PL247558B1

PL247558B1 - Wielofunkcyjny, hydrożelowy materiał hybrydowy, w szczególności do stosowania w leczeniu ubytków kostnych oraz sposób jego otrzymywania

Info

Publication number: PL247558B1
Application number: PL441996A
Authority: PL
Inventors: Joanna Lewandowska-Łańcucka; Joanna Klara
Original assignee: Univ Jagiellonski
Priority date: 2022-08-11
Filing date: 2022-08-11
Publication date: 2025-07-28
Also published as: EP4324492A1; EP4324492B1; PL441996A1

Abstract

W zgłoszeniu ujawniono wielofunkcyjny, ulepszony hydrożelowy materiał hybrydowy oraz sposób jego otrzymywania i zastosowanie w leczeniu lub profilaktyce ubytków tkanki kostnej.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest wielofunkcyjny, ulepszony materiał hybrydowy o potencjale terapeutycznym, sposób otrzymywania takich materiałów hydrożelowych oraz ich zastosowanie w medycynie regeneracyjnej, w szczególności w leczeniu ubytków kostnych spowodowanych osteoporozą.

Osteoporoza jest jedną z najbardziej postępujących, ogólnoustrojowych i metabolicznych chorób kości, charakteryzującą się zmniejszeniem masy kostnej i mikrostrukturalnymi uszkodzeniami tkanki kostnej. Ze względu na brak równowagi pomiędzy procesami tworzenia i wchłaniania kości, choroba ta zwiększa predyspozycje do złamań o podłożu osteoporotycznym nawet po niewielkich urazach, a tym samym znacznie pogarsza jakość życia pacjentów. Pomimo postępującego rozpadu masy kostnej, choroba ta długo nie daje o sobie znać, a pierwszym widocznym objawem często już zaawansowanego stanu chorobowego mogą być złamania osteoporotyczne. Za najczęstsze złamania związane z osteoporozą uważa się złamania nadgarstka, kręgosłupa i bliższego odcinka kości udowej. Według danych Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) osoby starsze, w tym zwłaszcza kobiety po menopauzie, doświadczają znacznego przyspieszenia utraty masy kostnej, co czyni osteoporozę poważnym problemem zagrażającym zdrowiu ludzi na całym świecie. Według szacunków w UE ponad 23 miliony osób jest narażonych na wysokie ryzyko zachorowania na osteoporozę. Choroba to jest nie tylko problemem zdrowotnym, ale również socjoekonomicznym, bowiem miliony złamań osteoporotycznych i związane z nimi rehabilitacja/opieka nad osobami niepełnosprawnymi kosztuje europejskie systemy opieki zdrowotnej ponad 56 miliardów euro rocznie (dane z 2019 roku). Każdego roku w Europie złamanie biodra lub kręgosłupa przyczynia się do śmierci prawie ćwierć miliona osób [Kanis, J. A., et al., (2021). Archives of osteoporosis, 16(1), 1-82]. Udział osteoporozy wśród innych chorób nasila się ze względu na starzejące się społeczeństwo większości krajów rozwiniętych, w tym krajów UE. Dlatego też wczesna profilaktyka, a także rozwój efektywnych metod diagnozowania i leczenia są w tym zakresie niezwykle istotne.

Podstawowymi zaleceniami dla osób zmagających się z osteoporozą są zmiana nawyków żywieniowych, wprowadzenie i dobranie właściwej aktywności fizycznej oraz suplementacja wapniem i witaminą D. Suplementy są istotnym czynnikiem wspomagającym leczenie osteoporozy, ponieważ wpływają na skuteczność leków przeciwosteoporotycznych. W leczeniu osteoporozy wykorzystuje się dwie klasy leków - antyresorpcyjne, które spowalniają resorpcję, i anaboliczne, które stymulują tworzenie kości. Spośród leków antyresorpcyjnych najliczniejszą grupę stanowią bisfosfoniany. Alendronian (ALN), inhibitor resorpcji kości, jest najczęściej przepisywanym doustnym lekiem z grupy aminobisfosfonianów stosowanym w leczeniu osteoporozy pomenopauzalnej, osteoporozy wywołanej kortykosteroidami, chorób Pageta i przerzutowych chorób kości. Niestety, podawanie ALN wiąże się z poważnymi skutkami ubocznymi, w tym martwicą kości szczęki, podrażnieniem układu żołądkowo-jelitowego, nudnościami, bólami mięśniowo-szkieletowymi a nawet problemami sercowo-naczyniowymi. Również dożylne podawanie ALN niesie ze sobą ryzyko nefrotoksyczności, wystąpienia objawów grypy a także zaburzenia równowagi elektrolitowej. W związku z tym układy umożliwiające miejscowe podanie i tym samym zlokalizowane działanie tego leku wydają się być niezwykle atrakcyjnym rozwiązaniem, zapewniającym ograniczenie resorpcji kości i jednocześnie ograniczającym ogólnoustrojowe skutki uboczne w trakcie trwania całej terapii. Opracowano różne systemy mające potencjał jako nośniki alendronianu, niemniej efekty miejscowego dostarczania wymagają dalszych optymalizacji i badań ze względu na powszechnie występujące problemy ze zbyt słabą wydajnością enkapsulacji w układzie jak również niedostateczną kontrolą nad dyfuzją i uwalnianiem tego leku.

Ze zgłoszenia P.428993 znany jest biokompatybilny hydrożelowy materiał hybrydowy i sposób jego otrzymywania, nadający się do stosowania w medycynie regeneracyjnej, zwłaszcza w odbudowie tkanki kostnej. Materiał ten zawiera hydrożel stanowiący mieszaninę kolagenu, chitozanu i kwasu hialuronowego sieciowaną genipiną wraz z zawieszonymi w niej cząstkami krzemionkowymi sfunkcjonalizowanymi grupami aminowymi, przy czym zawartość sfunkcjonalizowanych cząstek krzemionkowych wynosi nie mniej niż 1,9 mg/ml, korzystnie od 1,9 do 3,8 mg/ml końcowego zolu. Cząstki te posiadały powierzchnię całkowitą Sbet = 24 m²/g, co klasyfikuje je jako materiały nieporowate lub o niskiej porowatości [Plumere, N., et al., (2012). Journal of colloid and interface science, 368(1), 208-219]. Wyznaczone mezopory o średnicach D = 23 nm nie są elementem składowym samych cząstek, a powstały w szczelinach pomiędzy dwoma frakcjami obiektów obecnych w otrzymanym materiale (cząstki o średnicy 400 i 100 nm). Do syntezy materiału hybrydowego zastosowano dostępny komercyjnie kwas hialuronowy (nie poddawano go żadnym modyfikacjom) i stanowił on 10% wag mieszaniny biopolimerowej. Materiał ten nie zawierał w swoim składzie alendronianu i nie posiadał właściwości terapeutycznych.

Ze zgłoszenia P.435104 znany jest biokompatybilny hydrożelowy materiał hybrydowy i sposób jego otrzymywania, w którym jako nośnik dla alendronianu zastosowano dekorowane hydroksyapatytem funkcjonalizowane grupami aminowymi cząstki krzemionki. Cząstki te zostały udekorowane hydroksyapatytem, następnie przyłączono do nich alendronian i zawieszone w matrycy biopolimerowej zawierającej: kolagen, chitozan, modyfikowany kwas hialuronowy w stosunku wagowym wynoszącym odpowiednio 5 : 2 : 3. W znanym materiale jako nośnik dla alendronianu zastosowano dekorowane hydroksyapatytem funkcjonalizowane grupami aminowymi cząstki krzemionki, które nie posiadały mezoporów w obrębie swojej struktury a ich powierzchnia całkowita była równa 24 m²/g.

