PL247631B1

PL247631B1 - Sposób otrzymywania wodnego ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) bogatego w białko i peptydy oraz jego hydrolizatu i zastosowanie ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) oraz hydrolizatu do wspomagania profilaktyki i leczenia chorób wywołanych przez gronkowce i paciorkowce

Info

Publication number: PL247631B1
Application number: PL445189A
Authority: PL
Inventors: Urszula Kosikowska; Sylwia Andrzejczuk; Dorota Pietras-Ożga; Katarzyna Michalak; Stanisław Winiarczyk
Original assignee: Univ Medyczny W Lublinie; Univ Przyrodniczy W Lublinie
Priority date: 2023-06-12
Filing date: 2023-06-12
Publication date: 2025-08-11
Also published as: PL445189A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób otrzymywania ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) bogatego w białka i peptydy, charakteryzuje się tym, że przed ekstrakcją owocniki przygotowuje się w ten sposób, że oczyszczone i podzielone na mniejsze fragmenty mrozi się w temperaturze -20°C do -80°C, po czym zamrożony materiał zalewa się ciekłym azotem korzystnie trzykrotnie i rozciera się na proszek lub alternatywnie poddaje się liofilizacji w temperaturze od -50°C do -40°C, korzystnie -45°C przy ciśnieniu wynoszącym od 4 do 6 Pa, optymalnie 5 Pa, aż do uzyskania stałej masy liofilizatu, następnie zliofilizowane lub rozdrobnione (roztarte) owocniki poddaje się ekstrakcji zalewając wodą w proporcjach w:w od 1:15 do 1:30, korzystnie 1:20, proces prowadzi się w temperaturze od 50°C do 80°C przez 1,5 do 2-ch godzin, po czym chłodzi do temperatury 30°C, odwirowuje supernatant i poddaje koncentracji, korzystnie do uzyskania dziesięciokrotnie zatężonego ekstraktu. Przedmiotem zgłoszenia jest także ekstrakt z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) bogatego w białka i peptydy do zastosowania do wspomagania profilaktyki i leczenia chorób wywoływanych przez gronkowce i paciorkowce.

Description

Opis wynalazku

Przedmiot wynalazku stanowi sposób otrzymywania wodnego ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) bogatego w białko oraz jego hydrolizatu, w którym zastosowano ciekły azot lub proces liofilizacji i dobór optymalnej temperatury ekstrakcji na etapie przygotowywania surowca do rozdrobnienia oraz ekstrakcji białek endogennych oraz zastosowanie wodnego ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) oraz jego hydrolizatu do wspomagania profilaktyki i leczenia chorób wywołanych przez gronkowce i paciorkowce.

Analizując literaturę tematu, można znaleźć prace, w których opisywano endogenne białka i peptydy pochodzące z grzybów, w tym stosowane do regulowania (obniżania) ciśnienia krwi np. u pacjentów z nadciśnieniem oraz o aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Były to białka i peptydy bezpośrednio wyekstrahowane w różnych temperaturach ze świeżych owocników grzybów¹, wysuszonych owocników w formie proszków² lub sfermentowanych proszków³ przy użyciu wody destylowanej o temp. 4°C/25°C4, 30°C/50°C5, i 95°C/100°C⁶, jak również z wykorzystaniem buforu Tris-HCl⁷, 0,1 M buforu HEPES-KOH (pH 7,5)8, roztworu NaOH (pH 12,0)9, roztworu 0,15 M NaCl¹⁰, acetonu¹¹, a także etanolu lub metanolu^{5, 12}oraz 5% (v/v) zmrożonego kwasu octowego z 0,1% (v/v) β-merkaptoetanolem¹³.

Większość grup badawczych skupiała się na pełnych ekstraktach otrzymywanych z grzybów różnymi metodami i z użyciem często skomplikowanych, czasochłonnych i materiałochłonnych procedur, szczególnie z użyciem rozpuszczalników organicznych, w tym alkoholowych (głównie metanol i/lub etanol).

