylowa; zaś TFA to kwas trifluorooctowy.
W kontekście niniejszego wynalazku pojęcie rak nerki należy rozumieć jako rak (nowotwór złośliwy) pierwotny nerki rozwijający się z tkanek znajdujących się w nerce. Rakiem nerki jest najczęściej nerkowokomórkowy (ok. 90%). Stosowane tu pojęcie rak nerki obejmuje zatem wszelkie nowotwory złośliwe nerki rozwijające się z tkanek znajdujących się w nerce. W kontekście niniejszego wynalazku pojęcie diagnozowanie raka nerki należy rozumieć jako rozpoznanie tej choroby, w szczególności na jej wczesnym etapie, na którym inne metody diagnostyczne są zbyt mało czułe i/lub swoiste. W stosowanym tu znaczeniu diagnozowanie raka nerki obejmuje także wykrywanie choroby resztkowej po chirurgicznym wycięciu raka nerki oraz wykrywanie wznowy raka nerki po wcześniej zakończonym leczeniu raka nerki.
W kontekście niniejszego wynalazku pojęcie leczenie raka nerki należy rozumieć jako leczenie na wczesnym etapie rozwoju choroby, pozwalające na istotne wydłużenie czasu przeżycia oraz poprawę jakości życia chorych.
W kontekście niniejszego wynalazku pojęcie monitorowanie należy rozumieć jako diagnostykę choroby resztkowej (ang. Minimal Residual Disease (MRD)) - obecności małej liczby przetrwałych w organizmie (w trakcie leczenia lub w remisji) komórek nowotworowych, w ilościach niewykrywanych standardowo stosowanymi metodami diagnostycznymi.
W kontekście niniejszego wynalazku pojęcie osobnik należy rozumieć jako człowieka lub ssaka, u którego podejrzewa się występowanie raka nerki, ewentualnie jako człowieka lub ssaka należącego do grupy zwiększonego ryzyka wystąpienia raka nerki, albo człowieka lub ssaka po resekcji raka nerki, lub po zakończonym leczeniu raka nerki. Osobnikiem jest korzystnie człowiek.
Związki według wynalazku mają właściwości chromogeniczne dzięki obecności chromofora oraz fluorogeniczne, tj. zawierają cząsteczki donora i akceptora fluorescencji. Dzięki swojej budowie, opracowanej w taki sposób, że obserwowany jest wzrost barwy w przedziale długości fali 380-440 nm swoiście w wyniku kontaktu badanej próbki płynu ustrojowego od osobnika badanego z rakiem nerki, a jednocześnie nie jest obserwowany taki efekt w reakcji z próbką płynu ustrojowego od osobnika zdrowego lub z diagnozą innego typu nowotworu, związki te pozwalają na wykrywanie aktywności enzymatycznej
PL 245377 Β1 swoistej dla raka nerki, a w szczególności diagnozowanie raka nerki w sposób swoisty i czuły, również na wczesnym etapie rozwoju tego raka. Osobnikiem badanym jest korzystnie człowiek. Płynem ustrojowym jest korzystnie mocz, korzystniej ludzki.
W pierwszym aspekcie niniejszego wynalazku dostarczony jest nowy związek chemiczny o wzorze 1:
XI '-Leu2-Pro3-Gly4-Thr5-X26 (wzór 1), przy czym X1 stanowi pochodna aminokwasowa lub fragment peptydowy zawierający cząsteczkę C1 lub X1 składa się z takiej cząsteczki C1, a X2 stanowi pochodna aminokwasowa lub fragment peptydowy zawierający cząsteczkę C2 lub X1 składa się z takiej cząsteczki C2, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji. Cyfry w indeksie górnym oznaczają kolejne pozycje reszt w związku według wynalazku oraz kolejność ich dołączania podczas syntezy. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem można w tym kontekście wymiennie stosować także zapis wzoru 1 bez podawania numeracji reszt. Rdzeń wszystkich związków według wynalazku stanowi tetrapeptyd o wskazanej sekwencji 4 aminokwasów (Leu-Pro-Gly-Thr), którą przedstawiono także w Wykazie sekwencji jako sekwencję nr 1.
Związek według ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Leu-Pro-Gly-Thr-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnału optycznego poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2. Taki mierzalny sygnał optyczny jest mierzony sposobem pomiaru zmiany absorpcji/fluorescencji po rozpadzie enzymatycznym związku. Korzystnie cząsteczki C1 i C2 są rozdzielone od siebie nie więcej niż 10 resztami aminokwasowymi, co zapewnia wydajne wygaszanie donora fluorescencji przez akceptor fluorescencji. Dla znawcy oczywistym jest, że kluczowym czynnikiem jest odległość pomiędzy donorem i akceptorem fluorescencji. Zatem, w przypadkach, gdy sekwencja aminokwasowa oddzielająca cząsteczkę C1 i C2 jest zwinięta w skręconą lub skondensowaną strukturę drugorzędową, skutkującą zbliżeniem cząsteczek C1 i C2 w stosunku do struktury pierwszorzędowej, odległość między cząsteczkami C1 i C2 może być większa niż 10 reszt aminokwasowych.
Taki związek, dzięki swoim właściwościom chromogenicznym oraz posiadaniu miejsca reaktywnego w pozycji 5 pozwalającego na rozpad enzymatyczny (korzystnie proteolityczny) na mniejsze fragmenty, jest szczególnie odpowiedni do stosowania go jako marker diagnostyczny, w szczególności swoisty marker diagnostyczny raka nerki, w szczególności do zastosowania we wczesnym wykrywaniu raka nerki. W korzystnych wykonaniach związek według wynalazku ulega rozpadowi hydrolitycznemu, korzystniej proteolitycznemu.
W korzystnych wykonaniach para cząsteczek C1 i C2 jest wybrana jest z grupy składającej się z: kwasu 2-aminobeznoesowego (ABZ)/kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego (ANB), (ABZ)/pNA, ABZ/ANB-NH2, ABZ/DNP, ABZ/EDDNP, EDANS/DABCYL, TAM/DANSYL, ABZ/Tyr(3-NO2), przy czym korzystniej parę cząsteczek C1 i C2 stanowi ABZ/pNA lub ABZ/ANB-NH2.
W korzystnych wykonaniach związek według wynalazku stanowi: związek o wzorze 2:
ABZ1-Leu2-Pro3-Gly4-Thr5-ANB6-NH2 (wzór 2), lub związek o wzorze 3:
ABZ'-Leu2-Pro3-Gly4-Thr5-pNA6(wzór 3), w których ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego, zaś pNA oznacza 4-anilinę.
Taki związek ulega korzystniej rozpadowi hydrolitycznemu z powstaniem następującego fragmentu 1: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-OH oraz fragmentu 2: ANB-NH2 w przypadku związku o wzorze 2, zaś w przypadku związku o wzorze 3 z powstaniem następującego fragmentu 1: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-OH oraz fragmentu 2: pNA. Fragmenty 2 stanowią zatem chromofory w postaci wolnej.