Celem wynalazku jest dostarczenie wielofunkcyjnego materiału zawierającego znaną substancję czynną wspomagającą proces regeneracji kości, taką jak lek z grupy bisfosfonianów, przykładowo alendronian, który to materiał, wykazując terapeutyczny potencjał anty-osteoporotyczny, umożliwia jednocześnie mało inwazyjną implantację i kontrolę nad procesem uwalniania substancji czynnej, ponadto posiada zdolność do biointegracji i wspierania regeneracji kości, a także charakteryzuje się pożądanymi właściwościami mechanicznymi i biodegradowalnością.

W szczególności celem wynalazku jest uzyskanie ulepszonego materiału hydrożelowego zapewniającego wyższy stopień załadunku wspomnianą substancją czynną a jednocześnie ograniczającego niekontrolowany wyciek leku z matrycy hydrożelowej.

Przedmiotem wynalazku jest wielofunkcyjny, hydrożelowy materiał hybrydowy charakteryzujący się tym, że zawiera:

a) matrycę biopolimerową zawierającą: kolagen, chitozan, siarczan chondroityny korzystnie modyfikowany,

b) sfunkcjonalizowane grupami aminowymi mezoporowate cząstki krzemionkowo-apatytowe o powierzchni całkowitej Sbet nie mniejszej niż 613 m²/g i mezoporach (2-50 nm) utworzonych w strukturze cząstek o objętości nie mniejszej niż 0,57 cm³/g,

c) substancję czynną wybraną spośród znanych leków bisfosfonianowych, zwłaszcza alendronian, przyłączoną do cząstek krzemionkowo-apatytowych,

d) substancję sieciującą.

Korzystnie, matryca biopolimerowa zawiera: kolagen, chitozan, modyfikowany siarczan chondroityny w stosunku wagowym wynoszącym odpowiednio 5 : 2 : 3.

Korzystnie, siarczan chondroityny jest modyfikowany lizyną.

Korzystnie, substancją sieciującą jest genipina.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wielofunkcyjnego, hydrożelowego materiału hybrydowego charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące etapy:

a) otrzymuje się funkcjonalizowane grupami aminowymi mezoporowate cząstki krzemionki w reakcji bromku cetylotrimetyloamonu, tetraetoksysilanu i aminopropylotrietoksysilanu, prowadzonej w roztworze wodnym w środowisku zasadowym, a następnie otrzymany materiał oddziela się i traktuje roztworem azotanu amonu w etanolu, korzystnie mieszając przez około 18 godzin w temperaturze 80°C, a następnie izoluje się uzyskane cząstki mezoporowatej krzemionki funkcjonalizowanej grupami aminowymi (MSP-NH2),

b) cząstki MSP-NH2 otrzymane w etapie a) zawiesza się w buforze symulującym ludzkie osocze (SBF), korzystnie o stężeniu 1,5 M, otrzymując po 5 dniach inkubacji sfunkcjonalizowane grupami aminowymi mezoporowate cząstki krzemionkowo-apatytowe (MSP-NH2-HAp),

c) do cząstek otrzymanych w etapie b) przyłącza się alendronian sodu,

d) do mieszaniny kolagenu, chitozanu i modyfikowanego lizyną siarczanu chondroityny dodaje się wodnej zawiesiny cząstek z etapu c)

e) mieszaninę otrzymaną w etapie d) poddaje się reakcji sieciowania genipiną.

Korzystnie, sposób według wynalazku prowadzi się go metodą zol-żel.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wielofunkcyjny, hydrożelowy materiał hybrydowy określony powyżej lub otrzymany sposobem określonym powyżej stosowania w leczeniu lub profilaktyce ubytków tkanki kostnej, zwłaszcza będących efektem osteoporozy. Korzystnie, materiał hybrydowy do stosowania według wynalazku charakteryzuje się tym, że ubytki kostne są efektem osteoporozy.

Zgodnie z wynalazkiem jako „mezoporowate cząstki krzemionkowe funkcjonalizowane grupami aminowymi” rozumie się cząstki krzemionkowe o powierzchni całkowitej Sbet nie mniejszej niż 613 m²/g i mezoporach (2-50 nm) utworzonych w strukturze cząstek o objętości nie mniejszej niż 0,57 cm³/g.

Korzystnie, proces kontrolowanej dekoracji hydroksyapatytem takich cząsteczek nie trwa dłużej niż 5 dni.

Zgodnie z wynalazkiem jako „mezoporowate cząstki krzemionki dekorowane hydroksyapatytem (MSP-NH2-HAp)” uznaje się takie cząsteczki, które umożliwiają załadunek/przyłączenie alendronianu o wartości nie mniejszej niż 10%.

Szczegółowy opis wynalazku

Materiał według wynalazku to nowy wielofunkcyjny materiał hybrydowy otrzymany poprzez zawieszenie w biopolimerowym zolu (składającym się z mieszaniny kolagenu/chitozanu/modyfikowanego lizyną siarczanu chondroityny) mezoporowatych cząstek krzemionkowych funkcjonalizowanych grupami aminowymi i dekorowanych hydroksyapatytem z przyłączonym lekiem z grupy bisfosfonianów, korzystnie alendronianem.

Otrzymane systemy hybrydowe składają się z wyselekcjonowanego hydrożelu ColChCSmod30_20 (50% wag kolagenu (Col), 20% wag chitozanu (Ch) i 30% wag sfunkcjonalizowanego grupami aminowymi siarczanu chondroityny (CSmod) sieciowanego roztworem genipiny o stężeniu 20 mM i bioaktywnego nośnika z załadowanym/przyłączonym lekiem (cząstki MSP-NH2-HAp-ALN), który został zawieszony w zolu polimerowym a następnie kowalencyjne przyłączony do matrycy biopolimerowej.

Materiał według wynalazku stanowi zatem nowy wielofunkcyjny materiał hybrydowy otrzymany poprzez zawieszenie w biopolimerowym zolu (składającym się z mieszaniny kolagenu/chitozanu/modyfikowanego lizyną siarczanu chondroityny) mezoporowatych cząstek krzemionkowych funkcjonalizowanych grupami aminowymi i dekorowanych hydroksyapatytem z przyłączonym do jego powierzchni alendronianem. Tak sporządzoną mieszaninę poddaje się następnie procesowi sieciowania chemicznego substancją pochodzenia naturalnego (genipiną), uzyskując stabilny strukturalnie materiał hybrydowy, w którym cząstki są przyłączone wiązaniami kowalencyjnymi do biopolimerowej matrycy hydrożelowej. Tak skonstruowany sieciowany chemicznie układ pełni funkcję systemu do kontrolowanego i zlokalizowanego dostarczania substancji terapeutycznej (ALN). Ponadto starannie dobrana kompozycja tego materiału zapewnia jego biointegrację z naturalną kością (dekoracja nośnika fazą mineralną), a także stanowi dogodną biomatrycę dla zasiedlania przez komórki osteoblastyczne (biomimetyczna matryca hydrożelowa) i pożądane właściwości mechaniczne.

