PL247686B1 - Sposób wytwarzania wielordzeniowego nanonośnika polielektrolitowego syntetyzowanego na bazie siarczanu dodecylu sodu i wielordzeniowy nanonośnik polielektrolitowy do zastosowania do leczenia w terapii przeciwnowotworowej - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób wytwarzania wielordzeniowego nanonośnika polielektrolitowego syntetyzowanego na bazie siarczanu dodecylu sodu i wielordzeniowy nanonośnik polielektrolitowy do zastosowania do leczenia w terapii przeciwnowotworowej. Sposób wytworzenia wielordzeniowego nanonośnika polielektrolitowego, obejmuje następujące etapy. Solubilizacja wybranego lipofilowego czynnika aktywnego w micelach SDS, wytworzenie kompleksu micel SDS z przeciwnie naładowanym polielektrolitem — polikationem, opłaszczenie powstałego dodatnio naładowanego nanonośnika (kompleksu SDS/polikation) polianionem.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wielordzeniowego nanonośnika polielektrolitowego syntetyzowanego na bazie siarczanu dodecylu sodu i wielordzeniowy nanonośnik polielektrolitowy do zastosowania do leczenia w terapii przeciwnowotworowej.

W dobie współczesnej medycyny, technika i inżynieria biomedyczna za priorytet postawiły sobie, polepszenie ogólnego stanu zdrowia pacjenta poddawanego terapii przeciwnowotworowej. Ponieważ choroba nowotworowa ma niejednokrotnie wymiar wieloogniskowy to zastosowanie małocząsteczkowych cytostatyków o wysokiej toksyczności ogólnoustrojowej i niskiej selektywności wiąże się z częstym występowaniem niepożądanych efektów. Szczególnie narażone na negatywne skutki chemioterapii są szybko dzielące się komórki szpiku kostnego, nabłonka przewodu pokarmowego i gonad [Mordente A. et al., Curr. Med. Chem.; 16: 1656-1672, 2009]. Innym czynnikiem ograniczającym efektywność chemioterapii jest oporność komórek nowotworowych na leki. Przyczyną tego zjawiska może być mało efektywne gromadzenie się leku w komórkach guza, a w konsekwencji zmniejszenie jego skuteczności [Jarmuła A., et al., Postepy Hig. Med. Dosw.; 65: 216227, 2011], zaburzenia procesów związanych ze zmianami struktury DNA oraz hamowanie procesu apoptozy [Szenajch J., Cieślak A., Contemp. Oncol.; 9: 123-128 2005]. Zjawisko oporności wielolekowej jest najważniejszym problemem współczesnej chemioterapii i ma silny związek z fazą cyklu komórkowego, w której znajdują się komórki nowotworowe. Mniejszą wrażliwością na leki charakteryzują się komórki znajdujące się w fazie spoczynkowej, mamy wówczas do czynienia z opornością kinetyczną. Ponadto, występować może też oporność farmakologiczna polegająca na redukcji stężenia chemioterapeutyku z powodu ryzyka toksyczności systemowej [Miedzińska-Maciejewska M., Bodnar L., Contemp. Oncol.; 8: 457-465, 2004]. Jednoczesna oporność na kilka do kilkunastu leków, różnorodnych pod względem struktury, uwarunkowana jest często tym samym mechanizmem działania [Szenajch J., Cieślak A., Contemp. Oncol.; 9: 123-128, 2005]. Warto podkreślić, że dodatkowo, na populację komórek nowotworowych składają się ich różne grupy, z których jedne są wrażliwe na leki, podczas gdy inne bywają na nie oporne. Chemioterapia niszczy komórki wrażliwe, ale pozostawia wyższy procent opornych na leki, żywych komórek. Jest to poniekąd związane z obecnością w niszy nowotworu, nowotworowych komórek macierzystych (CSCs, ang. cancer stem cells), które odgrywają kluczową rolę w przerzutowaniu i tworzeniu nowych ognisk chorobowych. Oporność na chemioterapię jest także bardzo często skorelowana z obecnością w błonach komórek nowotworowych specyficznych białek, które na drodze aktywnego transportu usuwają ksenobiotyki z komórki [Nevozhay D., et al., Postepy Hig. Med. Dosw.; 61: 350-60, 2007]. Dlatego obecnie w chemioterapii coraz częściej stosuje się przenośniki leków, głównie po to, aby lek w większej ilości docierał do komórek nowotworowych, pozostawiając nienaruszone komórki prawidłowe. Idea zastosowania systemów dostarczania leków (D DS, ang. Drug delivery system) do obszaru niszy nowotworu opiera się na koncepcji magicznej kuli (ang. Magic ball) stworzonej na początku XX wieku przez Paula Ehrlicha. Zgodnie z jej założeniem idealny nośnik powinien charakteryzować się optymalnymi parametrami akumulacji i uwalniania leku, możliwie długim czasem połowicznego rozpadu i niską toksycznością ogólnoustrojową. Oznacza to, że tylko komórki nowotworowe powinny być miejscem docelowym działania uwalnianego z nośnika leku, podczas gdy tkanki zdrowe pozostawałyby nienaruszone. Zgodnie z teorią zaproponowaną przez Ehrlicha, wykorzystanie makrocząsteczek jako elementów składowych systemu DDS rozwinął po raz pierwszy Ringsdorf w 1975 r. W swoich pracach zasugerował, że najbardziej istotnymi parametrami ro zpatrywanymi podczas projektowania połączeń nośnik - lek są masa cząsteczkowa przenośnika, jego struktura przestrzenna oraz immunogenność. Drugim aspektem, jaki nie powinien być pominięty podczas opracowania procesu syntezy nośnika jest jego odpowiednia modyfikacja, tak aby nie zostały zaburzone parametry cytotoksyczne dostarczanego chemioterapeutyku [Nevozhay D., et al., Postepy Hig. Med. Dosw.; 61: 350-360, 2007].

Narzędzi molekularnych, które pozwalają na stworzenie niespotykanych dotąd cząstek o submikronowych rozmiarach (od 1 do 200 nm) dostarcza nanotechnologia. Nanocząstki, będące wytworem technologii w skali nano, dzięki swoim unikalnym właściwościom, dużej powierzchni w stosunku do masy oraz wysokiej reaktywności, dość szybko zostały uznane za potencjalne przenośniki leków, które w przyszłości mogą być stosowane w chemioterapii różnego typu nowotworów.

Za zastosowaniem nanoukładów jako składowych chemioterapii przemawia również charakterystyczna budowy niszy nowotworu, cechująca się występowaniem nieszczelności (rzędu 100-800 nm) w budowie sieci naczyń włosowatych tego obszaru. W zdrowych tkankach, w tym w prawidłowym śródbłonku, średnica przestrzeni międzykomórkowych wynosi jedynie 2 nm [Nevozhay D., et al., Postępy Hig. Med. Dosw.; 61: 350-360, 2007]. Wykorzystując tę dysproporcję, stwierdzono, że zastosowanie przenośników leków łatwo przedostających się do układu krążenia w obszarze niszy guza, sprzyja ich gromadzeniu się w jego środowisku. Transport takich makrocząsteczek jest ograniczony w przypadku prawidłowych tkanek ze względu na zbyt małą średnicę szczelin śródbłonka [Kratz F., et al., Chem. Med. Chem.; 3: 20-53, 2008], a samo zjawisko selektywnego gromadzenia się nanonośników w pobliżu tkanek nowotworowych określane jest jako efekt zwiększonej przepuszczalności i retencji (EPR, ang. enhanced permeability and retention). Pierwszymi nanostrukturami, które zostały dopuszczone przez amerykańską Agencję Żywności i Leków (FDA, ang. U.S. Food and Drug Administration) do zastosowania klinicznego były liposomy. Są to koliste pęcherzyki złożone z dwuwarstwy lipidowej, wewnątrz których znajduje się faza wodna [Malam Y., et al., TIPS; 30: 592-599, 2009]. Liposomalna forma doksorubicyny (DOX, ang. doxorubicin), występująca pod handlową nazwą Doxil® (USA) / Caelyx® (kraje Unii Europejskiej) [Sakai-Kato K.L., et al., Chem. Pharm. Bull. 2012; 60: 391-396] jest stosowana w leczeniu mięsaka Kaposiego i szpiczaka mnogiego [Ning YM., et al., Oncology; 21: 1503-1508, 2007]. Warto podkreślić, że liposomy Doxil® są dodatkowo opłaszczone glikolem polietylenowym (PEG ang. Poly(ethylene glycol), który wydłuża okres półtrwania tych nośników, a także ogranicza interakcje ze składnikami krwi oraz układem siateczkowo - śródbłonkowym. W porównaniu z wolnym lekiem, Doxil® charakteryzuje się większą skutecznością i niższą kardiotoksycznością [Szmit S., Szczylik C., Contemp. Oncol.; 13: 1-82; 2009]. Stosowanie preparatu Doxil® pozwala również skutecznie zredukować efekty uboczne towarzyszące terapii DOX tj. nudności, wypadanie włosów i nefro-toksyczność. Jednakże, głównymi, niepożądanymi skutkami ubocznymi podczas stosowania tego preparatu są zapalenie błony śluzowej, obrzęki i stany złuszczenia skóry oraz bolesne zaczerwienienia [Gaitanis A., Staal S., Methods Mol. Biol.; 624: 385-392, 2010]. Zastosowanie liposomów jako cząsteczek transportujących leki niesie zatem ze sobą pewne ograniczenia, w głównej mierze wynikające z ich nietrwałości. Innym czynnikiem zmniejszającym efektywność liposomów są ich trudności w pokonaniu bariery krew-mózg oraz zjawisko „przeciekania”, objawiające się uwalnianiem leku z liposomów w krwioobiegu [Sakai-Kato K., et al., Chem. Pharm. Bull. 2012; 60: 391-396]. Modyfikacja liposomów polegająca na ich opłaszczaniu PEG wydłuża okres półtrwania tych nośników, a także ogranicza interakcje ze składnikami krwi oraz układem siateczkowo - śródbłonkowym. Oprócz liposomów, duże zainteresowanie środowiska naukowego budzą nanonośniki polimerowe. Szczególnie biodegradowalne polimerowe nanocząstki (NPs, ang. nanoparticles) są obiecującymi nośnikami dla wielu związków aktywnych. Ich wysoki potencjał aplikacyjny w farmakologii wiąże się z poprawą skuteczności podawanej w formie „nano” substancji terapeutycznej przy jednoczesnym obniżeniu ryzyka wystąpienia niepożądanych skutków ubocznych. Dogodnym narzędziem do wytwarzania biodegradowalnych nanośników polimerowych jest sekwencyjna adsorpcja przeciwnie naładowanych polielektrolitów (LbL, ang. layer by layer). Po raz pierwszy metodę LbL zaproponował R. K. ller w 1966 r. [Iler R.K., J. Colloid Interface. Sci, 2: 569-594, 1966], a kolejne udoskonalenia syntezy zostały opisane przez Dechera [Decher G., et al., COCIS 3, 32-39, 1998]. Polielektrolity to polimery, które w roztworze wodnym dysocjują na polianiony i polikationy. Wiele biomakromolekuł, takich jak np. kwasy nukleinowe (DNA, RNA), białka lub polisacharydy są polielektrolitami. Toteż ich zastosowanie w przygotowywaniu nanonośników jest wysoce pożądane, ponieważ może spowodować wzrost bioakceptacji nanosystemów przez układy biologiczne oraz wydłużyć ich czas półtrwania w organizmie pacjenta. Wielokrotnie dowiedziono, że zawiesiny nanocząstek w płynach ustrojowych ulegają szybkiej agregacji. Dzieje się tak na skutek różnicy sił jonowych płynów ustrojowych i nanoukładów lub adsorpcji białek surowicy przez podawane nanosubstancje. Dlatego, aby obniżyć ryzyko niepożądanych reakcji nanonośnik - płyny biologiczne, powierzchnie nanomateriałów powlekane są hydrofilowymi, elastycznymi i niejonowymi polimerami polielektrolitowymi. Polielektrolity takie jak poli-L-aminokwasy, np. poli-L-lizyna (PLL, ang. poly-1-lysine) i kwas poli-L-glutaminowy (PGA ang. poly-1-glutamic acid) mają podobne właściwości do łatwo dysocjujących w roztworach wodnych biomakromolekuł i są z powodzeniem stosowane w wytwarzaniu nanoprzenośników leków metodą LbL. Dzięki stosunkowo prostej syntezie i łatwemu procesowi oczyszczania, takie polielektrolity użyte do tworzenia powłok nanokapsuł, cechuje wysoka biodegradowalność, mała toksyczność i niska zdolność do zmiany cytotoksyczności transportowanych leków. Pierwszym, rozpuszczalnym w wodzie polimerem do powlekania nanoukładów, który został zatwierdzony przez FDA był wspomniany wcześniej, PEG który obniża niespecyficzne wiązania się białek surowicy do nanocząstek. Dzieje się tak ponieważ łańcuchy polielektrolitowe PEG, tworzą charakterystyczną koronę, która blokuje dostępność kapsuł dla białek układu odpornościowego (tzw. efekt stealth) i zapobiega ich niespecyficznemu wiązaniu się z błoną komórkową.