W znanym stanie techniki można zauważyć niewielką liczbę odniesień literaturowych dotyczących hydrolizy białek grzybowych i otrzymywania z nich aktywnych biologicznie peptydów. Temat hydrolizy enzymatycznej białek grzybowych został przedstawiony w publikacji And i Ismail-Fitry¹⁴ dotyczącej przydatności peptydów otrzymywanych na bazie hydrolizy bromelainą. Enzym ten wykorzystano do cięcia białek z takich grzybów jak: shitake, boczniak ostrygowaty, grzyby shimeji i płomiennica zimowa w celu stworzenia najbardziej aromatycznego proszku kulinarnego. Autorzy przedstawili stopnie hydrolizy - DH (ang. degree of hydrolysis), wahające się w zakresie od 54 do 67%. Kolejną pozycją dotyczącą pozyskiwania hydrolizatów grzybowych jest publikacja z zastosowaniem proteazy¹⁵. W tej pozycji literaturowej, 0,1% (w/w) roztwór proteazy ProtamexTM był wykorzystywany do pozyskiwania peptydów z podstawczaka pochwiaka wielkopochwowego (Volvariella volvaceae). Reakcję prowadzono w trzech różnych temperaturach i różnych czasach trwania reakcji, co dało ostatecznie stopień hydrolizy sięgający 25%. Skuteczność trawienia proteinazą K, pepsyną i trypsyną przy różnych stężeniach enzymów (0,05%, 0,10%, 0,15%) i temperaturach (30°C, 40°C i 50°C) oraz odstępach czasu (60, 90 i 120 min) była również badana przez zespół Goswami i in.¹⁶. Materiałem do badań prowadzonych przez tę grupę badawczą były suszone owocniki boczniaka ostrygowatego Pleurotus ostreatus, uprawiane na słomie ryżowej. Przedstawione w tej publikacji dane na temat optymalizacji procesu enzymatycznej hydrolizy wyraźnie pokazały, że najbardziej odpowiednią pod względem uzyskiwanej wartości DH jest reakcja z użyciem 0,15% proteinazy K, w temperaturze 50°C przez 2 godziny. Produkt otrzymany przez Goswami i in.¹⁶ w drodze hydrolizy białek grzybowych charakteryzował się wysoką wydajnością pienienia, stabilnością piany oraz właściwościami emulgującymi. Podobne wartości DH otrzymane podczas trawienia trypsyną uzyskał zespół Farzaneh i in.¹⁷ dwóch grzybów z gatunku podstawczaków - pieczarka dwuzarodnikowa (Agaricus bisporus) i z gatunku workowców - trufla pustynna (Terfezia clavery). We wspomnianym artykule otrzymana wartość DH wahała się od 7,50 do 20,10%, a przygotowywanie badanych próbek różniło się występowaniem lub brakiem etapu blanszowania.

Ze stanu techniki znany jest również sposób otrzymywania białka z owocników T. versicolor, który został ujęty w zgłoszeniu patentowym TW201428005 (A) autorstwa Sheu Fuu, Kuan Yen-Chou, Wu Ying-Jou z 2014 roku, gdzie opisano sposób otrzymywania z owocników T. versicolor nowego białka YZP za pomocą chromatografii anionowymiennej. YZP jest nieglikozylowanym białkiem o masie cząsteczkowej 12 kDa, zawierającym 139 aminokwasów, wykazującym znaczącą aktywność przeciwzapalną.

Wynalazek rozwiązuje problem sposobu otrzymywania bogatego w białko wodnego ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego (T. versicolor) i jego hydrolizatu, o właściwościach antyoksydacyjnych i aktywności przeciwbakteryjnej. W wynalazku zastosowano ciekły azot lub liofilizację na etapie przygotowywania surowca z wrośniaka różnobarwnego do jego łatwiejszego rozdrobnienia oraz dobór optymalnej temperatury ekstrakcji białek endogennych.

Rozdrobniony surowiec został użyty do pozyskiwania ekstraktu bogatego w białka endogenne, z których następnie w wyniku hydrolizy z zastosowaniem proteazy serynowej pochodzenia zwierzęcego, która okazała się właściwa ze względu na skład aminokwasowy surowca, otrzymywano peptydy wykazujące właściwości antyoksydacyjne i przeciwdrobnoustrojowe, szczególnie antybakteryjne.

Zgodnie z wynalazkiem najpierw przygotowuje się owocniki do ekstrakcji w ten sposób, że oczyszczone i podzielone na mniejsze fragmenty owocniki mrozi się w temperaturze -20 do -80°C, po czym zamrożony materiał zalewa się ciekłym azotem korzystnie trzykrotnie i rozciera się na proszek lub alternatywnie poddaje się liofilizacji w temperaturze od -50 do -40°C, korzystnie -45°C przy ciśnieniu wynoszącym od 4 do 6 Pa, optymalnie 5 Pa, aż do uzyskania stałej masy liofilizatu, następnie zliofilizowane lub rozdrobnione (roztarte) ciekłym azotem owocniki poddaje się ekstrakcji zalewając wodą w proporcjach w : w od 1 : 15 do 1 : 30, korzystnie 1 : 20, proces prowadzi się w temperaturze od 50 do 80°C, korzystnie 60°C przez 1,5 do 2 godzin, po czym chłodzi do temperatury 30°C, odwirowuje supernatant i poddaje koncentracji, korzystnie do uzyskania dziesięciokrotnie zatężonego ekstraktu.

Korzystnie, gdy proces ekstrakcji prowadzi się w 60°C, stale mieszając.

Korzystnie, gdy supernatant odwirowuje się w temperaturze 4°C, przy obrotach od 3000 do 6000, korzystnie 5000 xg.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania hydrolizatu z ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego (T. versicolor) bogatego w białko wodnego, polegający na tym, że gdy otrzymany i zatężony ekstrakt według wynalazku poddaje się hydrolizie enzymatycznej w pH w granicach od 7 do 9, optymalnie 8, w temperaturze w zakresie od 35 do 50°C, optymalnie 40°C za pomocą proteazy serynowej pochodzenia zwierzęcego gdzie ilość enzymu wobec białka zawartego w ekstrakcie wynosi od 5 do 20%, optymalnie 10%, a czas trwania procesu od 1 do 3 godzin, i po zakończonej reakcji otrzymuje się hydrolizat bogaty w białka oraz peptydy o aktywności antyoksydacyjnej i przeciwdrobnoustrojowej wobec gronkowców i paciorkowców.

