2-[ (E)-2-( 2-metoksyf enylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4- metylobenzeno-1-sulfonian i jego zastosowanie Przedmiotem wynalazku jest 2-[(E)-2-(2- metoksyfenylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-l sulfonian, bedacy pochodna pirydo[2,3-d]pirymidyny z ugrupowaniem tosylowym oraz jego zastosowanie do barwienia biologicznych struktur komórkowych. Zwiazki oparte na szkielecie pirydo[2,3-d]pirymidyny znane sa ze swoich wlasciwosci przeciwnowotworowych oraz hamujacych dzialanie kinaz bialkowych. Wiele danych literaturowych wskazuje zastosowanie zwiazków pirydo[2,3-d]pirymidyny jako inhibitorów kinaz tyrozynowych, takich jak PDGFr, bFGFr oraz c-Src, czy tez bialek mTOR i Akt, które sa odpowiedzialne za sygnalizacje komórkowa, zwiazana z procesami umozliwiajacymi proliferacje, przezycie oraz rozsiew komórek nowotworowych. Zwiazki te sa opisane w dokumentach patentowych: US10618902, US2008194546, WO2007/060404 oraz w szeregu publikacji naukowych: Connolly C., Hamby J., Schroeder M., Barvian M., Lu G., Panek R., Amar A., Shen C., Kraker A., Fry D., Klohs D., Doherty A., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1997, 7(18), 2415-2420; Kraker A., Hartl B., Amar A., Barvian M., Showalter H., Moore C., Biochem. Pharmacol., 2000, 60(7), 885-898; Pares M., Abou-Seri S., Abdel-Aziz H., Abbas S., Youssef M., Eladwy R., Eur. J. Med. Chem., 2014, 83, 155-166. Jednakze zadna z cytowanych prac nie dotyczy mozliwosci wykorzystania zwiazków zawierajacych szkielet pirydo[2,3-d]pirymidyny do barwienia struktur komórkowych. Obrazowanie struktur komórkowych jest przedmiotem zainteresowania wielu osrodków badawczych, poniewaz ich efektywne i rzetelne zobrazowanie jest narzedziem do poznania mechanizmów wielu badan biomedycznych. Jest to istotne w szerokim zakresie, zarówno z punktu widzenia badan podstawowych, badan in vivo, pózniejszych badan klinicznych jak i ich ostatecznego wykorzystania w medycynie. Pomimo dostepnosci wielu zwiazków swiatloczulych, nadal istnieje potrzeba do zapelnienia luk w zaleznosci od potrzeb naukowych, medycznych i diagnostycznych. Charakterystyczne wlasciwosci absorpcyjne, a co za tym idzie PL 444571 A1 2/21równiez i emisyjne pozwalaja na wykorzystanie odpowiednich zródel wzbudzenia w zaleznosci od potrzeby badacza czy lekarza. Precyzyjne umiejscowienie organelli komórkowych pozwala na ocene wielu zjawisk w procesie wczesnych badan, a co najwazniejsze na dokladne ulokowanie zmian chorobowych w przypadku np. chirurgii onkologicznej. Obecnie istnieje wiele komercyjnie dostepnych barwników dedykowanych do poszczególnych struktur w komórce oraz posiadajacych maksimum emisji obejmujace caly zakres swiatla widzialnego. Gromadzenie sie barwników w charakterystycznych miejscach komórki czesto jest wynikiem oddzialywania z elementami cytoszkieletu oraz kwasami nukleinowymi [US9102835, US5075556, US20100184042, US20040156782]. Z punktu widzenia diagnostyki i samej medycyny istotne jest, aby barwnik wiazal sie z miejscem zmienionym chorobowo (np. nowotworem) i pozwalal na precyzyjne wskazanie miejsca przeznaczonego do resekcji wraz z obszarem marginesu [US6944493B2, US9044142B2 oraz Te Velde E.A., Veerman T, Subramaniam V., Ruers T., Eur J Surg Oncol 2010, 36(1), 6-15]. Przykladem zastosowania zwiazków sluzacych do wybarwiania struktur komórkowych jest pochodna para-iminostyrylochinoliny (PL 233179), majaca zastosowanie w diagnostyce chorób nowotworowych, ze szczególnym uwzglednieniem nowotworu jelita grubego. Innym przykladem jest wykorzystanie pochodnych fenotiazyny zawierajacych w swojej strukturze sprzezony pierscien imidazolu do obrazowania komórek nowotworowych (P.438052). Rozwijanie badan nad opracowaniem nowych zwiazków i metod obrazowania komórkowego jest niezwykle istotne z powodu ograniczen obecnie stosowanych barwników [Jensen E.C., Anat Rec 2012, 295, 2031-2036]. Pozadane cechy dobrego barwnika nie