Początkowo adsorpcję polimerów o przeciwnym ładunku, prowadzoną metodą LbL wykonywano na sztywnych matrycach takich jak polistyren, węglan wapnia, krzemionka, lateks. Takie działania miały jednak dwa poważne ograniczenia. Po pierwsze otrzymane stałe rdzenie, aby mogły być przekształcone w puste otoczki nanonośnikowe dla substancji aktywnych, musiały być poddawane działaniu substancji żrących, np. kwasów co związane było z wysokim prawdopodobieństwem uszkodzenia. Po drugie otoczki oparte na sztywnych matrycach miały niską pojemność załadunkową i były wypełnione substancją aktywną tylko w ograniczonym stopniu. [Grigoriev D.O., et al., Langmuir; 24: 999-1004, 2008; Szczepanowicz K., et al., Langmuir. 26: 12592-12597, 2010; Szczepanowicz, K., et al., Journal of microencapsulation; 27: 198-204, 2010].

W opisie zgłoszenia wynalazku WO2009/141329 przedstawiono nanocząstki na bazie złota i kreatyny pokryte warstwami albuminy. Stałą matrycą do wytwarzania nanokapsuł z polimerową otoczką mogą być też cząstki organiczne, np. ujemnie naładowane białka, ludzkie erytrocyty, grzyby czy bakterie E. coli, jak to zostało przedstawione w opisie patentowym nr US6699501. Bardziej skomplikowanym układem, opartym na stałych matrycach, jest ten, opisany w amerykańskim zgłoszeniu patentowym nr US20080248108, który przedstawia biokompatybilne wielowarstwowe kapsuły do enkapsulacji całych komórek. Takie nanokapsuły jako matrycę zawierają zmodyfikowane cząsteczki alginianu, na który następnie nakładane są warstwy chitozanu i albuminy wołowej.

Z kolei w amerykańskich zgłoszeniach patentowych US2003219384 i US20060275375 przedstawiono nanokapsuły zawierające jako matryce stałe cząstki melaminowo-formaldehydowe pokryte polimerową wielowarstwową otoczką zbudowaną z naprzemiennie nakładanych polielektrolitów PSS/PAH. Ta sama, sekwencyjnie nakładana mieszanina polimerów została wykorzystana do pokrycia matrycy zawierającej cząsteczki fluoresceiny, co zostało opisane w amerykańskim zgłoszeniu patentowym US2004001372. ‘

Dużym przełomem w badaniach nad techniką LbL była propozycja zespołu Sukhorukova [Sukhorukov G. B. et al. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects; 137: 253-266, 1998], w której wykorzystano tę metodę do tworzenia wielowarstwowych polielektrolitów na stałych cząstkach koloidalnych w celu otrzymania nanokapsuły. Cząstki koloidalne mogą zawierać składnik aktywny lub mogą być użyte jako rdzeń kapsuły [Szczepanowicz K., et al., Langmuir; 26: 12592-12597, 2010; Grigoriev D.O., et al., Langmuir; 24: 999-1004; 2008, Preetz C., et al., Nanomedicine NANOMED-NANOTECHNOL 4: 106-117, 2008]. Z czasem zaproponowana metoda tworzenia wielowarstwowych kapsuł powłokowych została rozszerzona na inne rodzaje rdzeni [Borodina T.N., et al., ACS Appl. Mater. Interfaces; 1: 996-1001, 2009], w tym także rdzenie ciekłe [Bazylińska U., et al., Bioelectrochemistry 87:147-153, 2012; Szczepanowicz K., et al., Adv. Colloid. Interface Sci. 222: 678-691, 2015]. Najczęściej stosowanymi metodami wykorzystywanymi do syntezy multiwarstwowych polimerowych nanokapsuł są metoda saturacyjna (wysyceniowa), filtracyjna oraz wirowania [Guzey D., McClements D.J., Adv. Colloid. Interface Sci.; 21: 227-48, 2006]. O ile kosztowne i energochłonne metody: filtracyjna i wirowania były stosowane dla syntetyzowanych metodą LbL nanokapsuł opartych na stałych matrycach, to szeroko opisana w literaturze patentowej metoda saturacyjna, znana z opisów WO2010/111517, WO2009/141329A1, jest stosowana do konstrukcji polimerowych nanokapsuł na bazie ciekłych rdzeni opisanych w opisie zgłoszenia wynalazku WO03/087384A1. Polega ona na dobraniu takiego stężenia polielektrolitu, które pozwoli na całkowite pokrycie wszystkich cząstek płynnej matrycy występujących w układzie. Po naniesieniu każdej warstwy polielektrolitu, ładunek nanoukładu kontrolowany jest przez pomiar potencjału zeta. Ponadto, metoda saturacyjna sprawia, że tylko niewielka ilość wolnego polimeru może pozostać w roztworze wodnym, a ryzyko agregacji tak otrzymanych nanokapsuł jest minimalne [Szczepanowicz K., et al., Langmuir; 2010; 15: 12592-12597]. Zastosowanie metody saturacyjnej na bazie płynnego rdzenia zostało również przedstawione w opisie zgłoszenia wynalazku WO03/087384A1, w którym zawarto przepis na wytwarzanie nanocząstek ukierunkowanych na transfer genów, które były złożone z multiwarstwowych wybranych polielektrolitów (m.in. polilizyna czy polietylenoimina). Tym samym sposobem, zgodnie z opisem zgłoszenia wynalazku WO2006/089572A1, można otrzymać polielektrolitowe kapsuły stosowane do enkapsulowania surowicy bydlęcej z immunoglobuliną G (IgG, and. Immunoglobulin G). Główną zaletą metody LbL na bazie ciekłego rdzenia jest fakt, że substancja czynna np. lek może być enkapsulowana w jednoetapowym procesie, co znacznie upraszcza syntezę i zwiększa wydajność enkapsulacji zamykanych we wnętrzu rdzenia substancji aktywnych. Za zastosowaniem w nanotechnologii wielowarstwowych nanokapsuł polielektrolitowych opartych na płynnych rdzeniach przemawiają także ich podatność na modyfikacje i wielofunkcyjność. Obie te cechy wynikają m.in. z możliwości łączenia różnych polielektrolitów oraz modyfikacji ich powłoki polielektrolitowej przez substancje nieorganiczne i organiczne w tym polimery, nanorurki węglowe, przeciwciała lub lipidowe grupy funkcyjne [Liu T., et al., Adv. Healthc. Mater.; 8: e1800939, 2019; Ślusarczyk J., et al., Neurotox. Res. 30: 581-592, 2016]. Taka wielofunkcyjność syntetyzowanych metodą LbL nanokapsuł, może być wykorzystana w dwóch systemach ukierunkowanego dostarczania leków: 1) pasywnego, w którym specjalna modyfikacja powłoki polielektrolitowej wydłuża czas aktywnego krążenia nanokapsuły w ustroju, 2) ukierunkowanego, w którym konieczne jest wykorzystanie ligandów celujących, np. dla receptorów powierzchniowych komórki [Hashemi M., et al., Acta Biomater.; 65: 376-392, 2018].

