PL246646B1 - 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino- -4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian i jego zastosowanie - Google Patents

2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino- -4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian i jego zastosowanie Download PDF

Info

Publication number
PL246646B1
PL246646B1 PL444571A PL44457123A PL246646B1 PL 246646 B1 PL246646 B1 PL 246646B1 PL 444571 A PL444571 A PL 444571A PL 44457123 A PL44457123 A PL 44457123A PL 246646 B1 PL246646 B1 PL 246646B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
pyrido
pyrimidin
ethenyl
methoxyphenyl
methylbenzene
Prior art date
Application number
PL444571A
Other languages
English (en)
Other versions
PL444571A1 (pl
Inventor
Katarzyna Malarz
Patrycja Rawicka
Jacek Mularski
Anna Mrozek-Wilczkiewicz
Original Assignee
Univ Slaski
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Slaski filed Critical Univ Slaski
Priority to PL444571A priority Critical patent/PL246646B1/pl
Publication of PL444571A1 publication Critical patent/PL444571A1/pl
Publication of PL246646B1 publication Critical patent/PL246646B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent materials, e.g. electroluminescent or chemiluminescent
    • C09K11/06—Luminescent materials, e.g. electroluminescent or chemiluminescent containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1059—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing three nitrogen atoms as heteroatoms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3d-]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian oraz jego zastosowanie jako barwnika fluorescencyjnego do barwienia biologicznych struktur komórkowych, korzystnie do barwienia błoniastych struktur komórkowych, najkorzystniej do barwienia błoniastych struktur komórkowych nowotworów nabłonkowych płuc lub błoniastych struktur komórkowych nowotworów mózgu, lub błoniastych struktur komórkowych nowotworów piersi.

