PL247631B1 - Method of preparing an aqueous extract of Trametes versicolor rich in protein and peptides and the use of the extract of Trametes versicolor to support the prevention and treatment of diseases caused by staphylococci and streptococci - Google Patents

Method of preparing an aqueous extract of Trametes versicolor rich in protein and peptides and the use of the extract of Trametes versicolor to support the prevention and treatment of diseases caused by staphylococci and streptococci

Info

Publication number
PL247631B1
PL247631B1 PL445189A PL44518923A PL247631B1 PL 247631 B1 PL247631 B1 PL 247631B1 PL 445189 A PL445189 A PL 445189A PL 44518923 A PL44518923 A PL 44518923A PL 247631 B1 PL247631 B1 PL 247631B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
extract
temperature
peptides
rich
proteins
Prior art date
Application number
PL445189A
Other languages
Polish (pl)
Other versions
PL445189A1 (en
Inventor
Urszula Kosikowska
Sylwia Andrzejczuk
Dorota Pietras-Ożga
Katarzyna Michalak
Stanisław Winiarczyk
Original Assignee
Univ Medyczny W Lublinie
Univ Przyrodniczy W Lublinie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Medyczny W Lublinie, Univ Przyrodniczy W Lublinie filed Critical Univ Medyczny W Lublinie
Priority to PL445189A priority Critical patent/PL247631B1/en
Publication of PL445189A1 publication Critical patent/PL445189A1/en
Publication of PL247631B1 publication Critical patent/PL247631B1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
    • A61K36/07—Basidiomycota, e.g. Cryptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/01—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/10—Preparation or pretreatment of starting material
    • A61K2236/13—Preparation or pretreatment of starting material involving cleaning, e.g. washing or peeling
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/10—Preparation or pretreatment of starting material
    • A61K2236/15—Preparation or pretreatment of starting material involving mechanical treatment, e.g. chopping up, cutting or grinding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/331—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using water, e.g. cold water, infusion, tea, steam distillation or decoction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/51—Concentration or drying of the extract, e.g. Lyophilisation, freeze-drying or spray-drying
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/53—Liquid-solid separation, e.g. centrifugation, sedimentation or crystallization

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Preparation Of Fruits And Vegetables (AREA)

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób otrzymywania ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) bogatego w białka i peptydy, charakteryzuje się tym, że przed ekstrakcją owocniki przygotowuje się w ten sposób, że oczyszczone i podzielone na mniejsze fragmenty mrozi się w temperaturze -20°C do -80°C, po czym zamrożony materiał zalewa się ciekłym azotem korzystnie trzykrotnie i rozciera się na proszek lub alternatywnie poddaje się liofilizacji w temperaturze od -50°C do -40°C, korzystnie -45°C przy ciśnieniu wynoszącym od 4 do 6 Pa, optymalnie 5 Pa, aż do uzyskania stałej masy liofilizatu, następnie zliofilizowane lub rozdrobnione (roztarte) owocniki poddaje się ekstrakcji zalewając wodą w proporcjach w:w od 1:15 do 1:30, korzystnie 1:20, proces prowadzi się w temperaturze od 50°C do 80°C przez 1,5 do 2-ch godzin, po czym chłodzi do temperatury 30°C, odwirowuje supernatant i poddaje koncentracji, korzystnie do uzyskania dziesięciokrotnie zatężonego ekstraktu. Przedmiotem zgłoszenia jest także ekstrakt z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) bogatego w białka i peptydy do zastosowania do wspomagania profilaktyki i leczenia chorób wywoływanych przez gronkowce i paciorkowce.The subject of the application is a method for obtaining an extract from the variegated taraxacum (Trametes versicolor) rich in proteins and peptides, characterized in that before extraction, the fruiting bodies are prepared in such a way that they are purified and divided into smaller fragments and frozen at a temperature of -20°C to -80°C, then the frozen material is poured with liquid nitrogen, preferably three times, and ground into powder or alternatively subjected to lyophilization at a temperature of -50°C to -40°C, preferably -45°C at a pressure of 4 to 6 Pa, optimally 5 Pa, until a constant mass of the lyophilizate is obtained, then the lyophilized or crushed (ground) fruiting bodies are subjected to extraction by pouring water in w:w proportions of 1:15 to 1:30, preferably 1:20, the process is carried out at a temperature of 50°C to 80°C for 1.5 to 2 hours, then cooled to 30°C, the supernatant was centrifuged, and concentrated, preferably to a ten-fold concentrated extract. The application also covers an extract of the variegated tarsi (Trametes versicolor), rich in proteins and peptides, for use in supporting the prevention and treatment of diseases caused by staphylococci and streptococci.

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiot wynalazku stanowi sposób otrzymywania wodnego ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) bogatego w białko oraz jego hydrolizatu, w którym zastosowano ciekły azot lub proces liofilizacji i dobór optymalnej temperatury ekstrakcji na etapie przygotowywania surowca do rozdrobnienia oraz ekstrakcji białek endogennych oraz zastosowanie wodnego ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) oraz jego hydrolizatu do wspomagania profilaktyki i leczenia chorób wywołanych przez gronkowce i paciorkowce.The subject of the invention is a method for obtaining an aqueous extract of Trametes versicolor rich in protein and its hydrolysate, in which liquid nitrogen or a lyophilization process is used and the selection of the optimal extraction temperature at the stage of preparing the raw material for fragmentation and extraction of endogenous proteins, as well as the use of an aqueous extract of Trametes versicolor and its hydrolysate to support the prevention and treatment of diseases caused by staphylococci and streptococci.

Analizując literaturę tematu, można znaleźć prace, w których opisywano endogenne białka i peptydy pochodzące z grzybów, w tym stosowane do regulowania (obniżania) ciśnienia krwi np. u pacjentów z nadciśnieniem oraz o aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Były to białka i peptydy bezpośrednio wyekstrahowane w różnych temperaturach ze świeżych owocników grzybów1, wysuszonych owocników w formie proszków2 lub sfermentowanych proszków3 przy użyciu wody destylowanej o temp. 4°C/25°C4, 30°C/50°C5, i 95°C/100°C6, jak również z wykorzystaniem buforu Tris-HCl7, 0,1 M buforu HEPES-KOH (pH 7,5)8, roztworu NaOH (pH 12,0)9, roztworu 0,15 M NaCl10, acetonu11, a także etanolu lub metanolu5, 12 oraz 5% (v/v) zmrożonego kwasu octowego z 0,1% (v/v) β-merkaptoetanolem13.When analyzing the literature on the subject, one can find works describing endogenous proteins and peptides derived from fungi, including those used to regulate (lower) blood pressure, e.g. in patients with hypertension, and those with antimicrobial activity. These were proteins and peptides directly extracted at different temperatures from fresh mushroom fruiting bodies 1 , dried fruiting bodies in the form of powders 2 or fermented powders 3 using distilled water at 4°C/25°C 4 , 30°C/50°C 5 , and 95°C/100°C 6 , as well as using Tris-HCl buffer 7 , 0.1 M HEPES-KOH buffer (pH 7.5) 8 , NaOH solution (pH 12.0) 9 , 0.15 M NaCl solution 10 , acetone 11 , as well as ethanol or methanol 5 , 12 and 5% (v/v) frozen acetic acid with 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol 13 .

Większość grup badawczych skupiała się na pełnych ekstraktach otrzymywanych z grzybów różnymi metodami i z użyciem często skomplikowanych, czasochłonnych i materiałochłonnych procedur, szczególnie z użyciem rozpuszczalników organicznych, w tym alkoholowych (głównie metanol i/lub etanol).Most research groups focused on whole extracts obtained from mushrooms by various methods and using often complicated, time-consuming and material-intensive procedures, especially those involving organic solvents, including alcohols (mainly methanol and/or ethanol).