Ważną zaletę opisanego w zgłoszeniu materiału stanowi fakt, że ma on postać wstrzykiwalną, a więc umożliwiającą aplikację w mało inwazyjny sposób. Oznacza to, iż terapia z użyciem tego materiału nie wymaga konwencjonalnych zabiegów chirurgicznych, a samo podawanie może odbywać się w gabinetach lekarskich.

Szczególnie korzystnym zastosowaniem opisanego w zgłoszeniu materiału jest leczenie lub odbudowa ubytków kostnych o niewielkich rozmiarach spowodowanych osteoporozą. Może zostać również wykorzystany we wspomaganiu leczenia różnego typu niewielkich ubytków ortopedycznych jak również ubytków stomatologicznych (np. ubytki kości szczęki po ekstrakcji zębów), a także wykorzystanie jako alternatywnego wypełnienia śrub do augmentacji stosowanych w zabiegach neurochirurgicznych.

To co wyróżnia prezentowany wynalazek od rozwiązań znanych ze stanu techniki (w szczególności materiału ze zgłoszenia patentowego P.428993) to zastosowanie jako nośnika ALN sfunkcjonalizowanych grupami aminowymi mezoporowatych cząstek krzemionki (MSP-NH2) dekorowanych hydroksyapatytem. Znakomite właściwości teksturalne otrzymanych MSP-NH2 w tym duża powierzchnia całkowita (Sbet~613 m²/g; dla cząstek SO2-NH2 prezentowanych w P.428993 powierzchnia całkowita wyniosła Sbet~24 m²/g) zapewniła efektywniejszy załadunek lekiem (10-14%; dla cząstek prezentowanych w P.428993 efektywność załadunku była na poziomie 3%). Ponadto adsorpcja w mezopory nośnika jest dodatkowo wspomagana oddziaływaniami pomiędzy grupami aminowymi matrycy i grupami fosforanowymi ALN przy jednoczesnym umożliwieniu kowalencyjnego przyłączenia MSP do sieci biopolimerowej w trakcie procesu sieciowania. Podejście to wyeliminuje niekontrolowany „wyciek” cząstek MSP z miejsc implantacji w warunkach in vivo, zapewniając tym samym zachowanie zaprojektowanej funkcjonalności Wynalazku. Ponadto duża gęstość grup silanolowych (SiOH) na powierzchni MSP przyczyniła się do znacznego skrócenia procesu kontrolowanej depozycji apatytu (do 5 dni z 10 dla cząstek SiO2-NH2), co jest niezwykle istotne z technologicznego punktu widzenia i potencjalnych zastosowań. Ponadto mezoporowaty nośnik z załadowanym ALN został zawieszony, a następnie kowalencyjnie przyłączony do matrycy hydrożelowej o nowym składzie. Wykorzystanie sfunkcjonalizowanego grupami aminowymi siarczanu chondroityny pozwoliło uzyskać biomateriał wspomagający proces kościotworzenia, co jest niezwykle istotne w kontekście wspomagania regeneracji tkanki kostnej.

W oparciu o przeprowadzone badania wykazano następujące nieoczekiwane korzystne właściwości otrzymanego materiału:

Wykazano, iż zastosowanie cząstek MSP-NH2 umożliwia znaczne skrócenia procesu kontrolowanej depozycji apatytu (do 5 dni z 10 dla cząstek SiO2-NH2 prezentowanych w zgłoszeniu patentowym P.428993), co jest niezwykle istotne z technologicznego punktu widzenia i potencjalnych zastosowań.

Potwierdzono, iż zastosowanie jako nośnika ALN sfunkcjonalizowanych grupami aminowymi mezoporowatych cząstek krzemionki dekorowanych hydroksyapatytem (MSP-NH2-HAp) zapewnia efektywniejszy załadunek lekiem (10-14%) (dla wynalazku prezentowanego w zgłoszeniu patentowym P.428993 załadunek ten wyniósł 3% (oznaczenie TG).

Potwierdzono wstrzykiwalność zaprojektowanego materiału a także wykazano efektywność przyłączania cząstek MSP-NH2-HAp-ALN do sieci polimerowej (badania degradacji enzymatycznej, badania reologiczne).

Otrzymany profil uwalniania leku z materiału hybrydowego w zestawieniu z wynikiem uwalniania ALN bezpośrednio z cząstek MSP-NH2-HAp-ALN jednoznacznie potwierdził skuteczność wykorzystania matryc hydrożelowych jako „narzędzia” ograniczającego niekontrolowany wyciek leku.

Wykazano biokompatybilność materiałów hybrydowych i ich zdolność do indukowania procesu mineralizacji komórek MG-63. Przeprowadzone wstępne testy biologiczne in vitro wykazały, iż obecność cząstek MSP-NH2-HAp-ALN nie powoduje obniżenia biokompatybilności materiałów hybrydowych (w porównaniu do materiału kontrolnego ColChCSmod). Badania aktywności ALP ujawniły zdolność badanych materiałów do indukowania procesu mineralizacji osteoblastów. Potwierdzono bioaktywność materiałów hybrydowych w warunkach SBF. Zaobserwowano biomineralizację zarówno dla zastosowanej matrycy CoChCSmod, jak i systemów hybrydowych już po 3 dniach inkubacji materiału w warunkach symulujących sztuczne osocze (SBF). Potwierdzono utworzenie nowej fazy mineralnej zapewniającej szybszą biointegrację materiału z naturalną kością w warunkach in vivo.

Dowiedziono, iż opracowana matryca hydrożelowa z wykorzystaniem sfunkcjonalizowanego grupami aminowymi siarczanu chondroityny pozwala uzyskać biomateriał wspomagający proces kościotworzenia (zaobserwowano zachodzenie biomineralizacji w warunkach SBF a także wzrost aktywności ALP komórek MG-63 już dla samej matrycy).

Wykazano potencjał terapeutyczny dla systemów hybrydowych. Przeprowadzone wstępne badania biologiczne in vitro z wykorzystaniem komórek J774A.1 wykazały, iż zaprojektowane materiały hybrydowe posiadają potencjał terapeutyczny przejawiający się upośledzeniem aktywności modelowych komórek osteoklastycznych.

Podsumowując, proponowany wynalazek zapewnia nieinwazyjną miejscową aplikację materiału, co zwiększa efektywność terapii alendronianem i jednocześnie ogranicza skutki uboczne związane z doustnym podawaniem tego leku. Materiał ten jest adresowany w szczególności do leczenia wczesnych zmian osteoporotycznych nie klasyfikujących się do konwencjonalnych zabiegów chirurgicznych. Wynalazek ten stanowi istotnie udoskonaloną wersję systemu ze zgłoszenia patentowego P.428993, w porównaniu ze znanym rozwiązaniem cechuje się następującymi zaletami: (1) przyspieszony proces dekoracji hydroksyapatytem, (2) wydajniejszy załadunek lekiem, (3) zoptymalizowany profil uwalniania a także (4) zaobserwowana bioaktywność nowej matrycy z dodatkiem sfunkcjonalizowanego grupami aminowymi siarczanu chondroityny znacznie zwiększają jego potencjał aplikacyjny. Dla lepszego zrozumienia istoty wynalazku niniejszy opis został zilustrowany załączonymi figurami.

Na Fig. 1 przedstawiono uzyskane dla cząstek MSP-NH2: (A) mikrofotografie SEM (B) obrazy HRTEM.