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian, będący pochodną pirydo[2,3-d]pirymidyny z ugrupowaniem tosylowym oraz jego zastosowanie do barwienia biologicznych struktur komórkowych.
Związki oparte na szkielecie pirydo[2,3-d]pirymidyny znane są ze swoich właściwości przeciwnowotworowych oraz hamujących działanie kinaz białkowych. Wiele danych literaturowych wskazuje zastosowanie związków pirydo[2,3-d]pirymidyny jako inhibitorów kinaz tyrozynowych, takich jak PDGFr, bFGFr oraz c-Src, czy też białek mTOR i Akt, które są odpowiedzialne za sygnalizację komórkową, związaną z procesami umożliwiającymi proliferację, przeżycie oraz rozsiew komórek nowotworowych. Związki te są opisane w dokumentach patentowych: US10618902, US2008194546, WO2007/060404 oraz w szeregu publikacji naukowych: Connolly C., Hamby J., Schroeder M., Barvian M., Fu G., Panek R., Amar A., Shen C., Kraker A., Fry D., Klohs D., Doherty A., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1997, 7(18), 2415-2420; Kraker A., Hartl B., Amar A., Barvian M., Showalter H., Moore C., Biochem. Pharmacol., 2000, 60(7), 885-898; Fares M., Abou-Seri S., Abdel-Aziz H., Abbas S., Youssef M., Eladwy R., Eur. J. Med. Chem., 2014, 83, 155-166. Jednakże żadna z cytowanych prac nie dotyczy możliwości wykorzystania związków zawierających szkielet pirydo[2,3-d]pirymidyny do barwienia struktur komórkowych.
Obrazowanie struktur komórkowych jest przedmiotem zainteresowania wielu ośrodków badawczych, ponieważ ich efektywne i rzetelne zobrazowanie jest narzędziem do poznania mechanizmów wielu badań biomedycznych. Jest to istotne w szerokim zakresie, zarówno z punktu widzenia badań podstawowych, badań in vivo, późniejszych badań klinicznych jak i ich ostatecznego wykorzystania w medycynie. Pomimo dostępności wielu związków światłoczułych, nadal istnieje potrzeba do zapełnienia luk w zależności od potrzeb naukowych, medycznych i diagnostycznych. Charakterystyczne właściwości absorpcyjne, a co za tym idzie również i emisyjne pozwalają na wykorzystanie odpowiednich źródeł wzbudzenia w zależności od potrzeby badacza czy lekarza. Precyzyjne umiejscowienie organelli komórkowych pozwala na ocenę wielu zjawisk w procesie wczesnych badań, a co najważniejsze na dokładne ulokowanie zmian chorobowych w przypadku np. chirurgii onkologicznej. Obecnie istnieje wiele komercyjnie dostępnych barwników dedykowanych do poszczególnych struktur w komórce oraz posiadających maksimum emisji obejmujące cały zakres światła widzialnego. Gromadzenie się barwników w charakterystycznych miejscach komórki często jest wynikiem oddziaływania z elementami cytoszkieletu oraz kwasami nukleinowymi [US9102835, US5075556, US20100184042, US20040156782]. Z punktu widzenia diagnostyki i samej medycyny istotne jest, aby barwnik wiązał się z miejscem zmienionym chorobowo (np. nowotworem) i pozwalał na precyzyjne wskazanie miejsca przeznaczonego do resekcji wraz z obszarem marginesu [US6944493B2, uS9044142B2 oraz Te Velde E.A., Veerman T, Subramaniam V., Ruers T., Eur J Surg Oncol 2010, 36(1), 6-15].
Przykładem zastosowania związków służących do wybarwiania struktur komórkowych jest pochodna para-iminostyrylochinoliny (PL 233179), mająca zastosowanie w diagnostyce chorób nowotworowych, ze szczególnym uwzględnieniem nowotworu jelita grubego. Innym przykładem jest wykorzystanie pochodnych fenotiazyny zawierających w swojej strukturze sprzężony pierścień imidazolu do obrazowania komórek nowotworowych (P.438052).
Rozwijanie badań nad opracowaniem nowych związków i metod obrazowania komórkowego jest niezwykle istotne z powodu ograniczeń obecnie stosowanych barwników [Jensen E.C., Anat Rec 2012, 295, 2031-2036]. Pożądane cechy dobrego barwnika nie ograniczają się tylko do korzystnych właściwości spektroskopowych takich jak wysoka kwantowa wydajność fluorescencji, duże przesunięcie Stokesa, brak zjawiska fotowybielenia, czyli inaczej stabilność fotochemiczna. Równie istotny jest brak cytotoksyczności (w przypadku barwień przeżyciowych) oraz wysokie powinowactwo do określonych struktur w komórce. Warto również nadmienić, że wartością progową obrazowania komórkowego jest barwa zielona ze względu na to, iż poniżej tej wartości absorbują molekuły zawarte w komórce. Dlatego też, barwniki emitujące zieloną barwę są najpopularniejsze i najbardziej uniwersalne z punktu widzenia możliwości sprzętowych [Swenson ES, Price JG, Brazelton T, Krause DS., Stem Cells 2007, 25, 2593-2600]. Stąd obecnie prowadzone badania mają duże wyzwanie, aby sprostać wysokim standardom stawianym związkom mającym zastosowanie do obrazowania organelli komórkowych. Charakterystyczne właściwości barwników są podyktowane potrzebą uzyskania obrazów mikroskopowych najwyższej jakości przy wysokim sygnale fluorescencji w stosunku do szumu, generowanego przez autofluorescencję komórki.