Korzystnie, gdy po zakończeniu hydrolizy prowadzi się dezaktywację enzymu w zakresie temperatur od 95 do 105°C, optymalnie 98°C, korzystnie w czasie 10 do 15 minut.

Przedmiotem wynalazku jest także ekstrakt z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) bogatego w białka i peptydy i jego hydrolizat do zastosowania do wspomagania profilaktyki i leczenia chorób wywoływanych przez gronkowce i paciorkowce.

Jak wykazano w pracy doświadczalnej, warunkami sprzyjającymi ekstrakcji jest zamrożenie i roztarcie owocników poprzedzone kilkukrotnym zanurzeniem ich w ciekłym azocie lub alternatywnie, przeprowadzenie procesu liofilizacji przed rozdrobnieniem surowca.

W sposobie według wynalazku na etapie przygotowywania surowca z wrośniaka różnobarwnego do ekstrakcji do jego łatwiejszego rozdrobnienia zastosowano ciekły azot lub liofilizację co w wydatnym stopniu wpływa na czas ekstrakcji i wydajność procesu. Zastosowanie wody jako rozpuszczalnika sprawia, że ekstrakt jest ekologiczny a przez to ma większe możliwości aplikacyjne. Ponadto dobór optymalnej temperatury do ekstrakcji białek endogennych podczas procesu ekstrakcji wpływa na wydajność ich pozyskiwania. W procesie hydrolizy ekstraktu zastosowano proteazę serynową pochodzenia zwierzęcego, która okazała się korzystna z uwagi na zgodność miejsc jej hydrolizowania wiązań peptydowych w stosunku do składu aminokwasowego.

Otrzymany ekstrakt oraz jego hydrolizat mogą znaleźć zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu, w szczególności jako w pełni naturalny konserwant żywności, kosmetyków oraz wyrobów medycznych i farmaceutycznych jako alternatywa do powszechnie stosowanych w tym celu substancji syntetycznych i związków chemicznych wykorzystywanych do wzbogacania produktów lub ich konserwacji.

Zgłaszający prowadzili badania mające na celu uzyskanie nieznanych dotychczas ekstraktów oraz hydrolizatów, nie opisanych w literaturze fachowej, które posiadają właściwości bioaktywne. Istotą wynalazku jest otrzymywanie i zastosowanie uzyskanego w wyniku procesu prowadzonego zgodnie z zaprojektowanym schematem wysokobiałkowego ekstraktu oraz hydrolizatu z wrośniaka różnobarwnego (T. versicolor) do wytwarzania preparatów o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, zwłaszcza przeciwbakteryjnym oraz do wytwarzania preparatu o działaniu antyoksydacyjnym. Uzyskane według wynalazku ekstrakty i hydrolizaty mogą znaleźć zastosowanie do otrzymania preparatów o działaniu antyoksydacyjnym, w tym składników bioaktywnych w kosmetykach oraz suplementach o działaniu antiaging czy naturalnych konserwantach. Ekstrakty uzyskane z wrośniaka różnobarwnego (T. versicolor) według wynalazku wykazują również silną aktywność przeciwbakteryjną - ekstrakty pozyskane z liofilizatu posiadają zależną od gatunku aktywność bakteriobójczą wobec gronkowców, w tym wobec gronkowca złocistego metycylino-opornego (MRSA - methicillin resistant Staphylococcus aureus) oraz bakteriostatyczną wobec paciorkowców, podczas gdy ekstrakt uzyskany z pominięciem procesu liofilizacji posiada zależną od szczepu aktywność bakteriobójczą wobec paciorkowców oraz bakteriostatyczną wobec gronkowców. Z tego względu, badana mieszanina może znaleźć zastosowanie do wytwarzania nowych produktów (wyrobów) farmaceutycznych o potencjalnym zastosowaniu podczas terapii chorób wywoływanych przez te bakterie u ludzi i zwierząt. Podobnie możliwe jest zastosowanie w środkach odkażających, zarówno antyseptykach, jak i dezynfektantach czy konserwantach. Uzyskane ekstrakty i hydrolizaty są bezpieczne w użytkowaniu, bowiem wrośniak jest znanym w medycynie grzybem, stosowanym jako adjuwant w leczeniu nowotworów.

Aktywność antyoksydacyjną ekstraktów i hydrolizatów będących przedmiotem wynalazku oceniano metodami badającymi procent wygaszenia wolnych rodników: kationorodnika ABTS*+ [siarczan 2,2’azyno-di-(3-etylobenztiazoliny)] oraz rodnika DPPH* [2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyI]. Jak wynika z uzyskanych danych, powyższy ekstrakt i hydrolizat charakteryzowała zróżnicowana zdolność wygaszania wobec kationorodnika ABTS oraz rodnika DPPH* wahająca się od 50% do niemal 100%.

Przykład 1.

