PL247262B1

PL247262B1 - Sposób wytwarzania 7-O-β-D-glukozydu 5-hydroksy-8-metoksyflawonu

Info

Publication number: PL247262B1
Application number: PL438508A
Authority: PL
Inventors: Tomasz Tronina; Monika Mrozowska; Jarosław Popłoński; Sandra Sordon; Mateusz Łużny; Tomasz Janeczko; Ewa Huszcza; Agnieszka Bartmańska
Original assignee: Wrocław University Of Environmental And Life Sciences
Priority date: 2021-07-16
Filing date: 2021-07-16
Publication date: 2025-06-02
Also published as: PL438508A1

Abstract

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania 7-O-β-D-glukozydu 5-hydroksy-8-metoksyflawonu o wzorze 2. Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Beauveria Bassiana AM278, następuje regioselektywna O-glikozylacja w substracie. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 7-O-e-D-glukozydu 5-hydroksy-8-metoksyflawonu (7-O-^-D-glukozydu wogoniny).

Metoda, według wynalazku może znaleźć zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym jako lek przeciwzapalny, przeciwwirusowy i przeciwnowotworowy.

Substratem do wytwarzania 7-O-e-D-glukozydu 5-hydroksy-8-metoksyflawonu jest wogonina (5,7-dihydroksy-8-metoksyflawon) izolowany m.in. z korzenia tarczycy bajkalskiej Scutteralia baicalensis. Wogonina wykazuje szereg właściwości biologicznych w tym: przeciwzapalne (Li-Weber, M., New therapeutic aspects of flavones: the anticancer properties of Scutellaria and its main active constituents Wogonin, Baicalein and Baicalin. Cancer treatment reviews 2009, 35, (1), 57-68.), przeciwwirusowe (Chu, Y.; Lv, X.; Zhang, L.; Fu, X.; Song, S.; Su, A.; Chen, D.; Xu, L.; Wang, Y.; Wu, Z., Wogonin inhibits in vitro herpes simplex virus type 1 and 2 infection by modulating cellular NF-kB and MAPK pathways. BMC microbiology 2020, 20, (1), 1-11.) oraz przeciwnowotworowe (Wang, W.; Guo, Q.-L; You, Q.-D.; Zhang, K.; Yang, Y.; Yu, J.; Liu, W.; Zhao, L.; Gu, H.-Y.; Hu, Y., The anticancer activities of wogonin in murine sarcoma S180 both in vitro and in vivo. Biological and Pharmaceutical Bulletin 2006, 29, (6), 1132-1137.; Li-Weber, M., New therapeutic aspects of flavones: the anticancer properties of Scutellaria and its main active constituents Wogonin, Baicalein and Baicalin. Cancer treatment reviews 2009, 35, (1), 57-68. Aktywność biologiczna wogoniny może być jednak ograniczona, ze względu na niską biodostępność tego flawonu, związaną z jego słabą rozpuszczalnością w wodzie.

Jednym ze sposobów zwiększenia rozpuszczalności w wodzie, a co za tym idzie, biodostępności, jest sprzęganie związku bioaktywnego z polarnymi cząsteczkami takimi jak cukry.

Znany jest sposób otrzymywania 7-O-e-D-glukozydu 5-hydroksy-8-metoksyflawonu - pochodnej wogoniny sprzężonej z cząsteczką β-D-glukopiranozy, z wykorzystaniem bakterii Escherichia coli z wklonowanym genem 7-O-glukozylotransferazy pochodzącym z kultur korzeni włośnikowatych tarczycy bajkalskiej Scuttelaria baicalensis Georgi (Hirotani, M.; Kuroda, R.; Suzuki, H.; Yoshikawa, T., Cloning and expression of UDP- glucose: flavonoid 7-O-glucosyltransferase from hairy root cultures of Scutellaria baicalensis. Planta 2000, 210, (6), 1006-1013.).

Istota wynalazku polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria Bassiana AM278. Po upływie, co najmniej 48 godzin do hodowli wprowadza się substrat, jakim jest 5,7-dihydroksy-8-metoksyflawon (wogonina) o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 15 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 3 dni. Kolejno produkt z hodowli ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.

W wyniku regioselektywnej glikozylacji grupy hydroksylowej w pozycji C7 substratu jakim jest wogonina o wzorze 1, aromatycznego otrzymuje się 7-O-e-D-glukozydu 5-hydroksy-8-metoksyflawonu o wzorze 2, a reakcję prowadzi się w wodnej kulturze szczepu Beauveria Bassiana AM278.

Korzystnie jest, gdy rozpuszczalnikiem mieszającym się z wodą jest dimetylosulfotlenek i/lub metanol, i/lub aceton.

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 20-25 stopni Celsjusza.

Korzystnie jest również, gdy rozpuszczalnikiem niemieszającym się z wodą jest octan etylu albo eter dietylowy.

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 7-O-e-D-glukozyd 5-hydroksy-8-metoksyflawonu o wzorze 2, w kulturze całych niemodyfikowanych genetycznie komórek, w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu.

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

Przykład. Do kolby Erlenmajera o pojemności 300 cm³, w której znajduje się 100 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 1 g aminobaku i 3 g glukozy, wprowadza się szczep Beauveria Bassiana AM278. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje się 20 mg 5,7-dihydroksy-8-metoksyflawon (wogonina) o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm³ dimetylosulfotlenku (DMSO). Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 8 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie, używając jako eluentu mieszaniny chloroform i metanol 10:1.

Na tej drodze otrzymuje się 7-O-e-D-glukozyd 5-hydroksy-8-metoksyflawon z wydajnością izolowaną 1%.

¹H NMR 600 MHz, DMSO-ds, δ [ppm]: 12,53 (1H, s, 5-OH), 8,09 (2H, m, H-2’,6’), 7,63 (3H, m, H-3’,4’,5’), 7,06 (1H, s, H-3), 6,68 (1H, s, H-6), 5,08 (1H, d, J = 7.1 Hz, H-1”), 3,90 (3H, s, C8-O-CH3), 3,71 (1H, m, H-6”a), 3,47 (1H, m, H-6”b), 3,33 (1H, m, nałożone sygnały od H-2” na H-3”), 3,33 (1H, m, nałożone sygnały od H-3” na H-2”), 3,19 (1H, m, H-4”).

¹³C NMR 150 MHz, DMSO-ds, δ [ppm]: 182,4 (C-4), 163,6 (C-2), 156,9 (C-7), 156,1 (C-9), 149,4 (C-5), 132,2 (C-4’), 129,7 (C-8), 129,3 (C-3’,C-5’), 126,4 (C-2’,C-6’), 123,3 (C-1’), 105,3 (C-10), 105,2 (C-3), 100,3 (C-1”), 98,9 (C-6), 77,3 (C-5”), 76,6 (C-3”), 73,3 (C-2”), 69,6 (C-4”), 61,4 (C8-O-CH3), 60,6 (C-6”).

Claims

1. Sposób wytwarzania 7-O-e-D-glukozydu 5-hydroksy-8-metoksyflawonu, znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria Bassiana AM278, następnie po upływie co najmniej 48 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 5,7-dihydroksy-8-metoksyflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 15 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 5 dni, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rozpuszczalnikiem mieszającym się z wodą jest dimetylosulfotlenek i/lub metanol, i/lub aceton.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 20-25 stopni Celsjusza.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rozpuszczalnikiem niemieszającym się z wodą jest octan etylu albo eter dietylowy.