PL247580B1

PL247580B1 - Kompozycja farmaceutyczna z flukonazolem o zwiększonej aktywności przeciwgrzybiczej, postać kompozycji farmaceutycznej oraz zastosowanie kompozycji farmaceutycznej

Info

Publication number: PL247580B1
Application number: PL443724A
Authority: PL
Inventors: Katarzyna MALEC; Katarzyna Malec; Karol Nartowski; Bożena Karolewicz; Urszula NAWROT; Urszula Nawrot; Agnieszka MATERA-WITKIEWICZ; Agnieszka Matera-Witkiewicz; Aleksandra Mikołajczyk; Dominik MARCINIAK; Dominik Marciniak
Original assignee: Univ Medyczny Im Piastow Slaskich We Wroclawiu
Priority date: 2023-02-09
Filing date: 2023-02-09
Publication date: 2025-07-28
Also published as: EP4661909A1; PL443724A1; WO2024167427A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca flukonazol i nośnik, który stanowi niejonowy trójblokowy kopolimer polioksyetyleno-polioksypropylenowy, charakteryzująca się tym, że zawiera flukonazol w stężeniu od 0,004% (w/v) do 0,45% (w/v) objętości kompozycji, niejonowy trójblokowy kopolimer polioksyetyleno-polioksypropylenowy w stężeniu od 0,08% (w/v) do 25% (w/v) objętości kompozycji i wodę oczyszczoną w ilości do 100% (w/v) objętości kompozycji, przy czym nośnik ma postać miceli o średnicy hydrodynamicznej od 5,0±0,1 nm do 40±1,0 nm. Wynalazek obejmuję również formulację zawierającą kompozycję oraz zastosowanie kompozycji albo formulacji.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna z flukonazolem, w której nośnikiem substancji czynnej jest polimer blokowy, do zastosowania w preparatach farmaceutycznych w terapii zakażeń grzybiczych powierzchniowych i układowych.

Z publikacji naukowej „Formulation & Evaluation of Fluconazole Gel for Topical Drug Delivery System” (American Scientific Research Journal for Engineering, Technology, and Sciences (ASRJETS) (2021) Volume 76, No 1, pp 124-137) znane są formulacje żelu do stosowania miejscowego zawierającego flukonazol oraz polimery Carbopol 940 i NaCMC (sól sodową karboksymetylocelulozy). Ponadto opisano zastosowanie metanolu jako promotora wchłaniania. W publikacji naukowej „Formulation and evaluation of fluconazole topical gel” (International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Vol 4, Suppl 5, 2012) opisano formulacje flukonazolu w postaci żelu do zastosowania miejscowego w leczeniu zakażeń grzybiczych skóry. Żele zostały opracowane z wykorzystaniem różnych polimerów, takich jak Carbopol 940, hydroksypropylometyloceluloza E4M, metyloceluloza, pektyna i Pluronic F-127 (w stężeniu 15 i 18%). Jako szczep modelowy do oceny aktywności przeciwgrzybiczej przygotowanych preparatów wykorzystano szczep Candida albicans. Natomiast w A Novel Thermo-Sensitive Sol-Gel Reversible Buccal Adhesive Property of Fluconazole in Situ Gel For Oral Thrush” (J. Biomed. Sci. and Res., Vol 2 (2), 2010, 100-109) ujawniono termowrażliwe i bioadhezyjne właściwości żelującego systemu dostarczania flukonazolu in situ, który może być stosowany w leczeniu pleśniawek jamy ustnej. Jako składowe opracowanego termowrażliwego nośnika zastosowano polimery bioadhezyjne poloksamer188 i Carbopol 934. W kolejnej publikacji naukowej „Fluconazole Loaded Cubosomal Vesicles for Topical Delivery” (Int J Drug Dev & Res 2015, 7:3) opisano formulację na bazie żelu kubosomalnego z flukonazolem do leczenia zakażeń grzybiczych skóry. Celem pracy była inkorporacja w kubosomach dużej ilości leku dla zwiększenia skuteczności terapeutycznej. Kubosomy zostały przygotowane techniką top down (fragmentacja przy użyciu sonikacji). W jeszcze innej publikacji naukowej „Thermoresponsive fluconazole gels for topical delivery: rheological and mechanical properties, in vitro drug release and anti-fungal efficacy” (Pharm Dev Technol, Early Online: 1-9) przedstawiono termowrażliwe żele z wykorzystaniem poloksamerów do miejscowego podawania flukonazolu (FLZ). Przygotowano osiem różnych formulacji zawierających 1% FLZ w poloksamerze i określonym współrozpuszczalniku (glikol propylenowy (PG) lub Transcutol-P) o różnych stężeniach. Z kolei w publikacji naukowej „Smart in-situ thermo-responsive and ion activated ophthalmic sol-gel system of fluconazole” (J Res Pharm 2021; 25(2): 173-178) opisano okulistyczne formulacje z przemianą zol-żel in situ, zdolne do uwalniania flukonazolu w miejscu podania (oko) przez dłuższy czas. Formulacje z flukonazolem żelujące in situ zostały przygotowane na bazie termowrażliwego Pluronicu F127, alginianu sodu i ich połączenia. Zoptymalizowana formulacja F8 składała się z flukonazolu (0,3% w/v), Pluronic F127 (1% w/v), alginianu sodu (0,5% w/v), chlorku sodu (0,9% w/v), chlorku benzalkoniowego (0,01% w/v) i buforu octanowego (pH 4 do 100% w/v). W innej publikacji („Development and machine-learning optimization of mucoadhesive nanostructured lipid carriers loaded with fluconazole for treatment of oral candidiasis” DRUG DEVELOPMENT AND INDUSTRIAL PHARMACY 2021, VOL 47, NO. 2, 246-258) opisano mukoadhezyjny nanostrukturalny nośnik lipidowy (NLC) z inkorporowanym flukonazolem w celu bardziej efektywnego leczenia kandydozy jamy ustnej. NLC zostały wytworzone przy użyciu techniki emulgacji/sonikacji. W skład nanocząstek wchodziły: kwas stearynowy, kwas oleinowy, Pluronic F127 i lecytyna. Nanocząstki charakteryzowały się wielkością cząstek 335 ± 13,5 nm, wydajnością inkorporacji 73,1 ± 4,9%. Powlekanie nanocząstek chitozanem zwiększyło ich adhezję do błony śluzowej policzka królika i poprawiło ich aktywność wobec Candida albicans. W „Recent progress in biomedical applications of Pluronic (PF127): Pharmaceutical perspectives” (J Control Release. 2015 Jul 10;209:120-38) ujawniono zastosowanie PF127 jako polimeru do otrzymywania nanonośników modyfikowanych innymi kopolimerami i/lub ich koniugatów z nanocząstkami magnetycznymi. Kluczowe wyniki tych badań wykazały, że nośniki na bazie PF127 mogą znacząco zwiększyć stabilność inkorporowanych substancji hydrofobowych, zmniejszyć potencjał cytotoksyczny in vitro i wychwyt komórkowy leków przeciwnowotworowych.