Przed przystąpieniem do procesu ekstrakcji, owocniki oczyszczano, dzielono na mniejsze fragmenty i mrożono w temperaturze -80°C. Zamrożone owocniki umieszczano w tyglu ceramicznym i zalewano ciekłym azotem. Po odparowaniu azotu, materiał powtórnie zalewano ciekłym azotem i tak postępowano trzykrotnie. Następnie, zamrożone owocniki rozcierano celem rozdrobnienia oraz rozbicia ściany komórkowej grzyba. Roztarty proszek umieszczano w zlewce z mieszadłem magnetycznym, zalewano wodą [w : w, 1 : 20] i ogrzewano w temperaturze 60°C. Po dwóch godzinach reakcji, mieszaninę ochłodzono do temperatury 30°C, umieszczano w falkonach i odwirowywano przez 20 minut w temperaturze 4°C przy obrotach 5000 xg. Supernatant zlano i skoncentrowano dziesięciokrotnie przy użyciu koncentratora próżniowego. Uzyskany supernatant zlewano i poddawano dziesięciokrotnej koncentracji przy użyciu koncentratora próżniowego. W wyniku powyższego procesu uzyskany został materiał o następującym składzie białkowo-peptydowym: stężenie białka 2,91 mg/mL (0,0305 - błąd standardowy średniej) i stężenie peptydów 0,54 mg/mL (0,005 - błąd standardowy średniej).

P r z y k ł a d 2.

Alternatywnie, owocniki grzyba wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) oczyszczano, cięto na mniejsze fragmenty oraz zamrażano na czas 24 h w temperaturze -80°C w celu przygotowania ich do liofilizacji. Proces liofilizacji został przeprowadzony w temperaturze -45°C, przy ciśnieniu wynoszącym 5 Pa, aż do uzyskania stałej masy liofilizatu. Następnie zliofilizowane i rozdrobnione (roztarte) owocniki zalewano wodą [w : w 1 : 20] i ogrzewano w temperaturze 60°C, stale mieszając przez 2 godziny, a następnie chłodzono do temperatury 30°C, odwirowywano w temperaturze 4°C, przy obrotach 5000 xg, a uzyskany supernatant zlewano i poddawano koncentracji przy użyciu koncentratora próżniowego do uzyskania dziesięciokrotnie zatężonego ekstraktu.

Przykład 3.

Postępuje jak w przykładzie 1 i 2, z tym, że po uzyskaniu ekstraktu przeprowadzano hydrolizę poprzez dodatek proteazy serynowej pochodzenia zwierzęcego w ilości 10% wobec stężenia białka w ekstrakcie. Po dodaniu enzymu, mieszaninę ogrzewano do 40°C i ustalano pH na poziomie 8,0. Po dwóch godzinach reakcję wstrzymywano poprzez zakończenie hydrolizy przez 10-minutowe ogrzewanie mieszaniny w temperaturze 95°C. Po ochłodzeniu, hydrolizat umieszczano w falkonach i odwirowywano przez 20 minut w temperaturze 4°C przy obrotach 5000 xg. Supernatant zlewano i poddawano dziesięciokrotnej koncentracji przy użyciu koncentratora próżniowego.

Przykład 4.

Mieszania o wysokiej zawartości białka oraz jej hydrolizat wykazują właściwości antyoksydacyjne. Celem zbadania właściwości antyoksydacyjnych wykonywano badanie wygaszenia kationorodnika ABTS*+ oraz zdolność wygaszania rodnika DPPH* zastosowano zmodyfikowaną metodę Brand-Williamsa. W przypadku metody wygaszania kationorodnika ABTS*+ użyto 0,5 mM roztworu rodnika rozcieńczonego etanolem do wartości absorbancji 0,9 przy długości fali 517 nm. Zdolności antyoksydacyjne wyznaczono na podstawie ubytku koloru próby otrzymanej przez zmieszanie 1 mL etanolu z 1 mL

PL 247631 Β1 rodnika przygotowanego w powyższy sposób oraz z 1 mL próby grzybowej. Pomiar absorbancji wykonano po 30-minutowej inkubacji w ciemnym miejscu dla długości fali 517 nm. Procent inhibicji obliczono według poniższego wzoru:

% DPPH* inhibicji = [(Abs kontrola -Abs próby)/Abs kontrola] χΙΟΟ

Aby ocenić zdolność wygaszania kationorodnika ABTS*⁺ zastosowano roztwór nadsiarczanu potasu i kationorodnika. Po całonocnej inkubacji powyższy roztwór rozcieńczono buforem fosforanowym do wartości absorbancji równej 0,7 przy długości fali 734 nm. Zdolności antyoksydacyjne wyznaczono na podstawie ubytku koloru próby otrzymanej przez zmieszanie 1 mL rodnika przygotowanego w powyższy sposób oraz 50 pL próby ekstraktu bądź hydrolizatu. Pomiar absorbancji wykonano po 6-minutowej inkubacji w ciemnym miejscu dla długości fali 734 nm. Procent inhibicji obliczono według poniższego wzoru:

% ABT5^,+ inhibicji = [(Abs kontrola - Abs próby)/Abs kontrola] χΙΟΟ

Pomiary wykonano dla serii rozcieńczeń ekstraktów i hydrolizatów w zakresie stężeń białek i peptydów: 0,25-8 mg/ml dla wygaszenia kationorodnika ABTS*⁺ oraz 0,1625-20 mg/ml dla wygaszenia rodnika DPPH*.