Szczególnym przypadkiem ciekłych rdzeni nanokapsuł są wytwarzane metodą saturacyjną i otulone otoczką polimerową nanoemulsje. Z amerykańskiego opisu patentowego US20030157181 znane są kapsuły wytwarzane metodą LbL z zastosowaniem różnych par przeciwnie naładowanych polielektrolitów (PSS/PEI; PLL/PAS; heparyna/BSA) do oplatania matryc typu nonoemulsji czy liposomów. Ponadto, dane literaturowe dowodzą, że emulsje sprowadzone do nanoskali cechuje obe cność kropli fazy zdyspergowanej o średnicy od 100 nm [Mason T.G., et al., Journal of Physics. Condensed Matter.; 18, 2006] do 500 nm [Zanetti-Ramos B.G., et al., Mater. Sci. Eng. C.; 28: 526-553, 2008]. Od tradycyjnych emulsji odróżnia je m.in. stopień rozdrobnienia fazy zdyspergowanej, który w przypadku nanoemulsji jest co najmniej o rząd wielkości mniejszy. Właściwości fizykochemiczne nanoemulsji powodują, że tworzą one wizualnie jednorodne, przezroczyste lub półprzezroczyste zawiesiny. Proces syntezy nanoemulsji jest prosty. Przeprowadzony w odpowiedniej temperaturze, najczęściej, w temperaturze pokojowej, wymaga mniejszego nakładu pracy w porównaniu z klasycznymi układami emulsyjnymi. Stabilność kinetyczna i jednorodność układów nanoemulsyjnych może być jednak zaburzona podczas formowania polimerowej osłonki [Anton N., et al., Int. J. Pharm.; 344: 4452, 2007; Wang L., et al., Langmuir; 24, 6092-6099, 2008; Gutierre J.M., et l., Curr. Opin. Colloid. Interface Sci.; 13: 245-251,2008]. Dzieje się tak na skutek utworzenia przez cząsteczki emulgatora warstewki ochronnej wokół jego zdyspergowanych kropel. Podczas stosowania emulgatorów jonowych, stabilizacja nanoemulsji jest utrudniona przez odpychanie jednakowo naładowanych cząstek fazy rozproszonej [Rodriguez-Abreu C., et al. Curr. Opin. Colloid. Interface Sci.; 13: 198, 2008; Velikov K.P., et al., Soft Matter.; 4: 1964-1985, 2008]. Jednakże, aby zastosowanie nanokapsuły na bazie ciekłej nanoemulsji, zakończyło się powodzeniem, decydujący wpływ na ich stabilność ma dobór odpowiednich składników układu nanoemulsyjnego, a szczególnie surfaktantu stabilizującego układ. Taką rolę spełnia jonowy emulgator będący także łącznikiem pomiędzy matrycą a pierwszą warstwą przeciwnie naładowanego polielektrolitu. W amerykańskim opisie patentowym US 2007036831 przedstawiono nanoemulsje stabilizowane surfaktantami niejonowymi, jonowymi lub ich mieszaniną, które wykazywały silne właściwości antybakteryjne. Tym samym sposobem zgodnie z polskim opisem patentowym PL 187493 można otrzymać nanoemulsje typu olej w wodzi e, obejmującą lipidową fazę amfifilową, w której krople oleju mają średni rozmiar niższy niż 150 nm. Dużym przełomem było rozwiązanie zaprezentowane w zgłoszeniu patentowym P. 392073 oraz pracy [K Szczepanowicz, D Dronka-Góra, G Para, P Warszyński Journal of microencapsulation 27 (3), 198204] przedstawiających sposób otrzymania nanokapsuł zawierających ciekły rdzeń nanoemulsji typu olej w wodzie, stabilizowanych kationowym surfaktantem, czyli np. solą sodową dokuzanu (AOT, ang. docusate sodium salt). Faza olejowa takich nanokapsuł została przygotowana przez rozpuszczenie ujemnie naładowanego środka powierzchniowo czynnego (AOT) w oleju. Zgodnie z regulacjami FDA, AOT otrzymał status GRAS (ang. Generally Regarded as Safe) i został dodany do listy substancji bezpiecznych. Publikacje naukowe przedstawiają opis formowania nanokapsuł opartych na AOT poprzez dodanie fazy olejowej, rozpuszczonego w chloroformie surfaktantu do roztworu PLL. Tak otrzymany roztwór miesza się na mieszadle magnetycznym przy jednoczesnym przeprowadzeniu pomiarów potencjału zeta otrzymanych nanokapsuł. Pomiar ten, jest kluczowy do wyznaczenia odpowiedniego stosunku objętościowego środka powierzchniowo czynnego do polikationu oraz do monitorowania stabilności utworzonych kapsuł. W ten sposób wyznacza się minimalną objętość zaadsorbowanego polielektrolitu w zawiesinie nanokapsuł co w efekcie doprowadza do odwrócenia ładunku kropel nanoemulsji. Średnią wielkość kropli mierzy się metodą dynamicznego rozpraszania światła

DLS (ang. dynamie light scattering) oraz metodą wizualizacji indywidualnych nanocząstek w zawiesinie NTA (ang. nanoparticles tracking analysis). Podobną sekwencję działań wykonuje się przy formowaniu nanoemulsji opartych na innym olejo-rozpuszczalnym surfaktancie kationowym bromku didodecylodimetyloamoniowym (DODABr, ang. didecyldimethylammonium bromide). Z opisu patentowego US 20150231153 znany jest przykład enkapsulacji nierozpuszczalnego w wodzie leku przeciwnowotworowego Fulvestrant, którego log P = 8,9. Kompozycja ta przewiduje podawanie Fulvestrantu w postaci płynnej. Lek rozpuszczany jest w mieszaninie alkoholu z polisorbatem 80, antyoksydantem oraz olejem rycynowym. Wynika z tego, że technika LbL jest zasadni czo dedykowana enkapsulacji leków hydrofobowych i materiałów rozpuszczalnych w fazie hydrofobowej. Do tej pory, surfaktantami stosowanymi podczas syntezy rdzeni nanokapsuł polielektrolitowych były wyłącznie olejorozpuszczalne środki powierzchniowo czynne takie, jak powyżej opisane AOT czy DODBR. Jednakże, główną przeszkodą zastosowania tych surfaktantów do wytworzenia końcowego produktu, który mógłby być podawany pacjentom, jest konieczność wykorzystania do syntezy nanokapsuł metodą LbL wysoce toksycznych substancji organicznych, np. chloroformu, cykloheksanu lub etyloglikolu, które służą jako rozpuszczalniki dla olejorozpuszczalnych surfaktantów. Mając na uwadze argument, że zastosowanie biomedyczne opisywanych nanopreparatów wymaga wyeliminowania wszystkich toksycznych związków z zawiesiny, w tym najczęściej stosowanego chloroformu, użycie olejorozpuszczalnych surfaktantów podczas syntezy nanokapsuł metodą LbL staje pod wielkim znakiem zapytania. Dlatego też, w celu uniknięcia stosowania rozpuszczalników organicznych, takich jak alkohole, halogenoalkany, etery i estry glikolu etylowego, ich stabilizatorów i dodatkowych małocząsteczkowych związków, prowadzone są intensywne badania nad tzw. takimi układami zdyspergowanymi, które dzięki wysokiemu rozdrobnieniu substancji aktywnej pozwalają osiągnąć zadowalającą dystrybucję leków w organizmie oraz kontrolę czasu i miejsca ich uwalniania.

Biorąc pod uwagę zastosowanie końcowego produktu, to jest nanonośnika leku do komórki nowotworowej, alternatywnym i bezpieczniejszym rozwiązaniem jest wykorzystanie rozpuszczalnych w wodzie surfaktantów, które to z przeciwnie naładowanym polielektrolitem tworzą kompleks objętościowy (micele/polielektrolit). Taki kompleks może stanowić również rdzeń tzw. multirdzeniowej, polielektrolitowej nanokapsuły, a wnętrze miceli tworzy dogodne warunki do enkapsulacji hydrofobowych leków.

Sposób wytwarzania wielordzeniowego nanonośnika polielektrolitowego syntetyzowanego na bazie dodecylosiarczanu sodu (SDS) według wynalazku charakteryzuje się tym, że wytworzenie układu wielordzeniowego załadowanego hydrofobowym czynnikiem aktywnym - paklitakselem (PTX) jest procesem trzyetapowym. W etapie pierwszym do wodnego roztworu micel dodecylosiarczanu sodu o stężeniu większym od krytycznego stężenia micelizalcji (CMC, Critical Micelle Concentration), to jest 10 x CMC, dodaje się roztwór hydrofobowego czynnika aktywnego, PTX w etanolu, to jest 0,3 ml roztworu nasyconego w etanolu, a następnie odparowuje się rozpuszczalnik. W drugim etapie wytwarzany jest dodatnio naładowany wielordzeniowy nanonośnik hydrofobowej substancji aktywnej (PTX) poprzez formowanie kompleksów micel SDS załadowanych hydrofobową substancją aktywną z przeciwnie naładowanym polielektrolitem poli-L-lizyną. Kompleksację przeprowadza się na mieszadle magnetycznym metodą saturacyjną/wysyceniową i do roztworu poli-L-lizyny dodaje się roztwór micel SDS z solubilizowaną hydrofobową substancją aktywną, przy czym proces kontrolowany jest przez pomiar potencjału zeta. W punkcie tuż przed przeładowaniem, większość micel SDS jest skompleksowana z przeciwnie naładowanym polielektrolitem i tak wytworzony nośnik dodatnio naładowany pokrywa się polianionem, poli-kwasem glutaminowym (PGA), co jest trzecim etapem syntezy. Opłaszczenie przeprowadza się na mieszadle magnetycznym, ponownie, metodą saturacyjną/wysyceniową i do roztworu poli-kwasu glutaminowego dodaje się roztwór dodatnio naładowanego wielordzeniowego nanonośnika hydrofobowej substancji aktywnej, a proces kontrolowany jest przez pomiar potencjału zeta. W punkcie tuż przed przeładowaniem, większość kompleksów SDS/Poli-L-lizyna pokryta jest przeciwnie naładowanym polielektrolitem, polianionem poli-kwasem glutaminowym.

Do tworzenia wielordzeniowych nanonośników polielektrolitowych stosuje się roztwory polielektrolitów o stężeniu od 10 do 2000 ppm, i sile jonowej z zakresu od 0,01 do 0,15 M.

W innej wersji stosuje się roztwór poli-Lizyny o stężenie 50 ppm, a poli-kwasu glutaminowego o stężeniu 2000 ppm oraz stężeniu chlorku sodu 0,015 mol/dm³.

W innej wersji do tworzenia wielordzeniowych polielektrolitowych nanonośników stosuje się biozgodne i biodegradowalne polielektrolity, poli-lizynę i poli-kwas glutaminowy.

Przedmiotem wynalazku jest także wielordzeniowy nanonośnik polielektrolitowy wytworzony sposobem według wynalazku do zastosowania do leczenia w terapii przeciwnowotworowej.

Otrzymany nanonośnik polielektrolitowy na bazie wodno-rozpuszczalnego surfaktantu SDS, charakteryzuje się wielordzeniową budową, powłokami polielektrolitowymi z PLL i PGA, średnicą od 70 nm do 200 nm i stabilnością w środowisku wodnym i nie wykazuje toksyczności wobec komórek śródbłonka, ma możliwości załadowania hydrofobowym/nierozpuszczalnym w wodzie czynnikiem aktywnym np. PTX, wykazuje zmniejszony efekt toksyczności dla czynników aktywnych zamkniętych w nanonośniku i wykazuje zbliżoną aktywność zamkniętego czynnika aktywnego do jego wolnej formy. Zasadniczą korzyścią polielektrolitowych nanonośników według wynalazku są: 1) wydajna enkapsulacja PTX, 2) prosty skład i 3) nieskomplikowana technika otrzymywania, które pozwalają uzyskać stabilne nanoukłady, optymalne dla transportu pasywnego do guzów nowotworowych.

Stosowane polielektrolity są biozgodne i biodegradowalne. Puste nanonośniki nie wykazują znaczącej cytotoksyczności dla komórek człowieka hodowanych w warunkach in vitro. Zamknięty w nanonośnikach PTX wykazuje wysoką aktywność przeciwnowotworową, porównywalną z wolnym lekiem, a ponadto zmniejszoną toksyczność względem komórek nienowotworowych w porównaniu do tej samej ilość leku w formie niezamkniętej.

