PL247763B1 - Zastosowanie ekstraktów z nadziemnych części rośliny z gatunku chaber kastrifereryjski (Centaurea castriferrei Borbás & Waisb) w leczeniu glejaka oraz sposób otrzymywania ekstraktów z nadziemnych części rośliny z gatunku chaber kastrifereryjski (Centaurea castriferrei Borbás & Waisb) - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest ekstrakt z nadziemnych części z gatunku chaber kastrifereryjski (Centaurea castriferrei Borbás & Waisb) do zastosowania w leczeniu glejaka. Przedmiotem zgłoszenia jest także sposób otrzymywania ekstraktu z nadziemnych części roślin z gatunku chaber kastrifereryjski (Centaurea castriferrei Borbás & Waisb), gdzie rozdrobniony materiał roślinny przesiewa się przez zespół sit i prowadzi się proces ekstrakcji, stosując jako rozpuszczalniki wodę destylowaną oraz mieszaninę metanol-woda korzystnie w proporcji 7:3 v/v, przy czym proces ekstrakcji powtarza się co najmniej dwukrotnie.

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie ekstraktów z nadziemnych części rośliny z gatunku chaber kastrifereryjski (Centaurea castriferrei Borbas & Waisb) w leczeniu glejaka oraz sposób otrzymywania ekstraktów z nadziemnych części rośliny z gatunku chaber kastrifereryjski (Centaurea castriferrei Borbas & Waisb).

Centaurea castriferrei Borbas & Waisb (chaber kastrifereryjski) to jedna z najmniej poznanych roślin rodzaju Centaurea L. Pochodzi z regionu Vas (Węgry) i jest wysoce endemicznym gatunkiem. Dotychczas nie zbadano ani składu jakościowego/ilościowego, ani nie opisano żadnych właściwości biologicznych ekstraktów z tej rośliny. W literaturze brak jest informacji dotyczącej stosowania tego surowca lub przetworów z tego surowca w leczeniu przeciwnowotworowym.

Centaurea L. (Asteraceae) to duży rodzaj, obejmujący kilkaset przedstawicieli, pochodzący ze strefy basenu Morza Śródziemnego (Turcja, Grecja). Rośliny tego rodzaju rozpowszechnione są niemal na całym świecie i wykorzystywane w medycynie ludowej do leczenia bardzo wielu schorzeń jak: dysfunkcje układu pokarmowego, moczowego, sercowo-naczyniowego (np. odwracanie procesów miażdżycowych, leczenie hemoroidów), układu oddechowego (leczenie przeziębień, astmy). Badania fitochemiczne oraz biologiczne, prowadzone nad gatunkami z rodzaju Centaurea L. potwierdzają takie działanie terapeutyczne, a także wskazują na możliwość działania przeciwwrzodowego, cytostatycznego, a także co ważne, możliwość działania przeciwnowotworowego [Gurbuz et al. 2007, Alper et al. 2019, Ahmed et al. 2014].

Właściwości przeciwnowotworowe roślin z rodzaju Centaurea L. w stosunku do pojedynczych linii komórkowych glejaka zostały wykazane m. in. w odniesieniu do gatunku Centaurea ragusina L, gdzie zaobserwowano cytotoksyczne działanie wodnych ekstraktów z kwiatów oraz liści tego gatunku na linię komórkową glejaka A1235 [Rodan i wsp. 2017]. Zater i wsp. wykazali cytotoksyczne działanie ekstraktu chloroformowego pozyskanego z gatunku Centaurea diluta Ait. subsp. algeriensis (Coss. & Dur.) Maire na linię komórkową glejaka U373. Jednak brak jest doniesień literaturowych na temat działania przeciwnowotworowego gatunku Centaurea castriferrei Borbas & Waisb w kierunku glejaka.

Wynalazek rozwiązuje problem otrzymywania ekstraktów z nadziemnych części rośliny z gatunku Centaurea castriferrei Borbas & Waisb o aktywności przeciwnowotworowej wobec komórek glejaka oraz zastosowania ekstraktów w leczeniu glejaka.

Nieoczekiwanie w wyniku badań okazało się, że ekstrakty wodne oraz metanolowo-wodne (korzystnie w proporcji 7 : 3 v/v) z nadziemnych części rośliny z gatunku Centaurea castriferrei Borbas & Waisb otrzymane na drodze ekstrakcji wspomaganej ultradźwiękami (UAE, ang. Ultrasound Assisted Extraction) lub przyspieszonej ekstrakcji rozpuszczalnikiem (ASE, ang. Accelerated Solvent Extraction) z nadziemnych części rośliny Centaurea castriferrei Borbas & Waisb wykazują wysoką aktywność przeciwnowotworową w stosunku do komórek glejaka (Fig. 1), przy jednocześnie nieznacznej toksyczności w stosunku do komórek prawidłowych (Fig. 1).

Istotą wynalazku jest sposób otrzymywania ekstraktu z nadziemnych części roślin, który charakteryzuje się tym, że rozdrobniony i wysuszony materiał roślinny z roślin z gatunku Centaurea castriferrei Borbas & Waisb, przesiewa się przez zespół sit i prowadzi się proces ekstrakcji, stosując co najmniej dwa rodzaje rozpuszczalników: wodę destylowaną oraz mieszaninę metanol-woda w proporcji 7 : 3 v/v, przy czym proces ekstrakcji powtarza się co najmniej dwukrotnie w temperaturze nie przekraczającej 75°C. Rozpuszczalniki stosuje się w zakresie 6-10 części rozpuszczalnika na 1 cześć materiału roślinnego.