Określano procent inhibicji rodnika (Rys. 1.) i porównywano go z wartościami uzyskanymi dla liofilizowanych owoców o powszechnie znanych właściwościach przeciwutleniających. Na podstawie uzyskanych danych wyznaczono wartość parametru IC50 dla danego rodnika, który określa stężenie antyoksydantu powodujące spadek początkowego stężenia rodnika o 50% (Tab. 1.):

Tab. 1. Wartości IC50 dla liofilizatów owoców o powszechnie znanych właściwościach przeciwutleniających oraz ekstraktu i hydrolizatu z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor).

Próba	IC50 ABT5*⁺ [mg/mL]	IC50 DPPH· [mg/mL]
wrośniak różnobarwny ekstrakt	2,25±0,015	6,30±0,01
wrośniak różnobarwny hydrolizat	l,94±0,013	1,75+0,009
Borówka	1,19+0,035	0,27+0,020
czarna porzeczka	2,78±0,045	0,39±0,025
Malina	2,63+0,315	0,31+0,021
Jabłko	4,62+0,060	1,29+0,030

Na rysunku na Fig. 1 przedstawiono inhibicję rodnika DPPH* oraz kationorodnika ABTS*⁺ dla ekstraktu (TVE) oraz hydrolizatu (TVH) otrzymanego z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor).

Na Fig. 2 przedstawiono ocenę wartości MIC (Minimal Inhibitory Concentration) wodnego ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) otrzymanego zmodyfikowaną metodą będącą przedmiotem wynalazku wobec wzorcowych szczepów Staphylococcus spp. Zaś na Fig. 3 ocenę MBC (Minimal Bactericicidal Concentration, [pg/mL]) badanego wodnego ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) otrzymanego zmodyfikowaną metodą będącą przedmiotem wynalazku w stosunku do izolatów klinicznych Staphylococcus spp.

Przykład 5.

Badano wpływ będących przedmiotem wynalazku ekstraktów i hydrolizatów otrzymanych zmodyfikowaną metodą hydrolizy enzymatycznej z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) na wzrost bakterii z rodzaju Staphylococcus i Streptococcus. Przed wykonaniem oznaczeń hodowlę bakterii prowadzono in vitro w warunkach tlenowych na stałym podłożu Mueller-Hinton (MHA, Biomaxima, Polska) w temperaturze 35 ± 2°C przez 18 ± 2 godziny. Do badań wykorzystywano izolaty kliniczne i szczepy wzorcowe z Amerykańskiej Kolekcji Kultur Typowych (ang. American Type Culture Collection, ATCC): S. aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, S. aureus ATCC 6538, S. aureus ATCC 43300 metycylino-oporny (MRSA, ang. methicillin-resistant Staphylococcus aureus), S. aureus ATCC 1707 MRSA, Streptococcus sobrinus ATCC 33478, Streptococcus mutans ATCC 25175, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, będące w kolekcji muzealnej Katedry i Zakładu Mikrobiologii Farmaceutycznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie. Aktywność badanych ekstraktów i hydrolizatów otrzymanych w wyniku hydrolizy enzymatycznej oceniano metodą seryjnych mikrorozcieńczeń w podłożu płynnym, zgodnie z rekomendacjami Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania Lekowrażliwości (EUCAST) z 2023 roku¹⁸. W tym celu zastosowano płytki titracyjne 96-dołkowe. Do świeżej hodowli bakterii dodawano badany ekstrakt wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) w postaci homogennej zawiesiny oraz dostępny komercyjnie lek - chloramfenikol (kontrola dodatnia).

Podczas eksperymentu sporządzano roztwór podstawowy 50 mg badanego ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) poprzez jego rozpuszczenie w 1 mL dimetylosulfotlenku (DMSO). Następnie, z roztworu podstawowego przygotowywano wyjściowy roztwór o stężeniu 32 mg/mL w jałowym płynnym podłożu bulionowym Mueller-Hinton (MHB, Biomaxima, Polska) dla gronkowców lub MHB wzbogaconym 5% odwłóknioną krwią końską (Biomaxima, Polska) i 20 mg/L β-NAD (MHF) dla paciorkowców¹⁸. Do pierwszych dołków płytki wielodołkowej dodawano pipetą automatyczną po 200 μL ekstraktu w stężeniu 32 mg/mL, a do pozostałych dołków po 100 μL jałowego płynnego podłoża, zachowując przy tym warunki aseptyczne. Zawartość dołków dokładnie mieszano i wykonywano seryjne rozcieńczenia za pomocą wielokanałowej pipety automatycznej. Dzięki temu uzyskano podwójnie malejące stężenia ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego w zakresie 0,0156-32 mg/mL. Następnie, przygotowywano zawiesiny badanych bakterii. W tym celu, za pomocą zwilżonej jałowej wymazówki pobierano 1-2 kolonie do jałowej probówki zawierającej 2 mL jałowego roztworu 0,85% NaCl (Biomerieux, Francja). Sporządzoną zawiesinę doprowadzano do gęstości 0,5 w skali McFarlanda (5 χ 105 CFU (Colony Forming Units)/mL; CFU - jednostki tworzące kolonie). Tak uzyskane zawiesiny badanych drobnoustrojów rozcieńczano w jałowym podłożu MHB lub MHF do uzyskania gęstości końcowej odpowiadającej 5 χ 10⁶ CFU/mL i wprowadzano do wszystkich dołków płytki w objętości 2 μL za pomocą pipety automatycznej. Równocześnie z oznaczeniami aktywności ekstraktu w stosunku do badanych szczepów bakterii z rodzaju Staphylococcus i Streptococcus, przeprowadzano: (a) kontrolę żywotności badanych szczepów bakterii poprzez dodanie 2 μL rozcieńczonej zawiesiny do trzech dołków zawierających czyste podłoże dla każdego szczepu, (b) kontrolę czystego podłoża poprzez umieszczenie w dołkach płytki titracyjnej 100 μL jałowego podłoża bez dodatku badanego związku oraz (c) kontrolę badanego ekstraktu przy tej samej serii rozcieńczeń bez dodatku zawiesiny mikroorganizmów.