Problemem technicznym byłoby zapewnienie kompozycji farmaceutycznej zawierającej flukonazol do stosowania miejscowo w postaci żelu lub płynnej, o przedłużonym czasie kontaktu z miejscem aplikacji. Dodatkowo powinno być możliwe otrzymanie kompozycji w łatwy sposób. Ponadto kompozycja powinna charakteryzować się hamowaniem wzrostu drożdżaków już przy niskich stężeniach substancji czynnej, być skuteczną wobec opornych szczepów z rodzaju Candida, przy czym skład kompozycji nie powinien wpływać na obniżenie aktywności przeciwgrzybicznej substancji czynnej.

Pierwszym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca flukonazol i nośnik, który stanowi niejonowy trójblokowy kopolimer polioksyetyleno-polioksypropylenowy, charakteryzująca się tym, że zawiera flukonazol w stężeniu od 0,004% (w/v) do 0,45% (w/v) objętości kompozycji, niejonowy trójblokowy kopolimer polioksyetyleno-polioksypropylenowy w stężeniu od 0,08% (w/v) do 25% (w/v) objętości kompozycji i wodę oczyszczoną w ilości do 100% (w/v) objętości kompozycji, przy czym nośnik ma postać miceli o średnicy hydrodynamicznej od 5,0 ± 0,1 nm do 40 ± 1,0 nm.

W korzystnej realizacji wynalazku kompozycja zawiera flukonazol w stężeniu od 0,004% (w/v) do 0,013% (w/v) objętości kompozycji, niejonowy trójblokowy kopolimer polioksyetyleno-polioksypropylenowy w stężeniu od 0,08% (w/v) do 5% (w/v) objętości kompozycji i wodę oczyszczoną w ilości do 100% (w/v) objętości kompozycji.

W następnej korzystnej realizacji wynalazku kompozycja zawiera flukonazol w stężeniu od 0,13% (w/v) do 0,45% (w/v) objętości kompozycji, niejonowy trójblokowy kopolimer polioksyetyleno-polioksypropylenowy w stężeniu od 10% (w/v) do 25% (w/v) objętości kompozycji i wodę oczyszczoną w ilości do 100% (w/v) objętości kompozycji.

Drugim przedmiotem wynalazku jest formulacja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że ma postać roztworu micelarnego w wodzie i zawiera kompozycję farmaceutyczną jak określono w pierwszym przedmiocie wynalazku.

W korzystnej realizacji wynalazku formulacja farmaceutyczna dla zawartości niejonowego trójblokowego kopolimeru polioksyetyleno-polioksypropylenowego od 0,08% (w/v) do 15% (w/v) objętości kompozycji ma postać ciekłą.

W następnej korzystnej realizacji wynalazku formulacja farmaceutyczna dla zawartości niejonowego trójblokowego kopolimeru polioksyetyleno-polioksypropylenowego od 20% (w/v) do 25% (w/v) objętości ma postać żelu.

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku formulacja farmaceutyczna jest stabilna w czasie 84 dni.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji farmaceutycznej, jak określono w pierwszym przedmiocie wynalazku albo formulacji farmaceutycznej, jak określono w drugim przedmiocie wynalazku do stosowania w terapii zakażeń grzybiczych powierzchniowych i układowych.

W korzystnej realizacji wynalazku stosowanie w terapii zakażeń grzybiczych powierzchniowych i układowych obejmuje podawanie miejscowe albo przez podawanie iniekcyjne.

Innym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji farmaceutycznej, jak określono w pierwszym przedmiocie wynalazku albo formulacji farmaceutycznej, jak określono w drugim przedmiocie wynalazku do otrzymywania leków do terapii zakażeń grzybiczych powierzchniowych i układowych.

Zastosowany w formulacji nośnik ma właściwości powierzchniowo czynne. Po przekroczeniu krytycznego stężenia micelizacji (CMC) tworzy w roztworze polimerowe micele. Wraz z rosnącą zawartością polimeru blokowego w roztworze wodnym powstaje hydrożel.

Substancją czynną inkorporowaną w micelach w rozwiązaniu według wynalazku jest flukonazol. Należy on do grupy azoli o działaniu przeciwgrzybiczym, podawanym miejscowo i ogólnoustrojowo. Autorzy nie wykluczają inkorporacji innych leków azolowych, w stosunku do których mikroorganizmy mogły rozwinąć mechanizmy oporności. Stosowany jest w leczeniu kandydoz błon śluzowych w obrębie jamy ustnej, gardła, przełyku, pochwy; grzybic skóry; kandydoz uogólnionych obejmujących m.in. drogi oddechowe, drogi moczowe, opony mózgowe, błonę trzewną oraz wsierdzie. Zarejestrowane w Polsce preparaty z flukonazolem obejmują postacie stałe, tj. tabletki i kapsułki w dawce 50 mg, 100 mg, 150 mg oraz 200 mg. Wśród postaci płynnych zarejestrowany jest roztwór do infuzji o stężeniu 2 mg/ml oraz syrop o stężeniu 5 mg/ml. W recepturze aptecznej w oparciu o w/w roztwór do infuzji przygotowuje się krople do oczu z flukonazolem o zawartości 2 mg/ml.