W znanym stanie techniki można zauważyć niewielką liczbę odniesień literaturowych dotyczących hydrolizy białek grzybowych i otrzymywania z nich aktywnych biologicznie peptydów. Temat hydrolizy enzymatycznej białek grzybowych został przedstawiony w publikacji And i Ismail-Fitry14 dotyczącej przydatności peptydów otrzymywanych na bazie hydrolizy bromelainą. Enzym ten wykorzystano do cięcia białek z takich grzybów jak: shitake, boczniak ostrygowaty, grzyby shimeji i płomiennica zimowa w celu stworzenia najbardziej aromatycznego proszku kulinarnego. Autorzy przedstawili stopnie hydrolizy - DH (ang. degree of hydrolysis), wahające się w zakresie od 54 do 67%. Kolejną pozycją dotyczącą pozyskiwania hydrolizatów grzybowych jest publikacja z zastosowaniem proteazy15. W tej pozycji literaturowej, 0,1% (w/w) roztwór proteazy ProtamexTM był wykorzystywany do pozyskiwania peptydów z podstawczaka pochwiaka wielkopochwowego (Volvariella volvaceae). Reakcję prowadzono w trzech różnych temperaturach i różnych czasach trwania reakcji, co dało ostatecznie stopień hydrolizy sięgający 25%. Skuteczność trawienia proteinazą K, pepsyną i trypsyną przy różnych stężeniach enzymów (0,05%, 0,10%, 0,15%) i temperaturach (30°C, 40°C i 50°C) oraz odstępach czasu (60, 90 i 120 min) była również badana przez zespół Goswami i in.16. Materiałem do badań prowadzonych przez tę grupę badawczą były suszone owocniki boczniaka ostrygowatego Pleurotus ostreatus, uprawiane na słomie ryżowej. Przedstawione w tej publikacji dane na temat optymalizacji procesu enzymatycznej hydrolizy wyraźnie pokazały, że najbardziej odpowiednią pod względem uzyskiwanej wartości DH jest reakcja z użyciem 0,15% proteinazy K, w temperaturze 50°C przez 2 godziny. Produkt otrzymany przez Goswami i in.16 w drodze hydrolizy białek grzybowych charakteryzował się wysoką wydajnością pienienia, stabilnością piany oraz właściwościami emulgującymi. Podobne wartości DH otrzymane podczas trawienia trypsyną uzyskał zespół Farzaneh i in.17 dwóch grzybów z gatunku podstawczaków - pieczarka dwuzarodnikowa (Agaricus bisporus) i z gatunku workowców - trufla pustynna (Terfezia clavery). We wspomnianym artykule otrzymana wartość DH wahała się od 7,50 do 20,10%, a przygotowywanie badanych próbek różniło się występowaniem lub brakiem etapu blanszowania.The prior art contains a limited number of literature references on the hydrolysis of fungal proteins and the production of biologically active peptides. The topic of enzymatic hydrolysis of fungal proteins was discussed in a publication by And and Ismail-Fitry 14 concerning the usefulness of peptides obtained by hydrolysis with bromelain. This enzyme was used to cleave proteins from mushrooms such as shitake, oyster mushrooms, shimeji mushrooms, and winter mushrooms to create the most aromatic culinary powder. The authors presented degrees of hydrolysis (DH), ranging from 54 to 67%. Another publication on the production of fungal hydrolysates is a publication using protease 15 . In this publication, a 0.1% (w/w) Protamex™ protease solution was used to obtain peptides from the basidiomycete Volvariella volvaceae. The reaction was carried out at three different temperatures and reaction times, resulting in a final hydrolysis degree of up to 25%. The digestion efficiency of proteinase K, pepsin, and trypsin at various enzyme concentrations (0.05%, 0.10%, 0.15%), temperatures (30°C, 40°C, and 50°C), and time intervals (60, 90, and 120 min) was also studied by Goswami et al. 16 . The material for the study conducted by this research group were dried fruiting bodies of the oyster mushroom Pleurotus ostreatus, grown on rice straw. The data presented in this publication on the optimization of the enzymatic hydrolysis process clearly showed that the most suitable reaction in terms of the obtained DH value was 0.15% proteinase K at 50°C for 2 hours. The product obtained by Goswami et al. 16 by hydrolysis of fungal proteins was characterized by high foaming efficiency, foam stability, and emulsifying properties. Similar DH values obtained during trypsin digestion were obtained by the team of Farzaneh et al. 17 for two basidiomycetes - the two-spore mushroom (Agaricus bisporus) and the ascomycete - the desert truffle (Terfezia clavery). In the aforementioned article, the DH values obtained ranged from 7.50 to 20.10%, and the preparation of the tested samples differed in the presence or absence of a blanching step.

Ze stanu techniki znany jest również sposób otrzymywania białka z owocników T. versicolor, który został ujęty w zgłoszeniu patentowym TW201428005 (A) autorstwa Sheu Fuu, Kuan Yen-Chou, Wu Ying-Jou z 2014 roku, gdzie opisano sposób otrzymywania z owocników T. versicolor nowego białka YZP za pomocą chromatografii anionowymiennej. YZP jest nieglikozylowanym białkiem o masie cząsteczkowej 12 kDa, zawierającym 139 aminokwasów, wykazującym znaczącą aktywność przeciwzapalną.A method for obtaining protein from T. versicolor fruiting bodies is also known in the art. This method is included in patent application TW201428005 (A) by Sheu Fuu, Kuan Yen-Chou, and Wu Ying-Jou from 2014, which describes a method for obtaining the novel YZP protein from T. versicolor fruiting bodies using anion exchange chromatography. YZP is a non-glycosylated protein with a molecular weight of 12 kDa, containing 139 amino acids, and exhibiting significant anti-inflammatory activity.

Wynalazek rozwiązuje problem sposobu otrzymywania bogatego w białko wodnego ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego (T. versicolor) i jego hydrolizatu, o właściwościach antyoksydacyjnych i aktywności przeciwbakteryjnej. W wynalazku zastosowano ciekły azot lub liofilizację na etapie przygotowywania surowca z wrośniaka różnobarwnego do jego łatwiejszego rozdrobnienia oraz dobór optymalnej temperatury ekstrakcji białek endogennych.The invention addresses the problem of obtaining a protein-rich aqueous extract of T. versicolor and its hydrolysate, with antioxidant properties and antibacterial activity. The invention utilizes liquid nitrogen or freeze-drying during the preparation of the T. versicolor raw material for easier fragmentation, and selects the optimal temperature for extracting endogenous proteins.

Rozdrobniony surowiec został użyty do pozyskiwania ekstraktu bogatego w białka endogenne, z których następnie w wyniku hydrolizy z zastosowaniem proteazy serynowej pochodzenia zwierzęcego, która okazała się właściwa ze względu na skład aminokwasowy surowca, otrzymywano peptydy wykazujące właściwości antyoksydacyjne i przeciwdrobnoustrojowe, szczególnie antybakteryjne.The crushed raw material was used to obtain an extract rich in endogenous proteins, from which, as a result of hydrolysis using serine protease of animal origin, which turned out to be appropriate due to the amino acid composition of the raw material, peptides with antioxidant and antimicrobial properties, especially antibacterial ones, were obtained.

Zgodnie z wynalazkiem najpierw przygotowuje się owocniki do ekstrakcji w ten sposób, że oczyszczone i podzielone na mniejsze fragmenty owocniki mrozi się w temperaturze -20 do -80°C, po czym zamrożony materiał zalewa się ciekłym azotem korzystnie trzykrotnie i rozciera się na proszek lub alternatywnie poddaje się liofilizacji w temperaturze od -50 do -40°C, korzystnie -45°C przy ciśnieniu wynoszącym od 4 do 6 Pa, optymalnie 5 Pa, aż do uzyskania stałej masy liofilizatu, następnie zliofilizowane lub rozdrobnione (roztarte) ciekłym azotem owocniki poddaje się ekstrakcji zalewając wodą w proporcjach w : w od 1 : 15 do 1 : 30, korzystnie 1 : 20, proces prowadzi się w temperaturze od 50 do 80°C, korzystnie 60°C przez 1,5 do 2 godzin, po czym chłodzi do temperatury 30°C, odwirowuje supernatant i poddaje koncentracji, korzystnie do uzyskania dziesięciokrotnie zatężonego ekstraktu.According to the invention, first, fruiting bodies are prepared for extraction in such a way that the fruiting bodies, cleaned and divided into smaller fragments, are frozen at a temperature of -20 to -80°C, then the frozen material is poured with liquid nitrogen, preferably three times, and ground into powder or alternatively subjected to lyophilization at a temperature of -50 to -40°C, preferably -45°C, at a pressure of 4 to 6 Pa, optimally 5 Pa, until a constant mass of the lyophilisate is obtained, then the lyophilized or crushed (ground) fruiting bodies with liquid nitrogen are subjected to extraction by pouring water in the proportions w : w from 1 : 15 to 1 : 30, preferably 1 : 20, the process is carried out at a temperature of 50 to 80°C, preferably 60°C for 1.5 to 2 hours, then cooled to a temperature of 30°C, centrifuged supernatant and concentrated, preferably to obtain a ten-fold concentrated extract.

Korzystnie, gdy proces ekstrakcji prowadzi się w 60°C, stale mieszając.Preferably, the extraction process is carried out at 60°C with constant stirring.

Korzystnie, gdy supernatant odwirowuje się w temperaturze 4°C, przy obrotach od 3000 do 6000, korzystnie 5000 xg.Preferably, the supernatant is centrifuged at 4°C, at 3000 to 6000 rpm, preferably 5000 xg.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania hydrolizatu z ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego (T. versicolor) bogatego w białko wodnego, polegający na tym, że gdy otrzymany i zatężony ekstrakt według wynalazku poddaje się hydrolizie enzymatycznej w pH w granicach od 7 do 9, optymalnie 8, w temperaturze w zakresie od 35 do 50°C, optymalnie 40°C za pomocą proteazy serynowej pochodzenia zwierzęcego gdzie ilość enzymu wobec białka zawartego w ekstrakcie wynosi od 5 do 20%, optymalnie 10%, a czas trwania procesu od 1 do 3 godzin, i po zakończonej reakcji otrzymuje się hydrolizat bogaty w białka oraz peptydy o aktywności antyoksydacyjnej i przeciwdrobnoustrojowej wobec gronkowców i paciorkowców.The subject of the invention is also a method for obtaining a hydrolysate from an extract of T. versicolor rich in aqueous protein, consisting in that when the obtained and concentrated extract according to the invention is subjected to enzymatic hydrolysis at a pH in the range of 7 to 9, optimally 8, at a temperature in the range of 35 to 50°C, optimally 40°C using a serine protease of animal origin, where the amount of enzyme in relation to the protein contained in the extract is from 5 to 20%, optimally 10%, and the duration of the process is from 1 to 3 hours, and after the reaction is completed, a hydrolysate rich in proteins and peptides with antioxidant and antimicrobial activity against staphylococci and streptococci is obtained.

Korzystnie, gdy po zakończeniu hydrolizy prowadzi się dezaktywację enzymu w zakresie temperatur od 95 do 105°C, optymalnie 98°C, korzystnie w czasie 10 do 15 minut.Preferably, after completion of hydrolysis, the enzyme is deactivated at a temperature ranging from 95 to 105°C, optimally 98°C, preferably within 10 to 15 minutes.

Przedmiotem wynalazku jest także ekstrakt z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) bogatego w białka i peptydy i jego hydrolizat do zastosowania do wspomagania profilaktyki i leczenia chorób wywoływanych przez gronkowce i paciorkowce.The subject of the invention is also an extract of Trametes versicolor, rich in proteins and peptides, and its hydrolysate for use in supporting the prevention and treatment of diseases caused by staphylococci and streptococci.