Na Fig. 2 zestawiono: (A) krzywe adsorpcji-desorpcji (B) rozkład średnicy porów (C) tabela z wynikami pomiarów porozymetrycznych dla cząstek MSP-NH2.

Na Fig. 3 przedstawiono (A) mikrofotografie SEM i (B) dyfraktogram XRD dla cząstek MSP-NH2-HAp.

Na Fig. 4 przedstawiono wyniki badań XPS dla cząstek (A) MSP-NH2, (B) MSP-NH2-HAp i (C) MSP-NH2-HAp-ALN.

Na Fig. 5 przedstawiono (A) krzywe termograwimeryczne i (B) krzywą uwalniania alendronianu z MSP-NH2-HAp-ALN (LC - efektywność załadunku, z ang. loading capacity).

Na Fig. 6 przedstawiono (A) wartości modułu sprężystości (B) Wynik pomiaru parametrów charakteryzujących punkt płynięcia (G’ = G”) dla utworzonych układów hybrydowych i ColChCSmod.

Na Fig. 7 przedstawiono (A) wyniki degradacji enzymatycznej dla utworzonych układów hybrydowych i ColChCSmod. (B) współczynnik pęcznienia dla utworzonych układów hybrydowych i ColChCSmod.

Na Fig. 8 przedstawiono wyniki badań kąta zwilżania dla układów hybrydowych i ColChCSmod.

Na Fig. 9 przedstawiono ((A) Wyniki testu Alamar Blue po 1, 3 i 7 dniach hodowli komórek MG-63 na powierzchni materiałów (B) Wyniki badania aktywności fosfatazy alkalicznej (ALP) po 3 i 7 dniach hodowli komórek MG-63 na powierzchni materiałów i (C) Wyniki testu Alamar Blue po 1, 3 i 7 dniach hodowli komórek J774A.1 na powierzchni materiałów.

Na Fig. 10 przedstawiono mikrofotografie SEM dla układów hydrożelowych po 3, 5 i 7 dniach biomineralizacji wraz z obliczonym stosunkiem Ca/P.

Na Fig. 11 przedstawiono zestawienie profili uwalniania ALN z układu hybrydowego (HybC3) i cząstek MSP-NH2-HAp-ALN.

W poniższych przykładach ujawniono kolejne etapy przykładowej realizacje sposobu według wynalazku oraz przedstawiono wyniki potwierdzające korzystne właściwości uzyskiwanych zgodnie z wynalazkiem materiałów.

Przykład 1. Otrzymanie i charakterystyka mezoporowatych cząstek krzemionkowych dekorowanych hydroksyapatytem i załadowanych alendronianem

Opracowano metodologię otrzymywania dekorowanych hydroksyapatytem mezoporowatych cząstek krzemionki z załadowanym/przyłączonym alendronianem (MSP-NH2-HAp-ALN). Uzyskane cząstki (MSP-NH2, MSP-NH2-HAp i MSP-NH2-HAp-ALN) scharakteryzowane pod kątem morfologii (SEM/HRTEM) i składu chemicznego (XPS, XRD, EDS, TG). Następnie wykorzystując pomiary spektrofotometryczne UV-Vis określono wydajność enkapsulacji i zbadano kinetykę uwalniania leku w warunkach fizjologicznych (do medium o pH = 7,4 i temp = 37°C).

Na zoptymalizowaną metodologię otrzymywania mezoporowatych cząstek krzemionkowych dekorowanych hydroksyapatytem i załadowanych alendronianem składają się trzy główne etapy: (i) synteza mezoporowatych cząstek krzemionki funkcjonalizowanych grupami aminowymi (MSP-NH2), (ii) proces dekoracji hydroksyapatytem w warunkach symulujących ludzkie osocze (MSP-NH2-HAp), (iii) załadunek/przyłączanie alendronianu (MSP-NH2-HAp-ALN).

(i) Synteza mezoporowatych cząstek krzemionki funkcjonalizowanych grupami amino- wymi (MSP-NH2)

0,2 g bromku cetylotrimetyloamonu (CTAB) rozpuszczono w 100 ml wody destylowanej i dodano 1,4 ml 1M zasady sodowej, NaOH. Roztwór mieszano przez 2 h (80°C, 500 rpm). Następnie wkroplono 2 ml tetraetoksysilanu (TEOS) i 0,2 ml aminopropylotrietoksysilanu (APTES) i reakcję kontynuowano w tych samych warunkach przez kolejne 2 godziny. Otrzymany materiał schłodzono i odwirowano (5°C, 9000 obr./min, 10 minut). Osad przemyto dwukrotnie wodą i trzykrotnie 96% roztworem etanolu (EtOH). 2 g azotanu amonu (NH4NO3) rozpuszczono w 200 ml 96% etanolu i dodano do otrzymanego osadu w celu usunięcia pozostałości CTAB. Otrzymaną zawiesinę mieszano (500 obr./min) w 80°C przez 18 godzin.

Otrzymany materiał (MSP-NH2) odwirowano i przepłukano trzykrotnie 96% EtOH i trzykrotnie wodą, zamrożono a następnie liofilizowano przez 24 godziny.

(ii) Dekoracja MSP-NH2 hydroksyapatytem (MSP-NH2-HAp)

W celu dekoracji cząstek MSP-NH2 hydroksyapatytem, 20 mg MSP-NH2 zawieszono w 20 ml buforu symulującego ludzkie osocze (1.5 simulated body fluid, SBF) poprzez umieszczenie go w łaźni ultradźwiękowej na 5 minut. Otrzymaną zawiesinę następnie inkubowano w 37°C, delikatnie wytrząsając (50 obr./min). Po 24 h materiał odwirowano (5°C, 10 000 obr./min, 20 min) i dodano świeżą porcję 1,5 x SBF. Inkubację prowadzono przez 5 dni. Po zakończeniu dekoracji materiał przemyto 3x wodą destylowaną, zamrożono i liofilizowano przez 24 h.

(iii) Załadunek alendronianu (MSP-NH2-HAp-ALN) mg alendronianu sodu (ALN) rozpuszczono w 10 ml 5 mM NaOH i pH roztworu podniesiono do 10 za pomocą 20 mM NaOH. 20 mg cząstek MSP-NH2-HAP zawieszono w 3 ml 5 mM roztworu NaOH przez umieszczenie go w łaźni ultradźwiękowej na 5 minut. Roztwór alendronianu dodano do zawiesiny zawierającej MSP-NH2-HAP i mieszano (500 obr./min) w 37°C przez 72 godziny. Po 3 dniach produkt (MSP-NH2-HAp-ALN) odwirowano (5°C, 10 000 obr./min, 20 minut), przemyto wodą dejonizowaną, zamrożono i liofilizowano przez 24 h.

Właściwości otrzymanych cząstek

Otrzymane materiały po procesie liofilizacji zostały zbadane za pomocą szeregu metod. Badania technikami SEM i HRTEM wykazały, iż zsyntezowane cząstki MSP-NH2 wykazują kulistą morfologię o średnicach z zakresu 150-250 nm i porach o d = 3,5 nm (Fig. 1).