ograniczaja sie tylko do korzystnych wlasciwosci spektroskopowych takich jak wysoka kwantowa wydajnosc fluorescencji, duze przesuniecie Stokesa, brak zjawiska fotowybielenia, czyli inaczej stabilnosc fotochemiczna. Równie istotny jest brak cytotoksycznosci (w przypadku barwien przezyciowych) oraz wysokie powinowactwo do okreslonych struktur w komórce. Warto równiez nadmienic, ze wartoscia progowa obrazowania komórkowego jest barwa zielona ze wzgledu na to, iz ponizej tej wartosci absorbuja molekuly zawarte PL 444571 A1 3/21w komórce. Dlatego tez, barwniki emitujace zielona barwe sa najpopularniejsze i najbardziej uniwersalne z punktu widzenia mozliwosci sprzetowych [Swenson ES, Price JG, Brazelton T, Krause DS., Stern Cells 2007, 25, 2593-2600]. Stad obecnie prowadzone badania maja duze wyzwanie, aby sprostac wysokim standardom stawianym zwiazkom majacym zastosowanie do obrazowania organelli komórkowych. Charakterystyczne wlasciwosci barwników sa podyktowane potrzeba uzyskania obrazów mikroskopowych najwyzszej jakosci przy wysokim sygnale fluorescencji w stosunku do szumu, generowanego przez autofluorescencje komórki. Celem twórców niniejszego wynalazku bylo opracowanie nowej pochodnej pirydo[2,3-d]pirymidyny z ugrupowaniem tosylowym o korzystnych wlasciwosciach spektroskopowych oraz wskazanie jej zastosowania jako barwnika fluorescencyjnego do barwienia biologicznych struktur komórkowych lub wykorzystania w diagnostyce chorób nowotworowych. Istote niniejszego wynalazku stanowi 2-[(E)-2-(2- metoksyfenylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-l sulfonian, o postaci chemicznej przedstawionej wzorem 1. Istote wynalazku stanowi takze zastosowanie 2-[(E)-2-(2- metoksyfenylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno- l - sulfonianu przedstawionego wzorem 1 jako barwnika fluorescencyjnego do barwienia biologicznych struktur komórkowych, przy czym stosuje sie go, to jest podaje do komórek, w pozywce hodowlanej umozliwiajacej przezycie komórek, po uprzednim rozpuszczeniu w rozpuszczalniku. Korzystnie, w roztworze gotowym do podania do komórek, stezenie rozpuszczalnika w pozywce hodowlanej nie przekracza 0,3%. Korzystnie, 2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4- ylo-4-metylobenzeno- l-sulfonian stosuje sie rozpuszczony w dimetylosulfotlenku. Korzystnie, jako pozywke hodowlana stosuje sie pozywke Dulbecco's Modified Eagle Medium - DMEM. PL 444571 A1 4/21Korzystnie, 2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4- ylo-4-metylobenzeno- l-sulfonian stosuje sie jako barwnik fluorescencyjny do barwienia bloniastych struktur komórkowych. Korzystnie, 2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4- ylo-4-metylobenzeno- l-sulfonian stosuje sie jako barwnik fluorescencyjny do barwienia bloniastych struktur komórkowych nowotworów nablonkowych pluc. Korzystnie, 2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4- ylo-4-metylobenzeno- l-sulfonian stosuje sie jako barwnik fluorescencyjny do barwienia bloniastych struktur komórkowych nowotworów mózgu. Korzystnie, 2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4- ylo-4-metylobenzeno- l-sulfonian stosuje sie jako barwnik fluorescencyjny do barwienia bloniastych struktur komórkowych nowotworów piersi. Z przedstawionych badan w przykladzie 1 wynika, ze 2-[(E)-2-(2- metoksyfenylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-l sulfonian (oznaczenie kodowe zwiazku: ET-05) posiada dwa pasma absorbcji w zakresie 300-350 nm oraz fluorescencje w zakresie 495 nm oraz 464 nm. Dodatkowo, istotnie korzystne parametry takie jak duze przesuniecie Stokesa (powyzej 110 nm) oraz wysoka intensywnosc fluorescencji umozliwiaja zastosowanie zwiazku jako barwnika fluorescencyjnego do barwienia biologicznych struktur komórkowych. Zwiazek ET-05 moze byc stosowany pod postacia farmaceutycznie dostepnego preparatu, przykladowo jako roztwór rozpuszczony w korzystnym dla komórek