Przygotowane w ten sposób mikropłytki inkubowano w temperaturze 35 ± 1°C przez 18 ± 2 godziny w warunkach tlenowych (gronkowce) lub w atmosferze wzbogaconej w 5% CO2 (paciorkowce). Po upływie tego czasu dokonywano odczytu wzrostu drobnoustrojów w poszczególnych dołkach płytki przy użyciu czytnika spektrofotometrycznego Bio-Tek Elx800 (Biokom, Polska) przy długości fali 570 nm oraz obserwacji makroskopowej widocznego zmętnienia. Następnie, pomiary przetwarzano z udziałem programu komputerowego Gen5 ver. 3.03.14 (Biokom, Polska). O wzroście bakterii świadczyło widoczne wzrokowo zmętnienie w studzienkach mikropłytki. Działanie przeciwbakteryjne badanego ekstraktu w stosunku do szczepów gronkowców i paciorkowców oceniano na podstawie wartości minimalnego stężenia hamującego wzrost bakterii (MlC - minimal inhibitory concentration) oraz minimalnego stężenia bakteriobójczego (MBC - minimal bactericidal concentration). Za wartość MIC uznawano dane uzyskiwane w dołkach, w których zaobserwowano prawie całkowite (>90%) zahamowanie namnażania bakterii. Najmniejsze stężenie ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego, przy którym stwierdzano brak wzrostu bakterii (99,9%) uznawano za wartość minimalnego stężenia bakteriobójczego (MBC). Na podstawie otrzymanych wyników i w oparciu o współczynnik MBC/MIC, oznaczano aktywność bójczą (MBC/MIC < 4) lub statyczną (MBC/MIC > 4) testowanych ekstraktów z wrośniaka różnobarwnego wobec badanych bakterii. Uzyskane dane przedstawiono w Tabeli 2.

PL 247631 Β1

Tab. 2. Aktywność przeciwbakteryjna badanych wodnych ekstraktów z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor) otrzymanego zmodyfikowaną metodą będącą przedmiotem wynalazku

Szczepy	Badany wodny ekstrakt otrzymany po zastosowaniu
liofilizacji ciekłego azotu
MIC [pg/mL]	MBC [pg/mL]	MBC/M IC	MIC [pg/mL]	MBC [pg/mL]	MBC/M IC
wzorcowe	Staphylococcus aureus ATCC 29213	500	1000	2 (+)	15,625	1000·	>4(4
Staphylococcus aureus ATCC 25923	1000	2000	2 (+)	31,25	2000	>4(-j
Staphylococcus aureus A1 CC 6538	1000	1000	1(+)	15,625	1000	>4(4
Staphylococcus aureus ATCC 43300 MRSA	500	1000	2 (+)	15,625	1000	>4(4
Staphylococcus aureus ATCC 1707 MRSA	1000	1000	Κ+)	15,625	1000·	>4(4
Streptococcus sobrinus ATCC 33478	>8000	-	-	500	8000	>4(4
Streptococcus mutans ATCC 25175	8000	>8000	>4 (-)	1000	8000	>4(4
Streptococcus pyogenes ATCC 19615	8000	>8000	>4 (-)	2000	8000·	4 W
kliniczne	5. aureus szczep 1 MSSA	7,81	2000	>4 (-)	3,91	1000·	>4 (4
S. aureus szczep 2 MSSA	500	1000	2 (+)	15,625	1000	>4(4
5. aureus szczep 3 MSSA	1000	1000	1(+)	31,25	2000	>4(4
5. aureus szczep 4 MSSA	500	2000	4(+)	15,625	1000·	>4(4
5. aureus szczep 5 MSSA	500	2000	4 (+)	15,625	1000·	>4(4
S. aureus szczep 6 MSSA	500	500	1 (+)	15,625	1000	>4(4
5. aureus szczep 7 MSSA	500	2000	4 (+)	15,625	1000·	>4(4
5. aureus szczep 8 MSSA	500	1000	2 (+)	15,625	1000	>4(4
Streptococcus agalactiae szczep 1	250	32000	>4 (-)	2000	8000·	4(+)
Streptococcus agalactiae szczep 2	8000	32000	4 (+)	2000	8000	4 (+)
Streptococcus agalactiae szczep 3	>8000	-	-	2000	8000	4 W
Streptococcus dysgalactiae	250	32000	>4 (-)	>8000	-	-
Streptococcus uberis	250	32000	>4 (-)	1000	8000	>4(4

