PL247689B1

PL247689B1 - Sposób wytwarzania implantów o kształcie cylindrycznym aktywujących proces chemotaksji dodatniej aksonów

Info

Publication number: PL247689B1
Application number: PL445788A
Authority: PL
Inventors: Katarzyna Nawrotek
Original assignee: Politechnika Lodzka
Priority date: 2023-08-08
Filing date: 2023-08-08
Publication date: 2025-08-18
Also published as: PL445788A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób wytwarzania implantów o kształcie cylindrycznym, aktywujących proces chemotaksji dodatniej aksonów, przeznaczonych zwłaszcza do regeneracji nerwów obwodowych, polegający na wytworzeniu szkieletu implantu w kształcie helisy z polikaprolaktonu, w drodze ekstruzji stopionego polikaprolaktonu na stalowym pręcie z dyszy ekstrudera w temperaturze 60°C — 100°C i następnie na pokryciu szkieletu wewnętrznego polimerem w drodze zamocowania pręta z naniesionym szkieletem wewnętrznym jako elektrody wewnętrznej elektrolizera, wprowadzenia do elektrolizera roztworu chitozanu w wodnym roztworze kwasu organicznego lub nieorganicznego, zawierającego dodatek hydroksyapatytu i prowadzenia procesu elektrodepozycji chitozanu z roztworu na szkielecie wewnętrznym implantu prądem stałym, a po zakończeniu elektrodepozycji zdjęciu powstałego implantu z elektrody, w którym implant poddaje się modyfikacji inkapsulowaną substancją aktywną, charakteryzuje się tym, że wytwarza się szkielet implantu w kształcie helisy o skoku gradientowym, zaś modyfikacja implantu inkapsulowaną substancją aktywną polega na modyfikacji objętościowej wytworzonego implantu w drodze wytrząsania w roztworze mikro- i nanokapsułek z substancją aktywną w dejonizowanej wodzie. Jako substancję aktywną stosuje się czynniki neurotroficzne, jak czynnik wzrostu nerwów, neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego, neurotrofina-3, neurotrofina-4, czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania implantów o kształcie cylindrycznym aktywujących proces chemotaksji dodatniej aksonów, przeznaczonych zwłaszcza do regeneracji nerwów obwodowych.

Urazowe uszkodzenia nerwów obwodowych o charakterze otwartym to uszkodzenia powstałe w wyniku zranień (rany cięte, szarpane, kłute lub postrzałowe), które spowodowały przerwanie ciągłości powłoki ciała i uszkodzenie wiązki włókien nerwowych. Uraz może spowodować całkowite przerwanie ciągłości wiązki włókien nerwów obwodowych, a odzyskanie utraconych funkcji będzie możliwe tylko w wyniku leczenia operacyjnego (rekonstrukcja mikrochirurgiczna).

W zależności od umiejscowienia nerwów obwodowych uraz spowoduje wystąpienie określonych, charakterystycznych objawów klinicznych.

Znane strategie rekonstrukcji uszkodzonych nerwów obwodowych obejmują: autoprzeszczepy, alloprzeszczepy i implantację przewodu naprowadzającego nerw (NGC - nerve guidance conduit,) w celu mostkowania kikutów nerwowych.

Autoprzeszczep nerwów jest uważany za technikę „złotego standardu” naprawy nieciągłości nerwów obwodowych, ale ma szereg ograniczeń, takich jak wymóg drugiego zabiegu chirurgicznego w celu pobrania tkanki do przeszczepu, powikłania w miejscu pobrania, dodatkowe urazy i blizny oraz wydłużony czas rekonwalescencji.

Alloprzeszczepy (np. przeszczepy nerwów ze zwłok) i heteroprzeszczepy (np. przeszczepy nerwów zwierzęcych) mogą stanowić alternatywę dla autoprzeszczepów, ale ich główną wadą jest duże prawdopodobieństwo niepożądanej odpowiedzi immunologicznej. Dlatego w takich przypadkach konieczne jest zastosowanie terapii immunosupresyjnej, która jest kosztowna i ma negatywny wpływ na zdrowie.