rozpuszczalniku. Przy czym, takim rozpuszczalnikiem moze byc DMSO lub etanol. Za bezpieczna dawke rozpuszczalnika uwaza sie nie wiecej niz 0,3% objetosci pozywki hodowlanej gotowej do podania do ukladu komórkowego. Zaleta opisanej pochodnej ET-05 jest brak dlugoterminowej cytotoksycznosci (72 godziny) wobec komórek raka pluca, jak i znikoma cytotoksycznosc wzgledem kilku linii komórek nowotworowych, tj. nowotworu mózgu oraz piersi. Przykladowo, opisana pochodna ET-05 po 2-godzinnej inkubacji w srodowisku komórkowym moze byc zastosowana do PL 444571 A1 /21obserwacji nowotworów pluc, piersi oraz mózgu. Intensywna zielona fluorescencja zwiazku pozwala na uzyskanie wysokiej jakosci obrazu (przy zachowaniu dobrego stosunku sygnalu do tla), który moze byc rejestrowany przy uzyciu kamery CCD. Pochodna ET-05 dobrze wiaze sie z elementami komórkowymi, na co wskazuje jej specyficzny mechanizm akumulacji w obszarach bloniastych komórek, jakie wystepuja w mitochondriach oraz lizosomach. Pochodna wedlug wynalazku mozna otrzymac z wykorzystaniem metod znanych ze stanu techniki, na przyklad z wykorzystaniem procedury syntezy, opisanej w publikacjach: Mularski J, Malarz K, Pacholczyk M, Musiol R., Eur J Med Chem. 2019, 163, 610-625 oraz Malarz K, Mularski J, Kuczak M, Mrozek-Wilczkiewicz A, Musiol R., Cancers 2021, 13, 1790 z modyfikacjami. Ponizej przedstawiono rozwiazania wedlug wynalazku, które maja charakter przykladowy. W przykladzie I przedstawiono postac chemiczna 2-[(E)- 2-(2-metoksyfenylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-l sulfonianu ( oznaczenie kodowe zwiazku: ET-05) oraz przykladowy sposób jego otrzymywania. W tym przykladzie przedstawiono takze wlasciwosci pochodnej ET-05, które sa istotne dla jej zastosowania, przy czym wskazano wlasciwosci spektroskopowe omawianej pochodnej wraz z przykladowymi widmami absorpcji i emisji oraz cytotoksycznosc badanej pochodnej ET-05 wobec róznych typów komórek nowotworowych. W przykladach 2-5 przedstawiono mozliwosc zastosowania 2-[(E)-2-(2- metoksyfenylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-l sulfonianu w barwieniu biologicznych struktur komórkowych. Przyklad 1 2-[ (E)-2-(2-metoksyfen y lo )eteny lo ]pirydo [2,3-d ]pirymidino-4-y lo-4- mety lobenzeno- l -sulfonian (ET-05) o postaci chemicznej przedstawionej wzorem 1. Zwiazek wedlug wynalazku, tj. 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3- d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-l-sulfonian otrzymano wedlug PL 444571 A1 6/21przykladowej metody, która polega na tym, ze w naczyniu umieszczono (0,2 mmol, 56 mg) bezposredni prekursor zwiazku ET-05: [2-[(E)-2-(2- metoksyfen y Io )eteny Io ]pirydo [2,3-d ]pirymid yno-4(3 H)-on. Dodano chlorek metylenu - CH2Ch (3 mL), DIPEA - N,N- diizopropyloetyloamine (0,3 mmol; 39 mg), TsCl - chlorek 4-metylobenzenosulfonowy (0,3 mmol, 57 mg) oraz DMAP - 4-dimetyloaminopirydyne (0,02 mmol; 3 mg). Calosc mieszano w atmosferze gazu obojetnego (w temperaturze pokojowej 20-22°C) do zaniku sygnalu pochodzacego od prekursora. Nastepnie dokonano identyfikacji sygnalu za pomoca cienkiej warstwy TLC (CH2Ch:heksan - 1: 1). Zwiazek wydzielano poprzez rozdzial chromatograficzny stosujac kartridz wypelniony zelem krzemionkowym (40- 63 µm, 60 A). 1 H NMR (500 MHz, CD2Ch) 8 9,19 (dd, J = 4.4, 2.0 Hz, lH), 8.52 (dd, J = 8,2, 2,0 Hz, lH), 8,42 (d, J = 16,1 Hz, lH), 8,29 - 8,18 (m, 2H), 7,74 (dd, J = 7,5, 1,6 Hz, lH), 7,56 (dd, J = 8,2, 4,4 Hz, lH), 7,48 - 7,40 (m, 3H), 7,36 (d, J = 16,1 Hz, lH), 7,17 - 7,04 (m, 2H), 4,07 (s, 3H). Natomiast bezposredni prekursor ET-05, to jest [2-[(E)-2-(2- metoksyfenylo )eteny Io ]pirydo[2,3-d]pirymidyno-4(3H)-on otrzymano uprzednio w wyniku przykladowej trzyetapowej syntezy: 1) W pierwszym kroku wykonano reakcje kwasu 2-aminonikotynowego z nadmiarem stechiometrycznym bezwodnika octowego (50 ekwiwalentów molowych), w temperaturze 80°C w reaktorze mikrofalowym - o mocy 80 W. Wynikiem reakcji byl 2-metylo-4H-pirydo[2,3-d][l,3]oksazyn-4-on. 1 H NMR (500 MHz, DMSO) 8 8,96 (dd, J = 4,7, 2,0 Hz, lH), 8.50 (dd, J = 7,8, 2,0 Hz, lH), 7,61 (dd, J = 7,8, 4,7 Hz, lH), 2,45 (s, 4H); Surowy produkt wydzielano poprzez filtracje. 