Jak wykazano w pracy doświadczalnej, warunkami sprzyjającymi ekstrakcji jest zamrożenie i roztarcie owocników poprzedzone kilkukrotnym zanurzeniem ich w ciekłym azocie lub alternatywnie, przeprowadzenie procesu liofilizacji przed rozdrobnieniem surowca.As demonstrated in experimental work, the conditions favorable for extraction are freezing and grinding the fruiting bodies, preceded by several immersions in liquid nitrogen, or alternatively, carrying out the freeze-drying process before grinding the raw material.

W sposobie według wynalazku na etapie przygotowywania surowca z wrośniaka różnobarwnego do ekstrakcji do jego łatwiejszego rozdrobnienia zastosowano ciekły azot lub liofilizację co w wydatnym stopniu wpływa na czas ekstrakcji i wydajność procesu. Zastosowanie wody jako rozpuszczalnika sprawia, że ekstrakt jest ekologiczny a przez to ma większe możliwości aplikacyjne. Ponadto dobór optymalnej temperatury do ekstrakcji białek endogennych podczas procesu ekstrakcji wpływa na wydajność ich pozyskiwania. W procesie hydrolizy ekstraktu zastosowano proteazę serynową pochodzenia zwierzęcego, która okazała się korzystna z uwagi na zgodność miejsc jej hydrolizowania wiązań peptydowych w stosunku do składu aminokwasowego.In the method according to the invention, liquid nitrogen or freeze-drying was used to facilitate fragmentation of the raw material from the variegated taraxacum officinale for extraction, significantly reducing extraction time and process efficiency. Using water as a solvent makes the extract eco-friendly and therefore offers greater application possibilities. Furthermore, selecting the optimal temperature for the extraction of endogenous proteins during the extraction process influences their yield. An animal-derived serine protease was used in the extract hydrolysis process, which proved beneficial due to the compatibility of its peptide bond hydrolysis sites with its amino acid composition.

Otrzymany ekstrakt oraz jego hydrolizat mogą znaleźć zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu, w szczególności jako w pełni naturalny konserwant żywności, kosmetyków oraz wyrobów medycznych i farmaceutycznych jako alternatywa do powszechnie stosowanych w tym celu substancji syntetycznych i związków chemicznych wykorzystywanych do wzbogacania produktów lub ich konserwacji.The obtained extract and its hydrolysate can be used in many industries, in particular as a fully natural preservative for food, cosmetics, medical and pharmaceutical products as an alternative to the commonly used synthetic substances and chemical compounds used to enrich products or preserve them.

Zgłaszający prowadzili badania mające na celu uzyskanie nieznanych dotychczas ekstraktów oraz hydrolizatów, nie opisanych w literaturze fachowej, które posiadają właściwości bioaktywne. Istotą wynalazku jest otrzymywanie i zastosowanie uzyskanego w wyniku procesu prowadzonego zgodnie z zaprojektowanym schematem wysokobiałkowego ekstraktu oraz hydrolizatu z wrośniaka różnobarwnego (T. versicolor) do wytwarzania preparatów o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, zwłaszcza przeciwbakteryjnym oraz do wytwarzania preparatu o działaniu antyoksydacyjnym. Uzyskane według wynalazku ekstrakty i hydrolizaty mogą znaleźć zastosowanie do otrzymania preparatów o działaniu antyoksydacyjnym, w tym składników bioaktywnych w kosmetykach oraz suplementach o działaniu antiaging czy naturalnych konserwantach. Ekstrakty uzyskane z wrośniaka różnobarwnego (T. versicolor) według wynalazku wykazują również silną aktywność przeciwbakteryjną - ekstrakty pozyskane z liofilizatu posiadają zależną od gatunku aktywność bakteriobójczą wobec gronkowców, w tym wobec gronkowca złocistego metycylino-opornego (MRSA - methicillin resistant Staphylococcus aureus) oraz bakteriostatyczną wobec paciorkowców, podczas gdy ekstrakt uzyskany z pominięciem procesu liofilizacji posiada zależną od szczepu aktywność bakteriobójczą wobec paciorkowców oraz bakteriostatyczną wobec gronkowców. Z tego względu, badana mieszanina może znaleźć zastosowanie do wytwarzania nowych produktów (wyrobów) farmaceutycznych o potencjalnym zastosowaniu podczas terapii chorób wywoływanych przez te bakterie u ludzi i zwierząt. Podobnie możliwe jest zastosowanie w środkach odkażających, zarówno antyseptykach, jak i dezynfektantach czy konserwantach. Uzyskane ekstrakty i hydrolizaty są bezpieczne w użytkowaniu, bowiem wrośniak jest znanym w medycynie grzybem, stosowanym jako adjuwant w leczeniu nowotworów.The applicants conducted research to obtain previously unknown extracts and hydrolysates, not described in the literature, possessing bioactive properties. The essence of the invention is the production and use of a high-protein extract and hydrolysate from the variegated taraxacum officinale (T. versicolor), obtained through a process conducted according to a designed protocol, for the production of preparations with antimicrobial, particularly antibacterial, activity, and for the production of a preparation with antioxidant activity. The extracts and hydrolysates obtained according to the invention can be used to obtain preparations with antioxidant activity, including bioactive ingredients in cosmetics and supplements with antiaging properties or as natural preservatives. The extracts obtained from the variegated tarsiers (T. versicolor) according to the invention also demonstrate potent antibacterial activity. Freeze-dried extracts possess species-dependent bactericidal activity against staphylococci, including methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), and bacteriostatic activity against streptococci. The extract obtained without freeze-drying exhibits strain-dependent bactericidal activity against streptococci and bacteriostatic activity against staphylococci. Therefore, the tested mixture may find application in the production of new pharmaceutical products (products) with potential use in the treatment of diseases caused by these bacteria in humans and animals. Similarly, it may be used in disinfectants, both antiseptics, disinfectants, and preservatives. The obtained extracts and hydrolysates are safe to use, because the fungus is a well-known fungus in medicine, used as an adjuvant in the treatment of cancer.

Aktywność antyoksydacyjną ekstraktów i hydrolizatów będących przedmiotem wynalazku oceniano metodami badającymi procent wygaszenia wolnych rodników: kationorodnika ABTS*+ [siarczan 2,2’azyno-di-(3-etylobenztiazoliny)] oraz rodnika DPPH* [2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyI]. Jak wynika z uzyskanych danych, powyższy ekstrakt i hydrolizat charakteryzowała zróżnicowana zdolność wygaszania wobec kationorodnika ABTS oraz rodnika DPPH* wahająca się od 50% do niemal 100%.The antioxidant activity of the extracts and hydrolysates being the subject of the invention was assessed using methods examining the percentage of quenching of free radicals: the ABTS*+ cation radical [2,2'azino-di-(3-ethylbenzthiazoline) sulfate] and the DPPH* radical [2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine]. As can be seen from the obtained data, the above extract and hydrolysate were characterized by a varied quenching capacity towards the ABTS cation radical and the DPPH* radical, ranging from 50% to almost 100%.

Przykład 1.Example 1.

Przed przystąpieniem do procesu ekstrakcji, owocniki oczyszczano, dzielono na mniejsze fragmenty i mrożono w temperaturze -80°C. Zamrożone owocniki umieszczano w tyglu ceramicznym i zalewano ciekłym azotem. Po odparowaniu azotu, materiał powtórnie zalewano ciekłym azotem i tak postępowano trzykrotnie. Następnie, zamrożone owocniki rozcierano celem rozdrobnienia oraz rozbicia ściany komórkowej grzyba. Roztarty proszek umieszczano w zlewce z mieszadłem magnetycznym, zalewano wodą [w : w, 1 : 20] i ogrzewano w temperaturze 60°C. Po dwóch godzinach reakcji, mieszaninę ochłodzono do temperatury 30°C, umieszczano w falkonach i odwirowywano przez 20 minut w temperaturze 4°C przy obrotach 5000 xg. Supernatant zlano i skoncentrowano dziesięciokrotnie przy użyciu koncentratora próżniowego. Uzyskany supernatant zlewano i poddawano dziesięciokrotnej koncentracji przy użyciu koncentratora próżniowego. W wyniku powyższego procesu uzyskany został materiał o następującym składzie białkowo-peptydowym: stężenie białka 2,91 mg/mL (0,0305 - błąd standardowy średniej) i stężenie peptydów 0,54 mg/mL (0,005 - błąd standardowy średniej).Before the extraction process, the fruiting bodies were cleaned, divided into smaller fragments, and frozen at -80°C. The frozen fruiting bodies were placed in a ceramic crucible and flooded with liquid nitrogen. After the nitrogen evaporated, the material was flooded again with liquid nitrogen, repeating this process three times. The frozen fruiting bodies were then ground to fragment and break down the fungal cell wall. The ground powder was placed in a beaker with a magnetic stirrer, poured with water [w:w, 1:20], and heated to 60°C. After two hours of reaction, the mixture was cooled to 30°C, placed in Falcons, and centrifuged for 20 minutes at 4°C at 5000 xg. The supernatant was decanted and concentrated ten-fold using a vacuum concentrator. The resulting supernatant was decanted and concentrated tenfold using a vacuum concentrator. This process yielded material with the following protein-peptide composition: protein concentration of 2.91 mg/mL (0.0305 - standard error of the mean) and peptide concentration of 0.54 mg/mL (0.005 - standard error of the mean).

P r z y k ł a d 2.Example 2.