Zauważono, że rozwiązania oparte na autoprzeszczepach i alloprzeszczepach są obarczone wystąpieniem niepożądanych reakcji, takich jak drętwienie, utrata funkcji czuciowych oraz zwiększone ryzyko rozwoju przewlekłego bólu i trwałej niepełnosprawności. Dlatego przywrócenie utraconych funkcji występuje nie więcej niż u 40-50% pacjentów.

Wymienione wyżej problemy nie występują przy implantacji przewodu naprowadzającego nerw (NGCs). Metoda ta bazuje na wykorzystaniu implantów służących jako osłona dla regenerującej się wiązki komórek nerwowych i polega na tym, że podczas operacji chirurgicznej na rozerwane końcówki wiązek obwodowych komórek nerwowych są zakładane implanty w kształcie rurek, których zadaniem jest odpowiednie nakierowywanie odrastających aksonów. W celu zwiększenia biofunkcjonalności implantu dopasowuje się kinetykę degradacji implantu do kinetyki regeneracji aksonu, umieszcza w strukturze implantu substancje wspomagających regenerację uszkodzonych komórek (czynniki neurotroficzne) oraz substancje umożliwiające zaadaptowanie się materiału implantu do naturalnego środowiska tkanki (zwiększające adhezję komórek). Ponadto strukturę implantu wzbogaca się w substancje biologicznie aktywne, odpowiedzialne za uruchomienie oraz przeprowadzenie procesów odpowiedzialnych za przywrócenie łączności anatomicznej uszkodzonych komórek nerwowych oraz „wskazywanie” drogi odrastającym aksonom.

Rozwiązania wykorzystujące NGCs są oparte głównie na polimerach naturalnych, o strukturalnym podobieństwie do natywnej tkanki macierzy pozakomórkowej, najczęściej takich jak kolagen, laminina, fibronektyna, fibroina, żelatyna, keratyna, kwas hialuronowy, celuloza, glukoza, alginian, chondroityna, agaroza, chityna i chitozan. W metodach naprawy nerwów obwodowych są także dość często stosowane materiały pochodzenia syntetycznego, takie jak polilaktyd (PLA), poli-L-laktyd (PLLA), poliglikolid (PGA), kopolimer polilaktyd-glikolid (PLGA), polikaprolakton (PCL), polidioksan (PDO), poli-e-hydroksymaślan (PHB), poli(ortoester), poli(cyjanoakrylan), poli(fosfazen), poli-(g-etyloglutaminian), poli(DTH-iminowęglan).

Z opisu zgłoszenia patentowego P. 438938 jest znany sposób wytwarzania hybrydowych implantów o kształcie cylindrycznym do kontrolowanego uwalniania substancji aktywnych w warunkach in vitro, przeznaczonych zwłaszcza do regeneracji nerwów obwodowych, polegający na wytworzeniu z polikaprolaktonu szkieletu implantu w kształcie helisy, o strukturze siatki lub strukturze pierścieniowej, w drodze ekstruzji stopionego polikaprolaktonu na stalowym pręcie o przekroju kołowym o średnicy 1-10 mm, poruszanym ruchem obrotowym, ręcznie lub mechanicznie, z dyszy ekstrudera o średnicy 0,1-0,6 mm, w temperaturze 60-100°C, połączonym z modyfikacją szkieletu substancją aktywną z grupy obejmującej leki małocząsteczkowe, białka jak NGF, DNA lub RNA, wirusy, i następnie na pokryciu szkieletu wewnętrznego implantu zawierającego substancję aktywną, polimerem w drodze zamocowania pręta z naniesionym szkieletem wewnętrznym jako elektrody wewnętrznej elektrolizera, wprowadzenia do elektrolizera roztworu chitozanu w wodnym roztworze kwasu organicznego lub nieorganicznego, zawierającego dodatek hydroksyapatytu w ilości 1-40% wagowych w stosunku do masy chitozanu i prowadzenia procesu elektrodepozycji chitozanu z roztworu na szkielecie wewnętrznym implantu prądem stałym przy napięciu 6-24 V w czasie 1-40 minut, a po zakończeniu elektrodepozycji zdjęciu powstałego implantu z elektrody i umieszczeniu w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Szkielet implantu, przed pokryciem go polimerem, poddaje się modyfikacji powierzchniowej substancją aktywną, polegającej kolejno na umieszczeniu szkieletu w roztworze buforu tris zawierającego chlorowodorek dopaminy, następnie poddaniu szkieletu łagodnemu mieszaniu bez dostępu światła, płukaniu w dejonizowanej wodzie i w końcu na łagodnym wytrząsaniu w wodnym roztworze mikrokapsułek inkapsulujących substancję aktywną. Stosuje się mikrokapsułki inkapsulujące wykonane metodą emulsyjną z kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego. W procesie elektrodepozycji stosuje się roztwór chitozanu w roztworze wodnym kwasu mlekowego.