2) W drugim etapie 2-metylo-4H-pirydo[2,3-d][l,3]oksazyn-4-on (8 g) wymieszano z 40 mL wodnego roztworu amoniaku (32%) w temperaturze pokojowej (20-22°C) do calkowitego rozpuszczenia sie osadu. Nasycanie roztworu reakcyjnego dwutlenkiem wegla powodowalo precypitacje produktu 2-metylopirydo[2,3-d]pirymidin-4(3H)-onu, który zbierano na lejku filtracyjnym i przemywano 2-propanolem- otrzymujac chinazolon z wydajnoscia 40%. Reakcja PL 444571 A1 7/21zostala sprawdzona w skali 50 mmol; 1 H NMR (500 MHz, DMSO) 8 12,48 (s, lH), 8,90 (dd, J = 4,6, 2,1 Hz, lH), 8,45 (dd, J = 7,8, 2,1 Hz, lH), 7,48 (dd, J = 7,8, 4,6 Hz, lH), 2,40 (s, 3H); 3) W ostatnim etapie przeprowadzono reakcje 2-metylopirydo[2,3-d]pirymidin- 4(3H)-onu z aldehydem 2-metoksysalicylowym w kwasie octowym (przykladowo stosowano taka ilosc, aby nie przekroczyc 2 M stezenia substratu). Reakcje mozna prowadzic stosujac reaktor mikrofalowy (130°C, 80 W, 120 minut) lub na lazni olejowej (130°C, 12 h). Produkt krystalizowano z medium reakcyjnego z wydajnoscia 45%. 1 H NMR (500 MHz, DMSO) 8 12,62 (s, lH), 8,93 (dd, J = 4,5, 2,1 Hz, IH), 8,46 (dd, J = 7,8, 2,1 Hz, IH), 8,29 (d, J = 16,0 Hz, IH), 7.64 (dd, J = 7,7, 1,7 Hz, IH), 7.47 (dd, J = 7,8, 4,6 Hz, IH), 7.44 (ddd, J = 8,8, 7,4, 1,7 Hz, IH), 7,16 - 7,09 (m, 2H), 7,06 (appt, J = 7,5, IH), 3,93 (s, 3H). Wlasciwosci spektroskopowe 2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )etenylo ]pirydo[2,3- d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonianu. W tabeli nr I przedstawiono zbiór najwazniej szych parametrów spektroskopowych zwiazku 2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )eteny Io ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4- metylobenzeno- l -sulfonianu rozpuszczonego w DMSO jako najkorzystniejszym rozpuszczalniku, które potwierdzaja przydatnosc wskazanej pochodnej z przykladu 1 do barwienia biologicznych struktur komórkowych. Zgodnie z przedstawionymi danymi mozna zaobserwowac, ze badana pochodna ET-05 wykazuje dwa pasma absorbcji przy dlugosci fali 307 nm oraz 358 nm oraz maksimum fluorescencji przy dlugosci fali 495 nm. Pochodna prezentuje takze istotnie wysoka intensywnosc fluorescencji oraz duze przesuniecie Stokesa, które wynosi 137 nm. W skazane parametry spektroskopowe sa szczególnie korzystne i istotne w zakresie uzyskania wysokiego sygnalu fluorescencji w stosunku do tla, co jest gwarantem otrzymania najwyzszej jakosci obrazów mikroskopowych. Z kolei, te cechy sa szczególnie wazne dla wskazanego zastosowania wedlug niniejszego wynalazku. PL 444571 A1 8/21Przykladowe widma absorpcji emisji 2-[(E)-2-(2- metoksyf enylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1- sulfonianu. Zaprezentowane w formie wizualnej widma absorpcji dla pochodnej ET-05 w DMSO (przedstawione na Fig. 1) oraz widma emisji (wzbudzenie 358 nm) dla pochodnej ET-05 w DMSO (przedstawione na Fig. 2) potwierdzaja korzystne wlasnosci spektroskopowe badanej pochodnej ET-05. N a wszystkich prezentowanych widmach widoczna jest zaleznosc intensywnosci polozenia pasm absorpcji oraz fluorescencji od badanego stezenia zwiazku. Co wazne, zastosowanie zwiazku ET-05 w niskim stezeniu: 6,25*10/\-6 M nadal potwierdza wysoka intensywnosc fluorescencji (powyzej 2000). W zwiazku z tym, tak korzystne parametry spektroskopowe zakwalifikowaly zwiazek do dalszych badan komórkowych. Wlasciwosci spektroskopowe 2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )etenylo ]pirydo[2,3- d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian u od stosowanego rozpuszczalnika. w zaleznosci W tabeli nr 2 przedstawiono zmiany wlasciwosci spektroskopowych pochodnej ET-05 w zaleznosci od stosowanego