Alternatywnie, owocniki grzyba wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) oczyszczano, cięto na mniejsze fragmenty oraz zamrażano na czas 24 h w temperaturze -80°C w celu przygotowania ich do liofilizacji. Proces liofilizacji został przeprowadzony w temperaturze -45°C, przy ciśnieniu wynoszącym 5 Pa, aż do uzyskania stałej masy liofilizatu. Następnie zliofilizowane i rozdrobnione (roztarte) owocniki zalewano wodą [w : w 1 : 20] i ogrzewano w temperaturze 60°C, stale mieszając przez 2 godziny, a następnie chłodzono do temperatury 30°C, odwirowywano w temperaturze 4°C, przy obrotach 5000 xg, a uzyskany supernatant zlewano i poddawano koncentracji przy użyciu koncentratora próżniowego do uzyskania dziesięciokrotnie zatężonego ekstraktu.Alternatively, fruiting bodies of the Trametes versicolor mushroom were cleaned, cut into smaller fragments, and frozen for 24 h at -80°C to prepare them for lyophilization. The lyophilization process was carried out at -45°C and 5 Pa until a constant lyophilizate mass was obtained. The lyophilized and ground (ground) fruiting bodies were then poured with water [w:w 1:20] and heated at 60°C with constant stirring for 2 hours. They were then cooled to 30°C, centrifuged at 4°C at 5000 xg, and the resulting supernatant was decanted and concentrated using a vacuum concentrator to obtain a tenfold concentrated extract.

Przykład 3.Example 3.

Postępuje jak w przykładzie 1 i 2, z tym, że po uzyskaniu ekstraktu przeprowadzano hydrolizę poprzez dodatek proteazy serynowej pochodzenia zwierzęcego w ilości 10% wobec stężenia białka w ekstrakcie. Po dodaniu enzymu, mieszaninę ogrzewano do 40°C i ustalano pH na poziomie 8,0. Po dwóch godzinach reakcję wstrzymywano poprzez zakończenie hydrolizy przez 10-minutowe ogrzewanie mieszaniny w temperaturze 95°C. Po ochłodzeniu, hydrolizat umieszczano w falkonach i odwirowywano przez 20 minut w temperaturze 4°C przy obrotach 5000 xg. Supernatant zlewano i poddawano dziesięciokrotnej koncentracji przy użyciu koncentratora próżniowego.The procedure was as in Examples 1 and 2, except that after obtaining the extract, hydrolysis was performed by adding animal-derived serine protease at 10% of the protein concentration in the extract. After adding the enzyme, the mixture was heated to 40°C and the pH was adjusted to 8.0. After two hours, the reaction was stopped by terminating the hydrolysis by heating the mixture to 95°C for 10 minutes. After cooling, the hydrolysate was placed in flasks and centrifuged for 20 minutes at 4°C at 5000 xg. The supernatant was decanted and concentrated tenfold using a vacuum concentrator.

Przykład 4.Example 4.

Mieszania o wysokiej zawartości białka oraz jej hydrolizat wykazują właściwości antyoksydacyjne. Celem zbadania właściwości antyoksydacyjnych wykonywano badanie wygaszenia kationorodnika ABTS*+ oraz zdolność wygaszania rodnika DPPH* zastosowano zmodyfikowaną metodę Brand-Williamsa. W przypadku metody wygaszania kationorodnika ABTS*+ użyto 0,5 mM roztworu rodnika rozcieńczonego etanolem do wartości absorbancji 0,9 przy długości fali 517 nm. Zdolności antyoksydacyjne wyznaczono na podstawie ubytku koloru próby otrzymanej przez zmieszanie 1 mL etanolu z 1 mLHigh-protein mixtures and their hydrolysate exhibit antioxidant properties. To assess antioxidant properties, a modified Brand-Williams method was used to test the quenching of the ABTS*+ cation radical and the DPPH* radical quenching capacity. For the ABTS*+ cation radical quenching method, a 0.5 mM radical solution diluted with ethanol to an absorbance of 0.9 at 517 nm was used. Antioxidant capacity was determined based on the color loss of a sample obtained by mixing 1 mL of ethanol with 1 mL of

PL 247631 Β1 rodnika przygotowanego w powyższy sposób oraz z 1 mL próby grzybowej. Pomiar absorbancji wykonano po 30-minutowej inkubacji w ciemnym miejscu dla długości fali 517 nm. Procent inhibicji obliczono według poniższego wzoru:PL 247631 Β1 radical prepared as above and from 1 mL of the fungal sample. Absorbance measurement was performed after 30 minutes of incubation in the dark at a wavelength of 517 nm. The percentage of inhibition was calculated using the following formula:

% DPPH* inhibicji = [(Abs kontrola -Abs próby)/Abs kontrola] χΙΟΟ% DPPH* inhibition = [(Abs control -Abs sample)/Abs control] χIOO

Aby ocenić zdolność wygaszania kationorodnika ABTS*+ zastosowano roztwór nadsiarczanu potasu i kationorodnika. Po całonocnej inkubacji powyższy roztwór rozcieńczono buforem fosforanowym do wartości absorbancji równej 0,7 przy długości fali 734 nm. Zdolności antyoksydacyjne wyznaczono na podstawie ubytku koloru próby otrzymanej przez zmieszanie 1 mL rodnika przygotowanego w powyższy sposób oraz 50 pL próby ekstraktu bądź hydrolizatu. Pomiar absorbancji wykonano po 6-minutowej inkubacji w ciemnym miejscu dla długości fali 734 nm. Procent inhibicji obliczono według poniższego wzoru:To assess the quenching capacity of the ABTS* + cation radical, a solution of potassium persulfate and the cation radical was used. After overnight incubation, the above solution was diluted with phosphate buffer to an absorbance of 0.7 at 734 nm. Antioxidant capacity was determined based on the color loss of a sample obtained by mixing 1 mL of the radical prepared as described above with 50 pL of the extract or hydrolysate sample. Absorbance was measured after a 6-minute incubation in the dark at 734 nm. Percent inhibition was calculated using the following formula:

% ABT5,+ inhibicji = [(Abs kontrola - Abs próby)/Abs kontrola] χΙΟΟ% ABT5 ,+ inhibition = [(Abs control - Abs sample)/Abs control] χIOO

Pomiary wykonano dla serii rozcieńczeń ekstraktów i hydrolizatów w zakresie stężeń białek i peptydów: 0,25-8 mg/ml dla wygaszenia kationorodnika ABTS*+ oraz 0,1625-20 mg/ml dla wygaszenia rodnika DPPH*.The measurements were performed for a series of dilutions of extracts and hydrolysates in the concentration range of proteins and peptides: 0.25-8 mg/ml for quenching the ABTS* + cation radical and 0.1625-20 mg/ml for quenching the DPPH* radical.

Określano procent inhibicji rodnika (Rys. 1.) i porównywano go z wartościami uzyskanymi dla liofilizowanych owoców o powszechnie znanych właściwościach przeciwutleniających. Na podstawie uzyskanych danych wyznaczono wartość parametru IC50 dla danego rodnika, który określa stężenie antyoksydantu powodujące spadek początkowego stężenia rodnika o 50% (Tab. 1.):The percentage of radical inhibition was determined (Fig. 1) and compared to values obtained for freeze-dried fruits with commonly known antioxidant properties. Based on the obtained data, the IC50 parameter was determined for a given radical, which defines the antioxidant concentration that causes a 50% decrease in the initial radical concentration (Table 1):

Tab. 1. Wartości IC50 dla liofilizatów owoców o powszechnie znanych właściwościach przeciwutleniających oraz ekstraktu i hydrolizatu z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor).Table 1. IC50 values for fruit lyophilisates with commonly known antioxidant properties and the extract and hydrolysate of Trametes versicolor.

Próba Attempt IC50 ABT5*+ [mg/mL] IC50 ABT5* + [mg/mL] IC50 DPPH· [mg/mL] IC50 DPPH [mg/mL] wrośniak różnobarwny ekstrakt Targot extract 2,25±0,015 2.25±0.015 6,30±0,01 6.30±0.01 wrośniak różnobarwny hydrolizat variegated taraxacum hydrolyzate l,94±0,013 1.94±0.013 1,75+0,009 1.75+0.009 BorówkaBlueberry 1,19+0,035 1.19+0.035 0,27+0,020 0.27+0.020 czarna porzeczkablackcurrant 2,78±0,045 2.78±0.045 0,39±0,025 0.39±0.025 MalinaRaspberry 2,63+0,315 2.63+0.315 0,31+0,021 0.31+0.021 Jabłko Apple 4,62+0,060 4.62+0.060 1,29+0,030 1.29+0.030

Na rysunku na Fig. 1 przedstawiono inhibicję rodnika DPPH* oraz kationorodnika ABTS*+ dla ekstraktu (TVE) oraz hydrolizatu (TVH) otrzymanego z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor).The figure in Fig. 1 shows the inhibition of the DPPH* radical and the ABTS* + cation radical for the extract (TVE) and hydrolysate (TVH) obtained from the variegated tree thorn (Trametes versicolor).

Na Fig. 2 przedstawiono ocenę wartości MIC (Minimal Inhibitory Concentration) wodnego ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) otrzymanego zmodyfikowaną metodą będącą przedmiotem wynalazku wobec wzorcowych szczepów Staphylococcus spp. Zaś na Fig. 3 ocenę MBC (Minimal Bactericicidal Concentration, [pg/mL]) badanego wodnego ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) otrzymanego zmodyfikowaną metodą będącą przedmiotem wynalazku w stosunku do izolatów klinicznych Staphylococcus spp.Fig. 2 presents the evaluation of the MIC (Minimal Inhibitory Concentration) value of the aqueous extract of the variegated tarsier (Trametes versicolor) obtained by the modified method being the subject of the invention against the reference strains of Staphylococcus spp., while Fig. 3 presents the evaluation of the MBC (Minimal Bactericidal Concentration, [pg/mL]) of the tested aqueous extract of the variegated tarsier (Trametes versicolor) obtained by the modified method being the subject of the invention against the clinical isolates of Staphylococcus spp.