W opisie patentowym PL 238404 ujawniono sposób wytwarzania hybrydowych implantów o kształcie cylindrycznym, przeznaczonych zwłaszcza do regeneracji lub zastąpienia tkanek i narządów o budowie cylindrycznej, w którym szkielet implantu w kształcie helisy o strukturze siatki lub strukturze pierścieniowej wytwarza się w drodze ekstruzji stopionego tworzywa termoplastycznego, korzystnie kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego lub polikaprolaktonu, ewentualnie zawierającego dodatek środka aktywnego, na stalowym pręcie, zaś proces elektrodepozycji chitozanu na szkielecie wewnętrznym prowadzi się z roztworu chitozanu w roztworze kwasu octowego, mlekowego i chlorowodorowego.

Celem niniejszego wynalazku jest opracowanie sposobu wytwarzania implantów o kształcie cylindrycznym aktywujących proces chemotaksji dodatniej aksonów, wykorzystującego proces absorpcji środka aktywnego enkapsulowanego w mikro- i nanosferach.

Sposób wytwarzania implantów o kształcie cylindrycznym aktywujących proces chemotaksji dodatniej aksonów, przeznaczonych zwłaszcza do regeneracji nerwów obwodowych, polegający na wytworzeniu szkieletu implantu w kształcie helisy z polikaprolaktonu, w drodze ekstruzji stopionego polikaprolaktonu na stalowym pręcie o przekroju kołowym o średnicy 1-10 mm, poruszanym ruchem obrotowym ręcznie lub mechanicznie, z dyszy ekstrudera o średnicy 0,1-0,6 mm, w temperaturze 60-100°C i następnie na pokryciu szkieletu wewnętrznego polimerem w drodze zamocowania pręta z naniesionym szkieletem wewnętrznym jako elektrody wewnętrznej elektrolizera, wprowadzenia do elektrolizera roztworu chitozanu w wodnym roztworze kwasu organicznego lub nieorganicznego, zawierającego dodatek hydroksyapatytu w ilości 1-40% wagowych w stosunku do masy chitozanu i prowadzenia procesu elektrodepozycji chitozanu z roztworu na szkielecie wewnętrznym implantu prądem stałym przy napięciu 6-24 V w czasie 1-40 minut, a po zakończeniu elektrodepozycji zdjęciu powstałego implantu z elektrody, w którym implant poddaje się modyfikacji inkapsulowaną substancją aktywną, według wynalazku charakteryzuje się tym, że wytwarza się szkielet implantu w kształcie helisy o skoku gradientowym, natomiast modyfikacja implantu inkapsulowaną substancją aktywną polega na modyfikacji objętościowej wytworzonego implantu w drodze wytrząsania w roztworze mikro- i nanokapsułek z substancją aktywną w dejonizowanej wodzie, o stężeniu 0,01-1 g/l, w czasie 2-óch godzin, przy czym jako substancję aktywną stosuje się czynniki neurotroficzne, jak czynnik wzrostu nerwów (NGF - nerve growth factor), neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF - brain-derived neurotrophic factor), neurotrofina-3 (NT-3), neurotrofina-4 (NT - 4), czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego (GDNF - glialderived neurotrophic factor), o stężeniu 0,1-2 g/l.