Ze względu na rosnącą liczbę zakażeń grzybiczych układowych i powierzchniowych wskazane jest opracowanie formulacji, która zwiększy skuteczność leczenia przeciwgrzybiczego. Na całym świecie rosną koszty leczenia infekcji grzybiczych ze względu na rozwijającą się oporność wielolekową. Zjawisko oporności dotyczy zwłaszcza pochodnych azolowych. Candida albicans spośród drożdżaków jest najczęstszą przyczyną ciężkich infekcji, natomiast Candida glabrata jest szczególnie podatna na rozwój wielolekowej oporności, prawdopodobnie ze względu na swój haploidalny genom. Jednym z głównych mechanizmów oporności drożdżaków jest czynne usuwanie leku z ich komórki (efluks, ang. efflux) przez transportery błonowe pełniące funkcję pompy. Mutacje w genach powodują nadekspresję białek regulujących transport azoli do komórki, co skutkuje zwiększonym wypływem leku przez błonę komórkową grzybów. Inny mechanizm oporności polega na zmianach w enzymie będącym miejscem uchwytu dla azoli, a mianowicie 14a-demetylazy sterolu kodowanej przez gen ERG11. Gen ten bierze udział w syntezie ergosterolu, który jest niezbędnym składnikiem struktury błon komórkowych grzybów. Mutacja punktowa w genie prowadzi do ekspresji białka, które charakteryzuje się mniejszym powinowactwem do miejsca wiązania.

Zastosowanie Pluronic® F-127 w formulacji zgodnie z wynalazkiem niesie za sobą wiele korzyści, ponieważ jest to polimer nietoksyczny i biozgodny. Ma on właściwości żelujące i mukoadhezyjne, więc w zależności od stężenia i temperatury może mieć postać roztworu lub żelu, który nadaje się do podania miejscowego na skórę, błony śluzowe lub do oka, co pozwala na przedłużone uwalnianie leku w miejscu aplikacji. Cząstki (micele) w badanym układzie micelarnym charakteryzują się niewielkimi rozmiarami, nieprzekraczającymi 10 nm oraz w przypadku stężeń Pluronic® F-127 w formulacji powyżej 1% w/v 40 nm, co pozwala na ich potencjalne wykorzystanie do podania dożylnego. Substancja czynna w prezentowanym systemie jest solubilizowana przez nośnik, co poprawia nieznacznie jej rozpuszczalność. Z tego względu możliwe jest przygotowanie formulacji o zwiększonej zawartości flukonazolu niż zarejestrowany na rynku roztwór do infuzji i wykonywane z niego krople do oczu (2 mg/ml). Właściwości fizykochemiczne Pluronicu® oraz fakt, że dodatek flukonazolu do preparatów Pluronic® F-127 prowadził do statystycznie istotnego zahamowania wzrostu badanych drożdżaków oraz zwiększenia strefy zahamowania wzrostu w prowadzonych badaniach mikrobiologicznych in vitro, można wnioskować, że wykorzystany polimer blokowy w pewnym stopniu wpływał na strukturę ściany/membrany drożdżaków oraz na działanie opisanej pompy, przez co zaobserwowano zwiększenie efektywności leku dostarczanego do komórki.

Przykłady realizacji wynalazku zobrazowano na rysunku, gdzie:

- Fig. 1 przedstawia wielowymiarową analizę wariancji (MANOVA - ang. Multivariate analysis of variance) - wielowymiarowa analiza wyników absorbancji w metodzie mikrorozcieńczeń. Efekt: F(2, 1520)=23,511, p<0,00001, średnia ± 95% Cl;

- Fig. 2 przedstawia wielowymiarową analizę wariancji (MANOVA) - wielowymiarowa analiza wyników absorbancji w metodzie mikrorozcieńczeń. Efekt: F(61, 1520)=9,2569, p<0,00001, średnia ± 95% Cl;

- Fig. 3 przedstawia wielowymiarową analizę wariancji (MANOVA) - wielowymiarowa analiza wyników strefy zahamowania wzrostu w metodzie krążkowo-dyfuzyjnej. Efekt: F(3, 1001)=709,20, p<0,00001, średnia ± 95% Cl;

- Fig. 4 przedstawia wielowymiarową analizę wariancji (MANOVA) - wielowymiarowa analiza wyników strefy zahamowania wzrostu w metodzie krążkowo-dyfuzyjnej. Efekt: F(9, 1001)=39,355, p<0,00001, średnia ± 95% Cl;

- Fig. 5 przedstawia hydrodynamiczną średnicę miceli w formulacjach ze wzrastającą zawartością Pluronic® F-127 i flukonazolu;

- Fig. 6 przedstawia wykres zależności lepkości dynamicznej od temperatury formulacji 20,0% i 25,0% w/v Pluronic® F-127.

Przykład 1 Kompozycja farmaceutyczna

Opracowane preparaty flukonazolu (CAS 86386-73-4) inkorporowanego do roztworów wodnych Pluronic® F-127 (niejonowy trójblokowy kopolimer polioksyetyleno-polioksypropylenowy, CAS 9003-11-6) pozwoliło na otrzymanie formulacji o zwiększonej aktywności przeciwgrzybiczej wobec opornych szczepów Candida. Zestawienie formulacji według wynalazku przedstawiono w Tabeli 1.