Na podstawie badań porozymetrycznych ustalono, że otrzymane struktury miały powierzchnię BET równą 613 m²/g, co odczytano z krzywych adsorpcji-desorpcji typu IVb (Fig. 2A), pory o objętości

PL 247558 Β1

0,57 cm³/g i średnicy 3,7 nm. Według literatury, otrzymane wielkości porów zarówno z pomiarów porozymetrycznych, jak i obrazów HRTEM mieszczą się w zakresie charakterystycznym dla mezoporów. Dodatkowo, dla MSP-NH2 pory te charakteryzowały się wąskim rozkładem średnicy (Fig. 2B). Wartości otrzymane z pomiarów porozymetrycznych zestawiono w Tabeli na Fig. 2C.

Dla porównania, funkcjonalizowane grupami aminowymi cząstki krzemionkowe opisane w stanie techniki zostały otrzymane metodą bez użycia matrycy surfaktantowej. Otrzymane cząstki charakteryzują się niską powierzchnią całkowitą Sbet = 24m²/g, co klasyfikuje je jako materiały nieporowate lub o niskiej porowatości [Plumere, N., et aL, (2012). Journal of colloid and interface science, 368(1), 208-219]. Wyznaczone mezopory o średnicach D = 23 nm nie są elementem składowym samych cząstek a wynikają z obecności szczelin utworzonych pomiędzy dwoma frakcjami obiektów obecnych w otrzymanym materiale (cząstki o średnicy 400 i 100 nm). Zestawienie parametrów porozymetycznych dla cząstek SIO2-NH2 i MSP-NH2 przedstawiono w Tabeli 1.

Tabela 1

Porównanie parametrów porozymetycznych dla cząstek SiO2-NH2 i MSP-NH2

	Sbet [m²/g]	V_mes [cm³/g]	D_mes [nm]
SiO₂-NH₂	24	0,14	23,00
MSP-NH2	613	0,57	3,69

Zsyntezowane cząstki MSP-NH2 zostały następnie poddane dekoracji hydroksyapatytem poprzez ich inkubację w buforze symulującym ludzkie osocze (1,5 SBF) w37°C przez 3, 5, 7 i 10 dni. Wykazano, że już 5 dniowa inkubacja jest wystarczająca, aby uzyskać efektywną depozycję hydroksyapatytu na powierzchni cząstek MSP. Uzyskane materiały zostały scharakteryzowane przy pomocy szeregu komplementarnych metod. Wykonane analizy SEM/EDS/XRD potwierdziły obecność hydroksyapatytu na cząstkach po 5 dniowej inkubacji (Fig. 3).

W kolejnym kroku dokonano przyłączania/załadunku alendronianu do cząstek MSP-NH2-HAp. Cząstki inkubowano w roztworze ALN (2 mg/ml w 5 mM NaOH, pH = 10) przez 72 h w 37°C. Następnie materiał został odwirowany, przemyty wodą i wyizolowany na drodze liofilizacji. Otrzymany materiał (MSP-NH2-HAp-ALN) scharakteryzowano pod kątem morfologii (SEM) a także składu chemicznego (XPS) potwierdzając obecność leku w otrzymanych cząstkach (Fig. 4).

Pomiary spektrofotometryczne a także analiza termograwimetryczna pozwoliły oszacować efektywność załadunku lekiem (z ang. loading capacity, LC), która mieści się w zakresie 10-14% (Fig. 5). Po przeprowadzeniu przyłączania/załadunku alendronianu do otrzymanych cząstek wykonano również badania jego uwalniania w warunkach fizjologicznych (pH = 7, temp = 37°C). Oznaczenia dokonywano przy pomocy spektroskopii UV-VIS. Profil uwalniania sporządzony w oparciu o 10-dniowy eksperyment wykazał zachodzenie zjawiska gwałtownego wycieku (tzw. burst effect), wskazując tym samym na potrzebę dodatkowego „zabezpieczenia” leku.

Potwierdzono zatem, że zastosowanie jako nośnika ALN sfunkcjonalizowanych grupami aminowymi mezoporowatych cząstek krzemionki dekorowanych hydroksyapatytem (MSP-NH2-HAp) zapewnia efektywniejszy załadunek lekiem (10-14%) (dla rozwiązania prezentowanego w zgłoszeniu patentowym P.428993 załadunek ten wyniósł 3%. Adsorpcja w mezopory nośnika jest dodatkowo wspomagana oddziaływaniami pomiędzy grupami aminowymi matrycy i grupami fosforanowymi ALN przy jednoczesnym umożliwieniu kowalencyjnego przyłączenia MSP do sieci biopolimerowej w trakcie procesu sieciowania. Pozwala to wyeliminować niekontrolowany „wyciek” cząstek MSP-NH2 z miejsc implantacji w warunkach in vivo, zapewniając tym samym zachowanie pożądanych cech materiału.

Przykład 2. Otrzymanie i charakterystyka fizykochemiczna wstrzykiwalnych systemów hybrydowych składających się z zoptymalizowanej matrycy polimerowej i mezoporowatych cząstek krzemionkowych załadowanych lekiem i dekorowanych hydroksyapatytem

Otrzymywanie materiału hybrydowego na bazie matrycy polimerowej składającej się z 30% wag siarczanu chondroityny funkcjonalizowanego lizyną (CSmod)

Procedura otrzymywania zmodyfikowanego lizyną siarczanu chondroityny została przedstawiona w publikacji (J. Klara, A. Marczak, A. Łatkiewicz, W. Horak, J. Lewandowska- Łańcucka*, Lysine-functionalized chondroitin sulfate improves the biological properties of collagen/chitosan-based injectable hydrogels, Int. J. Biol. Macromol, 202, 318-331, 2022, https://doi.Org/10.1016/j.ijbiomac,2022.01.026).

Synteza została przeprowadzona w buforze MES, który otrzymano poprzez rozpuszczenie 0,97 g kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) w 100 ml wody dejonizowanej i ustaleniu wartości pH do 4, wykorzystując 0,1 M roztwór NaOH. 500 mg siarczanu chondroityny (CS) rozpuszczono w 20 ml buforu MES (50 mM, pH = 4) i pozostawiono na mieszadle magnetycznym na 24 h. W kolejnym kroku dodawano kolejno 730 mg lizyny, 360 mg EDC (chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo)-N'-etylokarbodiimidu) oraz 220 mg NHS (N-hydroksysukcynimid) (każdy z odczynników został najpierw rozpuszczony w 5 ml buforu MES). Całość mieszano przez 24 h na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej. Oczyszczanie produktu polegało na przeprowadzeniu całonocnej dializy do 0,1M wodnego roztworu Na2CO3 (trwającej około 18 h), a następnie 2-tygodniowej dializy względem wody. Otrzymaną w ten sposób mieszaninę poddano zagęszczeniu na wyparce, następnie zamrożono i zliofilizowano. Stopień podstawienia lizyną w wyizolowanym produkcie (CSmod) określono za pomocą analizy elementarnej i spektroskopii 1H NMR, wyniósł on około 21%. Wykorzystując sfunkcjonalizowany lizyną siarczan chondroityny, otrzymano serię systemów hybrydowych składających się z hydrożelu ColChCSmod30_20 (system składający się z 50% wag kolagenu (Col), 20% wag chitozanu (Ch) i 30% wag sfunkcjonalizowanego grupami aminowymi siarczanu chondroityny (CSmod) sieciowany roztworem genipiny o stężeniu 20 mM) i bioaktywnego nośnika z załadowanym/przyłączonym lekiem (cząstki MSP-NH2-HAp-ALN), który został zawieszony w zolu polimerowym a następnie kowalencyjne przyłączony do matrycy biopolimerowej. W tym celu do 520 μl roztworu kolagenu (Col) (roztwór w kwasie solnym o stężeniu 4,06 mg/ml - roztwór dostarczony przez producenta BD Biosciences) dodano 84 μl roztworu chitozanu (Ch) (roztwór 1% wag. w 1% kwasie octowym), 126 μl roztworu zmodyfikowanego lizyną siarczanu chondroityny (CSmod) (roztwór 1% wag. w 10x buforze fosforanowym (PBS) i 100 μl wodnej zawiesiny otrzymanych w Przykładzie 1 cząstek MSP-NH2-HAp-ALN, (naważki odpowiednio 2,5 mg, 1,25 mg, 0,5 mg - każdą z nich zawieszono w 100 μl wody). Otrzymany zol poddano energicznemu wytrząsaniu a następnie dodano 170 μl roztworu genipiny (roztwór o stężeniu 20 mM, sporządzony w 10xPBS) i inkubowano w temperaturze 37°C aż do całkowitego usieciowania. Otrzymany materiał ma postać hydrożelu. Stosunek wagowy biopolimerów w otrzymanym materiale wyniósł: Col : Ch : CSmod - 5 : 2 : 3.