rozpuszczalnika (polarnosci). Rozpuszczalniki uporzadkowane wg indeksu polarnosci (klasyfikacja Burdick & Jackson). Zgodnie z przedstawionymi danymi, pochodna ET-05 prezentuje szczególnie korzystne parametry spektroskopowe w rozpuszczalniku polarnym, takim jak DMSO. Rozpuszczalnik ten jest uwazany za najkorzystniejszy z uwagi na rozpuszczenie substancji przeznaczonej do obrazowania materialu zywego [Nguyen, S., Nguyen, H., Truong, K., Biomed. Res. Ther. 2020, 7(7), 3855-3859 oraz Jamalzadeh, L., Ghafoori, H., Sariri, R., Rabuti, H., Nasirzade, J., Hasani, H., & Aghamaali, M. R., Avicenna J Med Biochem, 2016, 4(1), 10-33453]. Nalezy jednak zwrócic uwage, aby bezpieczna dawka rozpuszczalnika nie przekraczala 0,3% objetosci pozywki hodowlanej gotowej do podania do ukladu komórkowego. PL 444571 A1 9/21Podsumowujac, przedstawione korzystne parametry spektroskopowe zakwalifikowaly zwiazek ET-05 do dalszych badan komórkowych nad jego zastosowaniem. Cytotoksycznosci badanego 2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )etenylo ]pirydo[2,3- d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonianu wobec róznych typów komórek nowotworowych. Aktywnosc antyproliferacyjna zwiazku ET-05 oznaczono wobec ludzkich komórek nowotworów mózgu (linie komórkowe: U251, U87, LN-229), piersi (linia komórkowa MCF-7) oraz pluca (linia komórkowa A549). Komórki wysiewano na 96-dolkowa plytke w ilosci 5 tysiecy na dolek (po 100 µL/dolek) i inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C i 5% CO2. Po tym czasie przygotowano i podawano roztwory zwiazku ET-05 (rozpuszczonego w minimalnej ilosci DMSO, tj. w taki sposób aby zawartosc DMSO nie przekraczala 0,3% objetosci pozywki hodowlanej gotowej do podania do ukladu komórkowego) w stezeniach umozliwiajacych wyznaczenie wartosci ICso. Przykladowa aplikacja zwiazku: rozpuszczenie zwiazku w DMSO celem przygotowania roztworów o nastepujacych stezeniach: 25 µM, 12,5 µM, 5 µM, 2,5 µM, 1 µM, 0,5 µM, O, 1 µM w pozywce hodowlanej Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), koncowa objetosc w dolkach wynosila 200 µL. Nastepnie roztwory zostaly podane komórkom i inkubowane 72 godziny. Po tym czasie przezywalnosc komórek zostala okreslona za pomoca standardowego testu MTS. Aktywnosc antyproliferacyjna 2-[(E)-2-(2- metoksyf enylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1- sulfonianu w postaci wyliczonych wartosci ICso przedstawiono w tabeli 3. Zgodnie z przedstawionymi wynikami, dla badanego 2-[(E)-2-(2- metoksyfenylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-l sulfonianu nie obserwowano cytotoksycznosci wobec nowotworu nablonkowego pluc. Dodatkowo, prezentowane dane wskazuja na nieznaczna cytotoksycznosc pochodnej o wzorze 1 wobec kilku komórek nowotworowych mózgu oraz piersi. Jednakze, warte podkreslenia jest to, ze wyniki te prezentuja nieznaczna cytotoksycznosc zwiazku w wydluzonym (do 72 godzin) czasie inkubacji PL 444571 A1 /21w stosunku do czasu eksperymentu barwienia, który wynosil 2 godziny. W zwiazku z powyzszym, zachowanie zwiazku w srodowisku komórkowym uwaza sie za korzystne i wartosciowe wzgledem zastosowania opisanego w niniejszym wynalazku. Zwiazki moga zostac aplikowane w stezeniu pozwalajacym na osiagniecie wysokiej fluorescencji. Przyklad 2 Zastosowanie 2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )eteny Io ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo- 4-metylobenzeno- l -sulfonianu do barwienia bloniastych struktur komórkowych nowotworów nablonkowych pluc. Przykladowa procedura barwienia komórek ludzkiego nowotworu nablonkowego pluca linii A549. Komórki wysiano w ilosci 150 tys. (wraz z 1 mL DMEM) na wczesniej przygotowane specjalne szalki do obrazowania posiadajace powierzchnie zawierajaca szkielko nakrywkowe, a nastepnie inkubowano przez 24 godziny w 37°C, 5% CO2. Po tym czasie przygotowano roztwór zwiazku (rozpuszczalnik DMSO, którego zawartosc nie przekracza 