Celem twórców niniejszego wynalazku było opracowanie nowej pochodnej pirydo[2,3-d]pirymidyny z ugrupowaniem tosylowym o korzystnych właściwościach spektroskopowych oraz wskazanie jej zastosowania jako barwnika fluorescencyjnego do barwienia biologicznych struktur komórkowych lub wykorzystania w diagnostyce chorób nowotworowych.
Istotę niniejszego wynalazku stanowi 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian, o postaci chemicznej przedstawionej wzorem 1.
Istotę wynalazku stanowi także zastosowanie 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonianu przedstawionego wzorem 1 jako barwnika fluorescencyjnego do barwienia biologicznych struktur komórkowych, przy czym stosuje się go, to jest podaje do komórek, w pożywce hodowlanej umożliwiającej przeżycie komórek, po uprzednim rozpuszczeniu w rozpuszczalniku.
Korzystnie, w roztworze gotowym do podania do komórek, stężenie rozpuszczalnika w pożywce hodowlanej nie przekracza 0,3%.
Korzystnie, 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian stosuje się rozpuszczony w dimetylosulfotlenku.
Korzystnie, jako pożywkę hodowlaną stosuje się pożywkę Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM.
Korzystnie, 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian stosuje się jako barwnik fluorescencyjny do barwienia błoniastych struktur komórkowych.
Korzystnie, 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian stosuje się jako barwnik fluorescencyjny do barwienia błoniastych struktur komórkowych nowotworów nabłonkowych płuc.
Korzystnie, 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian stosuje się jako barwnik fluorescencyjny do barwienia błoniastych struktur komórkowych nowotworów mózgu.
Korzystnie, 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian stosuje się jako barwnik fluorescencyjny do barwienia błoniastych struktur komórkowych nowotworów piersi.
Z przedstawionych badań w przykładzie 1 wynika, że 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian (oznaczenie kodowe związku: ET-05) posiada dwa pasma absorbcji w zakresie 300-350 nm oraz fluorescencję w zakresie 495 nm oraz 464 nm. Dodatkowo, istotnie korzystne parametry takie jak duże przesunięcie Stokesa (powyżej 110 nm) oraz wysoka intensywność fluorescencji umożliwiają zastosowanie związku jako barwnika fluorescencyjnego do barwienia biologicznych struktur komórkowych. Związek ET-05 może być stosowany pod postacią farmaceutycznie dostępnego preparatu, przykładowo jako roztwór rozpuszczony w korzystnym dla komórek rozpuszczalniku. Przy czym, takim rozpuszczalnikiem może być DMSO lub etanol. Za bezpieczną dawkę rozpuszczalnika uważa się nie więcej niż 0,3% objętości pożywki hodowlanej gotowej do podania do układu komórkowego. Zaletą opisanej pochodnej ET-05 jest brak długoterminowej cytotoksyczności (72 godziny) wobec komórek raka płuca, jak i znikoma cytotoksyczność względem kilku linii komórek nowotworowych, tj. nowotworu mózgu oraz piersi. Przykładowo, opisana pochodna ET-05 po 2-godzinnej inkubacji w środowisku komórkowym może być zastosowana do obserwacji nowotworów płuc, piersi oraz mózgu. Intensywna zielona fluorescencja związku pozwala na uzyskanie wysokiej jakości obrazu (przy zachowaniu dobrego stosunku sygnału do tła), który może być rejestrowany przy użyciu kamery CCD. Pochodna ET-05 dobrze wiąże się z elementami komórkowymi, na co wskazuje jej specyficzny mechanizm akumulacji w obszarach błoniastych komórek, jakie występują w mitochondriach oraz lizosomach.
Pochodną według wynalazku można otrzymać z wykorzystaniem metod znanych ze stanu techniki, na przykład z wykorzystaniem procedury syntezy, opisanej w publikacjach: Mularski J, Malarz K, Pacholczyk M, Musiol R., Eur J Med Chem. 2019, 163, 610-625 oraz Malarz K, Mularski J, Kuczak M, Mrozek-Wilczkiewicz A, Musiol R., Cancers 2021, 13, 1790 z modyfikacjami.
Poniżej przedstawiono rozwiązania według wynalazku, które mają charakter przykładowy. W przykładzie 1 przedstawiono postać chemiczną 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonianu (oznaczenie kodowe związku: ET-05) oraz przykładowy sposób jego otrzymywania. W tym przykładzie przedstawiono także właściwości pochodnej ET-05, które są istotne dla jej zastosowania, przy czym wskazano właściwości spektroskopowe omawianej pochodnej wraz z przykładowymi widmami absorpcji i emisji oraz cytotoksyczność badanej pochodnej ET-05 wobec różnych typów komórek nowotworowych.
W przykładach 2-5 przedstawiono możliwość zastosowania 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonianu w barwieniu biologicznych struktur komórkowych.
Przykład 1
2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian (ET-05) o postaci chemicznej przedstawionej wzorem 1.