Separacja przestrzenna cząsteczek C1 i C2 będąca następstwem rozpadu enzymatycznego związku według wynalazku powoduje powstanie mierzalnego sygnału optycznego, ponieważ fluorescencja emitowana z donora fluorescencji nie jest już wygaszana przez akceptor fluorescencji. Taki mierzalny sygnał optyczny można wykrywać korzystnie przy długości fali 300-500 nm, korzystniej 380-430 nm.
Związki według wynalazku można otrzymywać znanymi sposobami. Przykładowo można je otrzymać z zastosowaniem sposobu otrzymywania peptydów chromogenicznych polegającego na prowadzeniu procesu na nośniku w postaci żywicy, posiadającej grupę Fmoc, którą usuwa się w trakcie prowadzenia reakcji. Przykładowo może to być żywica amidowa, np. TentaGel S RAM lub RinkAmide, ale można także zastosować dowolną inną żywicę dostępną na rynku. Używana żywica do prowadzenia tego procesu powinna zostać odpowiednio przygotowana. Przygotowanie tej żywicy polega na zwiększeniu jej objętości poprzez wielokrotne przemywanie rozpuszczalnikami hydrofobowymi. Korzystnie stosuje się żywicę o osadzeniu 0,23 mmol/g. Z żywicy tej należy usunąć grupę ochronną Fmoc poprzez przemywanie 20% roztworem rozpuszczalnika.
Następnie, znane procesy otrzymywania peptydów chromogenicznych obejmują przyłączanie poszczególnych elementów składowych w odpowiednich warunkach czasowych i stechiometrycznych. Ten proces przyłączania składa się z kolejnych etapów, w których poszczególne elementy (pochodne aminokwasowe) są przyłączane, pozostałości odmywane i kolejno grupy ochronne usuwane i ponownie przemywane. Taki cykl powtarzany jest dla każdej reszty aminokwasowej. Otrzymany peptyd oddzielany jest od żywicy poprzez reakcję w warunkach kwasowych. Następnie roztwór oddzielany jest od żywicy w procesie sączenia, a następnie z otrzymanego roztworu peptyd wytrącany jest rozpuszczalnikiem niepolarnym. Uzyskany w ten sposób osad peptydu jest wirowany. Przykładowy, szczegółowy ale nieograniczający, sposób syntezy związków według wynalazku opisano poniżej i w przykładzie 1 poniżej.
Sposób syntezy związków według wynalazku polega na tym, że proces prowadzi się na nośniku w postaci żywicy, korzystnie posiadającej grupę Fmoc, przy czym nośnik przed rozpoczęciem procesu przygotowuje się poprzez zwiększenie jego objętości przez wielokrotne przemywanie rozpuszczalnikami hydrofobowymi, korzystnie dimetyloformamidem, chlorkiem metylenu lub N-metylopirolidonem, i usunięcie grupy ochronnej Fmoc, korzystnie poprzez przemywanie 10-30% roztworem piperydyny, w rozpuszczalnikach, takich jak dimetyloformamid, chlorek metylenu lub N-metylopirolidon. Następnie przeprowadza się sposób w kolejnych etapach:
a) osadzenie kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego ANB (lub innego chromoforu odpowiedniego do zastosowania zgodnie z wynalazkiem jak zdefiniowano w zastrzeżeniach) na żywicy poprzedza się przemyciem nośnika 3-6% roztworem N-metylomorfoliny (NMM) w DMF, a następnie DMF, po czym przygotowuje się roztwór ANB w DMF, do którego dodaje się kolejno TBTU, DMAP, a na koniec diizopropyloetyloaminę (DIPEA) w następujących nadmiarach w stosunku do osadzenia polimeru: ANB/TBTU/DMAP/DIPEA, 3:3:2:6, tak przygotowaną mieszaninę dodaje się do żywicy i miesza się do uzyskania jednorodności, po czym żywicę odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i przemywa rozpuszczalnikami, takimi jak DMF, DCM i izopropanolem, a następnie kontynuuje się przyłączanie ANB do żywicy poprzez zastosowanie heksafluorofosforanu O-(7-azabenzotriazol-1-ilo)-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego (HATU), a potem heksafluorofosforanu O-(benzotriazol-1-ilo)-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego (HBTU) w ilościach nadmiarowych, a po zakończeniu przemywa się nośnik kolejno DMF, DCM oraz izopropanolem i łagodnie suszy się;
b) przyłączanie reszty aminokwasowej do ANB prowadzi się poprzez reakcję z pochodną aminokwasową Fmoc-Thr(OtBu)-OH, przy czym co najmniej pięciokrotny nadmiar molowy pochodnej aminokwasowej w stosunku do żywicy rozpuszcza się w bezwodnej pirydynie i kontaktuje się z żywicą z osadzonym ANB, po czym całość chłodzi się do temperatury nie niższej niż -20°C, a następnie dodaje się POCh w stosunku 1:1 do użytej ilości pochodnej aminokwasowej i całość miesza się, po czym proces mieszania prowadzi się w temperaturze pokojowej, a następnie w podwyższonej temperaturze, zaś po zakończeniu reakcji żywicę odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem, przemywa się DMF oraz MeOH i łagodnie suszy się, po czym uzyskany związek przejściowy poddaje się procesowi acylowania przyłączając kolejno fragment: Leu-Pro-Gly;
c) acylowanie uzyskanego związku przejściowego prowadzi się przy zastosowaniu pochodnej aminokwasowej, korzystnie Fmoc-Gly-OH, i kolejno Fmoc-Pro-OH, następnie Fmoc-Leu-OH i w końcowym etapie syntezy Boc-Abz-OH, przy czym acylowanie prowadzi się etapowo od reszty 6 do 1 z wykorzystaniem diizopropylokarbodiimidu jako środka sprzęgającego, który stosuje się w nadmiarze, a po zakończeniu każdego etapu żywicę przemywa się DMF, i korzystnie podaje testowi chloroanilowemu (test na obecność wolnych grup aminowych), w którym monitoruje się przyłączenia pochodnej aminokwasowej;
d) usunięcie grupy ochronnej Fmoc prowadzi się poprzez przemywanie roztworem 10-30% piperydyny w DMF i kolejnymi przemywaniami każdym z rozpuszczalników: DMF, izopropanolem i chlorkiem metylenu,
e) odszczepianie peptydu od żywicy przeprowadza się stosując mieszaninę TFA:fenol:woda:TIPS przy zachowaniu stosunków odpowiednio 88:5:5:2 v/v/v/v, przy czym mieszaninę miesza się przez okres co najmniej jednej godziny, korzystnie trzy godziny, a uzyskany osada odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym przemywa się eterem dietylowym i uzyskany peptyd odwirowuje się;
f) przygotowanie gotowego produktu przeprowadza się poprzez rozpuszczenie peptydu w wodzie przy pomocy ultradźwięków, a następnie poddaje liofilizacji.