W procesie elektrodepozycji stosuje się korzystnie roztwór chitozanu w roztworze wodnym kwasu mlekowego. Korzystnie stosuje się mikro- i nanokapsułki wytworzone standardową metodą emulsyjną z kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego.

Implanty wytworzone sposobem według wynalazku posiadają strukturę imitującą mikrośrodowisko uszkodzonego nerwu obwodowego. Poprzez dobór odpowiednich komponentów implantu (materiał termoplastyczny, kapsułkowane substancje czynne), wymiarów elektrody oraz nadanie właściwego ukształtowania szkieletowi wewnętrznemu uzyskuje się implant o parametrach preferowanych w regeneracji tkanki nerwowej, zwłaszcza aktywujących proces chemotaksji dodatniej aksonów. Dodatkowo absorpcja czynnika aktywnego zamkniętego w mikro- lub nanosferach umożliwia jego kontrolowane, przedłużone uwalnianie o kinetyce uwarunkowanej kinetyką degradacji, przy czym zwiększa to efektywność zastosowanej terapii, minimalizuje działania niepożądane przy jednoczesnym ograniczeniu kosztów leczenia.

Sposób według wynalazku ilustruje poniższy przykład z powołaniem się na rysunek, na którym Fig. 1A przedstawia poglądowo wytwarzanie szkieletu implantu, Fig. 1B poglądowo proces elektrodepozycji chitozanu na szkielecie wewnętrznym implantu, zaś Fig. 1C widok ogólny zmodyfikowanego implantu.

Przykład

W głowicy ekstrudera umieszczono filament polikaprolaktonu (PCL), który podgrzewano do temperatury 100°C. Szkielet wewnętrzny wytwarzano na drodze ekstruzji stopu przez dyszę ekstrudera o średnicy 0,1 mm na pręt wykonany ze stali nierdzewnej o średnicy 2 mm, poruszany ruchem obrotowym, w temperaturze 100°C przy prędkości podawania stopu PCL zdefiniowanej w G-codzie Z-132. Szkielet wewnętrzny w kształcie helisy z PCL o skoku gradientowym, o długości 2 cm drukowano za pomocą czteroosiowej frezarki CNC sterowanej przez zewnętrzny program Mach3 przy następujących parametrach:

G01 F8500 Z - 60 A2000 Y - 20

G91 G01 F8500 Z - 15 A1000 Y - 4

G91 G01 F8500 Z - 10 A500 Y -5

G91 G01 F8500 Z - 10 A300 Y -6

Y0.

Pręt z naniesioną helisą szkieletu implantu umieszczono jako elektrodę wewnętrzną w elektrolizerze. Jednocześnie w mieszalniku przygotowano 100 ml 1% roztworu chitozanu w 3% kwasie mlekowym, zawierającego 0,01 g dobrze rozdyspergowanego hydroksyapatytu. 8 ml tego roztworu umieszczono następnie w elektrolizerze. Elektrolizer podłączono do stabilizowanego zasilacza prądu stałego, tak że elektroda wewnętrzna z wewnętrznym szkieletem implantu posiadała potencjał ujemny, zaś elektroda zewnętrzna elektrolizera - anoda o średnicy wewnętrznej 22 mm, wykonana ze stali nierdzewnej, posiadała potencjał dodatni. Proces elektrodepozycji prowadzono 15 minut przy napięciu 12 V. W wyniku tego procesu na elektrodzie wewnętrznej odkładał się zredukowany w procesie elektrodepozycji chitozan z wbudowanymi w jego strukturę kryształami hydroksyapatytu, tworzący zewnętrzną osłonę implantu, zawierający wewnątrz szkielet z PCL. Po zakończeniu procesu powstały na elektrodzie hybrydowy implant zdjęto z elektrody, odcięto górną część szkieletu nie pokrytą depozytem i przeniesiono do roztworu mikro- i nanokapsułek z substancją aktywną w sterylnej wodzie dejonizowanej, o stężeniu 0,25 g/l.