Wykorzystanie nanokapsuł opartych na ciekłych nanomicelarnych rdzeniach, jako systemów dostarczania leków do komórek nowotworowych pozwala na kontrolowane uwalnianie substancji aktywnej, wydłużenie jej czasu działania, ale też ograniczenie jej cytotoksyczności wobec wysoce wrażliwych na chemioterapeutyki tkanek prawidłowych. Ponadto taki nanosystem cechuje zwiększona trwałość preparatu, co przekłada się na sekwencyjne uwalnianie leków, przez co zostaje zniwelowane ryzyko niepożądanych, wzajemnych interakcji substancji terapeutycznych. W efekcie lek enkapsulowany w takim nanonośniku jest: po pierwsze chroniony przed negatywnym wpływem czynników zewnętrznych, np. tlenu z powietrza, wilgoci, a po drugie może być uwolniony w miejscu docelowym. Oprócz tego nanonośniki mogą również służyć do maskowania zapachu, toksyczności, koloru, a nawet smaku podawanych substancji, czy stanowić molekularne sondy do wykrywania toksyn lub czynników chorobotwórczych. Zasadniczą zaletą rozwiązania według wynalazku jest wytwarzanie bardzo dogodną metodą, bez konieczności stosowania rozpuszczalników organicznyc h, stabilnych, nowoczesnych nanokapsuł, których rdzeń oparty jest na wo dnorozpuszczalnym surfaktancie - SDS, stanowiącym ciekły układ micelarny, będącym dogodnym środowiskiem dla substancji biologicznie czynnych. Nanokapsuły oparte są na metodzie sekwencyjnej adsorpcji przeciwnie naładowanych par polielektrolitów (to jest PLL i PGA) osadzonych na micelach SDS, które cechuje mała lepkość oraz duża stabilność kinetyczna. Ponadto zgłaszany wynalazek jest wysoce jednorodny i homogenny. Składnik aktywny, w tym przypadku hydrofobowy lek przeciwnowotworowy - PTX jest stosunkowo łatwo umieszczany w układzie nanomiceli, a cały nanoukład, wytwarzany, bez konieczności stosowania dużych nakładów energii, charakteryzuje się zadowalającą efektywnością działania.

Przedmiot wynalazku objaśniony w przykładach oraz na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia (A) schematy budowy multirdzeniowych nanonośników polielektrolitowych, o rdzeniach zbudowanych z miceli wodnorozpuszczalnego surfaktantu SDS, które mogą być pokryte jedną warstwą polielektrolitu - poli-L-lizyną (SDS/PLL) lub dwoma warstwami polielektrolitu to jest: poli-L-lizyną i poli-kwasem glutaminowym (SDS/PLL/PGA) i do dodatkowo oba typy nanokapsułek mogą być wypełnione paklitakselem, SDS/PLL/PTX i SDS/PLL/PGA/PTX, (B, C, D, E), wzory strukturalne dla składowych nanokapsuł oraz ich sygnatury używane na schematycznych rysunkach, odpowiednio dla poli-L-Lizyny (PLL), poli- kwasy glutaminowego (PGA), siarczanu dodecylu sodu (SDS) - czyli surfaktantu rozpuszczalnego w wodzie oraz leku enkapsulowanego wewnątrz kapsuły - paklitakselu (PTX), fig. 2 przedstawia parametry charakteryzujące fizykochemiczne właściwości multirdzeniowych nanonośników polielektrolitowych, których rdzenie zbudowane są z miceli wodnorozpuszczalnego surfaktan tu SDS przy czym zaznaczone parametry to: potencjał zeta dla badanych nanokapsuł - odpowiednio SDS/PLL (A) i SDS/PLL/PGA (B), rozkład średnicy hydrodynamicznej nanokapsuł typu SDS/PLL i SDS/PLL/PGA (C), widmo UV-Vis nanokapsuł wypełnionych PTX w odniesieniu do pustych nanoukładów (D), fig. 3 przedstawia zdjęcia z transmisyjnej mikroskopii elektronowej (mikroskop JEM 1010, JEOL, USA) obrazujące morfologię multirdzeniowych kapsuł polielektrolitowych opartych na micelach SDS, to jest: SDS/PLL, SDS/PLL/PGA, SDS/PLL/PTX, i SDS/PLL/PGA/PTX, a skala na zdjęciach odpowiada 50 μm, fig. 4 przedstawia charakterystykę komórek wykorzystywanych w eksperymentach prowadzonych na poziomie in vitro, których celem było określenie właściwości cytotoksycznych i cytostatycznych badanych nanokapsuł wobec komórek raka piersi oraz nienowotworowych komórek śródbłonka człowieka, dodatkowo przedstawiono morfologię badanych komórek (zdjęcia wykonan o za pomocą mikroskopu Olympus IX70 (Olympus, Japonia)) wyposażonego w obiektyw z kontrastem fazowym, przy powiększeniu 10x10), a wykorzystywane do badań linie komórkowe zostały scharakteryzowane m.in. pod względem szybkości proliferacji i czasu podwojenia, a skala na zdjęciach odpowiada 20 μm, fig. 5 przedstawia krzywe przeżywalności dla komórek linii HMEC-1, MCF-7 i MDAMB-231 potraktowanych nanokapsułami typu SDS/PLL I SDS/PLL/PGA oraz chlorkiem sodu, w którym zawieszone były nanokapsuły, inkubacje z badanymi substancjami prowadzono w warunkach wzrostu hodowli, w sposób ciągły, to jest przez 24, 48, 72 i 96 godzin, a prezentowane wyniki zostały uzyskane na podstawie testu redukcji MTT (średnia ± SD), w taki sposób, że wartości liczbowe z odczytów kolorymetrycznych przeliczono w stosunku do kontroli (komórki niepoddane działaniu nanokapsuł i NaCl), którą przyjęto jako 100%, n=3 niezależnych doświadczeń, fig. 6 przedstawia morfologię komórek linii ‘HMEC-1, MCF-7, MDA-MB-231 poddanych działaniu NaCl, SDS/PLL, SDS/PLL/PGA, przez 72 godziny (powiększenie 100x), przy czym zdjęcia były wykonane przy powiększeniu 10x10, za pomocą kamery CCD (Olympus, Japonia), będącej częścią doposażenia dla mikroskopu Olympus IX70 wyposażonego w obiektyw z kontrastem fazowym, a skala na zdjęciach odpowiada 20 μm, fig. 7 przedstawia krzywe przeżywalności dla komórek linii HMEC-1, MCF-7 i MDAMB-231 potraktowanych wolnym PTX, oraz lekiem enkapsulowanym w badanych nanoprzenośnikach, tj. SDS/PLL/PTX i SDS/PLL/PGA/PTX, przy czym komórki były poddane działaniu badanych preparatów w sposób ciągły przez 24, 48, 72 i 96 godzin w warunkach wzrostu hodowli, a prezentowane wyniki, uzyskane zostały na podstawie testu redukcji MTT (średnia ± SD), natomiast dane z odczytów kolorymetrycznych przeliczono w stosunku do kontroli (komórki niepoddane działaniu nanokapsuł lub PTX), którą przyjęto jako 100%, n=3 niezależnych doświadczeń. *p<0,05 - różnice istotne statystycznie między kontrolą, a próbami traktowanymi badanymi substancjami, #p<0,05 - różnice istotne statystycznie między próbami traktowanymi wolnym PTX, a lekiem enkapsulowanym w multirdzeniowych nośnikach polielektrolitowych, +p<0,05 - różnice istotne statystycznie między próbami traktowanymi PTX enkapsulowanym w nośnikach typu SDS/PLL a PTX enkapsulowanym w nośnikach typu SDS/PLL/PGA, fig. 8 przedstawia krzywe przeżywalności wykreślone na podstawie zmiany wewnątrzkomórkowego poziomu ATP w komórkach linii HMEC-1, MCF-7, MDA-MB-231 poddanych działaniu PTX, SDS/PLL/PTX i SDS/PLL/PGA/PTX przez 24, 48, 72 i 96 godzin a prezentowane wyniki (średnia ±SD) uzyskane w wyniku pomiarów luminescencji prób badanych przeliczono w stosunku do kontroli (komórki niepoddane działaniu nanokapsuł lub PTX), którą przyjęto jako 100%, n=3 niezależnych doświadczeń, *p<0,05 - różnice istotne statystycznie między kontrolą, a próbami traktowanymi badanymi substancjami, #p<0,05 - różnice istotne statystycznie między próbami traktowanymi wolnym PTX a lekiem enkapsulowanym w multirdzeniowych nośnikach poli-elektrolitowych, +p<0,05 - różnice istotne statystycznie między próbami traktowanymi PTX enkapsulowanym w nośnikach typu SDS/PLL a PTX enkapsulowanym w nośnikach typu SDS/PLL/PGA, fig. 9 przedstawia morfologię komórek linii HMEC-1, MCF-7, MDA-MB-231 poddanych działaniu PTX, SDS/PLL/PTX i SDS/PLL/PGA/PTX przez 72 godziny, przy czym zdjęcia były wykonane przy powiększeniu 10x10, za pomocą kamery CCD (Olympus, Japonia), będącej częścią doposażenia dla mikroskopu Olympus IX70 wyposażonego w obiekty w z kontrastem fazowym, a skala na zdjęciach odpowiada 20 μm, fig. 10 przedstawia spadek stopnia proliferacji komórek linii HMEC-1, MCF-7, MDA-MB-231 poddanych działaniu PTX, SDS/PLL/PTX i SDS/PLL/PGA/PTX przez 24, 48, 72 i 96 godzin, a eksperyment wykonano z wykorzystaniem sody fluorescencyjnej CyQuant zaś prezentowane wyniki (średnia ± SD), uzyskane w wyniku pomiarów zmian natężenia fluorescencji prób badanych, przeliczono w stosunku do kontroli (komórki niepoddane działaniu nanokapsuł lub PTX), którą przyjęto jako 100%, n=3 niezależnych doświadczeń. *p<0,05 - różnice istotne statystycznie między kontrolą, a próbami traktowanymi badanymi substancjami, #p<0,05 - różnice istotne statystycznie między próbami traktowanymi wolnym PTX, a lekiem enkapsulowanym w multirdzeniowych nośnikach polielektro litowych, +p<0,05 - różnice istotne statystycznie między próbami traktowanymi PTX enkapsulowanym w nośnikach typu SDS/PLL a PTX enkapsulowanym w nośnikach typu SDS/PLL/PGA, fig. 11 przedstawia komórki linii HMEC-1, MCF-7, MDA-MB-231 wybarwione sondą CyQuant, przy czym zdjęcia były wykonane przy powiększeniu 10x10, za pomocą kamery CCD (Olympus, Japonia), będącej częścią doposażenia dla mikroskopu fluorescencyjnego Olympus IX70, a skala na zdjęciach odpowiada 50 μm, fig. 12 przedstawia analizę rozkładu faz cyklu komórkowego komórek linii HMEC-1, MCF-7, MDA-MB-231 po działaniu PTX lub nanokapsuł SDS/PLL/PTX i SDS/PLL/PGA/PTX, przy czym komórki inkubowano z lekiem w formie wolnej jak i enkapsulowanej w badanych nośnikach polielektrolitowych przez 48 godzin, *p<0,05 różnice istotne statystycznie pomiędzy próbami traktowanymi badanymi substa ncjami i kontrolą, #p<0,05 różnice istotne statystycznie pomiędzy próbami traktowanymi lekiem w nanokapsułach, a samym PTX, +p<0,05 - różnice istotne statystycznie między próbami traktowanymi PTX enkapsulowanym w nośnikach typu SDS/PLL, a PTX enkapsulowanym w nośnikach typu SDS/PLL/PGA, fig. 13 przedstawia zmiany asymetrii błony komórkowej oznaczone z zastosowaniem sondy molekularnej Aneksyna V - FITC w komórkach linii HMEC-1, MCF-7, MDA-MB-231 po inkubacji z PTX lub nanokapsułami SDS/PLL/PTX i SDS/PLL/PGA/PTX w czasie 48 i 72 godzin, prezentowane wyniki (średnia ±SD) przedstawiono w stosunku do kontroli (komórki niepoddane działaniu leku), n=3 niezależnych doświadczeń, *p<0,05 różnice istotne statystycznie pomiędzy próbami traktowanymi badanymi substancjami i kontrolą, #p<0,05 różnice istotne statystycznie pomiędzy próbami traktowanymi lekiem w nanokapsułach, a samym PTX, +p<0,05 - różnice istotne statystycznie między próbami traktowanymi PTX enkapsulowanym w nośnikach typu SDS/PLL, a PTX enkapsulowanym w nośnikach typu SDS/PLL/PGA, fig. 14 przedstawia zdjęcia wykonane przy zastosowaniu mikroskopu konfokalnego (Leica microsystems, Niemcy), komórki linii HMEC-1, MCF-7, MDA-MB-231 po 72 godzinnej inkubacji z PTX lub nanokapsułami SDS/PLL/PTX i SDS/PLL/PGA/PTX były wybarwione mieszaniną fluorchromów DAPI/Aneksyna V-FITC, w komórkach traktowanych badanymi substancjami widoczne są typowe dla apoptozy: fragmentacja jądra komórkowego i kondensacja chromatyny, a skala na zdjęcia odpowiada 50 μm, a fig. 15 przedstawia zmiany aktywności kaspazy-3 lub -7, po działaniu PTX lub SDS/PLL/PTX i SDS/PLL/PGA/PTX w komórkach linii HMEC-1, MCF-7, MDA-MB-231, przy czym komórki były inkubowane z badanymi preparatami przez 48 i 72 godziny, a dodatkowo próby były preinkubowane z inhibitorem kaspazy 3 - zVAD, zaś wyniki uzyskano na podstawie pomiarów luminescencji prób badanych, n=3 niezależnych doświadczeń. 100% - komórki nietraktowane lekiem *p<0,05 różnice istotne statystycznie pomiędzy próbami traktowanymi PTX wolnym lub enkapsulowanym w nanonośnikach i próbami kontrolnymi, #p<0,05 różnice istotne statystycznie pomiędzy próbami traktowanymi PTX, SDS/PLL/PTX i SDS/PLL/PGA/PTX, =p<0,05 różnice istotne statystycznie pomiędzy próbami traktowanymi badanymi substancjami a próbami preinkubo wanymi z inhibitorem kaspazy 3 - zVAD, +p<0,05 - różnice istotne statystycznie między próbami traktowanymi PTX enkapsulowanym w nośnikach typu SDS/PLL a PTX enkapsulowanym w nośnikach typu SDS/PLL/PGA.