W drugim aspekcie niniejszego wynalazku dostarczony jest sposób in vitro wykrywania aktywności enzymatycznej, korzystnie proteolitycznej, obecnej w płynie ustrojowym osobnika, w szczególności pochodzącej z komórek raka nerki, obejmujący a) kontaktowanie próbki płynu ustrojowego ze związkiem według wynalazku i b) wykrywanie mierzalnego sygnału optycznego, który powstaje poprzez separację przestrzenną cząsteczek obecnych w związku według wynalazku C1 i C2. W korzystnym wykonaniu tego aspektu osobnikiem badanym jest w takim przypadku człowiek. W innym korzystnym wykonaniu tego aspektu płynem ustrojowym jest mocz, w szczególności ludzki.
W korzystnym wykonaniu tego aspektu stosuje się związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-pNA.
W trzecim aspekcie niniejszego wynalazku dostarczony jest sposób in vitro diagnozowania raka nerki, w którym wykrywa się obecność lub nieobecność raka nerki u osobnika poprzez pomiar w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego aktywności enzymatycznej, swoistej dla raka nerki, przy czym brak wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na nieobecność raka nerki, zaś obecność wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na obecność raka nerki, i przy czym do pomiaru w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego aktywności enzymatycznej jak określono powyżej stosuje się dowolny związek według wynalazku jak określono powyżej. Takie wykrywanie aktywności enzymatycznej korzystnie przeprowadza się z zastosowaniem sposobów wykrywania aktywności enzymatycznej jak omówiono powyżej. W korzystnym wykonaniu tego aspektu osobnikiem jest człowiek. W korzystnym wykonaniu tego aspektu płynem ustrojowym jest mocz, w szczególności ludzki. W korzystnym wykonaniu tego aspektu aktywność enzymatyczną swoistą dla raka nerki stanowi aktywność proteolityczna. W korzystnym wykonaniu tego aspektu stosuje się związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-pNA.
Ponadto, w korzystnym wykonaniu tego aspektu pomiar wspomnianej aktywności enzymatycznej w sposobach według wynalazku obejmuje pomiar intensywności absorbancji w zakresie 300-500 nm, korzystnie 380-430 nm, zwłaszcza 405 nm, w czasie 40-60 minut, w temperaturze w zakresie 25-40°C, korzystnie 36-38°C. Dzięki, czemu otrzymuje się maksymalnie intensywny mierzalny optyczny sygnał wynikający ze wzrostu absorbancji lub fluorescencji.
Ponadto, w korzystnych wykonaniach wspomnianych sposobów według wynalazku prowadzi się pomiar wspomnianej aktywności enzymatycznej z zastosowaniem związku według wynalazku w zakresie stężeń 0,1-10 mg/ml, korzystniej w stężeniu 1 mg/ml, w korzystnych wykonaniach wspomnianych sposobów według wynalazku badaną próbkę inkubuje się ze związkiem według wynalazku w buforze pomiarowym o pH obojętnym lub zasadowym, korzystnie fizjologicznym, z próbką płynu ustrojowego, korzystnie ludzkiego moczu, w zakresie proporcji 1:2 do 1:10, korzystnie 1:5 próbki (np. moczu) do buforu pomiarowego. Próbka korzystnie pochodzi od osoby skierowanej do diagnozy raka nerki. Korzystnie mierzy się intensywność absorbancji w zakresie 300-500 nm, korzystnie 380-430 nm, zwłaszcza 405 nm, w czasie 40-60 minut, w temperaturze w zakresie 25-40°C, korzystnie 36-38°C. W powyższych warunkach otrzymujemy maksymalnie intensywny mierzalny sygnał optyczny wynikający ze wzrostu absorbancji lub fluorescencji.
W czwartym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza zestaw zawierający dowolny związek według wynalazku i bufor pomiarowy. Bufory pomiarowe znane są w dziedzinie, przy czym odpowiedni do zastosowania w zestawie według wynalazku bufor to na przykład, ale nieograniczająco, bufor Tris-HCl. W korzystnym wykonaniu w takim zestawie według wynalazku wspomniany związek stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-pNA.
W piątym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza związek według wynalazku do zastosowania do wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej dla raka nerki. W szóstym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza związek według wynalazku do zastosowania do diagnozowania raka nerki. Korzystnie diagnozowanie raka nerki obejmuje zgodnie z wynalazkiem wykrywanie pierwotnego raka nerki, wykrywanie choroby resztkowej po resekcji chirurgicznej raka nerki i/lub wykrywanie wznowy raka nerki po zakończonym wcześniej leczeniu raka nerki.
W siódmym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza związek według wynalazku do zastosowania jako marker diagnostyczny do wykrywania raka nerki. W korzystnych wykonaniach tego aspektu takim związkiem jest związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-pNA.
Opisano tu również sposób leczenia raka nerki, w którym:
a) wykrywa się obecność aktywności enzymatycznej swoistej dla raka nerki dowolnym sposobem według wynalazku jak określono powyżej w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego, i
b) gdy we wspomnianej próbce stwierdzi się występowanie wspomnianej aktywności enzymatycznej, podejmuje się leczenie raka nerki u osobnika.
W jednym wariancie takiego sposobu leczenia po zakończeniu leczenia zgodnie z punktem b), można przeprowadzać monitorowanie wspomnianej aktywności enzymatycznej swoistej dla raka nerki w określonych odstępach czasu jak wiadomo w dziedzinie, np. co tydzień, co kilka tygodni, co miesiąc, co kilka miesięcy, co rok lub w dowolnych innych odstępach uznanych przez specjalistę za stosowne, celem wykrywania choroby resztkowej po resekcji chirurgicznej raka nerki lub pojawienia się wznowy. Ponadto, w jednym wariancie takiego sposobu leczenia jako próbkę do badania można stosować próbkę moczu, korzystnie moczu ludzkiego. W innym wariancie takiego sposobu leczenia jako wspomniany związek można stosować związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-pNA (wzór 3).
Zalety niniejszego wynalazku polegają na dostarczeniu nowego związku chemicznego o właściwościach sprawiających, że nadaje się on do zastosowania do czułego i swoistego wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej dla raka nerki, do zastosowania jako biomarker diagnostyczny do wykrywania raka nerki, do zastosowania do szybkiego, bezinwazyjnego diagnozowania raka nerki, pozwalającego przy tym na wykrywanie raka nerki na wczesnym etapie jego rozwoju. Kolejną zaletą jest to, że sposoby diagnostyczne według wynalazku mogą być z powodzeniem stosowane w badaniach przesiewowych. Daje to możliwość wykonania pełnej diagnostyki na wczesnym etapie rozwoju nowotworu i w konsekwencji skuteczniejszego leczenia. Wczesne rozpoznanie daje możliwość leczenia operacyjnego, które znacząco wydłuża przeżycie pacjenta. Jest to także istotne w przypadku monitorowania skuteczności przeprowadzonego leczenia chirurgicznego i/lub chemioterapeutycznego raka nerki, dzięki możliwości wykrywania choroby resztkowej lub ewentualnej wznowy.
Niniejszy wynalazek zostanie teraz zilustrowany na poniższych figurach i w poniższych przykładach, które jednak nie mają na celu ograniczenia w żaden sposób zakresu wynalazku zdefiniowanego w zastrzeżeniach patentowych.