PL 247580 Β1

Tabela 1. Formulacje micelarne z flukonazolem według wynalazku.

formulacja	stężenie Pluronic® F-127 [% w/v, mM]	stężenie flukonazolu [% w/v, mM]
F127-O.O8_FLU-1	0,08 (0,063)	0,00040 (0,013)
F127-O.O8_FLU-2	0,08 (0,063)	0,00080 (0,026)
F127-0.08_FLU-3	0,08 (0,063)	0,0016 (0,052)
F127-0.08_FLU-4	0,08 (0,063)	0,0031 (0,10)
F127-0.08_FLU-5	0,08 (0,063)	0,0064 (0,21)
F127-O.O8_FLU-6	0,08 (0,063)	0_f013 (0,42)
F127-5FLU-1	5,0 (4,0)	0,00040 (0,013)
F127-5_FLU-2	5,0 (4,0)	0,00080 (0,026)
F127-5_FLU-3	5,0 (4,0)	0,0016 (0,052)
F127-5_FLU-4	5,0 (4,0)	0,0031 (0,10)
F127-5_FLU-5	5,0 (4,0)	0,0064 (0,21)
F127-5_FLU-6	5,0 (4,0)	0,013 (0,42)
F127-10_FLU-7	10,0 (7,9)	0,13 (4,1)
F127-10_FLU-8	10,0 (7,9)	0,25 (8,2)
F127-10FLU-9	10,0 (7,9)	0,37 (12,2)
F127-10_FLU-10	10,0 (7,9)	0,45 (14,7)
F127-15_FLU-7	15,0 (11,9)	0,13 (4,1)
F127-15_FLU-8	15,0 (11,9)	0,25 (8,2)
F127-15FLU-9	15,0 (11,9)	0,37 (12,2)
F127-15_FLU-1O	15,0 (11,9)	0,45 (14,7)
F127-20_FLU-7	20,0 (15,9)	0,13 (4,1)
F127-20FLU-8	20,0 (15,9)	0,25 (8,2)
F127-20_FLU-9	20,0 (15,9)	0,37 (12,2)
F127-20_FLU-10	20,0 (15,9)	0,45 (14,7)
F127-25FLU-7	25,0 (19,8)	0,13 (4,1)
F127-25_FLU-8	25,0 (19,8)	0,25 (8,2)
F127-25FLU-9	25,0 (19,8)	0,37 (12,2)
F127-25_FLU-10	25,0 (19,8)	0,45 (14,7)

Krytyczne stężenie micelizacji (CMC), czyli stężenie, powyżej którego w roztworze polimeru tworzą się micele, wyznaczono spektrofluorymetrycznie oraz za pomocą pomiarów napięcia powierzchniowego. Wyniosło ono odpowiednio 0,060% w/v oraz 0,062% w/v.

Formulacje zostały otrzymane poprzez metodę zwaną „direct dissolution” czyli rozpuszczanie polimeru w wodnym rozpuszczalniku i dodanie substancji czynnej. Następuje wówczas spontaniczna agregacja cząsteczek polimeru do miceli i inkorporacja substancji czynnej. Substancja czynna, w zależności od publikacji, ma postać wstępnie przygotowanego roztworu albo jest dodawana bezpośrednio w formie stałej do roztworu polimeru, np. jak w publikacji „Novel Nanomicellar Formulation Approaches for Anterior and Posterior Segment Ocular Drug Delivery” (Recent Pat Nanomed. 2012; 2(2): 82-95).

Formulacje z Pluronic® F-127 z zawartością do 5,0% w/v były wykonywane przez rozpuszczenie polimeru w sterylnej wodzie oczyszczonej w temperaturze 2-8°C. Roztwór polimeru był następnie dodawany do flukonazolu i mieszany do rozpuszczenia leku.

Formulacje z Pluronic® F-127 z zawartością powyżej 5,0% w/v były wykonywane przez dodanie roztworu flukonazolu w sterylnej wodzie oczyszczonej do polimeru i przechowywanie w temperaturze 2-8°C do rozpuszczenia polimeru.

Wielkość średnicy hydrodynamicznej miceli w przygotowanych formulacjach zbadano za pomocą pomiarów dynamicznego rozproszenia światła (DLS, ang. Dynamie Light Scattering) oraz obrazowania z użyciem transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM, ang. Transmission Electron Microscopy). W zależności od stężenia leku oraz polimeru wyniosły od 5,0 ± 0,1-8,4 ± 0,6 nm do 38 ± 1,0-40 ± 1,0 nm (Fig. 5). W większych stężeniach (od 3% w/v) micele agregują, stąd pojawia się populacja cząstek o zwiększonej wartości odczytanej średnicy (38 ± 1,0-40 ± 1,0 nm), która pozostaje niezmieniona wraz ze wzrostem stężenia polimeru do 5% w/v. W zakresie stężeń nośnika od 0,08% (w/v) do 20% (w/v) układ zachowuje postać ciekłą w temperaturze pokojowej. Powyżej 20% (w/v) stężenia nośnika obserwowane jest przejście fazowe zol-żel w temperaturze pokojowej. Biorąc pod uwagę, że w całym zakresie badanych stężeń (do 5% w/v) wielkość miceli była stała, można wnioskować, że ze wzrostem stężenia polimeru wielkość tworzonych agregatów jest stała, a zwiększa się ich ilość i gęstość upakowania. W konsekwencji ich specyficznej przestrzennej organizacji tworzy się hydrożel. Na Fig. 5 widać też większe średnice przy niskich stężeniach w okolicy CMC (do 0,08% w/v), co wynika z niestabilności układu w niskich stężeniach, który stabilizuje się po osiągnięciu CMC. Dodatek flukonazolu w szerokim zakresie stężeń obejmującym 1,6-16,3 mM nie wpłynął na zmianę średnicy hydrodynamicznej miceli względem miceli bez dodatku leku. Wobec czego można wnioskować, że formulacje o zwiększonej aktywności przeciwgrzybiczej, w których stężenie flukonazolu wynosiło 0,013-14,7 mM charakteryzowały się stałą wielkością miceli.

Rozpuszczalność oraz stabilność flukonazolu w formulacjach oznaczono za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC, ang. High-Performance Liguid Chromatography). Pluronic® F-127 poprawił maksymalną rozpuszczalność flukonazolu w wodzie przy stężeniu polimeru co najmniej 3,0% w/v. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że flukonazol był stabilny w roztworze polimeru w całym zakresie badanych stężeń przez 84 dni. Zawartość leku w preparatach utrzymywała się w granicach 100 ± 2,8% w zależności od formulacji.