0,3% objetosci pozywki hodowlanej gotowej do podania do ukladu komórkowego) w stezeniu 25 µM w pozywce hodowlanej Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), koncowa objetosc na szkielku wynosila 1 mL. Nastepnie roztwór zostal podany komórkom i inkubowany przez 2 godziny w 37°C, celem wnikniecia zwiazku przez blone komórkowa. Po inkubacji komórki przemywano dwukrotnie DMEM (bez FBS i czerwieni fenolowej), a nastepnie obserwowano przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego po wzbudzeniu filtrem DAPI, co przedstawiono na Fig. 3. Zgodnie z przedstawionym obrazem, badana pochodna wykazuje jasna, intensywna zielona fluorescencje w komórkach raka pluca. Umiejscowienie sygnalu fluorescencyjnego na obszarze komórki moze wskazywac powinowactwo do struktur bloniastych. PL 444571 A1 11/21Przyklad 3 Zastosowanie 2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )eteny Io ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo- 4-metylobenzeno- l -sulfonianu do barwienia bloniastych struktur komórkowych nowotworów mózgu. Przykladowa procedura barwienia komórek ludzkiego nowotworu mózgu linii U251, U87 lub LN-229. Komórki wysiano w ilosci 150 tys. (wraz z I mL DMEM) na wczesniej przygotowane specjalne szalki do obrazowania posiadajace powierzchnie zawierajaca szkielko nakrywkowe, a nastepnie inkubowano przez 24 godziny w 37°C, 5% CO2. Po tym czasie przygotowano roztwór zwiazku (rozpuszczalnik DMSO, którego zawartosc nie przekracza 0,3% objetosci pozywki hodowlanej gotowej do podania do ukladu komórkowego) w stezeniu 25 µM w pozywce hodowlanej DMEM, koncowa objetosc na szkielku wynosila 1 mL. Nastepnie roztwór zostal podany komórkom i inkubowany przez 2 godziny w 37°C, celem wnikniecia zwiazku przez blone komórkowa. Po inkubacji komórki przemywano dwukrotnie DMEM (bez FBS i czerwieni fenolowej), a nastepnie obserwowano przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego po wzbudzeniu filtrem DAPI, co przedstawiono na Fig. 4. Przedstawiony obraz, wyraznie wskazuje na akumulacje pochodnej ET-05 we wnetrzu komórek nowotworów mózgu, przykladowo linii U25 l. Zwiazek charakteryzuje sie intensywna zielona fluorescencje, która moze wystepowac w obszarach bloniastych komórek. Przyklad 4 Zastosowanie 2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )eteny Io ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo- 4-metylobenzeno- l -sulfonianu do barwienia bloniastych struktur komórkowych nowotworów piersi. Przykladowa procedura barwienia komórek ludzkiego nowotworu piersi linii MCF-7. Komórki wysiano w ilosci 150 tys. (wraz z I mL DMEM) na wczesniej przygotowane specjalne szalki do obrazowania posiadajace powierzchnie PL 444571 A1 12/21zawierajaca szkielko nakrywkowe, a nastepnie inkubowano przez 24 godziny w 37°C, 5% CO2. Po tym czasie przygotowano roztwór zwiazku o wzorze 1 (rozpuszczalnik DMSO, którego zawartosc nie przekracza 0,3% objetosci pozywki hodowlanej gotowej do podania do ukladu komórkowego) w stezeniu µM w pozywce hodowlanej DMEM, koncowa objetosc na szkielku wynosila I mL. Nastepnie roztwór zostal podany komórkom i inkubowany przez 2 godziny w 37°C, celem wnikniecia zwiazku przez blone komórkowa. Po inkubacji komórki przemywano dwukrotnie DMEM (bez FBS i czerwieni fenolowej), a nastepnie obserwowano przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego po wzbudzeniu filtrem DAPI, co przedstawiono na Fig.5. Zgodnie z przedstawionym obrazem, badana pochodna wykazuje jasna, intensywna zielona fluorescencje w komórkach raka piersi. Umiejscowienie sygnalu fluorescencyjnego na obrzezach obszarzu komórki moze wskazywac powinowactwo do struktur bloniastych. Przyklad 5 Zastosowanie 2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo- 4-metylobenzeno- l -sulfonianu do selektywnego barwienia zmian w bloniastych strukturach komórkowych i diagnostyki chorób nowotworowych pluc. Przykladowa procedura barwienia struktur