Krótki opis figur
Fig. 1 przedstawia wyniki analizy chromatograficznej rozpadu substratu, tj. ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-ANB-NH2, w próbce moczu od osobnika z rakiem nerki.
Fig. 2 przedstawia stopień hydrolizy substratu - ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-ANB-NH2 - w próbkach moczu ze zdiagnozowanym rakiem nerki (próbki N1-N20) i moczu pochodzących od osób zdrowych (próbki 21-40). Cyfry arabskie oznaczają numer wybranej próbki moczu.
Fig. 3 przedstawia selektywność hydrolizy substratu - ABZ1-Leu2-Pro3-Gly4-Thr5-ANB6-NH2 (tj. związku o wzorze 2) w próbkach moczu ze zdiagnozowanym rakiem nerki (próbka 1) i moczu pochodzącym od osób z diagnozą innej choroby nowotworowej (próbka 2-9). Cyfry arabskie oznaczają numery poszczególnych rodzajów nowotworów. Badane próbki dla każdego rodzaju nowotworu pochodziły od 20 różnych pacjentów dla każdego z badanych nowotworów. Wyniki oznaczają średnie wartości dla poszczególnych rodzajów nowotworów. Wyniki te wykazują selektywność rozpadu substratu wobec moczu pacjentów z rakiem nerki względem próbek moczu od pacjentów chorych na inne nowotwory.
Fig. 4 przedstawia zależność stopnia hydrolizy substratu, tj. ABZ1-Leu2-Pro3-Gly4-Thr5-ANB6-NH2, od środowiska pH.
Przykłady
Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, niestanowiące jednak jego ograniczenia. O ile nie wskazano inaczej, w poniższych przykładach stosowano znane i/lub komercyjnie dostępne urządzenia, metody, warunki reakcji, odczynniki i zestawy, takie jakie powszechnie stosuje się w dziedzinie, do której należy niniejszy wynalazek i jakie są zalecane przez wytwórców odpowiednich odczynników i zestawów.
Przykład 1: Synteza związku według wynalazku
W przykładzie tym przedstawiono syntezę reprezentatywnego związku według niniejszego wynalazku, mianowicie związku: ABZ1-Leu2-Pro3-Gly4-Thr5-ANB6-NH2. Pozostałe peptydy według wynalazku można zsyntetyzować w analogiczny sposób. Cyfry w indeksie górnym oznaczają kolejne pozycje reszt w związku według wynalazku oraz kolejność ich dołączania podczas syntezy. Związki według wynalazku można zamiennie przedstawiać analogicznym wzorem bez podawania pozycji reszt, co nie zmienia kolejności reszt w związkach według wynalazku, gdyż pozostaje ona bez zmian.
1. Otrzymanie peptydu chromogenicznego
a) Pierwszym etapem syntezy było otrzymanie peptydu chromogenicznego, który otrzymano metodą syntezy w fazie stałej - na nośniku stałym - z wykorzystaniem chemii Fmoc/tBu, czyli z użyciem osłon.
Związek o sekwencji ABZ1-Leu2-Pro3-Gly4-Thr5-ANB6-NH2, gdzie ABZ oznacza kwas 2-amino-benzoesowy, a ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego, zaś ANB to kwas 5-amino-2-benzoesowy, otrzymano na drodze syntezy chemicznej w fazie stałej z wykorzystaniem następujących pochodnych aminokwasowych.
Boc-ABZ, Fmoc-Leu, Fmoc-Pro, Fmoc-Gly, Fmoc-Thr(OtBu).
Syntezę związku według wynalazku, czyli markera diagnostycznego do wykrywania raka nerki, prowadzono na nośniku stałym umożliwiającym przekształcenie kwasu 5-amino-2-beznoesowego w amid ANB-NH2, mianowicie żywicy amidowej TentaGel S RAM firmy RAPP Polymere (Niemcy) o osadzeniu 0,23 mmol/g. Można jednakże zastosować dowolną inną żywicę amidową, np. Rink Amide (Niemcy).
Syntezę związku prowadzono w sposób manualny z zastosowaniem wytrząsarki laboratoryjnej. Przez większość etapów reaktorami była strzykawka zakończona spiekiem do syntezy w fazie stałej o pojemności 25 ml.
Wszystkie otrzymywane końcowe związki zawierały w swojej sekwencji w pozycji 1, czyli na N-końcu, kwas 2-aminobenzoesowy (ABZ), zaś w pozycji 6, czyli na C-końcu, cząsteczkę kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego (ANB). ABZ pełni tu rolę donora fluorescencji, natomiast ANB pełni rolę wygaszacza fluorescencji i jednocześnie chromoforu. Peptydy w swojej sekwencji zawierały co najmniej i korzystnie jedno miejsce reaktywne zlokalizowane pomiędzy resztami aminokwasowymi Thr-ANB-NH2, tj. w pozycji 5 związku. Syntezę polegająca na przyłączaniu pochodnych aminokwasowych prowadzi się od reszty 6 do 1, czyli od końca C do N.
b) Osadzenie ANB na żywicy TentaGel S RAM:
Syntezę peptydów wykonano na żywicy TentaGel S RAM firmy Rapp Polymere o osadzeniu 0,23 mmol/g. W pierwszym etapie przygotowano żywicę, w tym dokonano spulchnienia żywicy poprzez cykl przemywań. Kolejno przystąpiono do usunięcia z nośnika osłony grupy aminowej Fmoc za pomocą 20% roztworu piperydyny w NMP. Następnie przeprowadzono cykl przemywań rozpuszczalnikami. W celu potwierdzenia obecności wolnych grup aminowych wykonano test chloranilowy.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 1x10 minut; IsOH 1 x 10 minut; DCM 1x10 minut.
Usunięcie osłony Fmoc:
DMF 1 x 5 minut; 20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty; 20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty; IsOH 3 x 2 minuty; DCM 3 x 2 minuty.
c) Test chloranilowy:
Test chloranilowy polegał na przeniesieniu, za pomocą łopatki, kilku ziaren żywicy z reaktora strzykawki - do szklanej ampułki, do której następnie dodano 100 μl nasyconego roztworu p-chloranilu w toluenie i 50 μl świeżego aldehydu octowego. Po upływie 10 minut przeprowadzono kontrolę zabarwienia ziaren.