Lepkość przygotowanych żeli oznaczono na reometrze rotacyjnym. Wykres zależności lepkości dynamicznej od temperatury wykazał termowrażliwość formulacji 20,0% i 25,0% w/v Pluronic® F-127 (Fig. 6). Temperatura przejścia fazowego zmniejszyła się wraz ze wzrostem stężenia polimeru (odpowiednio 25,8 ± 0,2°C i 21,3 ± 0,0°C). Dodatek flukonazolu nie miał wpływu na przejście zol-żel. Temperatura przejścia fazowego była niższa od temperatury ciała ludzkiego (36,6°C) i powierzchni ciała ludzkiego (34,0°C), co wskazuje na możliwość ich żelowania w miejscu aplikacji. W formulacjach o niższym stężeniu Pluronic® F-127 (10,0% w/v i 15,0% w/v, odpowiednio F127-10_FLU-7, F127-10_FLU-8, F127-10_FLU-9, F127-10_FLU-10, F127-10, i F127-15_FLU-7, F127-15_FLU-8, F127-15_FLU-9,

F127-15_FLU-10, F127-15) nie wykazano przejścia fazowego, stąd wniosek, że formulacje te mogłyby znaleźć zastosowania jako postaci płynne.

Przykład 2 Aktywność przeciwgrzybiczna

Aktywność przeciwgrzybiczą przygotowanych formulacji ustalono z wykorzystaniem drożdżaków (Candida spp.) opornych na flukonazol (C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis) oraz celem kontroli Candida krusei metodą mikrorozcieńczeń i metodą krążkowo-dyfuzyjną. Szczepy przechowywano w podłożu TSB (bulionie tryptonowo-sojowym, CAS 1132-61-2, nr katalogowy: PS 23, Biomaxima) w temp. -80°C. Przed każdymi testami wysiewano je na podłoże Sabourauda (agar Sabouraud z dektrozą i chloramfenikolem, nr katalogowy: 620203, Liofilchem) i inkubowano w 35°C przez 24 godziny. Następnie wykonano za pomocą densytometru zawiesinę o gęstości komórek 0,5 McFarlanda w podłożu RPMI 1640 z L-glutaminą bez wodorowęglanu sodu (medium, nr katalogowy: R6504, Sigma-Aldrich) i dodatkiem MOPS (kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego, CAS 1132-61-2).

Badania aktywności przeciwgrzybiczej prezentowanych formulacji metodą mikrorozcieńczeń wykonano na 22 szczepach grzybów:

- wzorcowy szczep oporny na flukonazol C. krusei ATCC (American Type Culture Collection) 6258 (szczep kontrolny, naturalnie oporny na flukonazol);

- wzorcowy szczep oporny na flukonazol C. albicans ATCC MYA-574;

- wzorcowy szczep oporny na flukonazol C. albicans ATCC 64124;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. albicans 1444;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. albicans 3057;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. albicans 3089;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. tropicals 3151;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 2586;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 2738;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 140;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 769;

PL 247580 Β1

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 773;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 1941;

— szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 1973;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 2342;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 3154;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 1467;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 2853;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 3010;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 137;

— szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 2124;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 3081.

Tabela 2. Formulacje kontrolne, wobec których porównywano efektywność przeciwgrzybiczą w metodzie mikrorozcieńczeń

formulacja	stężenie Pluronic® F-127 [% w/v, mM]	stężenie flukonazolu [%w/v, mM]
FLU-1	0	0,00040 (0,013)
FLU-2	0	0,00080 (0,026)
FLU-3	0	0,0016 (0,052)
FLU-4	0	0,0031 (0,10)
FLU-5	0	0,0064 (0,21)
FLU-6	0	0,013 (0,42)
F127-0.08	0,08 (0,063)	0
F127-5	5,0 (4,0)	0
formulacja	stężenie Pluronic® F-127 [% w/v, mM]	stężenie werapamilu [% w/v, mM]	stężenie flukonazolu [% w/v, mM]
WER	0	0,0049 (0,10)	0
WER_FLU-1	0	0,0049 (0,10)	0,00040 (0,013)
WER_FLU-2	0	0,0049 (0,10)	0,00080 (0,026)
WER_FLU-3	0	0,0049 (0,10)	0,0016 (0,052)
WERFLU-4	0	0,0049 (0,10)	0,0031 (0,10)
WER_FLU-5	0	0,0049 (0,10)	0,0064 (0,21)
WER_FLU-6	0	0,0049 (0,10)	0,013 (0,42)

W metodzie mikrorozcieńczeń 50 μΙ układu micelarnego (formulacje o stężeniu 0,16% w/v i 10,0% w/v Pluronic® F-127) z zawartością flukonazolu w zakresie stężeń 0,008 mg/ml - 0,256 mg/ml umieszczono w dołku 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej. Do każdego dołka dodano 50 μΙ zawiesiny z grzybami. Każdy z roztworów został dwukrotnie rozcieńczony po dodaniu do niego zawiesiny grzybów (zatem badane formulacje miały stężenia odpowiednio 0,004-0,128 mg/ml, 0,0004-0,0128% w/v, 0,013-0,42 mM - Tabela 1, formulacje‘F127-0.08_FLU: F127-0.08_FLU-1, F127-0.08_FLU-2, F127-0.08_FLU-3, F127-0.08_FLU-4, F127-0.08_FLU-5, F127-0.08_FLU-6, F127-5_FLU: F127-5_FLU-1, F127-5_FLU-2, F127-5_FLU-3, F127-5_FLU-4, F127-_FLU-5, F127-5_FLU-6). Końcowe stężenie grzybów w każdym dołku wynosiło około 1,5-10⁵ CFU/ml. Przygotowaną płytkę inkubowano 24 godziny w 35°C. Na podstawie wyników absorbancji przy długości fali 530 nm wyznaczono minimalne stężenie hamujące (MIC), czyli minimalne stężenie leku powodujące co najmniej 50% redukcję wzrostu komórek grzybów względem kontroli. Badanie przeprowadzono w standardzie EUCAST (ang., European Committee onAntimicrobial Susceptibility Testing). Jako kontrolę zastosowano roztwór flukonazolu w stężeniu 0,008 mg/ml - 0,256 mg/ml bez dodatku polimeru (Tabela 2, formulacje FLU-1, FLU-2, FLU-3, FLU-4, FLU-5, FLU-6) oraz roztwór miceli w stężeniu 0,16% w/v oraz 10,0% w/v bez inkorporowanego flukonazolu (zatem badane formulacje miały stężenia odpowiednio 0,08% w/v i 5% w/v - Tabela 2, formulacje F127-0.08,