Opisanym powyżej sposobem otrzymano trzy rodzaje systemów hybrydowych składających się z hydrożelu ColChCSmod30_20 i cząstek MSP-NH2-HAp-ALN o stężeniach w zolu 0,5; 1,25 i 2,5 mg/ml zolu. Uzyskane systemy oznaczono odpowiednio Hyb_C1 (dla 0,5 mg/ml), Hyb_C2 (dla 1,25 mg/ml) i Hyb_C3 (dla 2,5 mg/ml). Jako materiał kontrolny zastosowano matrycę (oznaczoną jako ColChCSmod) bez dodatku cząstek. Testowano trzy zawartości cząstek MSP-NH2-HAp-ALN (0,5; 1,25 i 2,5 mg/ml zolu) i ich wpływ na właściwości fizykochemiczne otrzymanych materiałów hybrydowych. Przeprowadzono badania fizykochemiczne wykazujące efektywność przyłączania nośnika do sieci polimerowej (badania degradacji enzymatycznej, pęcznienie, badania reologiczne). Zbadano również zwilżalność a także kinetykę uwalniania leku z hydrożelowego systemu w warunkach fizjologicznych.

Badania reologiczne

Badania reologiczne przeprowadzono dla serii zżelowanych materiałów hybrydowych i próbki kontrolnej (ColChCSmod) na reometrze rotacyjnym MCR 301 (Anton Paar) wyposażonym w celę pomiarową P-PTD200 oraz komorę H-PTD200, dzięki czemu uzyskano wysoką dokładność stabilizacji temperatury w trakcie pomiaru. Wykonano badania z wykorzystaniem geometrii pomiarowej typu płytkapłytka, średnica płytki d = 25 mm, wysokość szczeliny h = 0,1 mm, temperatura t = 37°C. Po umieszczeniu materiału na dolnej płytce pomiarowej reometru odsączano nadmiar wody. Następnie opuszczano płytkę górną reometru zgodnie ze zoptymalizowanym schematem: 2; 1,5; 1; 0,8; 0,6; 0,5; 0,1 mm. Przeprowadzano testy przemiatania amplitudy odkształcenia (z ang. amplitude sweep, AS) przy amplitudzie z zakresu γ = 0.1-1000% i stałej częstotliwości, f = 1 Hz. Dla każdego materiału wykonano co najmniej trzy niezależne eksperymenty.

Zarejestrowano krzywe modułu sprężystości (G’) i modułu stratności (G”) w funkcji odkształcenia (γ) w zakresie 0,1-1000%. Zgodnie z danymi literaturowymi, gdy wartości G > G' próbka zachowuje się jak lepka ciecz, natomiast gdy G' > G materiał wykazuje właściwości elastycznego/sprężystego ciała stałego. Dla wszystkich badanych próbek zaobserwowano wyższe wartości modułu sprężystości w stosunku do modułu stratności, co dowodzi, iż otrzymane materiały hybrydowe jak również hydrożel ColChCSmod wykazują przewagę właściwości sprężystych nad właściwościami lepkimi, będącymi następstwem efektywnego sieciowania. Eksperyment przemiatania amplitudy umożliwił również dokonanie oceny stabilności badanych systemów przy stałej częstotliwości i zmiennej amplitudzie odkształcenia i wyznaczenie obszaru liniowej lepkosprężystości, LVE (z ang. linear viscoelastic range).

PL 247558 Β1

Pomiary przeprowadzono w zakresie LVE materiału, zapewniają, że mierzone właściwości hydrożelu są niezależne od wielkości przyłożonego odkształcenia. Wykazano, iż dla większości próbek zakres ten sięga do γ < 5%, dlatego też w analizie danych bazowano na wartościach wyznaczonych przy γ = 1%.

Na Fig. 6A przedstawiono wartości modułu sprężystości (G’) otrzymane dla badanych materiałów. G’ jest parametrem opisującym elastyczne zachowanie próbki, a jego wartość wzrasta wraz ze stopniem usieciowania materiału. Tym samym im większa jest wartość G’, tym otrzymany układ jest sztywniejszy; wykazuje lepsze właściwości mechaniczne. W oparciu o przeprowadzone badania Teologiczne można zatem stwierdzić, iż wprowadzenie do matrycy polimerowej cząstek MSP-NH2-HAp-ALN przyczynia się w sposób istotny do poprawy właściwości mechanicznych. Im wyższe stężenie cząstek, tym większa wartość modułu elastyczności. Dla matrycy ColChCSmod G’ = 350 Pa, podczas gdy dla układu z najwyższą zawartością cząstek (Hyb_C3) wartość ta jest prawie trzykrotnie wyższa (G’ = 1035 Pa). Fig. 6B przedstawia wyznaczone wartości przecięcia krzywych modułu sprężystości (G’) i modułu stratności (G”) (G’ = G”) charakteryzujących punkt płynięcia. Tutaj ponownie można wskazać wyraźny trend, iż wraz ze wzrostem zawartości cząstek wartość punktu przecięcia krzywych przyjmuje wyższe wartości. Oznacza to, iż materiały hybrydowe charakteryzują się wyraźnie wyższym średnim naprężeniem płynięcia względem próbki kontrolnej (ColChCSmod), wykazując tym samym większą odporność na uszkodzenia mechaniczne. Wyniki testów Teologicznych potwierdzają zatem otrzymanie stabilnych strukturalnie materiałów hybrydowych.

Badania degradacji

Badania degradacji (Fig. 7A) przeprowadzono w medium na bazie roztworu kolagenazy o stężeniu 0,2 mg/ml w PBS zawierającym 0,36 mM CaCl2. W określonych punktach czasowych roztwór był zbierany, materiały ważone, a następnie poddane działaniu świeżej porcji medium. Wszystkie badane materiały wykazywały stopniową degradację w całym badanym zakresie czasu. Otrzymane wyniki potwierdzają, że wprowadzenie nieorganicznych cząstek do matryc hydrożelowych, nie powoduje zmniejszenia ich stabilności i dezintegracji. Po zakończonym eksperymencie (144 h), największą odpornością na degradację charakteryzował się materiał HybC2, porównywalną z układem bez cząstek. Tym samym dowiedziono brak „wycieku” cząstek z otrzymanych materiałów hybrydowych, co może pośrednio wskazywać na efektywne przyłączenie MSP-NH2-HAp-ALN do matrycy polimerowej w trakcie procesu sieciowania genipiną.