Na tym etapie po przeprowadzeniu testu otrzymano zielone zabarwienie ziaren, które świadczyło o obecności wolnych grup aminowych. Po potwierdzeniu usunięcia osłon 9-fluorenylometoksykarbonylowych z żywicy można było przystąpić do kolejnego etapu, przyłączania pochodnej ANB (kwasu 5-amino-2-nitrobenozesowego).
d) Osadzenie kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego na nośniku stałym:
Pierwszym etapem syntezy biblioteki peptydowej - mieszaniny peptydów, było osadzenie ANB na 1 g żywicy. Przed przyłączeniem chromoforu przemyto żywicę używaną do reakcji następującymi rozpuszczalnikami: DMF, DCM i ponownie DMF, po czym usunięto osłonę Fmoc- z grupy funkcyjnej nośnika. Jeden cykl usuwania osłony Fmoc- obejmował następujące etapy:
Usunięcie osłony Fmoc-:
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty; 20% pipety dyna w NMP 1 x 8 minut.
e) Przemywanie
DMF 3 x 2 minuty; IsOH 3 x 2 minuty; DCM 3 x 2 minuty.
f) Test chloranilowy:
Żywicę z wolną grupą aminową przemyto 5% roztworem N-metylomorfoliny (NMM) w DMF, a następnie DMF. Procedurę usuwania osłony Fmoc- oraz cykl przemywań przeprowadzono w naczynku Merrifielda. W osobnej kolbie rozpuszczono ANB w DMF i dodawano kolejno TBTU, DMAP, a na koniec diizopropyloetyloaminę (DIPEA) w następujących nadmiarach w stosunku do osadzenia polimeru: ANB/TBTU/DMAP/DIPEA, 3:3:2:6 v/v/v/v. Tak przygotowaną mieszaninę dodano do żywicy i mieszano przez 3 godziny. Żywicę odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem, przemyto DMF, DCM i izopropanolem, a całą procedurę acylowania powtórzono dwa razy. Do przeprowadzenia kolejnych reakcji przyłączania ANB do żywicy zastosowano heksafluorofosforan-O-(7-azabenzotriazol-1 -ilo)-N,N,N',N'-tetrametylouroniowy (HATU), a potem heksafluorofosforan-O -(benzotriazol-1-ilo)-N,N,N',N'-tetrametylouroniowy (HBTU). W ostatnim etapie żywicę przemyto kolejno DMF, DCM oraz izopropanolem i suszono na powietrzu.
g) Przyłączenie C-końcowej reszty aminokwasowej (Fmoc-Thr(OtBu)-OH) do ANB:
Odpowiednią pochodną aminokwasową (9-krotny nadmiar molowy w stosunku do osadzenia żywicy) rozpuszczono w pirydynie i przeniesiono do kolby zawierającej żywicę z osadzonym ANB. Całość chłodzono do uzyskania temperatury -15°C (łaźnia lodowa: 1 cz. wagowa NH4CI, 1 cz. wagowa NaNOs, 1 cz. wagowa lodu). Po osiągnięciu żądanej temperatury dodano POCI3 (w stosunku 1:1 do użytej ilości pochodnej aminokwasowej) i całość mieszano na mieszadle magnetycznym: 20 minut w -15°C, 30 minut w temperaturze pokojowej oraz 6 godzin w 40°C (łaźnia olejowa). Po zakończeniu reakcji żywicę odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem, przemyto DMF oraz MeOH i zostawiono do wysuszenia.
W kolejnym etapie przyłączono resztę w pozycji P2 (Fmoc-Gly).
Wszystkie przyłączania reszt aminokwasowych poprzedzono przemywaniem żywicy za pomocą DMF przez 5 minut. W kolejnych przyłączaniach stosowano diizopropylokarbodiimid jako środek sprzęgający. Procedurę powtarzano dwukrotnie.
Po każdym z acylowań rozpoczynano cykl przemywań żywicy, a następnie wykonywano test chloranilowy, w celu monitorowania przyłączania pochodnej aminokwasowej do wolnych grup aminowych żywicy.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty; IsOH 3 x 2 minuty; DCM 3 x 2 minuty.
Test chloranilowy:
W wyniku przeprowadzonych testów po dwóch pierwszych sprzęganiach zabarwienie ziaren najpierw było zielone, a następnie szare, więc konieczne było przeprowadzenie kolejnego acylowania, w wyniku którego ziarna żywicy badanej testem chloranilowym były bezbarwne. Świadczyło to o przyłączeniu ANB do żywicy TentaGel S RAM, co pozwoliło przejść do następnego etapu syntezy peptydu.
Przyłączanie kolejnych chronionych reszt aminokwasowych:
Żywicę wraz z przyłączonym fragmentem ANB-Thr(OtBu) - znajdującą się w reaktorku przemyto za pomocą DMF, a następnie przystąpiono do deprotekcji osłony Fmoc z grupy aminowej w celu przyłączenia chronionej pochodnej aminokwasowej Gly.
Usunięcie osłony Fmoc:
DMF 1 x 5 minut; 20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty; 20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty; IsOH 3 x 2 minuty; DCM 3 x 2 minuty.
Test chloranilowy:
W wyniku przeprowadzenia testu chloranilowego otrzymano wynik pozytywny, o czym świadczyło zielone zabarwienie ziaren żywicy. Pozwoliło to na rozpoczęcie kolejnego etapu - przyłączania reszty aminokwasowej Fmoc-Pro-OH.
Przyłączanie pochodnej aminokwasowej
Wykonywane sprzęgania poprzedzono przemywaniem żywicy w DMF. Podczas przyłączania chronionej reszty seryny skład mieszaniny sprzęgającej pozostawał bez zmian. Po zakończeniu każdego z acylowań stosowano cykl przemywań rozpuszczalnikami według podanej procedury, a następnie przeprowadzono test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych w roztworze.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami
DMF 3 x 2 minuty; IsOH 3 x 2 minuty; DCM 3 x 2 minuty.
Test chloranilowy:
Ziarna żywicy podczas testu przeprowadzonego po drugim acylowaniu były bezbarwne, co pozwoliło na przejście do kolejnego etapu syntezy, jakim było wprowadzenie kolejnej chronionej pochodnej aminokwasowej - Fmoc-Leu i cząsteczki kwasu 2-aminobenzoesowego. Procesy sprzęgania odbyły się zgodnie z procedurą omówioną wcześniej.
Testy przeprowadzone po przyłączeniu wyżej wymienionych reszt wykazały wyniki pozytywne, ziarna żywicy były bezbarwne.
2. Usuwanie peptydu z nośnika
Po zakończeniu syntezy amid peptydu ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-ANB-NH2 usunięto z nośnika wraz z jednoczesnym usunięciem osłon bocznych za pomocą mieszaniny: TFA:fenol:woda:TIPS (88:5:5:2, v/v/v/v) w kolbie okrągłodennej na mieszadle magnetycznym.
Po upływie 3 godzin zawartość kolby odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem na lejkach ze spiekiem Schotta przemywając eterem dietylowym. Powstały osad odwirowano na wirówce SIGMA 2K30 (Laboratory Centrifuges) w czasie 20 minut. Osad otrzymany po wirowaniu rozpuszczano w wodzie przy pomocy ultradźwięków, a następnie poddano liofilizacji. W analogiczny sposób można przeprowadzić otrzymywanie pozostałych związków według niniejszego wynalazku.
Potwierdzenie tożsamości/charakterystykę nowego związku według wynalazku przeprowadzono z zastosowaniem analizy HPLC. Warunki tej analizy HPLC były następujące: kolumna RP Bio Wide Pore Supelco C8, 250 mm 4 mm, układ faz A 0,1% TFA w wodzie, B: 80% acetonitrylu w A), przepływ 1 ml/min, detekcja UV przy 226 nm. Przeprowadzona analiza potwierdziła otrzymanie związku według wynalazku.