PL 247580 Β1

F127-5). Od 2 do 4 dołków przy badaniu każdego szczepu pozostawiono na kontrolę wzrostu (bez dodatku badanego systemu). Od 2 do 4 dołków na płytce pozostawiono na kontrolę jałowości (bez zawiesiny grzybów). Werapamil (w postaci chlorowodorku, CAS 152-11-4), czyli substancja hamująca działanie pompy efflux z grupy ABC w komórkach grzybiczych i ograniczająca wzrost drożdżaków, został zastosowany jako kontrola w badaniach (Tabela 2, formulacje WER, WER_FLU-1, WER_FLU-2, WER_FLU-3, WER_FLU-4, WER_FLU-5, WER_FLU-6).

Analiza statystyczna wyników wykazała, że formulacja 5,0% w/v Pluronic® F-127 z flukonazolem powodowała statystycznie istotne zmniejszenie absorbancji oznaczające zahamowanie wzrostu drożdżaków (Fig. 1 i Tabela 3, F127-5_FLU-l-6 vs. FLU-1-6, p <0,000001). Nie zaobserwowano statystycznie istotnej różnicy w wartości absorbancji po dodaniu flukonazolu do polimeru w najniższym badanym stężeniu tj. nieco powyżej CMC (Fig. 1 i Tabela 3, FLU-1-6 vs. F127-0.08_FLU-1-6, p = 0,138034).

Rozpatrując poszczególne szczepy, C. albicans ATCC MYA-574, C. albicans 1444 oraz C. glabrata 2586, 2738, 2853, 1973, 1467 oraz 2124 wykazały największe różnice w absorbancji między formulacją Pluronic® F-127 z flukonazolem a roztworem flukonazolu bez polimeru (Fig. 2 i Tabela 3, F127-5J=LU-1-6 vs. FLU-1-6, odpowiednio p <0,000001, p <0,000001, p = 0,000036, p <0,000001, p <0,000001, p = 0,000001, p = 0,000010, p = 0,000011).

Tabela 3. Jednowymiarowe testy istotności dla wartości absorbancji (formulacje FLU-1-6, F127-0.08_FLU-1-6, F127-5_FLU-1-6, VVER_FLU-1-6), parametryzacja z sigma-ograniczeniami, dekompozycja efektywnych hipotez.

Efekt	Suma kwadratów (SS)	Stopnie swobody	Średnie kwadraty (MS)	F	P
Wyraz wolny		0
Formulacja	0,38515	2	0,192575	23,5113	p<0,000001
Flukonazol		0
Szczep	19,94150	19	1,049553	128,1384	p<0,000001
Formulacja*	0,25766	10	0,025766	3,1457	0,000540
Formulacja*Szczep	4,62509	61	0,075821	9,2569	p<0,000001
Flukonazol*Szczep	12,17893	95	0,128199	15,6517	p<0,000001
Formulacja*	3,77053	305	0,012362	1,5093	0,000001
Błąd	12,44998	1520	0,008191

Rozpatrując wartości MIC, u 5 badanych szczepów (C. krusei ATCC 6258, C. albicans 3057, C. glabrata 2586, C. glabrata 2738 i C. glabrata 2853) uległy one obniżeniu po dodaniu do roztworu flukonazolu blokowego polimeru Pluronic® F-127 (Tabela 4).

PL 247580 Β1

Tabela 4. Aktywność przeciwgrzybicza flukonazolu (formulacje FLU-1-6) oraz flukonazolu inkorporowanego do Pluronic® F-127 w stężeniach 0,08% w/v (formulacje F127-0.08_FLU-1-6) i 5,0% (formulacje F127-5_FLU-1-6).

szczep	MICso [mg/Lj
FLU-1-6	F127-0.08_FLU-l-6	F127-5_FLU-l-6
C. krusei ATCC 6258	32	16	16
C. albicans ATCC MYA-574	>64	>64	>64
C. albicans ATCC 64124	>64	>64	>64
C. albicans 1444	>64	>64	>64
C. albicans 3057
C. albicans 3089	32	32	*
C. tropicalis 3151	>64	>64	*
C. glabrata 2586 C. glabrata 2738	64 64	32 64	32 32
C. glabrata 140	64	64	64
C. glabrata 769	64	64	64
C. glabrata 773	64	64	64
C. glabrata 1941	64	64	64
C. glabrata 1973	64	64	64
C. glabrata 2342	64	64	64
C. glabrata 3154	64	64	64
C. glabrata 1467	64	64	64
C. glabrata 2853	32 I	- - ₁₆ :
C. glabrata 3010	32	32	32
C. glabrata 137	32	32	32
C. glabrata 2124	32	32	32
C. glabrata 3081	32	32	32

Na podstawie przedstawionych wyników zaobserwowano, że agregacja polimeru powyżej wartości CMC i inkorporacja flukonazolu do miceli nie obniżała aktywności przeciwgrzybiczej flukonazolu. Polimer blokowy bez dodatku flukonazolu nie hamował wzrostu drożdżaków (poza C. albicans 3089 and C. tropicalis 3151 wformulacji z 5,0% w/v Pluronic® F-127, przez co zostały wykluczone z oznaczenia wartości MIC i z analizy statystycznej, (*) w Tabeli 4), zatem roztwór miceli bez inkorporowanego leku nie był toksyczny dla komórek drożdży.