Związek według wynalazku, tj. 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian otrzymano według przykładowej metody, która polega na tym, że w naczyniu umieszczono (0,2 mmol, 56 mg) bezpośredni prekursor związku ET-05: [2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyno-4(3H)-on. Dodano chlorek metylenu - CH2CI2 (3 mL), DIPEA N,N-diizopropyloetyloaminę (0,3 mmol; 39 mg), TsCl - chlorek 4-metylobenzenosulfonowy (0,3 mmol, 57 mg) oraz DMAP - 4-dimetyloaminopirydynę (0,02 mmol; 3 mg). Całość mieszano w atmosferze gazu obojętnego (w temperaturze pokojowej 20-22°C) do zaniku sygnału pochodzącego od prekursora. Następnie dokonano identyfikacji sygnału za pomocą cienkiej warstwy TLC (CH2Cl2:heksan - 1:1). Związek wydzielano poprzez rozdział chromatograficzny stosując kartridż wypełniony żelem krzemionkowym (40-63 μm, 60 A). 1H NMR (500 MHz, CD2CI2) δ 9,19 (dd, J = 4.4, 2.0 Hz, 1H), 8.52 (dd, J = 8,2, 2,0 Hz, 1H), 8,42 (d, J = 16,1 Hz, 1H), 8,29-8,18 (m, 2H), 7,74 (dd, J = 7,5, 1,6 Hz, 1H), 7,56 (dd, J = 8,2, 4,4 Hz, 1H), 7,48-7,40 (m, 3H), 7,36 (d, J = 16,1 Hz, 1H), 7,11-7,04 (m, 2H), 4,07 (s, 3H).
Natomiast bezpośredni prekursor ET-05, to jest [2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyno-4(3H)-on otrzymano uprzednio w wyniku przykładowej trzyetapowej syntezy:
1) W pierwszym kroku wykonano reakcję kwasu 2-aminonikotynowego z nadmiarem stechiometrycznym bezwodnika octowego (50 ekwiwalentów molowych), w temperaturze 80°C w reaktorze mikrofalowym - o mocy 80 W. Wynikiem reakcji był 2-metylo-4H-pirydo[2,3-d][1,3]oksazyn-4-on. 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8,96 (dd, J = 4,7, 2,0 Hz, 1H), 8.50 (dd, J = 7,8, 2,0 Hz, 1H), 7,61 (dd, J = 7,8, 4,7 Hz, 1H), 2,45 (s, 4H); Surowy produkt wydzielano poprzez filtrację.
2) W drugim etapie 2-metylo-4H-pirydo[2,3-d][1,3]oksazyn-4-on (8 g) wymieszano z 40 mL wodnego roztworu amoniaku (32%) w temperaturze pokojowej (20-22°C) do całkowitego rozpuszczenia się osadu. Nasycanie roztworu reakcyjnego dwutlenkiem węgla powodowało precypitację produktu 2-metylopirydo[2,3-d]pirymidin-4(3H)-onu, który zbierano na lejku filtracyjnym i przemywano 2-propanolem - otrzymując chinazolon z wydajnością 40%. Reakcja została sprawdzona w skali 50 mmol; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 12,48 (s, 1H), 8,90 (dd, J = 4,6, 2,1 Hz, 1H), 8,45 (dd, J = 7,8, 2,1 Hz, 1H), 7,48 (dd, J = 7,8, 4,6 Hz, 1H), 2,40 (s, 3H);
3) W ostatnim etapie przeprowadzono reakcję 2-metylopirydo[2,3-d]pirymidin-4(3H)-onu z aldehydem 2-metoksysalicylowym w kwasie octowym (przykładowo stosowano taką ilość, aby nie przekroczyć 2 M stężenia substratu). Reakcję można prowadzić stosując reaktor mikrofalowy (130°C, 80 W, 120 minut) lub na łaźni olejowej (130°C, 12 h). Produkt krystalizowano z medium reakcyjnego z wydajnością 45%. 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 12,62 (s, 1H), 8,93 (dd, J = 4,5, 2,1 Hz, 1H), 8,46 (dd, J = 7,8, 2,1 Hz, 1H), 8,29 (d, J = 16,0 Hz, 1H), 7.64 (dd, J = 7,7, 1,7 Hz, 1H), 7.47 (dd, J = 7,8, 4,6 Hz, 1H), 7.44 (ddd, J = 8,8, 7,4, 1,7 Hz, 1H), 7,16-7,09 (m, 2H), 7,06 (appt, J = 7,5, 1H), 3,93 (s, 3H).
Właściwości spektroskopowe 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonianu.
W tabeli nr 1 przedstawiono zbiór najważniejszych parametrów spektroskopowych związku 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonianu rozpuszczonego w DMSO jako najkorzystniejszym rozpuszczalniku, które potwierdzają przydatność wskazanej pochodnej z przykładu 1 do barwienia biologicznych struktur komórkowych.
Zgodnie z przedstawionymi danymi można zaobserwować, że badana pochodna ET-05 wykazuje dwa pasma absorbcji przy długości fali 307 nm oraz 358 nm oraz maksimum fluorescencji przy długości fali 495 nm. Pochodna prezentuje także istotnie wysoką intensywność fluorescencji oraz duże przesunięcie Stokesa, które wynosi 137 nm. Wskazane parametry spektroskopowe są szczególnie korzystne i istotne w zakresie uzyskania wysokiego sygnału fluorescencji w stosunku do tła, co jest gwarantem otrzymania najwyższej jakości obrazów mikroskopowych. Z kolei, te cechy są szczególnie ważne dla wskazanego zastosowania według niniejszego wynalazku.
Przykładowe widma absorpcji i emisji 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonianu.
Zaprezentowane w formie wizualnej widma absorpcji dla pochodnej ET-05 w DMSO (przedstawione na Fig. 1) oraz widma emisji (wzbudzenie 358 nm) dla pochodnej ET-05 w DMSO (przedstawione na Fig. 2) potwierdzają korzystne własności spektroskopowe badanej pochodnej ET-05. Na wszystkich prezentowanych widmach widoczna jest zależność intensywności położenia pasm absorpcji oraz fluorescencji od badanego stężenia związku. Co ważne, zastosowanie związku ET-05 w niskim stężeniu: 6,25*10Λ-6 M nadal potwierdza wysoką intensywność fluorescencji (powyżej 2000). W związku z tym, tak korzystne parametry spektroskopowe zakwalifikowały związek do dalszych badań komórkowych.