Przykład 2: Badanie właściwości peptydu według wynalazku jako markera nowotworowego
Badanie aktywności nowych związków według wynalazku wykonano na grupie 20 chorych z diagnozą raka nerki z wykorzystaniem reprezentatywnego związku według wynalazku. Mechanizm działania związków według wynalazku, w tym reprezentatywnego związku o wzorze 2, polega na swoistym rozpadzie enzymatycznym, dokładniej hydrolizie enzymatycznej, w takim miejscu, które prowadzi do uwolnienia wolnych cząsteczek chromoforów, odpowiednio, ANB-NH2 (amidu kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego) w przypadku związku o wzorze 2 lub pNA (para nitro anilidu) w przypadku związku o wzorze 3, które wykazują absorbancję przy długości fali 320-480 nm, zwłaszcza 380-430 nm, w szczególności 405 nm. Pozostałe związki według wynalazku cechują się analogicznym mechanizmem działania. W tym celu reprezentatywny związek według wynalazku, ABZ1-Leu2-Pro3-Gly4-Thr5ANB6-NH2, rozpuszczono w dimetylosulfotlenku (w stężeniu 0,5 mg/ml), a następnie 50 μl takiego roztworu zmieszano z 120 μl buforu (200 mM Tris-HCl, pH 8,0) i 80 μl moczu osoby chorej na raka nerki. Pomiar wykonano w płytce 96 dołkowej przeznaczonej do pomiaru absorbancji, a każdą próbkę analizowano w trzech powtórzeniach w temperaturze 37°C. Czas trwania pomiaru wynosił 60 minut. W czasie pomiaru monitorowano długość fali charakterystyczną dla uwalniającego się chromoforu (ANB-NH2) przy długości fali 405 nm (zakres 380-430 nm).
Jak pokazano na Fig. 1 analiza RP HPLC losowo wybranego systemu zawierającego mocz pochodzący od osoby z diagnozą raka nerki wskazuje na to, że związek według wynalazku rozpada się na fragment peptydowy ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-OH i grupę chromoforową związku (ANB-NH2).
W wyniku pomiaru wzrost zabarwienia roztworu w czasie zaobserwowano we wszystkich próbkach moczu pochodzących od osób z diagnozą raka nerki. Obserwowana wielkość wzrostu absorbancji w czasie jest różna dla każdej z badanych próbek. Odmienny efekt uzyskano dla 20 próbek osób zdrowych (próbki 21 -40), gdyż w żadnej z tych 20 badanych próbek moczu nie zaobserwowano wzrostu absorbancji w zakresie diagnostycznym.
Przeprowadzane badania wskazują, że wszystkie próbki N1-N20 od osób chorych na raka nerki uległy rozpadowi, lecz w przypadku próbek N3 i N6 rozpad substratu, tj. ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-ANB-NH2, zachodził mniej wydajnie niż w przypadku próbek N5 czy N20 (Fig. 2, Tabela 1). Taki rezultat może być spowodowany różnicą w aktywności, jak i ilości enzymów odpowiedzialnych za rozpad enzy
PL 245377 Β1 matyczny (proteolizę). Ponadto wyniki przedstawione w poniższej tabeli 1 wskazują, że inkubacja roztworu substratu - związku według wynalazku - z próbkami moczu pochodzącymi od osób zdrowych (bez zdiagnozowanego nowotworu, oznaczone cyframi arabskimi kolejno od 21 do 40) nie prowadzi do wzrostu absorbancji, a zatem nie zachodzi hydroliza badanego związku. Rezultat wskazuje na brak obecności enzymów proteolitycznych swoistych/charakterystycznych dla raka nerki.
Tabela 1. Wyniki analizy absorbancji
NI 0,027000 0,019000 0,023000
N2 0,021000 0,014000 0,019000
N3 0,004400 0,002100 0,003600
N4 0,032000 0,029000 0,030000
N5 0,034000 0,032000 0,029000
N6 0,003300 0,002700 0,003000
N7 0,020000 0,021000 0,018000
N8 0,002000 0,004400 0,003500
N9 0,031000 0,030000 0,035000
N10 0,002600 0,003700 0,003100
Nil 0,012000 0,010000 0,015000
N12 0,009800 0,011100 0,012000
NB 0,004000 0,005100 0,004500
N14 0,003600 0,003300 0,003200
N15 0,004300 0,003700 0,004000
N16 0,003900 0,003700 0,003500
N17 0,013000 0,013500 0,013600
N18 0,004000 0,003200 0,003800
N19 0,003800 0,004000 0,003700
N20 0,031000 0,031000 0,026000
21 0,000000 0,000000 0,000000
22 0,000000 0,000000 0,000000
23 0,000000 0,000000 0,000000
24 0,000000 0,000000 0,000000
25 0,000000 0,000000 0,000000
26 0,000000 0,000000 0,000000
27 0,000000 0,000000 0,000000
28 0,000000 0,000000 0,000000
PL 245377 Β1
29 0,000000 0,000000 0,000000
30 0,000000 0,000000 0,000000
31 0,000000 0,000000 0,000000
32 0,000000 0,000000 0,000000
33 0,000000 0,000000 0,000000
34 0,000000 0,000000 0,000000
35 0,000000 0,000000 0,000000
36 0,000000 0,000000 0,000000
37 0,000000 0,000000 0,000000
38 0,000000 0,000000 0,000000
39 0,000000 0,000000 0,000000
40 0,000000 0,000000 0,000000
Ponadto, przeprowadzano badania selektywności rozpadu substratu, tj. związku według wynalazku, w zależności od badanego typu raka. Wyniki przeprowadzonych badań przedstawiono na Fig. 3 i wskazują one, że badany substrat, tj. ABZ1-Leu2-Pro3-Gly4-Thr5-ANB6-NH2, inkubowany z próbkami pochodzącymi od pacjentów z diagnozą poszczególnych nowotworów: raka jądra, jelita, prostaty, trzustki, dróg żółciowych, płuca, jajnika, odbytnicy nie rozpada się i nie powoduje wzrostu absorbancji we wskazanym zakresie. Badane próbki każdorazowo stanowiły mieszaninę 20 próbek otrzymanych dla każdego z badanych nowotworów. Wskazuje to na selektywność rozpadu związków według wynalazku, która sprawia, że nadają się one do swoistego wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej wobec raka nerki oraz swoistego diagnozowania raka nerki.
W tabeli 2 poniżej przedstawiono wyniki pomiarów uzyskane dla trzech powtórzeń każdej z próbek.
Tabela 2. Wyniki analizy selektywności rozpadu
nerka 1 0,01416 0,01476 0,01874
żołądek 2 0 0 0
płuco 3 0 0 0
jelito 4 0 0 0
prostata 5 0 0 0
pęcherz moczowy 6 0 0 0
trzustka 7 0 0 0
jajnik 8 0 0 0
wątroba 9 0 0 0
Ponadto przeprowadzono pomiary zależności aktywności proteolitycznej reprezentatywnego związku według wynalazku od odczynu środowiska reakcji. W wyniku tego eksperymentu stwierdzono, że w badanym materiale występuje co najmniej jeden enzym wykazujący maksimum aktywności w pH zasadowym (Fig. 4).