komórkowych ludzkiego nowotworu nablonkowego pluca linii A549. Komórki wysiano w ilosci 150 tys. (wraz z I mL DMEM) na wczesniej przygotowane specjalne szalki do obrazowania posiadajace powierzchnie zawierajaca szkielko nakrywkowe, a nastepnie inkubowano przez 24 godziny w 37°C, 5% CO2. Po tym czasie przygotowano roztwór zwiazku o wzorze 1 (rozpuszczalnik DMSO, którego zawartosc nie przekracza 0,3% objetosci pozywki hodowlanej gotowej do podania do ukladu komórkowego) w stezeniu 25 µM w pozywce hodowlanej DMEM, koncowa objetosc na szkielku wynosila I mL. Nastepnie roztwór zostal podany komórkom i inkubowany przez 2 godziny w 37°C, celem wnikniecia zwiazku przez blone komórkowa. Po zakonczonej inkubacji komórki przeplukano dwukrotnie DMEM (bez FBS i czerwieni fenolowej), a nastepnie dodano roztwór odpowiedniego markera PL 444571 A1 13/21fluorescencyjnego, tj. barwnika do mitochondriów (przykladowe warunki barwienia: 100 nM, 30 min) lub lizosomów (przykladowe warunki barwienia: µM, 1 godzina). Zastosowane fluorofory pozwalaja na specyficzne wybarwienie wybranych struktur wewnatrzkomórkowych: lizosomów oraz mitochondriów. Wobec tego zastosowanie powyzszych barwników ulatwia ocene akumulacji badanego zwiazku we wnetrzu komórek na tle wybarwionych struktur. Po uplywie wymaganego czasu inkubacji, dolki przeplukano dwukrotnie DMEM (bez FBS i czerwieni fenolowej), a nastepnie obserwowano przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego po wzbudzeniu filtrem o odpowiedniej dlugosci fali. Prezentowany przyklad barwienia potwierdza specyficzny mechanizm zwiazku i tendencje do akumulacji w komórkowych strukturach bloniastych, jakie wystepuja w mitochondriach oraz lizosomach. Nalozenie obrazów powstalych w wyniku przeprowadzonego kontrbarwienia 2-[(E)-2-(2- metoksyfenylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno- l - sulfonianu z barwnikami komercyjnie dostepnymi (dedykowanymi dla poszczególnych organelli komórkowych, tj. mitochondriów lub lizosomów) pozwalaj ednoznacznie stwierdzic umiejscowienie badanego zwiazku w komórce. PL 444571 A1 14/21Zastrzezenia patentowe 1. 2-[ (E)-2-(2-metoksyfen y Io )eteny Io ]pirydo [2,3-d ]pirymidino-4-y lo-4- mety lo benzeno- l -sulfonian, o postaci chemicznej przedstawionej wzorem 1. 2. Zastosowanie 2-[ (E)-2-(2-metoksyfen y Io )eten ylo] pirydo [2,3- d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-l-sulfonianu przedstawionego wzorem 1 jako barwnika fluorescencyjnego do barwienia biologicznych struktur komórkowych, przy czym stosuje sie go, to jest podaje do komórek, w pozywce hodowlanej umozliwiajacej przezycie komórek, po uprzednim rozpuszczeniu w rozpuszczalniku. 3. Zastosowanie wedlug zastrz. 2 znamienne tym, ze w roztworze gotowym do podania do komórek, stezenie rozpuszczalnika w pozywce hodowlanej nie przekracza 0,3%. 4. Zastosowanie wedlug zastrz. 2 do 3 znamienne tym, ze 2-[(E)-2-(2- metoksyfenylo )eteny Io ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno- l -sulfonian rozpuszczony jest w dimetylosulfotlenku. . Zastosowanie wedlug zastrz. 2 do 4 znamienne tym, ze jako pozywke hodowlana stosuje sie pozywke Dulbecco's Modified Eagle Medium -DMEM. 6. Zastosowanie wedlug któregokolwiek z zastrzezen 2 do 5 znamienne tym, ze 2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )eteny Io ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4- metylobenzeno- l -sulfonian stosuje sie jako barwnik fluorescencyjny do barwienia bloniastych struktur komórkowych. 7. Zastosowanie wedlug któregokolwiek z zastrzezen 2 do 6 znamienne tym, ze 2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )eteny Io ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4- metylobenzeno- l -sulfonian stosuje sie jako barwnik fluorescencyjny do barwienia bloniastych struktur komórkowych nowotworów nablonkowych pluc. 8. Zastosowanie wedlug któregokolwiek z zastrzezen 2 do 6 znamienne tym, ze 2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )eteny Io ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4- PL 444571 A1 /21metylobenzeno-1-sulfonian stosuje sie jako barwnik fluorescencyjny do barwienia bloniastych struktur komórkowych nowotworów mózgu. 