Badania aktywności przeciwgrzybiczej prezentowanych formulacji metodą krążkowo-dyfuzyjną wykonano na 15 szczepach grzybów:

- wzorcowy szczep oporny na flukonazol C. krusei ATCC 6258;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. albicans 3057;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 2586;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 2738;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 2853;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 3010;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 1467;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 2124;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 137;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 140;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 1941;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 1973;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 2342;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 3154;

- szczep kliniczny oporny na flukonazol C. glabrata 773.

PL 247580 Β1

Tabela 5. Formulacje kontrolne, wobec których porównywano efektywność przeciwgrzybiczą w metodzie krażkowo-dyfuzyjnej.

formulacja	stężenie Pluronic® F-127 [% w/v, mM]	stężenie flukonazolu [%w/v, mM]
FLU-7	0	0,13 (4,1)
FLU-8	0	0,25 (8,2)
FLU-9	0	0,37 (12,2)
FLU-10	0	0,45 (14,7)
F127-10	10,0 (7,9)	0
F127-15	15,0(11,9)	0
F127-20	20,0 (15,9)	0
F127-25	25,0 (19,8)	0

Gęstość komórek Candida inokulowanych na powierzchni agaru Mueller Hinton z dodatkiem glukozy i błękitu metylenowego wynosiła 0,5 McFarlanda. Studzienki o średnicy 7 mm wycinano w podłożu sterylnym korkociągiem. W każdej studzience na płytce agarowej umieszczano 20 pL roztworu flukonazolu (Tabela 5, formulacja FLU-7-10) lub roztwory Pluronic® F-127 o stężeniu 10,0% w/v, 15,0% w/v i 20,0% w/v z flukonazolem (Tabela 1, formulacje F127-10_FLU-7-10, F127-15_FLU-7-10, F127-FLU-7-10, F127-25_FLU-7-10). Końcowe stężenie flukonazolu w każdym dołku wynosiło 25 pg, 50 pg, 75 pg i 90 pg. Aby upewnić się, że dodatek polimeru nie hamuje wzrostu drożdży, przygotowano kolejne studzienki kontrolne wypełnione roztworami Pluronic® F-127 bez dodatku flukonazolu (Tabela 5, F127-10, F127-15, F127-20, F127-25). Po inokulacji płytki inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 35°C, a następnie zmierzono średnicę strefy zahamowania wzrostu (Tabela 6a i 6b).

Wyniki wykazały, że dodatek polimeru blokowego nawet w wysokich stężeniach nie hamował aktywności przeciwgrzybiczej flukonazolu podobnie jak w metodzie mikrorozcieńczeń. Dodatek polimeru nie hamował wzrostu drożdżaków w studzienkach wypełnionych roztworami Pluronic® F-127 bez flukonazolu niezależnie od stężenia polimeru. W 10 z 15 badanych szczepów strefa zahamowania wzrostu uległa zwiększeniu, a największy wzrost średnicy strefy zahamowania w porównaniu z roztworami flukonazolu zaobserwowano dla Pluronic® F-127 w stężeniu 10,0% w/v (Tabela 1, formulacje F127-10_FLU-7-10).

Tabela 6a i 6b. Aktywność przeciwgrzybicza flukonazolu (formulacje FLU_7-10) oraz flukonazolu inkorporowanego do Pluronic® F-127 w stężeniach 10,0% w/v (F127-10_FLU-7-10), 15,0% (F127-15_FLU-7-10) i 20% w/v (F127-20_FLU-7-10).

Tabela 6a

	Strefa zhamowania wzrostu [mm]
szczep	FLU-7	FLU-8	FLU-9	FLU-10	F12710_FLU-7	F12710FLU-8	F12710FLU-9	οτ-nid ot -ćżtd
C. k. ATCC 6258	7,0 ±0,0	14,8 ±1,9	20,4 +1,8	22,8 +1,2	12,8 ±0,4	22,4 ±0,5	24,2 ±0,8	26,2 +0,4
C. a. 3057	7,0 +0,0	21,3 ±1,0	24,3 ±1,1	26,2 +1,2	19,4 ±0,5	24,0 ±0,5	26,5 ±0,8	27,6 +0,5
C. g. 2586	7,0 +0,0	7,0 ±0,0	14,6 ±0,6	17,2 +0,9	7,0 ±0,0	7,0 ±0,0	18,0 ±0,0	18,3 +0,6
C. g. 2738	7,0 ±0,0	7,0 ±0,0	16,3 +0,8	17,7 +0,5	7,0 ±0,0	7,0 ±0,0	18,2 ±0,9	19,6+1,2

PL 247580 Β1

c. g. 2853	7,0 +0,0	16,5 ±1,1	19,2 ±1,1	20,7 ±0,4	7,0 ±0,0	19,6 ±0,5	22,5 ±0,5	26,4 ±0,5
C. g. 3010	7,0 +0,0	7,0 ±0,0	15,3 ±0,5	18,2 ±0,7	19,1 ±1,2	24,2 ±1,2	27,6 ±0,5	29,8 ±0,5
C. g. 1467	7,0 +0,0	7,0 +0,0	7,0 ±0,0	14,7 ±0,6	7,0 +0,0	7,0 ±0,0	18,0 ±0,0	18,7 ±0,4
C. g. 2124	7,0 ±0,0	7,0 ±0,0	16,7 ±1,4	20,8 ±1,0	7,0 ±0,0	17,7 ±0,4	20,3 ±0,7	21,4 ±0,9
c. g. 137	7,0 ±0,0	7,0 ±0,0	16,3 ±1,3	18,2 ±0,6	7,0 ±0,0	7,0 ±0,0	18,6 ±1,3	20,1 ±1,3
c. g. 140	7,0 +0,0	7,0 ±0,0	17,6 ±0,5	19,9 ±0,5	7,0 ±0,0	21,5 ±0,0	20,3 ±1,4	20,5 ±0,6