Przykład 5.Example 5.

Badano wpływ będących przedmiotem wynalazku ekstraktów i hydrolizatów otrzymanych zmodyfikowaną metodą hydrolizy enzymatycznej z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) na wzrost bakterii z rodzaju Staphylococcus i Streptococcus. Przed wykonaniem oznaczeń hodowlę bakterii prowadzono in vitro w warunkach tlenowych na stałym podłożu Mueller-Hinton (MHA, Biomaxima, Polska) w temperaturze 35 ± 2°C przez 18 ± 2 godziny. Do badań wykorzystywano izolaty kliniczne i szczepy wzorcowe z Amerykańskiej Kolekcji Kultur Typowych (ang. American Type Culture Collection, ATCC): S. aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, S. aureus ATCC 6538, S. aureus ATCC 43300 metycylino-oporny (MRSA, ang. methicillin-resistant Staphylococcus aureus), S. aureus ATCC 1707 MRSA, Streptococcus sobrinus ATCC 33478, Streptococcus mutans ATCC 25175, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, będące w kolekcji muzealnej Katedry i Zakładu Mikrobiologii Farmaceutycznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie. Aktywność badanych ekstraktów i hydrolizatów otrzymanych w wyniku hydrolizy enzymatycznej oceniano metodą seryjnych mikrorozcieńczeń w podłożu płynnym, zgodnie z rekomendacjami Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania Lekowrażliwości (EUCAST) z 2023 roku18. W tym celu zastosowano płytki titracyjne 96-dołkowe. Do świeżej hodowli bakterii dodawano badany ekstrakt wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) w postaci homogennej zawiesiny oraz dostępny komercyjnie lek - chloramfenikol (kontrola dodatnia).The effect of the extracts and hydrolysates obtained by a modified enzymatic hydrolysis method from Trametes versicolor on the growth of Staphylococcus and Streptococcus bacteria was studied. Before the assays were performed, the bacteria were cultured in vitro under aerobic conditions on solid Mueller-Hinton medium (MHA, Biomaxima, Poland) at 35 ± 2°C for 18 ± 2 hours. Clinical isolates and reference strains from the American Type Culture Collection (ATCC) were used in the study: S. aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, S. aureus ATCC 6538, S. aureus ATCC 43300 methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), S. aureus ATCC 1707 MRSA, Streptococcus sobrinus ATCC 33478, Streptococcus mutans ATCC 25175, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, from the museum collection of the Department of Pharmaceutical Microbiology of the Medical University of Lublin. The activity of the tested extracts and hydrolysates obtained by enzymatic hydrolysis was assessed by serial microdilution in a liquid medium, in accordance with the 2023 recommendations of the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). 96-well titration plates were used for this purpose. A fresh bacterial culture was supplemented with the tested extract of Trametes versicolor as a homogeneous suspension and a commercially available drug, chloramphenicol (positive control).

Podczas eksperymentu sporządzano roztwór podstawowy 50 mg badanego ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) poprzez jego rozpuszczenie w 1 mL dimetylosulfotlenku (DMSO). Następnie, z roztworu podstawowego przygotowywano wyjściowy roztwór o stężeniu 32 mg/mL w jałowym płynnym podłożu bulionowym Mueller-Hinton (MHB, Biomaxima, Polska) dla gronkowców lub MHB wzbogaconym 5% odwłóknioną krwią końską (Biomaxima, Polska) i 20 mg/L β-NAD (MHF) dla paciorkowców18. Do pierwszych dołków płytki wielodołkowej dodawano pipetą automatyczną po 200 μL ekstraktu w stężeniu 32 mg/mL, a do pozostałych dołków po 100 μL jałowego płynnego podłoża, zachowując przy tym warunki aseptyczne. Zawartość dołków dokładnie mieszano i wykonywano seryjne rozcieńczenia za pomocą wielokanałowej pipety automatycznej. Dzięki temu uzyskano podwójnie malejące stężenia ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego w zakresie 0,0156-32 mg/mL. Następnie, przygotowywano zawiesiny badanych bakterii. W tym celu, za pomocą zwilżonej jałowej wymazówki pobierano 1-2 kolonie do jałowej probówki zawierającej 2 mL jałowego roztworu 0,85% NaCl (Biomerieux, Francja). Sporządzoną zawiesinę doprowadzano do gęstości 0,5 w skali McFarlanda (5 χ 105 CFU (Colony Forming Units)/mL; CFU - jednostki tworzące kolonie). Tak uzyskane zawiesiny badanych drobnoustrojów rozcieńczano w jałowym podłożu MHB lub MHF do uzyskania gęstości końcowej odpowiadającej 5 χ 106 CFU/mL i wprowadzano do wszystkich dołków płytki w objętości 2 μL za pomocą pipety automatycznej. Równocześnie z oznaczeniami aktywności ekstraktu w stosunku do badanych szczepów bakterii z rodzaju Staphylococcus i Streptococcus, przeprowadzano: (a) kontrolę żywotności badanych szczepów bakterii poprzez dodanie 2 μL rozcieńczonej zawiesiny do trzech dołków zawierających czyste podłoże dla każdego szczepu, (b) kontrolę czystego podłoża poprzez umieszczenie w dołkach płytki titracyjnej 100 μL jałowego podłoża bez dodatku badanego związku oraz (c) kontrolę badanego ekstraktu przy tej samej serii rozcieńczeń bez dodatku zawiesiny mikroorganizmów.During the experiment, a stock solution of 50 mg of the tested extract from Trametes versicolor was prepared by dissolving it in 1 mL of dimethyl sulfoxide (DMSO). Subsequently, a stock solution with a concentration of 32 mg/mL was prepared from the stock solution in sterile liquid Mueller-Hinton broth (MHB, Biomaxima, Poland) for staphylococci or MHB supplemented with 5% defibrinated horse blood (Biomaxima, Poland) and 20 mg/L β-NAD (MHF) for streptococci 18 . Using an automatic pipette, 200 μL of the extract at a concentration of 32 mg/mL was added to the first wells of the multiwell plate, and 100 μL of sterile liquid medium was added to the remaining wells, maintaining aseptic conditions. The well contents were thoroughly mixed and serial dilutions were performed using a multichannel automatic pipette. This resulted in doubly decreasing concentrations of the extract from variegated tarsiers ranging from 0.0156 to 32 mg/mL. Suspensions of the tested bacteria were then prepared. To do this, using a moistened sterile swab, 1-2 colonies were collected into a sterile tube containing 2 mL of sterile 0.85% NaCl solution (Biomerieux, France). The prepared suspension was adjusted to a density of 0.5 on the McFarland scale (5 χ 105 CFU (Colony Forming Units)/mL). The suspensions of tested microorganisms were diluted in sterile MHB or MHF medium to obtain a final density of 5 x 106 CFU/mL and added to all wells of the plate in a volume of 2 μL using an automatic pipette. Simultaneously with the determination of the extract activity against the tested bacterial strains of the Staphylococcus and Streptococcus genera, the following were performed: (a) a check of the viability of the tested bacterial strains by adding 2 μL of the diluted suspension to three wells containing clean medium for each strain; (b) a check of the clean medium by placing 100 μL of sterile medium without the test compound in the wells of the titration plate; and (c) a check of the tested extract using the same dilution series without the addition of the microorganism suspension.

Przygotowane w ten sposób mikropłytki inkubowano w temperaturze 35 ± 1°C przez 18 ± 2 godziny w warunkach tlenowych (gronkowce) lub w atmosferze wzbogaconej w 5% CO2 (paciorkowce). Po upływie tego czasu dokonywano odczytu wzrostu drobnoustrojów w poszczególnych dołkach płytki przy użyciu czytnika spektrofotometrycznego Bio-Tek Elx800 (Biokom, Polska) przy długości fali 570 nm oraz obserwacji makroskopowej widocznego zmętnienia. Następnie, pomiary przetwarzano z udziałem programu komputerowego Gen5 ver. 3.03.14 (Biokom, Polska). O wzroście bakterii świadczyło widoczne wzrokowo zmętnienie w studzienkach mikropłytki. Działanie przeciwbakteryjne badanego ekstraktu w stosunku do szczepów gronkowców i paciorkowców oceniano na podstawie wartości minimalnego stężenia hamującego wzrost bakterii (MlC - minimal inhibitory concentration) oraz minimalnego stężenia bakteriobójczego (MBC - minimal bactericidal concentration). Za wartość MIC uznawano dane uzyskiwane w dołkach, w których zaobserwowano prawie całkowite (>90%) zahamowanie namnażania bakterii. Najmniejsze stężenie ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego, przy którym stwierdzano brak wzrostu bakterii (99,9%) uznawano za wartość minimalnego stężenia bakteriobójczego (MBC). Na podstawie otrzymanych wyników i w oparciu o współczynnik MBC/MIC, oznaczano aktywność bójczą (MBC/MIC < 4) lub statyczną (MBC/MIC > 4) testowanych ekstraktów z wrośniaka różnobarwnego wobec badanych bakterii. Uzyskane dane przedstawiono w Tabeli 2.The prepared microplates were incubated at 35 ± 1°C for 18 ± 2 hours under aerobic conditions (staphylococci) or in an atmosphere enriched with 5% CO2 (streptococci). After this time, microbial growth in individual plate wells was read using a Bio-Tek Elx800 spectrophotometric reader (Biokom, Poland) at a wavelength of 570 nm, and the visible turbidity was observed macroscopically. The measurements were then processed using the Gen5 computer program version 3.03.14 (Biokom, Poland). Bacterial growth was indicated by visually visible turbidity in the microplate wells. The antibacterial activity of the tested extract against staphylococci and streptococci strains was assessed based on the minimal inhibitory concentration (MlC) and minimal bactericidal concentration (MBC). The MIC value was defined as data obtained in wells where almost complete (>90%) inhibition of bacterial growth was observed. The lowest concentration of the variegated taraxacum extract at which no bacterial growth was observed (99.9%) was considered the minimum bactericidal concentration (MBC). Based on the obtained results and the MBC/MIC ratio, the bactericidal (MBC/MIC < 4) or static (MBC/MIC > 4) activity of the tested variegated taraxacum extracts against the tested bacteria was determined. The obtained data are presented in Table 2.