Badania pęcznienia

Eksperyment pęcznienia (Fig. 7B) został przeprowadzony poprzez inkubację układów hybrydowych w roztworze PBS przez 24 h, po czym materiały zostały zważone, zliofilizowane i ponownie zważonę. Współczynnik pęcznienia (SR) obliczono na podstawie wzoru: —— 100%, gdzie Ws jest masą przed liofilizacją, a Wd masą po liofilizacji. Otrzymane hybrydy wykazują zdolność do pęcznienia, wyznaczone dla nich wartości SR są w zakresie 4062-6225 (Fig. 7B). Potwierdzono, iż dodatek MSP-NH2-HAp-ALN ogranicza pęcznienie powstałych układów w porównaniu z matrycą hydrożelową (8711). Ponadto zaobserwowano, iż efekt ten jest tym większy, im większe jest stężenie cząstek w układzie.

Badania zwilżalności

Wykonane badania kąta zwilżania ujawniły (Fig. 8), że próbka hydrożelu (ColChCSmod30_20) charakteryzuje się niską zwilżalnością (kąt zwilżania 109,7 ±1,9). Istotny spadek tego parametru obserwuje się, gdy w układzie hybrydowym zastosowano nawet niskie stężenie cząstek (72,3 ±1,2 dla Hyb_C1). Wraz ze wzrostem stężenia cząstek zmniejszał się kąt zwilżania, przez co hybrydy stały się bardziej hydrofilowe - najniższą wartość zmierzono dla Hyb_C3 wynoszącą 61,9 ±1,2. Obserwację tę można wyjaśnić dużą ilością grup hydroksylowych (OH) obecnych w cząstkach, zarówno pochodzących z hydroksyapatytu, alendronianu, jak i cząstek mezoporowatej krzemionki funkcjonalizowanej grupami aminowymi, a także innymi grupami hydrofilowymi. Jednak zmiana wartości kąta zwilżania między układami z różnymi stężeniami cząstek była mniej wyraźna w porównaniu z kontrolną próbką hydrożelu. Hydrofilowość materiałów przygotowanych do inżynierii tkanki kostnej wpływa na ich przydatność i zdolność do skutecznego przylegania komórek oraz ich proliferacji. Przykładowo, zwiększona zwilżalność powierzchni Ti pozwoliła na lepszą osteointegrację w obecności osteoporozy [Siqueira, R. et al. (2021). J. Periodontal Res. 56, 351-362], wzmożone tworzenie kości poprzez regulację angiogenezy, mineralizację kości i ich przebudowę [Calciolari, E., et al,. (2018). J. Periodontal Res. 53, 598-609, Boyan, B. D„ et al., (2017). Tissue Eng‘ - Part A 23, 1479-1489],

Przykład 3. Badania biologiczne in vitro wyselekcjonowanych systemów hybrydowych

Otrzymane materiały hybrydowe poddano wstępnym badaniom biologicznym in vitro z zastosowaniem komórek osteoblastycznych MG-63. Określono proliferację i aktywność fosfatazy alkalicznej komórek hodowanych na powierzchni testowanych materiałów. Analizując wyniki testu Alamar Blue (Fig. 9A) wykonanego w 1 i 3 dniu hodowli można stwierdzić, iż wprowadzenie cząstek MSP-NH2-HAp-ALN w testowanych stężeniach C1, C2 i C3 do matrycy hydrożelowej nie powoduje obniżenia biokompatybilności materiałów hybrydowych w porównaniu do układu kontrolnego ColChCSmod. Wszystkie testowane materiały wspierają zdolność do proliferacji komórek MG-63 rozważając 3 dniową hodowle. Po 3 dniach eksperymentu odnotowano porównywalny (brak różnic istotnych statystycznie) wzrost liczby komórek na materiałach hybrydowych względem wyników dla kontroli.

Tymczasem po 7 dniach hodowli na wszystkich badanych systemach zaobserwowano wyraźne zahamowanie proliferacji komórek, co można wyjaśnić wejściem komórek w fazę mineralizacji. W celu zweryfikowania tej tezy zbadano aktywność fosfatazy alkalicznej (ALP) będącej markerem potwierdzającym fenotyp i mineralizację osteoblastów. Badania wykonano w 3 i 7 dniu hodowli a wyniki zaprezentowano na Fig. 9B. Poziom ALP komórek hodowanych na powierzchni materiałów zarówno w trzecim jak i siódmym dniu eksperymentu in vitro był istotnie wyższy w porównaniu do aktywności ALP komórek na płytce hodowlanej. To co jednak najistotniejsze to wykazanie, iż w przypadku wszystkich materiałów zaobserwowano istotny wzrost aktywności po 7 dniach eksperymentu pomimo zahamowanej proliferacji komórek. Wynik ten potwierdza zatem, iż materiały wykazują zdolność do indukowania mineralizacji osteoblastów. Analizując wpływ stężenia cząstek MSP-NH2-HAp-ALN na aktywność ALP po 3 dniach hodowli nie zaobserwowano różnic istotnych statystycznie. W 7 dniu eksperymentu największą aktywność ALP wykazały komórki hodowane na materiale Hyb_C1.

W celu wykazania właściwości terapeutycznych polegających na zdolności materiałów do zahamowania resorpcji kości przeprowadzono wstępne badania biologiczne in vitro z wykorzystaniem modelowej linii osteoklastów (komórki J774A.1). Linia ta została wybrana z uwagi na fakt, iż jest linią referencyjną wykorzystywana w analizach in vitro nad metabolizmem związków z grupy bisfosfonianów. Wyniki testów na proliferację komórek (test Alamar Blue) przeprowadzone po 1, 3 i 7 dniach hodowli przedstawiono na Fig. 9C. Otrzymane dane jednoznacznie potwierdzają, iż proliferacja komórek osteoklastycznych hodowanych na materiałach hybrydowych zostaje zahamowana po 7 dniach eksperymentu. Efekt ten jest wyraźny tylko w przypadku materiałów hybrydowych (istotność statystyczna porównując wyniki po 3 i 7 dniach hodowli). Jednocześnie nie zaobserwowano istotności wpływu analizowanych stężeń cząstek w matrycy hydrożelowej na ten efekt. Podsumowując wykazano, iż otrzymane systemy hybrydowe o testowanej zawartości cząstek MSP-NH2-HAp-ALN (C1, C2 i C3) posiadają potencjał terapeutyczny przejawiający się upośledzeniem aktywności modelowych komórek osteoklastycznych.

Przykład 4. Badania biomineralizacji in vitro w warunkach SBF

W celu wykazania, iż otrzymana Innowacja będzie sprzyjała biointegracji materiału z kością i tym samym wspomagała zaburzony w procesie osteoporozy proces mineralizacji kości zbadano jej właściwości bioaktywne. Przeprowadzono eksperyment biomineralizacji in vitro w warunkach symulowanego sztucznego osocza (SBF). Eksperyment ten obejmował inkubację materiałów w SBF w 37°C. Następnie w celu weryfikacji utworzenia nowej fazy mineralnej w określonych punktach czasowych (po 3, 5, 7 dniach inkubacji w SBF) materiały zostały poddane badaniom przy użyciu technik SEM i EDS.