Właściwości spektroskopowe 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonianu w zależności od stosowanego rozpuszczalnika.
W tabeli nr 2 przedstawiono zmiany właściwości spektroskopowych pochodnej ET-05 w zależności od stosowanego rozpuszczalnika (polarności). Rozpuszczalniki uporządkowane wg indeksu polarności (klasyfikacja Burdick & Jackson).
Zgodnie z przedstawionymi danymi, pochodna ET-05 prezentuje szczególnie korzystne parametry spektroskopowe w rozpuszczalniku polarnym, takim jak DMSO. Rozpuszczalnik ten jest uważany za najkorzystniejszy z uwagi na rozpuszczenie substancji przeznaczonej do obrazowania materiału żywego [Nguyen, S., Nguyen, H., Truong, K., Biomed. Res. Ther. 2020, 7(7), 3855-3859 oraz Jamalzadeh, L., Ghafoori, H., Sariri, R., Rabuti, H., Nasirzade, J., Hasani, H., & Aghamaali, M. R., Avicenna J Med Biochem, 2016, 4(1), 10-33453]. Należy jednak zwrócić uwagę, aby bezpieczna dawka rozpuszczalnika nie przekraczała 0,3% objętości pożywki hodowlanej gotowej do podania do układu komórkowego.
Podsumowując, przedstawione korzystne parametry spektroskopowe zakwalifikowały związek ET-05 do dalszych badań komórkowych nad jego zastosowaniem.
Cytotoksyczności badanego 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonianu wobec różnych typów komórek nowotworowych.
Aktywność antyproliferacyjną związku ET-05 oznaczono wobec ludzkich komórek nowotworów mózgu (linie komórkowe: U251, U87, LN-229), piersi (linia komórkowa MCF-7) oraz płuca (linia komórkowa A549). Komórki wysiewano na 96-dołkową płytkę w ilości 5 tysięcy na dołek (po 100 μL/dołek) i inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C i 5% CO2. Po tym czasie przygotowano i podawano roztwory związku ET-05 (rozpuszczonego w minimalnej ilości DMSO, tj. w taki sposób aby zawartość DMSO nie przekraczała 0,3% objętości pożywki hodowlanej gotowej do podania do układu komórkowego) w stężeniach umożliwiających wyznaczenie wartości IC50. Przykładowa aplikacja związku: rozpuszczenie związku w DMSO celem przygotowania roztworów o następujących stężeniach: 25 μM, 12,5 μM, 5 μM, 2,5 μM, 1 μM, 0,5 μM, 0,1 μM w pożywce hodowlanej Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), końcowa objętość w dołkach wynosiła 200 μL. Następnie roztwory zostały podane komórkom i inkubowane 72 godziny. Po tym czasie przeżywalność komórek została określona za pomocą standardowego testu MTS. Aktywność antyproliferacyjną 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonianu w postaci wyliczonych wartości IC50 przedstawiono w tabeli 3.
Zgodnie z przedstawionymi wynikami, dla badanego 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonianu nie obserwowano cytotoksyczności wobec nowotworu nabłonkowego płuc. Dodatkowo, prezentowane dane wskazują na nieznaczną cytotoksyczność pochodnej o wzorze 1 wobec kilku komórek nowotworowych mózgu oraz piersi. Jednakże, warte podkreślenia jest to, że wyniki te prezentują nieznaczną cytotoksyczność związku w wydłużonym (do 72 godzin) czasie inkubacji w stosunku do czasu eksperymentu barwienia, który wynosił 2 godziny. W związku z powyższym, zachowanie związku w środowisku komórkowym uważa się za korzystne i wartościowe względem zastosowania opisanego w niniejszym wynalazku. Związki mogą zostać aplikowane w stężeniu pozwalającym na osiągnięcie wysokiej fluorescencji.
Przykład 2
Zastosowanie 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonianu do barwienia błoniastych struktur komórkowych nowotworów nabłonkowych płuc.
Przykładowa procedura barwienia komórek ludzkiego nowotworu nabłonkowego płuca linii A549. Komórki wysiano w ilości 150 tys. (wraz z 1 mL DMEM) na wcześniej przygotowane specjalne szalki do obrazowania posiadające powierzchnię zawierającą szkiełko nakrywkowe, a następnie inkubowano przez 24 godziny w 37°C, 5% CO2. Po tym czasie przygotowano roztwór związku (rozpuszczalnik DMSO, którego zawartość nie przekracza 0,3% objętości pożywki hodowlanej gotowej do podania do układu komórkowego) w stężeniu 25 μM w pożywce hodowlanej Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), końcowa objętość na szkiełku wynosiła 1 mL. Następnie roztwór został podany komórkom i inkubowany przez 2 godziny w 37°C, celem wniknięcia związku przez błonę komórkową. Po inkubacji komórki przemywano dwukrotnie DMEM (bez FBS i czerwieni fenolowej), a następnie obserwowano przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego po wzbudzeniu filtrem DAPI, co przedstawiono na Fig. 3.
Zgodnie z przedstawionym obrazem, badana pochodna wykazuje jasną, intensywną zieloną fluorescencję w komórkach raka płuca. Umiejscowienie sygnału fluorescencyjnego na obszarze komórki może wskazywać powinowactwo do struktur błoniastych.
Przykład 3
Zastosowanie 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonianu do barwienia błoniastych struktur komórkowych nowotworów mózgu.