PL 245377 Β1
Przeprowadzone analizy potwierdziły przydatność związków według wynalazku w czułym i swoistym wykrywaniu aktywności enzymatycznej swoistej dla raka nerki, a tym samym ich przydatności także do swoistego diagnozowania raka nerki, jak również jako markera diagnostycznego raka nerki. Mechanizm działania związków według wynalazku polega na ich swoistym rozpadzie enzymatycznym w takiej pozycji, która prowadzi do uwolnienia wolnych cząsteczek chromoforów, co powoduje powstanie mierzalnego sygnału optycznego, który można wykorzystywać do celów diagnostycznych, w szczególności w diagnozowaniu raka nerki zgodnie z niniejszym wynalazkiem.
WYKAZ SEKWENCJI <1 IO> URTESTE S.A.
<120> Nowy marker diagnostyczny raka nerki <130> I7P50361PL00 <160> 1 <17O> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211>4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1
Leu Pro Gly Thr

Claims (24)

1. Związek o wzorze 1:
Xl‘-Leu2-Pro3-Gly4-Thr5-X26 (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę C1 lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę C2 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym związek ten ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Leu-Pro-Gly-Thr-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnału optycznego poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.
2. Związek według zastrzeżenia 1, który to związek ulega rozpadowi hydrolitycznemu, korzystnie proteolitycznemu.
3. Związek według zastrzeżenia 1 albo 2, w którym to związku para cząsteczek C1 i C2 jest wybrana jest z grupy składającej się z: kwasu 2-aminobeznoesowego (ABZ)/kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego (ANB), (ABZ)/pNA, ABZ/ANB-NH2, ABZ/DNP, ABZ/EDDNP, EDANS/DABCYL, TAM/DANSYL, ABZ/Tyr(3-NO2), korzystnie parę C1 i 02 stanowi ABZ/pNA lub ABZ/ANB-NH2.
4. Związek według jednego z zastrzeżeń 1 do 3, który to związek stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-pNA (wzór 3).
5. Związek według zastrzeżenia 4, który to związek ulega rozpadowi hydrolitycznemu z powstaniem następującego fragmentu 1: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-OH oraz fragmentu 2: ANB-NH2.
PL 245377 Β1
6. Sposób in vitro wykrywania aktywności enzymatycznej obecnej w płynie ustrojowym osobnika pochodzącej z komórek raka nerki, obejmujący:
a) kontaktowanie próbki płynu ustrojowego ze związkiem o wzorze 1:
Xl1-Leu2-Pro3-Gly4-Thr5-X26 (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę C1 lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę C2 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym wspomniany związek ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Leu-Pro-Gly-Thr-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2), i
b) wykrywanie mierzalnego sygnału optycznego, który powstaje poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.
7. Sposób in vitro według zastrzeżenia 6, w którym aktywność enzymatyczną stanowi aktywność hydrolityczna, korzystnie aktywność proteolityczna.
8. Sposób in vitro według zastrzeżenia 6 albo 7, w którym jako wspomniany związek stosuje się związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-ANB-Nhh (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-pNA (wzór 3).
9. Sposób według jednego z zastrz. 6 do 8, w którym jako wspomniany płyn ustrojowy stosuje się mocz, korzystnie mocz ludzki.
10. Sposób in vitro diagnozowania raka nerki, w którym wykrywa się obecność lub nieobecność raka nerki u osobnika poprzez pomiar w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego aktywności enzymatycznej swoistej dla raka nerki, przy czym brak wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na nieobecność raka nerki, zaś obecność wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na obecność raka nerki, i przy czym do pomiaru wspomnianej aktywności enzymatycznej stosuje się związek o wzorze 1:
Xl‘-Leu2-Pro3-Gly4-Thr5-X26 (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę C1 lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę 02 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym wspomniany związek ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Leu-Pro-Gly-Thr-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnału optycznego poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.
11. Sposób według zastrz. 10, w wykrywanie aktywności enzymatycznej przeprowadza się sposobem jak określono w jednym z zastrz. 6 do 9.
12. Sposób według jednego z zastrz. 10 do 11, w którym wspomnianą próbkę płynu ustrojowego inkubuje się ze wspomnianym związkiem w buforze pomiarowym o pH obojętnym lub pH zasadowym, korzystnie fizjologicznym, w zakresie proporcji 1:2 do 1:10 korzystnie 1:5 próbki do buforu pomiarowego.
13. Sposób według jednego z zastrz. 10 do 12, w którym wspomniany związek stosuje się w stężeniu 0,1-10 mg/ml, w szczególności 0,25-7,5 mg/ml.
14. Sposób według zastrz. 10 do 13, w którym jako wspomniany związek stosuje się związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-ANB-Nhh (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-pNA (wzór 3).
15. Sposób według jednego z zastrz. 10 do 14, w którym jako wspomnianą próbkę stosuje się próbkę moczu, korzystnie moczu ludzkiego.
16. Sposób według jednego z zastrz. 10 do 15, w którym pomiar wspomnianej aktywności enzymatycznej obejmuje pomiar intensywności absorbancji w zakresie 300-500 nm, korzystnie 380-430 nm, w szczególności 405 nm, w czasie 40-60 minut, w temperaturze z przedziału 25-40°C, korzystnie 36-38°C.
17. Zestaw zawierający związek jak określono w jednym z zastrz. 1 do 5 i bufor pomiarowy.
18. Zestaw według zastrz. 17, w którym związek stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-pNA (wzór 3).
19. Związek jak określono w jednym z zastrz. 1 do 5 do zastosowania do wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej dla raka nerki.
PL 245377 Β1
20. Związek jak określono w jednym z zastrz. 1 do 5 do zastosowania do diagnozowania raka nerki.
21. Związek do zastosowania według zastrzeżenia 20, w którym diagnozowanie raka nerki obejmuje wykrywanie pierwotnego raka nerki, wykrywanie choroby resztkowej po resekcji chirurgicznej raka nerki i/lub wykrywanie wznowy raka nerki.
22. Związek do zastosowania według jednego z zastrz. 19 do 21, w którym związek stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-ANB-Nhh (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-pNA (wzór 3).
23. Związek jak określono w jednym z zastrz. 1 do 5 do zastosowania jako marker diagnostyczny do wykrywania raka nerki.
24. Związek do zastosowania według zastrz. 23, który to związek startowi związek o wzorze 2: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Leu-Pro-Gly-Thr-pNA (wzór 3).