Mikro- i nanokapsułki przygotowano standardową techniką podwójnej emulsji woda/olej/woda (W/O/W) z odparowaniem rozpuszczalnika. W tym celu przygotowano roztwór 0,5 g kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego (PLGA) w postaci granulek w 2,5 ml dichlorometanu (DCM). Następnie do roztworu tego dodano 0,08 ml 0,1% (w/v) roztworu surowicznej albuminy wołowej (BSA) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem PBS, zawierający 0,2 mg czynnika wzrostu nerwów (NGF). Mieszaninę homogenizowano 1 minutę przy użyciu homogenizatora o mocy 10% i liczbie cykli równej 6. W kolejnym etapie zhomogenizowaną mieszaninę wlano do 25 ml wodnego roztworu polialkoholu winylowego) (PVA) o stężeniu 1% wagowy i homogenizowano przez koleją 1 minutę zmieniając moc na 50% przy liczbie cykli 6. Następnie mieszaninę dodano do 25 ml 0,1% wodnego roztworu PVA i homogenizowano nie zmieniając parametrów. Powstałą podwójną emulsję mieszano mieszadłem magnetycznym przez 1 godzinę. Po całkowitym odparowaniu rozpuszczalnika, powstałe mikrosfery odwirowywano 3 minuty w temperaturze pokojowej. W ostatnim etapie odwirowane mikrosfery zebrane razem przemyto 2-krotnie 50 ml wody dejonizowanej, po czym ponownie odwirowywano przez 3 minuty.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania implantów o kształcie cylindrycznym aktywujących proces chemotaksji dodatniej aksonów, przeznaczonych zwłaszcza do regeneracji nerwów obwodowych, polegający na wytworzeniu szkieletu implantu w kształcie helisy z polikaprolaktonu, w drodze ekstruzji stopionego polikaprolaktonu na stalowym pręcie o przekroju kołowym o średnicy 1-10 mm, poruszanym ruchem obrotowym ręcznie lub mechanicznie, z dyszy ekstrudera o średnicy 0,1-0,6 mm, w temperaturze 60-100°C i następnie na pokryciu szkieletu wewnętrznego polimerem w drodze zamocowania pręta z naniesionym szkieletem wewnętrznym jako elektrody wewnętrznej elektrolizera, wprowadzenia do elektrolizera roztworu chitozanu w wodnym roztworze kwasu organicznego lub nieorganicznego, zawierającego dodatek hydroksyapatytu w ilości 1-40% wagowych w stosunku do masy chitozanu i prowadzenia procesu elektrodepozycji chitozanu z roztworu na szkielecie wewnętrznym implantu prądem stałym przy napięciu 6-24 V w czasie 1-40 minut, a po zakończeniu elektrodepozycji zdjęciu powstałego implantu z elektrody, w którym implant poddaje się modyfikacji inkapsulowaną substancją aktywną, znamienny tym, że wytwarza się szkielet implantu w kształcie helisy o skoku gradientowym, natomiast modyfikacja implantu inkapsulowaną substancją aktywną polega na modyfikacji objętościowej wytworzonego implantu w drodze wytrząsania w roztworze mikro- i nanokapsułek z substancją aktywną w dejonizowanej wodzie, o stężeniu 0,01-1 g/l, w czasie 2-óch godzin, przy czym jako substancję aktywną stosuje się czynniki neurotroficzne, jak czynnik wzrostu nerwów, neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego, neurotrofina-3, neurotrofina-4, czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego, o stężeniu 0,1-2 g/l.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w procesie elektrodepozycji stosuje się roztwór chitozanu w roztworze wodnym kwasu mlekowego.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się mikro- i nanokapsułki inkapsulujące substancję aktywną, wytworzone z kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego metodą emulsyjną.