Przykładowa procedura barwienia komórek ludzkiego nowotworu mózgu linii U251, U87 lub LN-229. Komórki wysiano w ilości 150 tys. (wraz z 1 mL DMEM) na wcześniej przygotowane specjalne szalki do obrazowania posiadające powierzchnię zawierającą szkiełko nakrywkowe, a następnie inkubowano przez 24 godziny w 37°C, 5% CO2. Po tym czasie przygotowano roztwór związku (rozpuszczalnik DMSO, którego zawartość nie przekracza 0,3% objętości pożywki hodowlanej gotowej do podania do układu komórkowego) w stężeniu 25 μM w pożywce hodowlanej DMEM, końcowa objętość na szkiełku wynosiła 1 mL. Następnie roztwór został podany komórkom i inkubowany przez 2 godziny w 37°C, celem wniknięcia związku przez błonę komórkową. Po inkubacji komórki przemywano dwukrotnie DMEM (bez FBS i czerwieni fenolowej), a następnie obserwowano przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego po wzbudzeniu filtrem DAPI, co przedstawiono na Fig. 4.
Przedstawiony obraz, wyraźnie wskazuje na akumulację pochodnej ET-05 we wnętrzu komórek nowotworów mózgu, przykładowo linii U251. Związek charakteryzuje się intensywną zieloną fluorescencję, która może występować w obszarach błoniastych komórek.
Przykład 4
Zastosowanie 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonianu do barwienia błoniastych struktur komórkowych nowotworów piersi.
Przykładowa procedura barwienia komórek ludzkiego nowotworu piersi linii MCF-7. Komórki wysiano w ilości 150 tys. (wraz z 1 mL DMEM) na wcześniej przygotowane specjalne szalki do obrazowania posiadające powierzchnię zawierającą szkiełko nakrywkowe, a następnie inkubowano przez 24 godziny w 37°C, 5% CO2. Po tym czasie przygotowano roztwór związku o wzorze 1 (rozpuszczalnik DMSO, którego zawartość nie przekracza 0,3% objętości pożywki hodowlanej gotowej do podania do układu komórkowego) w stężeniu 25 μM w pożywce hodowlanej DMEM, końcowa objętość na szkiełku wynosiła 1 mL. Następnie roztwór został podany komórkom i inkubowany przez 2 godziny w 37°C, celem wniknięcia związku przez błonę komórkową. Po inkubacji komórki przemywano dwukrotnie DMEM (bez FBS i czerwieni fenolowej), a następnie obserwowano przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego po wzbudzeniu filtrem DAPI, co przedstawiono na Fig. 5.
Zgodnie z przedstawionym obrazem, badana pochodna wykazuje jasną, intensywną zieloną fluorescencję w komórkach raka piersi. Umiejscowienie sygnału fluorescencyjnego na obrzeżach obszaru komórki może wskazywać powinowactwo do struktur błoniastych.
Przykład 5
Zastosowanie 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonianu do selektywnego barwienia zmian w błoniastych strukturach komórkowych i diagnostyki chorób nowotworowych płuc. Przykładowa procedura barwienia struktur komórkowych ludzkiego nowotworu nabłonkowego płuca linii A549. Komórki wysiano w ilości 150 tys. (wraz z 1 mL DMEM) na wcześniej przygotowane specjalne szalki do obrazowania posiadające powierzchnię zawierającą szkiełko nakrywkowe, a następnie inkubowano przez 24 godziny w 37°C, 5% CO2. Po tym czasie przygotowano roztwór związku o wzorze 1 (rozpuszczalnik DMSO, którego zawartość nie przekracza 0,3% objętości pożywki hodowlanej gotowej do podania do układu komórkowego) w stężeniu 25 μM w pożywce hodowlanej DMEM, końcowa objętość na szkiełku wynosiła 1 mL. Następnie roztwór został podany komórkom i inkubowany przez 2 godziny w 37°C, celem wniknięcia związku przez błonę komórkową. Po zakończonej inkubacji komórki przepłukano dwukrotnie DMEM (bez FBS i czerwieni fenolowej), a następnie dodano roztwór odpowiedniego markera fluorescencyjnego, tj. barwnika do mitochondriów (przykładowe warunki barwienia: 100 nM, 30 min) lub lizosomów (przykładowe warunki barwienia: 5 μΜ, 1 godzina). Zastosowane fluorofory pozwalają na specyficzne wybarwienie wybranych struktur wewnątrzkomórkowych: lizosomów oraz mitochondriów.
Wobec tego zastosowanie powyższych barwników ułatwia ocenę akumulacji badanego związku we wnętrzu komórek na tle wybarwionych struktur. Po upływie wymaganego czasu inkubacji, dołki przepłukano dwukrotnie DMEM (bez FBS i czerwieni fenolowej), a następnie obserwowano przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego po wzbudzeniu filtrem o odpowiedniej długości fali.
Prezentowany przykład barwienia potwierdza specyficzny mechanizm związku i tendencję do akumulacji w komórkowych strukturach błoniastych, jakie występują w mitochondriach oraz lizosomach. Nałożenie obrazów powstałych w wyniku przeprowadzonego kontrbarwienia 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonianu z barwnikami komercyjnie dostępnymi (dedykowanymi dla poszczególnych organelli komórkowych, tj. mitochondriów lub lizosomów) pozwala jednoznacznie stwierdzić umiejscowienie badanego związku w komórce.