Przykład 1. Opis otrzymywania dodatnio naładowanego wielordzeniowego nanonośnika polielektrolitowego syntetyzowanego na bazie siarczanu dodecylu sodu.

Wielordzeniowy nanonośnik polielektrolitowy otrzymano poprzez bezpośrednią kompleksację micel na bazie siarczanu dodecylu sodu (stężenie powyżej CMC, najlepiej 10 CMC) z przeciwnie naładowanym polielektrolitem - poli-L-lizyną, w roztworze wodnym o stężeniu NaCl od 0 do 0,15M. Kompleksacje przeprowadzono na mieszadle magnetycznym o obrotach 200 rpm metodą saturacyjną/wysyceniową. Polega ona na dobraniu takiego stosunku ilościowego składników, który pozwoli na całkowitą kompleksację wszystkich micel SDS występujących w układzie. Proces kontrolowany jest przez pomiar potencjału zeta. Do 200 ml roztworu poli-lizyny o stężeniu 50 ppm w 0,015M NaCl dodano odpowiednią ilość roztworu SDS (0,4 ml o stężeniu 10 CMC). Otrzymano dodatnio naładowane wielordzeniowe nanonośniki (fig. 1, fig. 2, fig. 3) polielektrolitowe (SDS/PLL) o średnicy hydrodynamicznej ok. 80 nm i potencjale zeta +43 mV (Tabela 1), określonymi na podstawie pomiarów dynamicznego rozpraszania światła DLS.

P rzy kła d 2 . Opis otrzymywania ujemnie naładowanego wielordzeniowego nanonośnika polielektrolitowego syntetyzowanego na bazie siarczanu dodecylu sodu

Dodatnio naładowany wielordzeniowy nanonośnik polielektrolitowy otrzymano jak w przykładzie 1, następnie tak wytworzony nośnik opłaszczono polianionem poli-kwasem glutaminowym (PGA). Opłaszczenie przeprowadzono na mieszadle magnetycznym o obrotach 200 rpm metodą saturacyjną/wysyceniową. Polega ona na dobraniu takiego stosunku ilościowego składników, który pozwoli na całkowite opłaszczenie polianionem PGA wszystkich dodatnio naładowanych nanonośników SDS/PLL występujących w układzie. Proces kontrolowany jest przez pomiar potencjału zeta. Do 1 ml roztworu PGA (2000 ppm, 0,015M NaCl) dodano odpowiednia objętość (10 ml) zawiesiny dodatnio naładowanych nanonośników SDS/PLL. Otrzymano ujemnie naładowane wielordzeniowe nanonośniki polielektrolitowe (SDS/PLL/PGA) o średnicy hydrodynamicznej ok. 105 nm i potencjale zeta -33 mV (fig. 1, fig. 2, fig. 3), określonymi na podstawie pomiarów dynamicznego rozpraszania światła DLS (Tabela 1).

P rze kład 3 . Opis otrzymywania dodatnio naładowanego wielordzeniowego nanonośnika paklitakselu syntetyzowanego na bazie siarczanu dodecylu sodu.

PL 247686 Β1

Dodatnio naładowany wielordzeniowy nanonośnik ΡΤΧ (fig. 1, fig. 2, fig. 3) otrzymano jak w przykładzie 1, z tym że w roztworze micel SDS o stężeniu 10 CMC uprzednio zsolubilizowano ΡΤΧ, poprzez dodanie 0,3 ml roztworu ΡΤΧ w etanolu (18,3 mg/ml), a następnie odparowanie etanolu.

Otrzymano dodatnio naładowane wielordzeniowe nanonośniki ΡΤΧ (SDS/PLL/PTX) o średnicy hydrodynamicznej ok. 80 nm i potencjale zeta +49 mV, określonymi na podstawie pomiarów dynamicznego rozpraszania światła DLS (Tabela 1).

Przekład 4. Opis otrzymywania ujemnie naładowanego wielordzeniowego nanonośnika ΡΤΧ syntetyzowanego na bazie siarczanu dodecylu sodu

Dodatnio naładowany wielordzeniowy nanonośnik ΡΤΧ otrzymano jak w przykładzie 3 następnie tak wytworzony nośnik ΡΤΧ opłaszczono polianionem poli-kwasem glutaminowym (PGA) (fig. 1, fig. 2, fig. 3). Opłaszczenie przeprowadzono na mieszadle magnetycznym o obrotach 200 rpm metodą saturacyjną/wysyceniową. Polega ona na dobraniu takiego stosunku ilościowego składników, który pozwoli na całkowite opłaszczenie polianionem PGA wszystkich dodatnio naładowanych nanonośników SDS/PLL występujących w układzie. Proces kontrolowany jest przez pomiar potencjału zeta. Do 1 ml roztworu PGA (2000 ppm, 0,015M NaCI) dodano odpowiednia objętość (10 ml) zawiesiny dodatnio naładowanych nanonośników SDS/PLL/PTX.

Otrzymano ujemnie naładowane wielordzeniowe nanonośniki polielektrolitowe (PTX-SDS//PLL/PGA) o średnicy hydrodynamicznej ok. 105 nm (Tabela 1) i potencjale zeta - 32 mV, określonymi na podstawie pomiarów dynamicznego rozpraszania światła DLS.

Tabela 1. Potencjał zeta, średnica i stężenia nanomateriału oraz leku w badanych nanokapsułach polielektrolitowych.

Typy nanokapsuł	Średnica	Potencjał Zeta	Stężenie nanonośnika w roztworze tuż po syntezie	Stężenie ΡΤΧ
SDS/PLL	80 nm	+43 mV	1 χ 108NPs/ml	-
SDS/PLL/PGA	105 nm	-33 mV	1 x 108NPs/ml	-
SDS/PLL/PTX	80 nm	+49 mV	1 x 108NPs/ml	2.07 mg/1
SDS/PLL/PGA/PTX	105 nm	-32 mV	1 χ l()8NPs/ml	1.85 mg/1

Przykład 5. Właściwości cytotoksyczne i cytostatyczne polielektrolitowych nanokapsuł (wolnych i wypełnionych lekiem) opartych na wodnorozpuszczalnym surfaktancie SDS - badania in vitro

Do wykonania eksperymentów, których celem była ocena właściwości cytotoksycznych badanych nanokapsuł, zastosowano: nienowotworowe komórki śródbłonka człowieka (HMEC-1) oraz komórki reprezentujące dwa typy ludzkiego raka piersi: komórki MDA-MB-231 i MCF-7, które charakteryzują się różnymi: 1) parametrami biologicznymi 2) indeksami wrażliwości na stosowane w klinikach chemioterapeutyki. Wykorzystywane linie komórkowe nabyto w Europejskiej Kolekcji Kultur Tkankowych (LGC Standards, Wielka Brytania). Komórki MDA-MB-231, reprezentujące potrójnie negatywny rak piersi, są pozbawione receptorów: estrogenowych, progesteronowych oraz ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (EGFR, ang. Epidermal Growth Factor Receptor). Natomiast na powierzchni komórek linii MCF-7 znajdują się receptory estrogenowe (HER) i progesteronowe, co odpowiada luminalnemu podtypowi A raka piersi. Mając na uwadze, że przy podaniu dożylnym, badane nanokapsuły będą miały kontakt z komórkami prawidłowymi, równolegle doświadczenia prowadzono na nienowotworowych komórkach śródbłonka człowieka - linii HMEC-1. Wybór modelowych komórek (fig. 4), do prowadzonych badań był zatem w pełni uzasadniony, ponieważ w Polsce ΡΤΧ jest stosowany jako składnik chemioterapii dla pacjentek z potrójnie ujemnym nowotworem piersi. Czasem podaje się go również w kombinacji z antracyklinami lub trastuzumabem, dla przypadków zdiagnozowanych jako HER2+. Jako monoterapia, ΡΤΧ jest stosowany w leczeniu uzupełniającym raka piersi, a okołooperacyjna chemioterapia z jego użyciem trwa od 3 do 6 miesięcy [Sung H et al. CA Cancer J Clin. 2021; 71(3): 209-249].

Przed rozpoczęciem hodowli, komórki przechowywano w stanie głębokiego zamrożenia w temperaturze - 180°C, w roztworze 50% płodowej surowicy cielęcej w medium hodowlanym z dodatkiem 7.5% dimetylosulfotlenku (DMSO, ang. dimethyl sulfoxide). Hodowle prowadzono w sterylnych polistyrenowych naczyniach (Nunc, Dania). Komórki po wyjęciu z oparów ciekłego azotu rozmrażano i umieszczano w medium DMEM, dedykowanym dla komórek nowotworowych raka piersi człowieka (Corning, USA), z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej oraz penicyliny (100 jedn./cm³) i streptomycyny (100 μg/cm³), (Sigma, USA) lub w medium MCDB (Corning, USA), dla komórek nienowotworowych śródbłonka człowieka, z dodatkiem tych samych składników jak dla komórek nowotworowych. Ponadto medium MCDB było suplementowane roztworami EGF (10 ng/mL, Thermofisher, USA) i Hydrokortyzonu 1 μg/mL (Merck, USA).