PL440976A 2022-04-20 2022-04-20 Związek-marker diagnostyczny raka nerki, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka nerki, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego PL245377B1 (pl)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL440976A PL245377B1 (pl) 2022-04-20 2022-04-20 Związek-marker diagnostyczny raka nerki, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka nerki, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego
CA3249634A CA3249634A1 (en) 2022-04-20 2023-04-19 COMPOUND, DIAGNOSTIC MARKER FOR KIDNEY CANCER, METHOD FOR DETECTING ENZYMATIC ACTIVITY, METHOD FOR DIAGNOSTIC DETECTION OF KIDNEY CANCER, KIT INCLUDING THE COMPOUND, USES OF THE COMPOUND AND METHOD FOR TREATMENT OF KIDNEY CANCER
IL316412A IL316412A (en) 2022-04-20 2023-04-19 A diagnostic marker preparation for kidney cancer, a method for enzymatic testing, a method for diagnosing kidney cancer, a kit containing the preparation, and a method for treating kidney cancer
JP2024561822A JP2025513350A (ja) 2022-04-20 2023-04-19 化合物 － 腎臓がん用診断マーカー、酵素活性の検出法、腎臓がんの診断法、本化合物を含むキット、本化合物の使用、及び腎臓がんの治療法
US18/857,796 US20250270617A1 (en) 2022-04-20 2023-04-19 Compound - diagnostic marker for kidney cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of kidney cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of kidney cancer
AU2023256464A AU2023256464A1 (en) 2022-04-20 2023-04-19 Compound - diagnostic marker for kidney cancer, method lor detecting enzymaticactivity, method for diagnosis of kidney cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of kidney cancer
CN202380035326.5A CN119072484A (zh) 2022-04-20 2023-04-19 化合物-肾癌诊断标志物、酶活性检测方法、肾癌诊断方法、包含该化合物的试剂盒、化合物的用途及肾癌治疗方法
KR1020247038558A KR20250007581A (ko) 2022-04-20 2023-04-19 화합물 - 신장암 진단 마커, 효소 활성 검출 방법, 신장암 진단 방법, 상기 화합물을 포함하는 키트, 상기 화합물의 용도 및 신장암 치료 방법
EP23729873.2A EP4511383A1 (en) 2022-04-20 2023-04-19 Compound - diagnostic marker for kidney cancer, method lor detecting enzymaticactivity, method for diagnosis of kidney cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of kidney cancer
PCT/PL2023/050026 WO2023204721A1 (en) 2022-04-20 2023-04-19 Compound - diagnostic marker for kidney cancer, method lor detecting enzymaticactivity, method for diagnosis of kidney cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of kidney cancer
MX2024012634A MX2024012634A (es) 2022-04-20 2024-10-11 Compuesto-marcador de diagnostico para cancer de ri?on, metodo de deteccion de actividad enzimatica, metodo de diagnostico de cancer de ri?on, kit que comprende el compuesto, usos del compuesto y metodo para el tratamiento del cancer de ri?on

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL440976A PL245377B1 (pl) 2022-04-20 2022-04-20 Związek-marker diagnostyczny raka nerki, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka nerki, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL440976A1 PL440976A1 (pl) 2023-10-23
PL245377B1 true PL245377B1 (pl) 2024-07-08

Family

ID=86732844

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL440976A PL245377B1 (pl) 2022-04-20 2022-04-20 Związek-marker diagnostyczny raka nerki, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka nerki, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20250270617A1 (pl)
EP (1) EP4511383A1 (pl)
JP (1) JP2025513350A (pl)
KR (1) KR20250007581A (pl)
CN (1) CN119072484A (pl)
AU (1) AU2023256464A1 (pl)
CA (1) CA3249634A1 (pl)
IL (1) IL316412A (pl)
MX (1) MX2024012634A (pl)
PL (1) PL245377B1 (pl)
WO (1) WO2023204721A1 (pl)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150037824A1 (en) * 2013-04-12 2015-02-05 Chang Gung University Urinary biomarker for urinary tract cancer and application of the same
EP2910948A1 (en) * 2012-10-17 2015-08-26 Public University Corporation Nara Medical University Novel cancer marker and utilization thereof

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100279328A1 (en) * 2009-02-06 2010-11-04 Anita Hong Fret assays, methods for performing the assays and compounds relevant to the assays
EP3987050A1 (en) * 2019-06-24 2022-04-27 Urteste S.A. Novel diagnostic marker for pancreatic cancer

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2910948A1 (en) * 2012-10-17 2015-08-26 Public University Corporation Nara Medical University Novel cancer marker and utilization thereof
US20150037824A1 (en) * 2013-04-12 2015-02-05 Chang Gung University Urinary biomarker for urinary tract cancer and application of the same

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
I. BELCZACKA ET AL.:: "Sci Rep; 2018; 8: 5227", "URINARY CE-MS PEPTIDE MARKER PATTERN FOR DETECTION OF SOLID TUMORS" *

Also Published As

Publication number Publication date
IL316412A (en) 2024-12-01
CN119072484A (zh) 2024-12-03
WO2023204721A1 (en) 2023-10-26
PL440976A1 (pl) 2023-10-23
JP2025513350A (ja) 2025-04-24
US20250270617A1 (en) 2025-08-28
CA3249634A1 (en) 2023-10-26
EP4511383A1 (en) 2025-02-26
KR20250007581A (ko) 2025-01-14
MX2024012634A (es) 2024-11-08
AU2023256464A1 (en) 2024-10-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL244818B1 (pl) Związek-marker diagnostyczny raka wątroby, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka wątroby, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego
PL245377B1 (pl) Związek-marker diagnostyczny raka nerki, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka nerki, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego
PL244819B1 (pl) Związek-marker diagnostyczny raka płuca, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka płuca, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego
PL245425B1 (pl) Związek-marker diagnostyczny raka trzonu macicy, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka trzonu macicy, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego
PL247268B1 (pl) Związek-marker diagnostyczny raka dróg żółciowych, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka dróg żółciowych, zestaw zawierający taki związek oraz zastosowania takiego związku
US20250206777A1 (en) Compound - diagnostic marker for intestinal cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of intestinal cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of intestinal cancer
HK40113726A (zh) 化合物-肾癌诊断标志物、酶活性检测方法、肾癌诊断方法、包含该化合物的试剂盒、化合物的用途及肾癌治疗方法
HK40111059A (zh) 化合物——肠癌诊断标志物、酶活性检测方法、肠癌诊断方法、包含该化合物的试剂盒、化合物的用途和治疗肠癌的方法
PL246444B1 (pl) Związek-marker diagnostyczny raka jajnika, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka jajnika, zestaw zawierający taki związek oraz zastosowania takiego związku
HK40107766A (zh) Fret酶底物及其在肺癌中的应用
HK40116114A (zh) 化合物-子宫体癌诊断标志物、检测酶活性的方法、诊断子宫体癌的方法、含该化合物的试剂盒、该化合物的用途和治疗子宫体癌的方法
HK40129291A (zh) 化合物-用於胆道癌的诊断标志物、用於检测酶活性的方法、用於诊断胆道癌的方法、包括该化合物的试剂盒、该化合物的用途和用於治疗胆道癌的方法
HK40105068A (zh) Fret酶底物及其在肝癌中的应用
PL248105B1 (pl) Związek, marker diagnostyczny raka piersi, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka piersi, zestaw zawierający taki związek oraz zastosowania takiego związku
HK40121437A (zh) 化合物-卵巢癌诊断标记物、检测酶活性的方法、诊断卵巢癌的方法、包含所述化合物的试剂盒、所述化合物的用途和治疗卵巢癌的方法