Objaśnienia: (+) - efekt bakteriobójczy, (-) - efekt bakteriostatyczny; MRSA - gronkowiec metycylino-oporny (ang. methicillin-resistant Staphylococcus aureus); MSSA - gronkowiec metycylino-wrażliwy (ang. methicillin-susceptible Staphylococcus aureus).

Zaletą badanego wodnego ekstraktu z wrośniaka różnobarwnego (Trametes versicolor), otrzymanego zmodyfikowaną metodą będącą przedmiotem wynalazku, jest stwierdzone działanie przeciwbakteryjne zależne od gatunku: obejmujące wpływ bójczy na gronkowce (Staphylococcus spp., w tym na szczep wzorcowy metycylino-oporny - MRSA) i hamujący na namnażanie paciorkowców (Streptococcus spp.) w przypadku ekstraktów uzyskanych z liofilizatów wrośniaka różnobarwnego, a także zależne od szczepu: obejmujące wpływ bójczy na paciorkowce i statyczny na gronkowce poza pewnymi wyjątkami w przypadku ekstraktów uzyskiwanych z pominięciem etapu liofilizacji; a także właściwości antyoksydacyjne bez potrzeby frakcjonowania czy separacji produktu końcowego ekstrakcji na pojedyncze składowe lub ich grupy. Poprzez zastosowanie wodyjako rozpuszczalnika ekstrahującego, możliwe jest łatwe i nietoksyczne wytworzenie ekstraktu oraz hydrolizatu. Produkt końcowy ekstrakcji może stanowić alternatywę wobec tradycyjnych substancji przeciwdrobnoustrojowych, wykorzystywanych w celach wspomagania terapii oraz odkażania, zarówno dezynfekcji jak i antyseptyki, a także konserwujących.

Warunkiem przeprowadzenia efektywnego procesu pozyskania produktu o unikalnych właściwościach jest odpowiednie rozdrobnienie substratu grzybiczego gwarantujące przede wszystkim rozbicie ścian komórkowych grzyba. Kolejność etapów procesu musi zostać zachowana, a więc: zamrożenie owocnika, rozdrobnienie z udziałem ciekłego azotu lub alternatywnie liofilizacji w niskiej temperaturze, ekstrakcja białek, hydroliza enzymatyczna oraz dezaktywacja enzymu. Zastosowanie innych niż wymienione właściwości skutkuje otrzymaniem mieszanki o słabszych właściwościach przeciwbakteryjnych. Ważna jest także dezaktywacja temperaturowa enzymu, ponieważ brak tego etapu wpływa na uzyskanie nieaktywnego produktu hydrolizy.

Literatura:

1. Lau, C. C. et al. Novel angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from edible mushroom Agaricus bisporus (J.E. Lange) Imbach identified by LC-MS/MS. Food Chem. 148, 396 (2014).

2. Mishra, J. et al. Antibacterial Natural Peptide Fractions from Indian Ganoderma lucidum. Int. J. Pept. Res. Ther. 24, 543 (2018).

3. He, H. et al. Hepatoprotective Effects of Ganoderma Lucidum Peptides Against Carbon Tetrachloride-Induced Liver Injury in Mice. J. Food Biochem. 32, 628 (2008).

4. Geng, X. et al. A Tricholoma matsutake Peptide with Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory and Antioxidative Activities and Antihypertensive Effects in Spontaneously Hypertensive Rats. Sci. Rep.

6, (2016).

5. Jang, J.-H. et al. Characterisation of a new antihypertensive angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide from Pleurotus cornucopiae. Food Chem. 127, 412 (2011).

6. Choi, H. S. et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitor from Grifola frondosa. FoodRes. Int. 34, 177 (2001).

7. Mishra, J. et al. Antibacterial Natural Peptide Fractions from Indian Ganoderma lucidum. Int. J. Pept. Res. Ther. 24, 543 (2018).

8. Takakura, Y. et al. Novel avidin-like proteins with low isoelectric points from shiitake mushroom (Lentinula edodes). J. Biosci. Bioeng. 121, 420 (2016).

9. Zhang, Q. et al. Improvement of antioxidant activity of Morchella esculenta protein hydrolysate by optimized glycosylation reaction. CYTA - J. Food 16, 238 (2018).

10. Zheng, S. et al. A novel alkaline protease from wild edible mushroom Termitomyces albuminosus. Acta Biochim. Pol. 58, 269 (2011).

11. Chen, J. et al. In Vitro Antitumor and Immunomodulatory Effects of the Protein PCP-3A from Mushroom Pleurotus citrinopileatus. J. Agric. Food Chem. 58, 12117 (2010).