Claims (9)

1. 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian, o postaci chemicznej przedstawionej wzorem 1.
2. Zastosowanie 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonianu przedstawionego wzorem 1 jako barwnika fluorescencyjnego do barwienia biologicznych struktur komórkowych, przy czym stosuje się go, to jest podaje do komórek, w pożywce hodowlanej umożliwiającej przeżycie komórek, po uprzednim rozpuszczeniu w rozpuszczalniku.
3. Zastosowanie według zastrz. 2 znamienne tym, że w roztworze gotowym do podania do komórek, stężenie rozpuszczalnika w pożywce hodowlanej nie przekracza 0,3%.
4. Zastosowanie według zastrz. 2 do 3 znamienne tym, że 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian rozpuszczony jest w dimetylosulfotlenku.
5. Zastosowanie według zastrz. 2 do 4 znamienne tym, że jako pożywkę hodowlaną stosuje się pożywkę Dulbecco's Modified Eagle Medium - DMEM.
6. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrzeżeń 2 do 5 znamienne tym, że 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian stosuje się jako barwnik fluorescencyjny do barwienia błoniastych struktur komórkowych.
7. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrzeżeń 2 do 6 znamienne tym, że 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian stosuje się jako barwnik fluorescencyjny do barwienia błoniastych struktur komórkowych nowotworów nabłonkowych płuc.
8. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrzeżeń 2 do 6 znamienne tym, że 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian stosuje się jako barwnik fluorescencyjny do barwienia błoniastych struktur komórkowych nowotworów mózgu.
9. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrzeżeń 2 do 6 znamienne tym, że 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian stosuje się jako barwnik fluorescencyjny do barwienia błoniastych struktur komórkowych nowotworów piersi.
PL444571A 2023-04-25 2023-04-25 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino- -4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian i jego zastosowanie PL246646B1 (pl)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL444571A PL246646B1 (pl) 2023-04-25 2023-04-25 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino- -4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian i jego zastosowanie