PL 247631 Β1PL 247631 Β1

Tab. 2. Aktywność przeciwbakteryjna badanych wodnych ekstraktów z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) otrzymanego zmodyfikowaną metodą będącą przedmiotem wynalazkuTable 2. Antibacterial activity of the tested aqueous extracts of Trametes versicolor obtained by the modified method being the subject of the invention

SzczepyStrains Badany wodny ekstrakt otrzymany po zastosowaniu The tested aqueous extract obtained after application liofilizacji ciekłego azotu liquid nitrogen freeze-drying MIC [pg/mL] MIC [pg/mL] MBC [pg/mL] MBC [pg/mL] MBC/M IC MBC/MIC MIC [pg/mL] MIC [pg/mL] MBC [pg/mL] MBC [pg/mL] MBC/M IC MBC/MIC wzorcowe exemplary Staphylococcus aureus ATCC 29213 Staphylococcus aureus ATCC 29213 500 500 1000 1000 2 (+) 2 (+) 15,625 15,625 1000· 1000· >4(4 >4(4 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Staphylococcus aureus ATCC 25923 1000 1000 2000 2000 2 (+) 2 (+) 31,25 31.25 2000 2000 >4(-j >4(-j Staphylococcus aureus A1 CC 6538 Staphylococcus aureus A1 CC 6538 1000 1000 1000 1000 1(+) 1(+) 15,625 15,625 1000 1000 >4(4 >4(4 Staphylococcus aureus ATCC 43300 MRSA Staphylococcus aureus ATCC 43300 MRSA 500 500 1000 1000 2 (+) 2 (+) 15,625 15,625 1000 1000 >4(4 >4(4 Staphylococcus aureus ATCC 1707 MRSA Staphylococcus aureus ATCC 1707 MRSA 1000 1000 1000 1000 Κ+) K+) 15,625 15,625 1000· 1000· >4(4 >4(4 Streptococcus sobrinus ATCC 33478 Streptococcus sobrinus ATCC 33478 >8000 >8000 - - - - 500 500 8000 8000 >4(4 >4(4 Streptococcus mutans ATCC 25175 Streptococcus mutans ATCC 25175 8000 8000 >8000 >8000 >4 (-) >4 (-) 1000 1000 8000 8000 >4(4 >4(4 Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Streptococcus pyogenes ATCC 19615 8000 8000 >8000 >8000 >4 (-) >4 (-) 2000 2000 8000· 8000· 4 W 4 In kliniczneclinical 5. aureus szczep 1 MSSA5. aureus strain 1 MSSA 7,81 7.81 2000 2000 >4 (-) >4 (-) 3,91 3.91 1000· 1000· >4 (4 >4 (4 S. aureus szczep 2 MSSAS. aureus strain 2 MSSA 500 500 1000 1000 2 (+) 2 (+) 15,625 15,625 1000 1000 >4(4 >4(4 5. aureus szczep 3 MSSA5. aureus strain 3 MSSA 1000 1000 1000 1000 1(+) 1(+) 31,25 31.25 2000 2000 >4(4 >4(4 5. aureus szczep 4 MSSA5. aureus strain 4 MSSA 500 500 2000 2000 4(+) 4(+) 15,625 15,625 1000· 1000· >4(4 >4(4 5. aureus szczep 5 MSSA5. aureus strain 5 MSSA 500 500 2000 2000 4 (+) 4 (+) 15,625 15,625 1000· 1000· >4(4 >4(4 S. aureus szczep 6 MSSAS. aureus strain 6 MSSA 500 500 500 500 1 (+) 1 (+) 15,625 15,625 1000 1000 >4(4 >4(4 5. aureus szczep 7 MSSA5. aureus strain 7 MSSA 500 500 2000 2000 4 (+) 4 (+) 15,625 15,625 1000· 1000· >4(4 >4(4 5. aureus szczep 8 MSSA5. aureus strain 8 MSSA 500 500 1000 1000 2 (+) 2 (+) 15,625 15,625 1000 1000 >4(4 >4(4 Streptococcus agalactiae szczep 1 Streptococcus agalactiae strain 1 250 250 32000 32000 >4 (-) >4 (-) 2000 2000 8000· 8000· 4(+) 4(+) Streptococcus agalactiae szczep 2 Streptococcus agalactiae strain 2 8000 8000 32000 32000 4 (+) 4 (+) 2000 2000 8000 8000 4 (+) 4 (+) Streptococcus agalactiae szczep 3 Streptococcus agalactiae strain 3 >8000 >8000 - - - - 2000 2000 8000 8000 4 W 4 In Streptococcus dysgalactiaeStreptococcus dysgalactiae 250 250 32000 32000 >4 (-) >4 (-) >8000 >8000 - - - - Streptococcus uberisStreptococcus uberis 250 250 32000 32000 >4 (-) >4 (-) 1000 1000 8000 8000 >4(4 >4(4

Objaśnienia: (+) - efekt bakteriobójczy, (-) - efekt bakteriostatyczny; MRSA - gronkowiec metycylino-oporny (ang. methicillin-resistant Staphylococcus aureus); MSSA - gronkowiec metycylino-wrażliwy (ang. methicillin-susceptible Staphylococcus aureus).Explanations: (+) - bactericidal effect, (-) - bacteriostatic effect; MRSA - methicillin-resistant Staphylococcus aureus; MSSA - methicillin-susceptible Staphylococcus aureus.

Zaletą badanego wodnego ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor), otrzymanego zmodyfikowaną metodą będącą przedmiotem wynalazku, jest stwierdzone działanie przeciwbakteryjne zależne od gatunku: obejmujące wpływ bójczy na gronkowce (Staphylococcus spp., w tym na szczep wzorcowy metycylino-oporny - MRSA) i hamujący na namnażanie paciorkowców (Streptococcus spp.) w przypadku ekstraktów uzyskanych z liofilizatów wrośniaka różnobarwnego, a także zależne od szczepu: obejmujące wpływ bójczy na paciorkowce i statyczny na gronkowce poza pewnymi wyjątkami w przypadku ekstraktów uzyskiwanych z pominięciem etapu liofilizacji; a także właściwości antyoksydacyjne bez potrzeby frakcjonowania czy separacji produktu końcowego ekstrakcji na pojedyncze składowe lub ich grupy. Poprzez zastosowanie wodyjako rozpuszczalnika ekstrahującego, możliwe jest łatwe i nietoksyczne wytworzenie ekstraktu oraz hydrolizatu. Produkt końcowy ekstrakcji może stanowić alternatywę wobec tradycyjnych substancji przeciwdrobnoustrojowych, wykorzystywanych w celach wspomagania terapii oraz odkażania, zarówno dezynfekcji jak i antyseptyki, a także konserwujących.The advantage of the tested aqueous extract of Trametes versicolor, obtained by the modified method of the invention, is its observed species-dependent antibacterial activity: including a staphylococcal (Staphylococcus spp.) killifish (including the methicillin-resistant reference strain - MRSA) and an inhibitory effect on the growth of streptococci (Streptococcus spp.) in the case of extracts obtained from lyophilized Trametes versicolor, as well as a strain-dependent activity: including a streptococcal killifish and a staphylococcal killifish, with some exceptions in extracts obtained without the lyophilization step; and its antioxidant properties without the need for fractionation or separation of the final extraction product into individual components or groups thereof. By using water as the extraction solvent, easy and non-toxic production of the extract and hydrolysate is possible. The final extraction product may be an alternative to traditional antimicrobial substances used to support therapy and disinfection, both for disinfection and antisepsis, as well as for preservatives.

Warunkiem przeprowadzenia efektywnego procesu pozyskania produktu o unikalnych właściwościach jest odpowiednie rozdrobnienie substratu grzybiczego gwarantujące przede wszystkim rozbicie ścian komórkowych grzyba. Kolejność etapów procesu musi zostać zachowana, a więc: zamrożenie owocnika, rozdrobnienie z udziałem ciekłego azotu lub alternatywnie liofilizacji w niskiej temperaturze, ekstrakcja białek, hydroliza enzymatyczna oraz dezaktywacja enzymu. Zastosowanie innych niż wymienione właściwości skutkuje otrzymaniem mieszanki o słabszych właściwościach przeciwbakteryjnych. Ważna jest także dezaktywacja temperaturowa enzymu, ponieważ brak tego etapu wpływa na uzyskanie nieaktywnego produktu hydrolizy.A prerequisite for effectively obtaining a product with unique properties is the appropriate fragmentation of the fungal substrate, which primarily guarantees the disruption of the fungal cell walls. The sequence of process steps must be maintained: freezing the fruiting body, fragmentation using liquid nitrogen or, alternatively, low-temperature freeze-drying, protein extraction, enzymatic hydrolysis, and enzyme deactivation. Using other properties than those listed results in a mixture with weaker antibacterial properties. Thermal deactivation of the enzyme is also important, as the omission of this step results in an inactive hydrolysis product.