C. k. - C. krusei; C. a. - C. albicans; C. g. - C. glabrata; jeżeli nie zaobserwowano strefy zahamowania wzrostu, w tabeli wskazana średnica studzienki; wyniki przedstawione w formie średnia ± odchylenie standardowe; w tabeli pominięto szczepy C. glabrata 1941, 1973, 2342, 3154 i 773, dla których nie obserwowano strefy zahamowania wokół dołków na płytkach zarówno w przypadku formulacji z flukonazolem, jak i z flukonazolem wprowadzonym do formulacji z Pluronic® F-127

Analiza statystyczna potwierdziła, że strefa zahamowania wzrostu była statystycznie istotnie większa, gdy do flukonazolu dodano polimer blokowy, niezależnie od stężenia polimeru (Fig. 3 i Tabela 7, FLU-7-10 vs. F127-10_FLU-7-10, p <0,000001, FLU vs. F127-15_FLU-7-10, p <0,000001 oraz FLU vs. F127-20_FLU-7-10, p <0,000001).

Ten sam efekt był obserwowany, gdy rozpatrywano poszczególne stężenia flukonazolu w dołku (25 pg, 50 pg, 75 pg i 90 pg oznaczone odpowiednio jako FLU-7, FLU-8, FLU-9, FLU-10, Tabela 1) inkorporowane do formulacji z polimerem (Fig. 4 i Tabela 7), gdzie tabela 7 przedstawia wyniki analizy statystycznej, którą objęto i porównywano formulacje FLU-7-10, F127-10_FLU-7-10, F127-15_FLU-7-10, F127-20_FLU-7-10 z tabel 1 i 5, czyli 4 różne typy formulacji, a w obrębie każdego typu 4 próbki o zróżnicowanym stężeniu flukonazolu, czyli 16 formulacji.

Tabela 7. Jednowymiarowe testy istotności dla wartości strefy zahamowania wzrostu (formulacje FLU-7-10, F127-10_FLU-7-10, F127-15_FLU-7-10, F127-20_FLU-7-10), parametryzacja z sigma-ograniczeniami, dekompozycja efektywnych hipotez.

Efekt	Suma kwadratów	Stopnie swobody	Średnie kwadraty	F	P
Wyraz wolny	164790,7	1	164790,7	97786,82	p<0,000001
Formulacja	3585,5	3	1195,2	709,20	p<0,000001
Flukonazol	55050,6	3	18350,2	10889,02	p<0,000001
Szczep	29703,1	9	3300,3	1958,42	p<0,000001
Formulacja*	596,6	9	66,3	39,33	p<0,000001
Formulacja*Szczep	5325,7	27	197,2	117,05	p<0,000001
Flukonazol*Szczep	7930,1	27	293,7	174,29	p<0,000001
Formulacja*	5018,0	81	62,0	36,76	p<0,000001
Błąd	1686,9	1001	1,7

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca flukonazol i nośnik, który stanowi, niejonowy trójblokowy kopolimer polioksyetyleno-polioksypropylenowy, znamienna tym, że zawiera flukonazol w stężeniu od 0,004% (w/v) do 0,45% (w/v) objętości kompozycji, niejonowy trójblokowy kopolimer polioksyetyleno-polioksypropylenowy w stężeniu od 0,08% (w/v) do 25% (w/v) objętości kompozycji i wodę oczyszczoną w ilości do 100% (w/v) objętości kompozycji, przy czym nośnik ma postać miceli o średnicy hydrodynamicznej od 5,0 ± 0,1 nm do 40 ± 1,0 nm.
2. Kompozycja według zastrzeżenia 1, znamienna tym, że zawiera flukonazol w stężeniu od 0,004% (w/v) do 0,013% (w/v) objętości kompozycji, niejonowy trójblokowy kopolimer polioksyetyleno-polioksypropylenowy w stężeniu od 0,08% (w/v) do 5% (w/v) objętości kompozycji i wodę oczyszczoną w ilości do 100% (w/v) objętości kompozycji.
3. Kompozycja według zastrzeżenia 1 albo 2, znamienna tym, że zawiera flukonazol w stężeniu od 0,13% (w/v) do 0,45% (w/v) objętości kompozycji, niejonowy trójblokowy kopolimer polioksyetyleno-polioksypropylenowy w stężeniu od 10% (w/v) do 25% (w/v) objętości kompozycji i wodę oczyszczoną w ilości do 100% (w/v) objętości kompozycji.
4. Formulacja farmaceutyczna, znamienna tym, że ma postać roztworu wodnego zawierającego kompozycję farmaceutyczną jak określono w zastrzeżeniu 1.
5. Formulacja farmaceutyczna według zastrz. 4, znamienna tym, że dla zawartości niejonowego trójblokowego kopolimeru polioksyetyleno-polioksypropylenowego od 0,08% (w/v) do 20% (w/v) objętości kompozycji ma postać ciekłą.
6. Formulacja farmaceutyczna według zastrz. 4, znamienna tym, że dla zawartości niejonowego trójblokowego kopolimeru polioksyetyleno-polioksypropylenowego od 20% (w/v) do 25% (w/v) objętości kompozycji ma postać żelu.
7. Formulacja farmaceutyczna według dowolnego zastrz. od 4 do 6, znamienna tym, że jest stabilna w czasie 84 dni.
8. Kompozycja farmaceutyczna, jak określono w zastrzeżeniu 1 albo formulacja farmaceutyczna, jak określono w zastrz. 4, do stosowania w terapii zakażeń grzybiczych powierzchniowych i układowych.
9. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 8, znamienna tym, że stosowana jest miejscowo albo przez podawanie iniekcyjne.
10. Kompozycja farmaceutyczna, jak określono w zastrzeżeniu 1 albo formulacja farmaceutyczna, jak określono w zastrz. 4, do otrzymywania leków do terapii zakażeń grzybiczych powierzchniowych i układowych.