Komórki były wykorzystane do doświadczeń, gdy osiągnęły fazę logarytmicznego wzrostu, czyli przy 80% konfluencji. Hodowlę komórkową prowadzono w warunkach in vitro (37°C, 5% CO2, 100% wilgotności bezwzględnej) i poddawano ją codziennej obserwacji mikroskopowej, a raz na trzy miesiące wykonywano test na obecność mykoplazmy - Mycoalert Plus (Lonza, Szwajcaria) w celu przeprowadzenia gruntownej oceny czystości komórek. Przed rozpoczęciem bezpośrednich oznaczeń, komórki uwalniano z naczynia stosując 0.5% roztwór trypsyny (Cornning, USA), sporządzając mieszaninę komórek z 0.4% roztworem błękitu trypanu w stosunku 1:1, a następnie komórki liczono w komorze Thoma.

Przykład 6. Cytotoksyczność polimerowych nośników polielektrolitowych (pustych i wypełnionych PTX) wobec nienowotworowej linii HMEC-1 i nowotworowych komórek raka piersi - test redukcji MTT

Test aktywności cytotoksycznej z MTT (bromek- 3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2-5-difenylotetrazolu, Merck, USA) jest metodą kolorymetryczną służącą ocenie wrażliwości komórek nowotworowych na różnego rodzaju chemioterapeutyki. Zasadą tego doświadczenia jest zdolność enzymów mitochondrialnych z grupy oksydoreduktaz, obecnych w łańcuchu oddechowym, do redukcji żółtego MTT, czego konsekwencją jest otworzenie pierścienia tetrazolowego MTT i powstanie barwnych, purpurowych kryształów formazanu. Wytworzone kryształy formazanu nie mogą zostać przetransportowane przez błonę komórkową, dlatego też, w celu dokonania pomiarów, komórki lizuje się za pomocą detergentu, który pozwala na ich uwolnienie z komórki i rozpuszczenie. Ze względu na to, że intensywność wytworzonego produktu jest proporcjonalna do liczby żywych komórek, to kolor powstającego zabarwienia jest ilościową miarą przeżywalności komórek, która może zostać oszacowana spektrofotometrycznie [Stokłosa S. Hodowla komórek i tkanek; PWN, 2004]. Eksperyment wykonywano na płaskodennych, przezroczystych, 96-dołkowych płytkach polistyrenowych w czasie 24, 48, 72 i 96 godzin inkubacji z badanymi substancjami tj.: 1) puste nanokapsuły, 2) nanokapsuły wypełnione PTX, 3) chlorek sodu, 4) wolny PTX. Komórki nowotworowe linii MCF-7 lub MDA-MB-231 (6000 komórek/dołek) oraz komórki śródbłonka człowieka HMEC-1 (7000 komórek/dołek), wysiewano w 150 μl pełnego medium hodowlanego DMEM (dla komórek nowotworowych raka piersi) lub MCDB (dla komórek śródbłonka człowieka). Kiedy komórki się przykleiły, rozpłaszczyły i osiągnęły fazę logarytmicznego wzrostu, pożywkę usuwano, a komórki zawieszano w 150 μl roztworu zawierającego testowane preparaty zgodnie z zakresem stężeń przedstawionym w tabeli 2. Po zakończonej inkubacji medium zlewano, a do monowarstwy komórek dodawano po 50 μl na dołek roztworu MTT (50 mg/100 ml w medium DMEM bez czerwieni fenylowej). Następnie płytkę umieszczano w inkubatorze i prowadzono dalszą inkubację przez kolejne 3 godziny. W kolejnym etapie, w celu rozpuszczenia kryształów formazanu, roztwór MTT delikatnie usuwano, a powstałe kryształy rozpuszczano w 100 μl DMSO/dołek, wytrząsając je przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Przeżywalność komórek określano mierząc absorbancję na czytniku spektrofotometrycznym firmy Awarness, USA, przy długości fali λ = 580 nm i fali referencyjnej λ = 720 nm. Uzyskane wyniki przeliczono na wartości procentowe i na ich podstawie dokonano analizy przebiegu krzywych przeżywalności komórek potraktowanych badanymi preparatami, względem nietraktowanych prób kontrolnych. Dla każdej próbki oznaczenia wykonywano po 3 powtórzenia wyliczając średnią arytmetyczną i odchylenie standardowe.

PL 247686 Β1

Tabela 2. Zestawienie zakresu stężeń dla nanokapsuł pustych, wypełnionych lekiem oraz dla wolnej formy leku i chlorku sodu, będącego główną składową roztworu, w którym były zawieszone nanokapsuły.

Stężenia substancji wykorzystane do badania cytotoksyczności pustych nanokapsuł	Stężenia substancji wykorzystane do badania cytotoksyczności nanokapsuł wypełnionych ΡΤΧ
SDS/PLL lub SDS/PLL/PGA [n NPs/ml]	NaCl [Μ]	SDS/PLL/PTX lub SDS/PLL/PGA/PTX [x 10Λ7 n NPs/ml]	ΡΤΧ wolny lub enkapsulowany w nanonośnikach [nM]
10Λ2	0.000000015	0.015625	3.125
10Λ3	0.00000015	0.03125	6.25
10Λ4	0.0000015	0.0625	12.5
10Λ5	0.000015	0.125	25
10Λ6	0.00015	0.25	50
10Λ7	0.0015	0.5	100
10Λ8	0.015	1	200

Uzyskane wyniki wskazują, że żadna z testowanych pustych nanokapsuł nie obniżała przeżywalności badanych linii komórkowych, nawet jeśli komórki poddawano ciągłej inkubacji aż do 96 godzin (fig. 5). W przypadku komórek linii MCF-7 i MDA-MB-231 nanokapsuły wypełnione ΡΤΧ wykazywały właściwości cytotoksyczne, zbliżone do wolnej formy leku, przy dłuższych czasach inkubacji, tj. 72 i 96 godzin (fig. 7). Taka obserwacja może sugerować, że aktywny ΡΤΧ enkapsulowany w SDS/PLL i SDS/PLL/PGA dłużej utrzymuje się wewnątrz nośnika, a tym samym potrzebny jest dłuższy czas inkubacji z nanokapsułami, aby lek się uwolnił, i aby możliwe było obserwowanie jego toksycznych właściwości. Ciekawym wydaje się fakt, że nienowotworowe komórki śródbłonka człowieka były bardziej oporne na działanie ΡΤΧ enkapsulowanego w nośnikach niż na wolną formę leku, co sugeruje mniejszy efekt cytotoksyczny badanych nanopreparatów wobec komórek, które nie uległy transformacji nowotworowej .

Przykład 7. Określenie zmian morfologicznych komórek śródbłonka i komórek nowotworowych inkubowanych z pustymi nanokapsułami, wolnym lekiem lub ΡΤΧ enkapsulowanym w nanonośnikach techniki mikroskopowe

Tuż przed końcowym etapem testu MTT, dokonano obserwacji mikroskopowych komórek linii HMEC-1 oraz nowotworowych komórek MCF-7 i MDA-MB-231 poddanych działaniu badanych preparatów. Zmiany morfologii komórek zobrazowano wykorzystując mikroskop Olympus ΙΧ70 wyposażony w kamerę CCD (Olympus, Japonia). Zanotowano, że puste nanokapsuły zastosowane w najwyższym stężeniu nie powodowały zmian morfologii komórek (fig. 6), ani nie wpływały na ich tempo wzrostu. Inaczej było, jeśli komórki HMEC-1 i komórki nowotworowe były poddane działaniu SDS/PLL/PTX, SDS/PLL/PGA/PTX oraz samego ΡΤΧ (fig. 9). Pod wpływem tych preparatów komórki zmieniały swoją morfologię, stając się okrągłymi, ale nie odklejały się od podłoża. Widoczny był spadek liczności populacji, co potwierdzało cytostatyczne właściwości badanych nanoukładów z enkapsulowanym wewnątrz ΡΤΧ.

Przykład 8. Oznaczenie wewnątrzkomórkowego poziomu ATP w komórkach śródbłonka człowieka HMEC-1 i komórkach linii MCF-7 i MDA-MB-231 po działaniu wolnego paklitakselu i leku enkapsulowanego w kapsułach typu SDS/PLL oraz SDS/PLL/PGA

Zgodnie z wytycznymi amerykańskiego Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH, ang. National Insitute of Health) przy weryfikacji toksyczności substancji, która w przyszłości mogłaby uzyskać status leku, konieczne jest przeprowadzenie oznaczeń przeżywalności komórek co najmniej dwoma, różnymi metodami badawczymi [Szwed M., et al., Sci Rep, 11: 3849-3865]. Dlatego, przy analizie cytotoksycznych właściwości nanokapsuł polielektrolitowych z enkapsulowanym PTX dokonano również oceny spadku poziomu ATP w badanych liniach komórkowych fig. 8). Poziom ATP w komórkach poddanych działaniu polimerowych nanokapsuł wypełnionych PTX określono ilościowo przy pomocy komercyjnego zestawu odczynników CellTiter-Glo® (Promega, Niemcy), zgodnie z procedurą dostarczoną przez producenta testu. Za jego pomocą można ilościowo ocenić, w warunkach in vitro, wrażliwość komórek na różnego rodzaju związki chemiczne. W eksperymencie zmierzono natężenia luminescencji, pochodzącej z reakcji katalizowanej przez lucyferazę, w której D - lucyferyna jest przekształcana, w wykazującą właściwości luminescencyjne, oksylucyferynę. Kofaktorem reakcji jest znajdujący się w środowisku ATP. A zatem im więcej ATP, tym wyższy sygnał odczytu wynikający ze zwiększonego odsetka żywych i aktywnych metaboliczne komórek. Komórki wysiewano na białe, polistyrenowe płytki 96-dołkowe przeznaczone do hodowli in vitro w liczbie 6000 na dołek (komórki linii MCF-7 I MDA-MB-231) oraz 7000 na dołek (komórki linii HMEC-1) w objętości 150 μL medium hodowlanego. Kiedy komórki osiągnęły odpowiednią konfluencję, medium hodowlane zastępowano roztworami nanokapsuł SDS/PLL/PTX, SDS/PLL/PGA/PTX lub wolną formą leku według Tabeli 2. Po 24, 48, 72 lub 96-godzinnej, ciągłej inkubacji z badanymi substancjami, do każdego dołka dodawano równą objętość mieszaniny reakcyjnej dostarczonej przez producenta. Następnie, przez 2 minuty, płytki intensywnie wytrząsano w temperaturze pokojowej, a po 10 minutowej inkubacji w tych samych warunkach dokonywano pomiaru luminescencji na mikropłytkowym czytniku spektrofluorymetrycznym (Fluoroscan Ascent FL, Szwecja). Podobnie jak w przypadku metody MTT, uzyskane wyniki przeliczono na wartości procentowe i na ich podstawie wykreślono krzywe przeżywalności badanych komórek wobec nietraktowanych nanokapsułami ani wolnym lekiem prób kontrolnych. Dla każdej próbki wykonywano po 3 powtórzenia. Obliczano przeżywalność komórek względem nietraktowanej kontroli, a dla każdej próby wyliczono średnią arytmetyczną i odchylenie standardowe.