Literatura:Literature:

1. Lau, C. C. et al. Novel angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from edible mushroom Agaricus bisporus (J.E. Lange) Imbach identified by LC-MS/MS. Food Chem. 148, 396 (2014).1. Lau, C. C. et al. Novel angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from edible mushroom Agaricus bisporus (J.E. Lange) Imbach identified by LC-MS/MS. Food Chem. 148, 396 (2014).

2. Mishra, J. et al. Antibacterial Natural Peptide Fractions from Indian Ganoderma lucidum. Int. J. Pept. Res. Ther. 24, 543 (2018).2. Mishra, J. et al. Antibacterial Natural Peptide Fractions from Indian Ganoderma lucidum. Int. J. Pept. Res. Ther. 24, 543 (2018).

3. He, H. et al. Hepatoprotective Effects of Ganoderma Lucidum Peptides Against Carbon Tetrachloride-Induced Liver Injury in Mice. J. Food Biochem. 32, 628 (2008).3. He, H. et al. Hepatoprotective Effects of Ganoderma Lucidum Peptides Against Carbon Tetrachloride-Induced Liver Injury in Mice. J. Food Biochem. 32, 628 (2008).

4. Geng, X. et al. A Tricholoma matsutake Peptide with Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory and Antioxidative Activities and Antihypertensive Effects in Spontaneously Hypertensive Rats. Sci. Rep.4. Geng, X. et al. A Tricholoma matsutake Peptide with Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory and Antioxidative Activities and Antihypertensive Effects in Spontaneously Hypertensive Rats. Sci. Rep.

6, (2016).6, (2016).

5. Jang, J.-H. et al. Characterisation of a new antihypertensive angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide from Pleurotus cornucopiae. Food Chem. 127, 412 (2011).5. Jang, J.-H. et al. Characterization of a new antihypertensive angiotensin I-converting enzyme inhibitor peptide from Pleurotus cornucopiae. Food Chem. 127, 412 (2011).

6. Choi, H. S. et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitor from Grifola frondosa. FoodRes. Int. 34, 177 (2001).6. Choi, H. S. et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitor from Grifola frondosa. FoodRes. Int. 34, 177 (2001).

7. Mishra, J. et al. Antibacterial Natural Peptide Fractions from Indian Ganoderma lucidum. Int. J. Pept. Res. Ther. 24, 543 (2018).7. Mishra, J. et al. Antibacterial Natural Peptide Fractions from Indian Ganoderma lucidum. Int. J. Pept. Res. Ther. 24, 543 (2018).

8. Takakura, Y. et al. Novel avidin-like proteins with low isoelectric points from shiitake mushroom (Lentinula edodes). J. Biosci. Bioeng. 121, 420 (2016).8. Takakura, Y. et al. Novel avidin-like proteins with low isoelectric points from shiitake mushroom (Lentinula edodes). J. Biosci. Bioeng. 121, 420 (2016).

9. Zhang, Q. et al. Improvement of antioxidant activity of Morchella esculenta protein hydrolysate by optimized glycosylation reaction. CYTA - J. Food 16, 238 (2018).9. Zhang, Q. et al. Improvement of antioxidant activity of Morchella esculenta protein hydrolysate by optimized glycosylation reaction. CITATION - J. Food 16, 238 (2018).

10. Zheng, S. et al. A novel alkaline protease from wild edible mushroom Termitomyces albuminosus. Acta Biochim. Pol. 58, 269 (2011).10. Zheng, S. et al. A novel alkaline protease from wild edible mushroom Termitomyces albuminosus. Acta Biochim. Half. 58, 269 (2011).

11. Chen, J. et al. In Vitro Antitumor and Immunomodulatory Effects of the Protein PCP-3A from Mushroom Pleurotus citrinopileatus. J. Agric. Food Chem. 58, 12117 (2010).11. Chen, J. et al. In Vitro Antitumor and Immunomodulatory Effects of the Protein PCP-3A from Mushroom Pleurotus citrinopileatus. J. Agric. Food Chem. 58, 12117 (2010).

12. Sillapachaiyaporn, C. et al. HIV-1 Protease and Reverse Transcriptase Inhibitory Activities of Curcuma aeruginosa Roxb. Rhizome Extracts and the Phytochemical Profile Analysis: In Vitro and In Silico Screening. Pharmaceuticals 14, 1115 (2021).12. Sillapachaiyaporn, C. et al. HIV-1 Protease and Reverse Transcriptase Inhibitory Activities of Curcuma aeruginosa Roxb. Rhizome Extracts and the Phytochemical Profile Analysis: In Vitro and In Silico Screening. Pharmaceuticals 14, 1115 (2021).

13. Kimatu, B. M. et al. Antioxidant potential of edible mushroom (Agaricus bisporus) protein hydrolysates and their ultrafiltration fractions. Food Chem. 230, 58 (2017).13. Kimatu, B. M. et al. Antioxidant potential of edible mushroom (Agaricus bisporus) protein hydrolysates and their ultrafiltration fractions. Food Chem. 230, 58 (2017).

14. Ang, S.-S. et al. Production of Different Mushroom Protein Hydrolysates as Potential Flavourings in Chicken Soup Using Stem Bromelain Hydrolysis. Food Technol. Biotechnol. 57, 472 (2019).14. Ang, S.-S. et al. Production of Various Mushroom Protein Hydrolysates as Potential Flavorings in Chicken Soup Using Stem Bromelain Hydrolysis. Food Technol. Biotechnol. 57, 472 (2019).

15. Palupi, N. et al. The Effect of Enzymatic Hydrolysis on The Properties of Protein Hydrolysate from Paddy Mushroom. Makara J. Technol. 14, (2010).15. Palupi, N. et al. The Effect of Enzymatic Hydrolysis on The Properties of Protein Hydrolysate from Paddy Mushroom. Makara J. Technol. 14, (2010).

16. Goswami, B. et al. Evaluation of bioactive properties of Pleurotus ostreatus mushroom protein hydrolysate of different degree of hydrolysis, LWT 149, 1 (2021)16. Goswami, B. et al. Evaluation of bioactive properties of Pleurotusrzutus mushroom protein hydrolysate of different degrees of hydrolysis, LWT 149, 1 (2021)

17. Farzaneh, P. et al. Bioactive properties of Agaricus bisporus and Terfezia claveryi proteins hydrolyzed by gastrointestinal proteases. LWT 91, 322 (2018).17. Farzaneh, P. et al. Bioactive properties of Agaricus bisporus and Terfezia claveryi proteins hydrolyzed by gastrointestinal proteases. LWT 91, 322 (2018).

18. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 13.0, 2023. http://www.eucast.org.18. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 13.0, 2023. http://www.eucast.org.

Claims (6)