Eksperyment biomineralizacji obejmował inkubację otrzymanych materiałów hybrydowych i materiału kontrolnego w SBF w 37°C przez odpowiednio 3, 5 i 7 dni. Po tym czasie materiały były płukane 3-krotnie wodą i suszone. W celu weryfikacji utworzenia nowej fazy mineralnej materiały poddane badaniom przy użyciu technik SEM i EDS. Fig. 10 przedstawia zestawienie mikrofotografii SEM i stosunki Ca/P oszacowane na podstawie analizy EDS. Zaobserwowano, iż w przypadku wszystkich testowanych materiałów zarówno hybryd jak i materiału hydrożelowego dochodzi do utworzenia nowej fazy mineralnej już po 3 dniach inkubacji! Jest to bardzo ciekawy wynik wyraźnie wskazujący, iż sama matryca ColChCSmod30_20 wykazuje zdolność do indukowania mineralizacji. Można zauważyć, że w przypadku układu hydrożelowego, wraz ze wzrostem długości czasu inkubacji w SBF, zwiększa się zarówno zakres fazy mineralnej, jak również wartość stosunku Ca/P. W przypadku układów hybrydowych, wydłużony czas trwania inkubacji nie jest wprost powiązany z otrzymanym stosunkiem Ca/P, jednakże zaobserwowano, iż wyższe stężenie cząstek w układach sprzyjało tworzeniu większych agregatów fazy mineralnej.

Przykład 5. Skuteczność wykorzystania matryc hydrożelowych jako „narzędzia” ograniczającego niekontrolowany wyciek leku

Zbadano również kinetykę uwalniania leku z hydrożelowego systemu w warunkach fizjologicznych. W tym celu otrzymany układ hybrydowy poddano inkubacji w roztworze PBS przez 20 dni (37°C, 50 rpm). Po upływie określonych przedziałów czasowych (1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 96 h, 192 h, 288 h, 480 h) roztwór zbierano i spektrofotometrycznie oznaczano stężenie ALN, a hybrydy zalewano świeżą porcją PBS. Fig. 11 przedstawia profil uwalniania leku z otrzymanych hybryd wyrażony jako procent całkowitej zawartości leku w cząstkach. Otrzymany profil dla materiału hybrydowego w zestawieniu z wynikiem uwadniania ALN bezpośrednio z cząstek MSP-NH2-HAp-ALN wyraźnie wskazuje na skuteczność wykorzystania matryc hydrożelowych jako „narzędzia” ograniczającego niekontrolowany wyciek leku. Oprócz efektywnego zahamowania tzw. „burst release” można również zaobserwować wydłużone w czasie uwalnianie alendronianu.

Przykład 6. Efekt terapeutyczny otrzymanych materiałów

Przeprowadzone wstępne badania biologiczne in vitro z wykorzystaniem komórek J774A.1 (model osteoklastów) wykazały, iż materiał według wynalazku posiada potencjał terapeutyczny przejawiający się istotnym upośledzeniem aktywności modelowych komórek osteoklastycznych. Efekt ten w porównaniu do materiału ze zgłoszenia patentowego nr P.435104 jest istotnie wyraźniejszy.

Potwierdzono, iż wprowadzenie do systemu zmodyfikowanego lizyną siarczanu chondroityny pozwoliło uzyskać biomateriał wspomagający proces kościotworzenia, co jest niezwykle istotne w kontekście wspomagania regeneracji tkanki kostnej. Zaobserwowano biomineralizację zarówno dla zastosowanej matrycy CoChCSmod, jak i systemów hybrydowych już po 3 dniach inkubacji materiału w warunkach symulujących sztuczne osocze (SBF). Potwierdzono utworzenie nowej fazy mineralnej zapewniającej efektywniejszą biointegrację materiału z naturalną kością w warunkach in vivo. Otrzymane mikrofotografie SEM wykazały, iż zakres mineralizacji obejmuje duże powierzchnie hydrożelu. W przypadku matryc zastosowanych w stanie techniki (matryca KolChHAmod) po 3 dniach inkubacji w SBF obserwowano wstępne tworzenie nowej fazy mineralnej z niewielkim pokryciem powierzchni materiału.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Wielofunkcyjny, hydrożelowy materiał hybrydowy, znamienny tym, że zawiera:

a) matrycę biopolimerową zawierającą: kolagen, chitozan, siarczan chondroityny korzystnie modyfikowany,

b) sfunkcjonalizowane grupami aminowymi mezoporowate cząstki krzemionkowo-apatytowe o powierzchni całkowitej Sbet nie mniejszej niż 613 m²/g i mezoporach (2-50 nm) utworzonych w strukturze cząstek o objętości nie mniejszej niż 0,57 cm³/g,

c) substancję czynną wybraną spośród znanych leków bisfosfonianowych, zwłaszcza alendronian, przyłączoną do cząstek krzemionkowo-apatytowych,

d) substancję sieciującą.
2. Materiał hybrydowy według zastrz. 1, znamienny tym, że matryca biopolimerowa zawiera: kolagen, chitozan, modyfikowany siarczan chondroityny w stosunku wagowym wynoszącym odpowiednio 5 : 2 : 3.
3. Materiał hybrydowy według zastrz. 1 i 2, znamienny tym, że siarczan chondroityny jest modyfikowany lizyną.
4. Materiał hybrydowy według zastrz. 1, znamienny tym, że substancją sieciującą jest genipina.
5. Sposób wytwarzania wielofunkcyjnego, hydrożelowego materiału hybrydowego, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

a) otrzymuje się funkcjonalizowane grupami aminowymi mezoporowate cząstki krzemionki w reakcji bromku cetylotrimetyloamonu, tetraetoksysilanu i aminopropylotrietoksysilanu, prowadzonej w roztworze wodnym w środowisku zasadowym, a następnie otrzymany materiał oddziela się i traktuje roztworem azotanu amonu w etanolu, korzystnie mieszając przez około 18 godzin w temperaturze 80°C, a następnie izoluje się uzyskane cząstki mezoporowatej krzemionki funkcjonalizowanej grupami aminowymi (MSP-NH2),

b) cząstki MSP-NH2 otrzymane w etapie a) zawiesza się w buforze symulującym ludzkie osocze (SBF), korzystnie o stężeniu 1,5 M, otrzymując po 5 dniach inkubacji sfunkcjonalizowane grupami aminowymi mezoporowate cząstki krzemionkowo-apatytowe (MSP-NH2-HAp),

PL 247558 Β1

c) do cząstek otrzymanych w etapie b) przyłącza się alendronian sodu,

d) do mieszaniny kolagenu, chitozanu i modyfikowanego lizyną siarczanu chondroityny dodaje się wodnej zawiesiny cząstek z etapu c)

e) mieszaninę otrzymaną w etapie d) poddaje się reakcji sieciowania genipiną.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że prowadzi się go metodą zol-żel.
7. Wielofunkcyjny, hydrożelowy materiał hybrydowy określony w dowolnym z zastrz. 1-4 do stosowania w leczeniu lub profilaktyce ubytków tkanki kostnej, zwłaszcza będących efektem osteoporozy.
8. Wielofunkcyjny, hydrożelowy materiał hybrydowy otrzymany sposobem określonym w dowolnym z zastrz. 5-6 do stosowania w leczeniu lub profilaktyce ubytków tkanki kostnej, zwłaszcza będących efektem osteoporozy.