Uzyskane rezultaty potwierdziły cytotoksyczne właściwości SDS/PLL/PTX oraz SDS//PLL/PGA/PTX. Wyniki są zbliżone do tych, które wyliczono na podstawie testu redukcji MTT. Interesujące jest to, że nie zanotowano różnic między dwoma formami badanych nanoukładów. Jednocześnie obie metody dały podstawę, aby do dalszych eksperymentów wybrać 3 stężenia wolnego i enkapsulowanego PTX, tj. 12,5; 25 i 50 nM.

P rzy kła d 9 . Wyznaczenie tempa proliferacji badanych komórek potraktowanych wolnym PTX i enkapsulowanym w nośnikach lekiem za pomocą testu CyQUANT®

Opublikowane do tej pory wyniki licznych badań jasno dowodzą, że w swoim działaniu przeciwnowotworowym PTX cechują wysokie parametry cytostatyczne, co oznacza, że lek hamuje podziały komórkowe. Udowodniono, że zatrzymanie mitozy szybko dzielących się komórek nowotworowych wynika również z indukowania przez PTX programowanej śmierci komórki - apoptozy [Gallego Jara J., et ah, Molecules, 25: 5986-5997, 2020]. W badaniach prowadzonych na polimerowych nośnikach polielektrolitowych wypełnionych PTX sprawdzono, czy lek posiada te same właściwości antyproliferacyjne i cytostatyczne, jeśli występuje w formie wolnej lub zamkniętej w nośnikach.

Test CyQUANT® Direct Cell Proliferation Assay jest metodą spektrofluorymetryczną pozwalającą ocenić szybkość proliferacji komórek poddanych działaniu ksenobiotyków. Oparty na odczycie mikropłytkowym komercyjny zestaw odczynników zawiera: 1) barwnik fluorescencyjny, który po interkalacji do DNA emituje zieloną fluorescencję i 2) barwnik tłumiący, który nie przechodzi przez błonę komórkową żywych komórek, a wygasza fluorescencję sondy w komórkach martwych. Podstawą oznaczenia wykonywanego za pomocą testu CyQUANT® Direct Cell Proliferation jest ilość DNA tylko w żywych, proliferujących komórek.

Na czarną płytkę 96-dołkową z przezroczystym dnem (ThemoFisher, USA), wysiewano komórki linii MCF-7 i MDA-MB-231 i HMEC-1 w objętości 150 μl na dołek. Gęstość komórek w zawiesinie, zależała od czasu inkubacji z badanymi związkami i była tak dobrana, aby odpowiednio po 24, 48, 72 i 96 godzinach nietraktowane komórki kontrolne osiągnęły fazę konfluencji. Następnie medium hodowlane zostało zastąpione PTX lub lekiem enkapsulowanym w nośnikach, a więc SDS/PLL/PTX i SDS/ /PLL/PGA/PTX, tak aby jego końcowe stężenie wynosiło odpowiednio 12,5; 25 i 50 nM. Po zakończonej inkubacji do każdego dołka dodawano mieszaninę reakcyjną zgodnie z wcześniej przedstawionymi założeniami i po 1 godzinnej, prowadzonej w warunkach hodowli inkubacji, odczytywano poziom natężenia fluorescencji prób badanych przy użyciu mikropłytkowego czytnika płytek (BioTek, USA) przy długości fali wzbudzenia 485 nm i fali emisji 535 nm. Wyniki zaprezentowano jako wartości procentowe dla fluorescencji sondy CyQuant względem kontroli. Równocześnie, tuż przed pomiarem fluoroscencyjnym, zobrazowano zmiany stopnia proliferacji komórek, prowadząc obserwacje mikroskopowe wykonane na mikroskopie fluorescencyjnym (Olympus XI - 90, Japonia).

Wyniki oceny stopnia proliferacji komórek poddanych działaniu PTX, SDS/PLL/PTX i SDS//PLL/PGA/PTX pokazują, że substancja aktywna, zamknięta w nanokapsułach (PTX) ma podobne właściwości cytostatyczne wobec komórek nowotworowych, co wolny lek (fig. 10). Dla nienowotworowych komórek HMEC-1, nanokapsuły wypełnione PTX przejawiały znacznie mniejsze działanie antyproliferacyjne niż sam PTX, szczególnie jeżeli inkubacja z badanymi preparatami była przedłużona aż do 96 godzin, a lek był stosowny w stężeniach 25 i 50 nM. Tak silnego, hamującego efektu nie obserwowano, jeśli komórki nienowotworowe były traktowane nanokapsułami SDS/PLL/PTX i SDS/PLL/PGA/PTX. Na przykład, 12,5 nM wolnego leku zmniejszało proliferacje komórek o ponad 60%, podczas gdy nanokapsuły SDS/PLL/PTX i SDS/PLL/PGA/PTX odpowiednio wywoływały spadek proliferacji komórek HMEC-1 tylko o 21% i o 17%. Uzyskane dane liczbowe znalazły odzwierciedlenie podczas prowadzonych tuż przed pomiarem obserwacji mikroskopowych, a obniżone tempo proliferacji komórek przełożyło się na spadek stopnia ich konfluencji (fig. 11).

Przykład 10. Analiza rozkładu faz cyklu komórkowego.

Obserwacje zahamowania szybkości proliferacji nienowotworowych komórek śródbłonka oraz komórek nowotworowych raka piersi człowieka inkubowanych z badanymi nanoukładami, dały przesłanki, aby sprawdzić czy polielektrolitowe nanokapsuły wypełnione lekiem powodują powstanie bloków podziałowych podczas podziału komórki, to jest jej mitozy.

Analiza cyklu komórkowego została przeprowadzona z zastosowaniem techniki cytometrii przepływowej. Komórki barwiono jodkiem propidyny, który interkaluje pomiędzy pary zasad kwasów nukleinowych zarówno DNA, jak i RNA. Maksimum wzbudzenia dla postaci związanej z DNA obserwuje się przy 536 nm, zaś maksimum emisji występuje przy długości fali około 617 nm. Komórki wysiewano na płytki 6 dołkowe w liczbie 5000/ml w końcowej objętości 3 ml medium MCDB lub DMEM dedykowanego odpowiednio do wykorzystywanych w badaniach komórek HMEC-1 i nowotworowych linii komórek raka piersi człowieka. Następnego dnia, do hodowli in vitro dodawano, PTX, SDS/PLL/PTX lub SDS//PLL/PGA/PTX w stężeniach 12,5; 25 i 50 nM i inkubowano przez 48 godzin w warunkach wzrostu komórek (37°C, 5% CO2, 100% wilgotności bezwzględnej). Wybrano ten czas eksperymentu, ze względu na wcześniej wyliczony współczynnik podwojenia wykorzystywanych do badań komórek. Po zakończonej inkubacji usuwano z naczyń hodowlanych medium hodowlane, komórki wirowano (300 g//5 minut) oraz przemywano roztworem PBS. Po tych czynnościach komórki utrwalano w 100% alkoholu w stosunku 1:1 (delikatnie mieszając, dodawano kroplami 1 ml 100% alkoholu etylowego do 1 ml komórek zawieszonych w PBS). Tak przygotowane próbki przechowywano w temperaturze - 20°C do czasu przeprowadzenia pomiaru. Przed wykonaniem oznaczeń usuwano z komórek nadmiar etanolu, a zawiesinę komórek poddawano 30 minutowej inkubacji w temperaturze 4°C w 0,5 ml mieszaniny reakcyjnej, w skład której wchodziły: PBS zawierającym 4 mg/ml jodku propidyny rozpuszczonego w DMSO, 1 M Tris HCl (pH 7,4), 1 M MgCl2, 10 mg/ RNAza A. Po zakończonej, 30 minutowej inkubacji w temperaturze 37°C komórki poddawano analizie cytometrycznej dokonując pomiaru ich fluorescencji przy wzbudzeniu λ=488 nm. W puli komórek proliferujących, które nie są poddane działaniu żadnej substancji chemicznej, wyróżniono trzy główne populacje: 1) G0/G1 - komórki zarówno w fazie G1 jak i w fazie spoczynkowej (G0) mają taką samą zawartość DNA (2n), 2) S - komórki znajdują się w trakcie replikacji DNA, 3) G2/ M - komórki przygotowujące się do podziału oraz wchodzące w stadium mitozy mają podwójną ilość DNA (4n).

Dodatkowo w próbach traktowanych badanymi preparatami z PTX wyodrębniono fazę subG1 czyli komórki ulegające apoptozie z charakterystyczną fragmentacją DNA. W prowadzonych badaniach zaobserwowano, że PTX powodował nagromadzenie się komórek w fazie G2/M (fig. 12). Taką samą zależność obserwowano również dla prób traktowanych SDS/PLL/PTX i SDS/PLL/PGA/PTX, w których np. dla linii MCF-7 enkapsulowany PTX powodował nawet dwukrotne zwiększenie się odsetka komórek w fazie G2/M. Godnym zauważenia jest fakt, że najniższe, stosowane stężenie leku (12.5 nM) - we wszystkich jego formach - powodowało wzrost populacji komórek znajdujących się w fazie subG1.

Przykład 11. Oznaczenie zmian apoptotycznych komórek za pomocą Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit

Zgodnie z wcześniej przytoczonymi informacjami, PTX jest proapoptotycznym chemioterapeutykiem, który kieruje komórki na drogę programowanej śmierci komórki. Takie wnioski wyciągnięto również, kiedy analizowano rosnący odsetek komórek w fazie subG1. Początkową zmianą w komórce, charakterystyczną dla procesu apoptozy jest eksternalizacja fosfatydyloseryny (PS, ang. phosphatidylserine) będąca bezpośrednim wynikiem zaburzenia asymetrii błony komórkowej. W żywych komórkach fosfatydyloseryna jest transportowana do wewnętrznych części dwuwarstwy lipidowej z udziałem MgATP zależnej aminofosfolipido - translokazy, dzięki czemu zachowana jest asymetria położenia PS [Boles JC., et al., Thromb Res., 129: 197-203, 2012]. W komórkach apoptotycznych PS pojawia się w zewnętrznej monowarstwie dwuwarstwy lipidowej dzięki czemu może być oznaczona za pomocą Aneksyny V. W doświadczeniu wykorzystano fakt, że aneksyna V wiąże się z fosfolipidami w obecności jonów wapnia. Na takiej samej zasadzie łączy się zatem z fosfatydyloseryną kompleks aneksyny V skoniugowanej z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC, ang. Fluorescein isothiocyanate). Komórki będące w początkowych stadiach procesu apoptozy, charakteryzowały się zieloną fluorescencją, w wyniku oddziaływania aneksyna V - fosfatydyloseryna. W doświadczeniu oprócz FITC zastosowano jodek propidyny (PI, ang. propidium iodide) jako barwnik fluorescencyjny swobodnie wnikający do komórek, które całkowicie utraciły ciągłość błony komórkowej.