1. Sposób otrzymywania ekstraktu z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) bogatego w białka i peptydy, znamienny tym, że przed ekstrakcją oczyszczone i podzielone na mniejsze fragmenty owocniki mrozi się w temperaturze od -20 do -80°C korzystnie -80°C, po czym zamrożony materiał zalewa się ciekłym azotem korzystnie trzykrotnie następnie rozciera na proszek lub owocniki poddaje się liofilizacji w temperaturze od -50 do -40°C, korzystnie -45°C przy ciśnieniu wynoszącym od 4 do 6 Pa, optymalnie 5 Pa aż do uzyskania stałej masy liofilizatu, który dzieli się na kawałki i tak przygotowany surowiec poddaje ekstrakcji zalewając wodą w proporcji w : w od 1 : 5 do 1 : 15 korzystnie 1 : 10, przy czym proces prowadzi się w temperaturze od 50 do 80°C, korzystnie 60°C, stale mieszając przez 1,5 do 2 godzin, a następnie chłodzi do temperatury 30°C, odwirowuje supernatant i poddaje koncentracji, korzystnie do uzyskania dziesięciokrotnie zatężonego ekstraktu.1. A method for obtaining an extract from oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) rich in proteins and peptides, characterized in that before extraction, the fruiting bodies, cleaned and divided into smaller fragments, are frozen at a temperature of -20 to -80°C, preferably -80°C, then the frozen material is poured with liquid nitrogen, preferably three times, then ground into powder or the fruiting bodies are subjected to lyophilization at a temperature of -50 to -40°C, preferably -45°C, at a pressure of 4 to 6 Pa, optimally 5 Pa until a constant mass of the lyophilizate is obtained, which is divided into pieces and the raw material prepared in this way is subjected to extraction by pouring water in a ratio of w : w from 1 : 5 to 1 : 15, preferably 1 : 10, wherein the process is carried out at a temperature of 50 to 80°C, preferably 60°C, with constant stirring for 1.5 to 2 hours, then cooled to 30°C, the supernatant is centrifuged and concentrated, preferably to obtain a ten-fold concentrated extract. 2. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że supernatant odwirowuje się przy obrotach od 3000 do 6000, korzystnie 5000 xg, w temperaturze 4°C.2. The method according to claim 1, characterized in that the supernatant is centrifuged at a speed of 3000 to 6000, preferably 5000 xg, at a temperature of 4°C. 3. Ekstrakt z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) bogatego w białka i peptydy uzyskany sposobem opisanym w zastrz. 1 do zastosowania we wspomaganiu profilaktyki i leczenia chorób wywoływanych przez grzyby pleśniowe Aspergillus i Penicillium.3. Extract of oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) rich in proteins and peptides obtained by the method described in claim 1 for use in supporting the prevention and treatment of diseases caused by Aspergillus and Penicillium mold fungi. 4. Sposób otrzymywania hydrolizatu z ekstraktu z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus ) bogatego w białka i peptydy, znamienny tym, że najpierw otrzymuje się ekstrakt gdzie oczyszczone i podzielone na mniejsze fragmenty owocniki mrozi się w temperaturze od -20 do -80°C korzystnie -80°C, po czym zamrożony materiał zalewa się ciekłym azotem korzystnie trzykrotnie następnie rozciera na proszek lub owocniki poddaje się liofilizacji w temperaturze od -50 do -40°C, przy ciśnieniu wynoszącym od 4 do 6 Pa, optymalnie 5 Pa aż do uzyskania stałej masy liofilizatu, który dzieli się na kawałki i tak przygotowany surowiec poddaje ekstrakcji zalewając wodą w proporcji w : w od 1 : 5 do 1 : 15 korzystnie 1 : 10, przy czym proces prowadzi się w temperaturze od 50 do 80°C, stale mieszając przez 1,5 do 2 godzin, a następnie chłodzi do temperatury 30°C, odwirowuje supernatant i poddaje koncentracji, korzystnie do uzyskania dziesięciokrotnie zatężonego ekstraktu, następnie tak zatężony ekstrakt poddaje się hydrolizie enzymatycznej za pomocą proteazy serynowej pochodzenia zwierzęcego, gdzie ilość enzymu wobec białka zawartego w ekstrakcie od 5 do 20%, optymalnie 10%, a reakcję prowadzi się w warunkach pH od 7 do 9, optymalnie 8, w temperaturze w zakresie od 35 do 50°C, korzystnie 40°C, w czasie od 1 do 3 godzin, a po zakończeniu reakcji otrzymuje się hydrolizat.4. A method for obtaining a hydrolysate from an extract of oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) rich in proteins and peptides, characterized in that first an extract is obtained where the fruiting bodies, purified and divided into smaller fragments, are frozen at a temperature of -20 to -80°C, preferably -80°C, then the frozen material is poured with liquid nitrogen, preferably three times, then ground into powder or the fruiting bodies are subjected to lyophilization at a temperature of -50 to -40°C, at a pressure of 4 to 6 Pa, optimally 5 Pa, until a constant mass of the lyophilisate is obtained, which is divided into pieces and the raw material prepared in this way is subjected to extraction by pouring water in a w : w ratio of 1 : 5 to 1 : 15, preferably 1 : 10, wherein the process is carried out at a temperature of 50 to 80°C, with constant stirring for 1.5 to 2 hours, and then cooled to a temperature of 30°C, the supernatant is centrifuged and concentrated, preferably to obtain a ten-fold concentrated extract, then the extract thus concentrated is subjected to enzymatic hydrolysis using a serine protease of animal origin, where the amount of enzyme relative to the protein contained in the extract is from 5 to 20%, optimally 10%, and the reaction is carried out under pH conditions from 7 to 9, optimally 8, at a temperature in the range from 35 to 50°C, preferably 40°C, for 1 to 3 hours, and after the reaction is completed, a hydrolysate is obtained. 5. Sposób według zastrzeżenia 1 i 2, znamienny tym, że po zakończeniu hydrolizy prowadzi się dezaktywację enzymu w temperaturze od 95 do 105°C, korzystnie 98°C, w czasie 10 do 15 minut.5. The method according to claim 1 and 2, characterized in that after completion of hydrolysis, the enzyme is deactivated at a temperature of 95 to 105°C, preferably 98°C, for 10 to 15 minutes. 6. Hydrolizat z ekstraktu z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) bogatego w białka i peptydy uzyskany sposobem opisanym w zastrz. 4 do zastosowania we wspomaganiu profilaktyki i leczenia chorób wywoływanych przez grzyby pleśniowe Aspergillus i Penicillium.6. Hydrolysate from an extract of oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) rich in proteins and peptides obtained by the method described in claim 4 for use in supporting the prevention and treatment of diseases caused by Aspergillus and Penicillium mold fungi.
PL445189A 2023-06-12 2023-06-12 Method of preparing an aqueous extract of Trametes versicolor rich in protein and peptides and the use of the extract of Trametes versicolor to support the prevention and treatment of diseases caused by staphylococci and streptococci PL247631B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL445189A PL247631B1 (en) 2023-06-12 2023-06-12 Method of preparing an aqueous extract of Trametes versicolor rich in protein and peptides and the use of the extract of Trametes versicolor to support the prevention and treatment of diseases caused by staphylococci and streptococci

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL445189A PL247631B1 (en) 2023-06-12 2023-06-12 Method of preparing an aqueous extract of Trametes versicolor rich in protein and peptides and the use of the extract of Trametes versicolor to support the prevention and treatment of diseases caused by staphylococci and streptococci

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL445189A1 PL445189A1 (en) 2024-12-16
PL247631B1 true PL247631B1 (en) 2025-08-11

Family

ID=93894978

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL445189A PL247631B1 (en) 2023-06-12 2023-06-12 Method of preparing an aqueous extract of Trametes versicolor rich in protein and peptides and the use of the extract of Trametes versicolor to support the prevention and treatment of diseases caused by staphylococci and streptococci

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL247631B1 (en)

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
K. SUŁKOWSKA-ZIAJA I INNI, „TRAMETES VERSICOLOR (L.) LLOYD JAKO ŹRÓDŁO ZWIĄZKÓW BIOLOGICZNIE AKTYWNYCH O SZEROKIM SPEKTRUM DZIAŁANIA I ZASTOSOWANIA", BORGIS - POSTĘPY FITOTERAPII 4/2016, S. 274-281 *
MDPI; Zhichen He et al "Polysaccharide-Peptide from Trametes versicolor: The Potential Medicine for Colorectal Cancer Treatment", Biomedicines 2022, 10, 2841., https://doi.org/10.3390/biomedicines10112841, MDPI *
NIH; Aarti Bains et al. "In vitro bioactivity, antimicrobial and anti-inflammatory efficacy of modified solvent evaporation assisted Trametes versicolor extract", 3 Biotech. 2020 Sep; 10(9): 404., doi: 10.1007/s13205-020-02397-w *
ŞULE İNCİ ET AL., "ANTIOXIDANT AND ANTIMICROBIAL EFFECTS OF TRAMETES VERSICOLOR (L.) LLOYD EXTRACTS IN DIFFERENT SOLVENTS", TURKISH JOURNAL OF SCIENCE & TECHNOLOGY , 17(2), 261-265, 2022, HTTPS://DOI.ORG/10.35234/FUMBD.1076245 *

Also Published As

Publication number Publication date
PL445189A1 (en) 2024-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Moayedi et al. ACE-inhibitory and antioxidant activities of peptide fragments obtained from tomato processing by-products fermented using Bacillus subtilis: effect of amino acid composition and peptides molecular mass distribution
Wang et al. Purification and evaluation of a novel antioxidant peptide from corn protein hydrolysate
Segura-Campos et al. Biological potential of chia (Salvia hispanica L.) protein hydrolysates and their incorporation into functional foods
Arulrajah et al. Lacto-fermented Kenaf (Hibiscus cannabinus L.) seed protein as a source of bioactive peptides and their applications as natural preservatives
Corrêa et al. Antioxidant, antihypertensive and antimicrobial properties of ovine milk caseinate hydrolyzed with a microbial protease
Jiang et al. Purification and characterization of antioxidative peptides from round scad (Decapterus maruadsi) muscle protein hydrolysate
Moayedi et al. Valorization of tomato waste proteins through production of antioxidant and antibacterial hydrolysates by proteolytic Bacillus subtilis: optimization of fermentation conditions
Bijina et al. Protease inhibitor from Moringa oleifera with potential for use as therapeutic drug and as seafood preservative
Beaulieu et al. Evaluation of the in vitro biological activity of protein hydrolysates of the edible red alga, Palmaria palmata (dulse) harvested from the Gaspe coast and cultivated in tanks
Lima et al. Antimicrobial and radical scavenging properties of bovine collagen hydrolysates produced by Penicillium aurantiogriseum URM 4622 collagenase
Sawicki et al. The effect of processing and in vitro digestion on the betalain profile and ACE inhibition activity of red beetroot products
Gottardi et al. Conjugation of gluten hydrolysates with glucosamine at mild temperatures enhances antioxidant and antimicrobial properties
Tapal et al. Nutraceutical protein isolate from pigeon pea (Cajanus cajan) milling waste by-product: Functional aspects and digestibility
Abdelmalek et al. Sulfated polysaccharides from Loligo vulgaris skin: Potential biological activities and partial purification
CO2022006972A2 (en) Compositions comprising bacterial strains for use in increasing the bioavailability of amino acids derived from proteins
Bueno-Gavilá et al. Bioactivity of hydrolysates obtained from bovine casein using artichoke (Cynara scolymus L.) proteases
Sitohy et al. Original Research Antibacterial phycocyanin from Anabaena oryzae SOS13
Michalak et al. Antioxidant and antimicrobial properties of an extract rich in proteins obtained from Trametes versicolor
Bai-Ngew et al. Antimicrobial activity of a crude peptide extract from lablab bean (Dolichos lablab) for semi-dried rice noodles shelf-life
Mirzaei et al. Antioxidant, ACE-inhibitory and antimicrobial activities of Kluyveromyces marxianus protein hydrolysates and their peptide fractions
Ulagesan et al. Antimicrobial and antioxidant activities of protein hydrolysate from terrestrial snail Cryptozona bistrialis
Taniguchi et al. Identification and characterization of multifunctional cationic peptides from enzymatic hydrolysates of soybean proteins
Osman et al. Green biochemical protection of postharvest table grapes against gray mold (Botrytis cinerea) using 7s proteins
Selvendran et al. Studies on novel bacteriocin like inhibitory substance (BLIS) from microalgal symbiotic Vibrio spp MMB2 and its activity against aquatic bacterial pathogens
Leonid et al. Production of herbal protein isolates with the enzymatic hydrolysis technology