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL444571A PL246646B1 (pl) 2023-04-25 2023-04-25 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino- -4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian i jego zastosowanie

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL444571A1 PL444571A1 (pl) 2024-10-28
PL246646B1 true PL246646B1 (pl) 2025-02-17

Family

ID=93289644

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL444571A PL246646B1 (pl) 2023-04-25 2023-04-25 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino- -4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian i jego zastosowanie

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL246646B1 (pl)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017014601A1 (ko) * 2015-07-23 2017-01-26 서울대학교 산학협력단 인돌리지노[3,2-ｃ]퀴놀린계 형광 프로브
PL233179B1 (pl) * 2016-10-31 2019-09-30 Univ Slaski Nowe zastosowanie pochodnych para-iminostyrylochinoliny

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017014601A1 (ko) * 2015-07-23 2017-01-26 서울대학교 산학협력단 인돌리지노[3,2-ｃ]퀴놀린계 형광 프로브
PL233179B1 (pl) * 2016-10-31 2019-09-30 Univ Slaski Nowe zastosowanie pochodnych para-iminostyrylochinoliny

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BARBARA CZAPLIŃSKA I IN.: "Scientific Reports 2019, 9:15304", „ACID SELECTIVE PRO-DYE FOR CELLULAR COMPARTMENTS" *

Also Published As

Publication number Publication date
PL444571A1 (pl) 2024-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gebremedhin et al. Development of a red-light emission hypoxia-sensitive two-photon fluorescent probe for in vivo nitroreductase imaging
Wang et al. A novel DCM-NBD conjugate fluorescent probe for discrimination of Cys/Hcy from GSH and its bioimaging applications in living cells and animals
Papalia et al. Cell internalization of BODIPY-based fluorescent dyes bearing carbohydrate residues
Wang et al. Discriminating normal and inflammatory models by viscosity changes with a mitochondria-targetable fluorescent probe
Yang et al. A near-infrared fluorescent probe for sulfide detection
CN107459483B (zh) 一种细胞膜靶向h2s荧光探针及其制备方法和应用
Chen et al. Imidazo [1, 5-α] pyridine-based fluorescent probe with a large Stokes shift for specific recognition of sulfite
Henary et al. Near infrared active heptacyanine dyes with unique cancer-imaging and cytotoxic properties
JP7140398B2 (ja) ニトロベンゼン誘導体またはその塩およびそれらの用途
François et al. A functionalized heterobimetallic 99m Tc/Re complex as a potential dual-modality imaging probe: synthesis, photophysical properties, cytotoxicity and cellular imaging investigations
EP3130596B1 (en) Glucose derivative, and cell imaging method and imaging agent using said derivative
KR101472318B1 (ko) 넓은 범위의 pH 측정이 가능한 비율계량적 pH 프로브
Zhang et al. TICT improved NIR emission and lysosome-specific functional dye visualizing viscosity in disease model
Stoean et al. New methylene blue analogues with N-piperidinyl-carbinol units: Synthesis, optical properties and in vitro internalization in human ovarian cancer cells
Lu et al. Log P analyzation-based discovery of GSH activated biotin-tagged fluorescence probe for selective colorectal cancer imaging
Wang et al. A red-emitting fluorescent probe for sensing and imaging biothiols in living cells
Baek et al. A novel chalcone derivative exerts anticancer effects by promoting apoptotic cell death of human pancreatic cancer cells
Iacopini et al. Coumarin-based fluorescent biosensor with large linear range for ratiometric measurement of intracellular pH
WO2014088512A1 (en) Ratiometric fluorescent dye for the detection of glutathione in cell and tissue
EP3943919B1 (en) Fluorescence imaging of lipid droplets in cell and tissue with 3-(benzo[d]thiazol-2-yl)-2h-benzo[g]chromen-2-one derivatives and the corresponding benzo[d]oxazole and 1h-benzo[d]imidazole derivatives
CN109796444B (zh) 一种近红外双荧光探针化合物及制法和应用
An et al. Visualizing mitochondria and mouse intestine with a fluorescent complex of a naphthalene-based dipolar dye and serum albumin
PL246646B1 (pl) 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino- -4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian i jego zastosowanie
CN110386898A (zh) 一种喹啉环类衍生物荧光探针及其制备方法和应用
Karakaş et al. Silver and selenium compounds of benzimidazolium salts containing fluorine substituents: Synthesis, characterization, and evaluation of anticancer potentials