Na przezroczystą płytkę 12-dołkową (Nunc, Dania) wysiewano komórki linii HMEC-1, MCF-7 i MDA-MB-23, tak aby na 1 ml zawiesiny komórkowej ostatecznie przypadało: na 48 godzin - 60000 komórek, a na 72 godziny - 50000 komórek. Kiedy komórki się przykleiły i osiągnęły fazę logarytmicznego wzrostu, do monowarstwy komórkowej dodawano sam PTX lub SDS/PLL/PTX albo SDS/PLL/PGA/PTX, tak aby ostatecznie, stężenia leku były równe 12,5; 25 i 50 nM. Równolegle jako kontrolę pozytywną dla testu zastosowano 48 godzinną inkubację z 10 μΜ kamptotecyną. Dalej całą procedurę przeprowadzano na lodzie, zaczynając od uwolnienia komórek z monowarstwy przy zastosowaniu 0.5% roztworu trypsyny. Potem komórki dwukrotnie wirowano (300xg, 5 min, 4°C), przemywając je zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej PBS (ang. Phosphate Buffered Saline; 137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4). Tak przygotowane zawiesiny komórek barwiono w temperaturze pokojowej przez 5 minut, stosując roztwór barwiący (250 μL/próbkę) sporządzony wg. protokołu dostarczonego przez producenta odczynników do oznaczenia eksternalizacji fosfatydyloseryny (Biovision, USA). Mieszanina reakcyjna powstała przez połączenie odpowiednich objętości buforu wiążącego (1X Binding Buffer) Annexin V-FITC oraz roztworu jodku propidyny.

Wyniki uzyskane na podstawie powyższej metody pozwoliły na wyróżnienie w badanej populacji następujących frakcji komórek:

1) nieapoptotycznych: aneksyno - ujemnych, PI - ujemnych; 2) we wczesnej apoptozie: aneksyno - dodatnich, PI - ujemnych; 3) późnoapoptotycznych: aneksyno - dodatnich, PI - dodatnich; 4) nekrotycznych: aneksyno - ujemnych, PI - dodatnich;

Pomiary były wykonywane na cytometrze przepływowym (LSRII, BD Biosciences), wyposażonym w laser emitujący światło wzbudzające od długości 488 nm i odpowiedniej emisji dla FITC - 530 nm oraz dla PI - 617 nm.

Przeprowadzone eksperymenty dowodzą, że nanokapsuły SDS/PLL/PTX, SDS/PLL/PGA/PTX podobnie jak wolny lek, wywoływały stopniowy wzrost populacji komórek wiążących aneksynę-V w obu nowotworowych liniach komórkowych i przyjmowały one zbliżone wartości wynosząc odpowiednio około 12%, 11% i 13% (fig. 13). Gdy inkubację z nanokapsułami przedłużono do 72 h, odsetek komórek ujawniających eksternalizację fosfatydyloseryny była dwukrotnie wyższy (około 35%) w obu liniach komórkowych raka piersi człowieka eksponowanych na wszystkie badane formy PTX. Równolegle, w celu sprawdzenia integralności błony komórkowej, wykonano barwienie jodkiem propidyny, ale populacja komórek określanych jako „PI dodatnie” nie przekraczała 8% w komórkach nowotworowych i komórkach HMEC-1. Jednocześnie we wszystkich komórkach poddanych działaniu SDS/PLL/PTX lub SDS/PLL/PGA/PTX stopniowo nasilały się morfologiczne cechy związane z programowaną śmiercią komórki. Komórki, przygotowywane do oznaczeń cytometrycznych, były dodatkowo barwione roztworem DAPI w stężeniu 2 μg/ml. Widoczna kondensacja i marginalizacja chromatyny (fig. 14) oraz tworzenie ciałek apoptotycznych i kurczenie się komórek zostały zobrazowane po 72 godzinach ciągłej inkubacji z PTX zamkniętym w nanokapsułach SDS/PLL lub SDS/PLL/PGA albo wolnym lekiem.

Przykład 12. Zmiany aktywności kaspazy 3 lub 7 przez PTX, SDS/PLL/PTX oraz SDS//PLL/PGA/PTX oznaczone za pomocą luminescencyjnego testu Caspase-Glo® 3/7 Assay

Pamiętając, że proces apoptozy wymaga udziału enzymów proteolitycznych (kaspaz), sprawdzono, czy kaspazy wykonawcze, np. kaspaza-3 lub kaspaza-7, były aktywowane w końcowym etapie programowanej śmierci komórki zaindukowanej przez nanokapsuły wypełnione PTX. Oceny dokonano na podstawie monitorowania zmian aktywności tych enzymów. Kaspazy 3 lub 7 posiadają specyficzność substratową dla sekwencji aminokwasowej Asp - Glu - Val- Asp (DEVD). Zmiany aktywności tych enzymów zostały ocenione za pomocą komercyjnego zestawu odczynników Caspase-Glo® 3/7 Assay (Promega, Niemcy). Jeśli kaspazy 3 lub 7 są aktywne w cytosolu komórki, to enzym uwalnia z substratu lucyferazę, która utlenienia obecną w środowisku reakcji D-lucyferynę do bioluminescencyjnego produktu - oksylucyferynę. Intensywność obserwowanej bioluminescencji jest zatem wprost proporcjonalna do ilości aktywnej kaspazy 3 lub 7 w komórce. W celu wyeliminowania reakcji niespecyficznych, w doświadczeniu wykorzystano także inhibitor kaspazy-3, Ac-DEVD-CHO (z-VAD). Na białą płytkę 96dołkową (Nunc, Dania) wysiewano komórki, HMEC-1, MCF-7 i MDA-MB-231 w gęstości: na 48 godzin - 6000 na dołek i na 72 godziny - 5000 na dołek, tak aby ostatecznie były one zawieszone w 150 μl medium hodowlanego. Po 24 godzinach, kiedy komórki się przykleiły i osiągnęły konfluencję, pożywkę usuwano i do połowy płytki dodawano inhibitora kaspazy 3 - z-VAD (R&D, Wielka Brytania) w stężeniu 20 μΜ. Równocześnie do drugiej połowy płytki dodawano, w tej samej objętości, samej pożywki dedykowanej do odpowiednich komórek. Dalej, prowadzono 30 minutową preinkubację z inhibitorem w warunkach wzrostu komórek (37°C, 5% CO2), a następnie dodawano do każdego dołka badane preparaty, tj. PTX, SDS/PLL/PTX i SDS/PLL/PGA/PTX w końcowych stężeniach wynoszących odpowiednio 12,5; 25 i 50 nM. Tak przygotowaną płytkę inkubowano przez 48 lub 72 h (37°C i 5% CO2). Po zakończonej inkubacji, do każdego dołka dodawano w proporcjach 1:1, dostarczonej przez producenta mieszaniny reakcyjnej, to jest buforu Caspase-Glo® 3/7, w skład którego wchodziły koniugat lucyferaza-DEVD, luceferyna oraz bufor lizujący. Następnie płytkę wytrząsano przez 3 minuty i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Końcowym etapem doświadczenia było dokonanie pomiarów bioluminescencji na spektrofluorymetrycznym czytniku mikropłytkowym (Fluoroscan Ascent FL, Szwecja). Otrzymane dane, pokazują, że nanokapsuły SDS/PFF/PTX oraz SDS/PFF/PGA/PTX aktywowały kaspazę-3 zarówno w komórkach nowotworowych MDA-MB-231, jak i nienowotworowych komórkach HMEC-1 (fig. 15). Maksymalny, prawie dwukrotny wzrost aktywności kaspazy-3 odnotowano jednak dla komórek HMEC-1 traktowanych przez 72 godziny wolnym PTX. W linii komórkowej MDA-MB-231 obserwowano 2.5 krotny wzrost aktywności kaspazy-3, jeśli komórki były inkubowane z SDS/PLL/PTX przez 72 godziny. Preinkubacja komórek z inhibitorem kaspazy-3 (z-VAD) potwierdziła, że zmiany aktywności enzymu były konsekwencją indukcji programowanej śmierci komórki. Ponadto, ze względu na profil genetyczny i brak ekspresji kaspazy-3 [Jaanicke R., Breast Cancer Res Treat., 117: 219-21,2009], komórki MCF-7 nie wykazały zmian aktywności tego enzymu.

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania wielordzeniowego nanonośnika polielektrolitowego syntetyzowanego na bazie dodecylosiarczanu sodu (SDS), znamienny tym, że wytworzenie układu wielordzeniowego załadowanego hydrofobowym czynnikiem aktywnym paklitakselem (PTX) jest procesem trzy etapowym, przy czym w etapie pierwszym do wodnego roztworu micel dodecylosiarczanu sodu o stężeniu większym od krytycznego stężenia micelizacji (CMC, Critical Micelle Concentration), to jest 10 x CMC, dodaje się roztwór hydrofobowego czynnika aktywnego, PTX w etanolu, to jest 0,3 ml roztworu nasyconego w etanolu, a następnie odparowuje się rozpuszczalnik, po czym w drugim etapie wytwarzany jest dodatnio naładowany wielordzeniowy nanonośnik hydrofobowej substancji aktywnej (PTX) poprzez formowanie kompleksów micel SDS załadowanych hydrofobową substancją aktywną z przeciwnie naładowanym polielektrolitem poli-L-lizyną, przy czym kompleksację przeprowadza się na mieszadle magnetycznym metodą saturacyjną/wysyceniową i do roztworu poli-L-lizyny dodaje się roztwór micel SDS z solubilizowaną hydrofobową substancją aktywną, przy czym proces kontrolowany jest przez pomiar potencjału zeta, a w punkcie tuż przed przeładowaniem, większość micel SDS jest skompleksowana z przeciwnie naładowanym polielektrolitem i tak wytworzony nośnik dodatnio naładowany pokrywa się polianionem, poli-kwasem glutaminowym (PGA), co jest trzecim etapem syntezy, przy czym opłaszczenie przeprowadza się na mieszadle magnetycznym, ponownie, metodą saturacyjną/wysyceniową i do roztworu poli-kwasu glutaminowego dodaje się

   PL 247686 BI roztwór dodatnio naładowanego wielordzeniowego nanonośnika hydrofobowej substancji aktywnej, a proces kontrolowany jest przez pomiar potencjału zeta, przy czym w punkcie tuż przed przeładowaniem, większość kompleksów SDS/Poli-L-lizyna pokryta jest przeciwnie naładowanym polielektrolitem, polianionem poli-kwasem glutaminowym.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do tworzenia wielordzeniowych nanonośników polielektrolitowych stosuje się roztwory polielektrolitów o stężeniu od 10 do 2000 ppm, i sile jonowej z zakresu od 0,01 do 0,15 M.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się roztwór poli-Lizyny o stężenie 50 ppm, a poli-kwasu glutaminowego o stężeniu 2000 ppm oraz stężeniu chlorku sodu 0,015 mol/dm³.
4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienny tym, że do tworzenia wielordzeniowych polielektrolitowych nanonośników stosuje się biozgodne i biodegradowalne polielektrolity, polilizynę i poli-kwas glutaminowy.
5. 5. Wielordzeniowy nanonośnik polielektrolitowy wytworzony sposobem według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4 do zastosowania do leczenia w terapii przedwnowotworowej.