9. Zastosowanie wedlug któregokolwiek z zastrzezen 2 do 6 znamienne tym, ze 2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )eteny Io ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4- metylobenzeno- l -sulfonian stosuje sie jako barwnik fluorescencyjny do barwienia bloniastych struktur komórkowych nowotworów piersi. PL 444571 A1 16/211,4 1,2 ~ 1,0 ~ 6 ro 0,8 ·u C: (lJ -8 0,6 Si .o < 0,4 Wzór 1 *10A-5M 2,5*101\-5 M , 1,25*1QA-5M 6,25*101\.-6 M 300 320 340 360 380 400 420 Dlugoscfali (nm) Fig, 1. PL 444571 A1 17/218000 - 3: o 'i;;-6000 .E (I) •(.) •Cl) g 4000 ~ Cl) C (I) 2000 400 500 600 Dlugosc fali (nm) Fig. 2. Fig. 3 *10A-5M 2,5*10"·5 M 1,25*10"-5 M 6,25*10A-6 M 700 PL 444571 A1 18/21Fig. 4 Fig. 5 PL 444571 A1 19/21Tabela 1. Polozenie Zakres Maksimum Przesuniecie pasm fluorescencji Intensywnosc Zwiazek absorpcji Stokesa absorpcji fluorescencji [nm] i\max [nm] [nm] i\ [nm] ET-05 280-430 307;358 495 8030 137 Tabela 2. Polozenie Maksimum Przesuniecie pasm fluorescencji Intensywnosc Zwiazek Rozpuszczalnik Stokesa absorpcji fluorescencji A.max [nm] [nm] ;\ [nm] DMSO 307;358 495 8030 137 metanol 304;358 499 1880 141 ET-05 chloroform 305;358 440 5872 82 toluen 303;353 423 3700 70 Tabela 3. Zwiazek Aktywnosc antyproliferacyjna - ICso [µM] U251 U87 LN-229 MCF-7 A549 ET-05 6,006 ± 0,760 5,134 ± 0,743 5,632 ± 0,925 10,21 ± 1,24 25 PL 444571 A1 /21al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt. 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 OS SS I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI DO ZGLOSZENIA NR P.444571 Klasyfikacja zgloszenia: C07D 471/04, G0lN 33/52, C09K 11/06 Podklasy w których prowadzono poszukiwania: C07D GO IN C09K Bazy komputerowe w których prowadzono poszukiwania: EPODOC WPI Caplus Registry bazy UPRP Google Kategoria dokumentu A A A Dokumenty - z podana identyfikacja PL233179 Bl (UNIWERSYTET SLASKI W KATOWICACH, PL) 30-09-2019 Barbara Czaplinska i in., ,,Acid selective pro-dye for cellular compartments", Scientific Reports 2019, 9:15304, WO2017014601 Al (SEOUL NAT UNIV R & DB FOUND, KR; I IN.) 26-01- 2017 D Dalszy ciag wykazu dokumentów na nastepnej stronie A- dokument okreslajacy ogólny stan techniki, który nie jest uwazany za posiadajacy szczególne znaczenie, E - dokument stanowiacy wczesniejsze zgloszenie lub patent, ale opublikowany w lub po dacie zgloszenia, Odniesienie do zastrz. 1-9 1-9 1-9 L - dokument, który moze poddawac w watpliwosc zastrzegane pierwszenstwo(-wa), lub przytoczony w celu ustalenia daty publikacji innego cytowanego dokumentu lub z innego szczególnego powodu, O - dokument odnoszacy sie do ujawnienia ustnego przez zastosowanie, wystawienie lub ujawnienie w inny sposób, P - dokument opublikowany przed data zgloszenia, ale pózniej niz zastrzegana data pierwszenstwa, T - dokument pózniejszy, opublikowany po dacie zgloszenia lub w dacie pierwszenstwa i niebedacy w konflikcie ze zgloszeniem, ale cytowany w celu zrozumienia zasad lub teorii lezacych u podstaw wynalazku, X - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za nowy lub nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument brany jest pod uwage samodzielnie, Y - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument zostanie polaczony z jednym lub kilkoma tego typu dokumentami, a takie polaczenie bedzie oczywiste dla znawcy, & - dokument nalezacy do tej samej rodziny patentowej. Sprawozdanie wykonali-a: Wioleta Swierczynska Naczelnik Wydzialu Data: .01.2024 Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o zastrz. z dnia 25.04.2023 r. Podpis: /podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym/ Pismo wydane w formie dokumentu elektronicznego PL 444571 A1 21/21 PL