12. Sillapachaiyaporn, C. et al. HIV-1 Protease and Reverse Transcriptase Inhibitory Activities of Curcuma aeruginosa Roxb. Rhizome Extracts and the Phytochemical Profile Analysis: In Vitro and In Silico Screening. Pharmaceuticals 14, 1115 (2021).

13. Kimatu, B. M. et al. Antioxidant potential of edible mushroom (Agaricus bisporus) protein hydrolysates and their ultrafiltration fractions. Food Chem. 230, 58 (2017).

14. Ang, S.-S. et al. Production of Different Mushroom Protein Hydrolysates as Potential Flavourings in Chicken Soup Using Stem Bromelain Hydrolysis. Food Technol. Biotechnol. 57, 472 (2019).

15. Palupi, N. et al. The Effect of Enzymatic Hydrolysis on The Properties of Protein Hydrolysate from Paddy Mushroom. Makara J. Technol. 14, (2010).

16. Goswami, B. et al. Evaluation of bioactive properties of Pleurotus ostreatus mushroom protein hydrolysate of different degree of hydrolysis, LWT 149, 1 (2021)

17. Farzaneh, P. et al. Bioactive properties of Agaricus bisporus and Terfezia claveryi proteins hydrolyzed by gastrointestinal proteases. LWT 91, 322 (2018).

18. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 13.0, 2023. http://www.eucast.org.

Claims

1. Sposób otrzymywania ekstraktu z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) bogatego w białka i peptydy, znamienny tym, że przed ekstrakcją oczyszczone i podzielone na mniejsze fragmenty owocniki mrozi się w temperaturze od -20 do -80°C korzystnie -80°C, po czym zamrożony materiał zalewa się ciekłym azotem korzystnie trzykrotnie następnie rozciera na proszek lub owocniki poddaje się liofilizacji w temperaturze od -50 do -40°C, korzystnie -45°C przy ciśnieniu wynoszącym od 4 do 6 Pa, optymalnie 5 Pa aż do uzyskania stałej masy liofilizatu, który dzieli się na kawałki i tak przygotowany surowiec poddaje ekstrakcji zalewając wodą w proporcji w : w od 1 : 5 do 1 : 15 korzystnie 1 : 10, przy czym proces prowadzi się w temperaturze od 50 do 80°C, korzystnie 60°C, stale mieszając przez 1,5 do 2 godzin, a następnie chłodzi do temperatury 30°C, odwirowuje supernatant i poddaje koncentracji, korzystnie do uzyskania dziesięciokrotnie zatężonego ekstraktu.

2. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że supernatant odwirowuje się przy obrotach od 3000 do 6000, korzystnie 5000 xg, w temperaturze 4°C.

3. Ekstrakt z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) bogatego w białka i peptydy uzyskany sposobem opisanym w zastrz. 1 do zastosowania we wspomaganiu profilaktyki i leczenia chorób wywoływanych przez grzyby pleśniowe Aspergillus i Penicillium.

4. Sposób otrzymywania hydrolizatu z ekstraktu z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus ) bogatego w białka i peptydy, znamienny tym, że najpierw otrzymuje się ekstrakt gdzie oczyszczone i podzielone na mniejsze fragmenty owocniki mrozi się w temperaturze od -20 do -80°C korzystnie -80°C, po czym zamrożony materiał zalewa się ciekłym azotem korzystnie trzykrotnie następnie rozciera na proszek lub owocniki poddaje się liofilizacji w temperaturze od -50 do -40°C, przy ciśnieniu wynoszącym od 4 do 6 Pa, optymalnie 5 Pa aż do uzyskania stałej masy liofilizatu, który dzieli się na kawałki i tak przygotowany surowiec poddaje ekstrakcji zalewając wodą w proporcji w : w od 1 : 5 do 1 : 15 korzystnie 1 : 10, przy czym proces prowadzi się w temperaturze od 50 do 80°C, stale mieszając przez 1,5 do 2 godzin, a następnie chłodzi do temperatury 30°C, odwirowuje supernatant i poddaje koncentracji, korzystnie do uzyskania dziesięciokrotnie zatężonego ekstraktu, następnie tak zatężony ekstrakt poddaje się hydrolizie enzymatycznej za pomocą proteazy serynowej pochodzenia zwierzęcego, gdzie ilość enzymu wobec białka zawartego w ekstrakcie od 5 do 20%, optymalnie 10%, a reakcję prowadzi się w warunkach pH od 7 do 9, optymalnie 8, w temperaturze w zakresie od 35 do 50°C, korzystnie 40°C, w czasie od 1 do 3 godzin, a po zakończeniu reakcji otrzymuje się hydrolizat.

5. Sposób według zastrzeżenia 1 i 2, znamienny tym, że po zakończeniu hydrolizy prowadzi się dezaktywację enzymu w temperaturze od 95 do 105°C, korzystnie 98°C, w czasie 10 do 15 minut.

6. Hydrolizat z ekstraktu z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) bogatego w białka i peptydy uzyskany sposobem opisanym w zastrz. 4 do zastosowania we wspomaganiu profilaktyki i leczenia chorób wywoływanych przez grzyby pleśniowe Aspergillus i Penicillium.