Korzystnie, gdy ekstrakcję prowadzi się stosując następujące ilości składników: substancja roślinna: rozpuszczalnik 1 : 6 (1 g substancji roślinnej 6 ml rozpuszczalnika).

Korzystnie ekstrakcję prowadzi się przy udziale fal ultradźwiękowych o częstotliwości 50 Hz w czasie 20-40 minut, korzystnie 30 minut, w temperaturze 60°C - 70°C, korzystnie 65°C powtarzając proces co najmniej dwukrotnie trzykrotnie, a otrzymane ekstrakty łączy się i przesącza oraz odparowuje do otrzymania postaci suchego proszku.

Korzystnie, gdy ekstrakcję prowadzi się z wykorzystaniem techniki ASE przyspieszona ekstrakcja rozpuszczalnikiem, stosując ciśnienie 100 bar, temperaturę ekstrakcji od 60 do 75°C korzystnie 65°C, czas stacjonarny (State time) - 5 minut, objętość przepływowa (Flush volume) - 60%, stosując trzy cykle, a otrzymane ekstrakty łączy się i przesącza oraz odparowuje do otrzymania postaci suchego proszku.

Istotą wynalazku jest także zastosowanie ekstraktów wodnych oraz metanolowo-wodnych (7 : 3 v/v) otrzymanych na drodze ekstrakcji ASE i UAE z nadziemnych części rośliny Centaurea castriferrei Borbas & Waisb w leczeniu glejaka.

Sposób według wynalazku dostarcza ekstraktu z nadziemnych części roślin z gatunku Centaurea castriferrei Borbas & Waisb, który cechuje się wysoką aktywnością przeciwnowotworową wobec komórek glejaka.

Ekstrakt otrzymany sposobem wynalazku może mieć zastosowanie do wytwarzania preparatów przeciwnowotworowych.

Wynalazek przedstawiono w poniższych przykładach wykonania.

Przykład 1

W badaniach wykorzystano kwitnące ziele Centaurea castriferrei Borbas & Waisb. Zebrany materiał roślinny wysuszono w suszarkach z wymuszonym obiegiem powietrza w temperaturze nie przekraczającej 30°C. Po wysuszeniu części nadziemne pozbawiono zdrewniałych części łodyg, pozostawiając do badań szczytowe łodygi, liście oraz kwiaty. Następnie materiał został rozdrobniony, zmielony, a następnie przesiany przez sita (wielkość oczek 1 mm = 1000 μm).

Proces ekstrakcji materiału roślinnego prowadzono niezależnie na 2 sposoby, wykorzystując: ekstrakcję bezpośrednią wspomaganą ultradźwiękami (UAE) oraz przyspieszoną ekstrakcję rozpuszczalnikiem (ASE). W obu przypadkach zastosowano 2 rodzaje rozpuszczalników: wodę destylowaną oraz mieszaninę metanol-woda (7 : 3 v/v).

W celu przeprowadzenia ekstrakcji wspomaganą ultradźwiękami (UAE), odważono dokładnie po 20 g sproszkowanego ziela Centaurea castriferrei Borbas & Waisb., umieszczono w kolbie okrągłodennej o poj. 250 ml zalewając porcją (120 ml) ekstrahenta odpowiednio dwa rodzaje: mieszanina metanol-woda (7 : 3 v/v) oraz woda destylowana. Kolby podłączono do chłodnicy zwrotnej i umieszczano w łaźni wodnej pilnując, by kolba zanurzona była w wodzie do poziomu, jaki stanowi materiał roślinny oraz ekstrahent. Ekstrakcje prowadzono przez 30 minut w temperaturze 65°C, z siłą ultradźwięków 50 Hz, powtarzając proces 3-krotnie. Po połączeniu ekstraktów przesączono je przez sączek bibułowy. Otrzymany ekstrakt metanolowo-wodny (7 : 3 v/v) oddestylowano do sucha i ponownie rozpuszczono w tym ekstrahencie przenosząc do kolby miarowej o pojemności 100 ml. Ekstrakt wodny zagęszczono i przeniesiono do kolby miarowej o pojemności 100 ml. 25 ml ekstraktów, odpowiadające zawartości 5 g materiału wyjściowego odparowano do sucha, roztarto w moździerzu na jednolity proszek, zamknięto w szczelnym opakowaniu i przeznaczono do dalszych badań.

Druga z technik ekstrakcyjnych, wykorzystana w badaniach to przyspieszona ekstrakcja rozpuszczalnikiem (ASE), wspomagana ciśnieniem 100 bar. Odważone substancje roślinne (1 g materiału roślinnego) przenoszono do celek ekstrakcyjnych Dionex (Sunnyvale, CA, USA) o objętości 10 ml, aparatu ASE 100 i prowadzono proces ekstrakcji w następujących warunkach: temperatura ekstrakcji - 65°C, czas stacjonarny (State time) - 5 minut, objętość przepływowa (Flush volume) - 60% (przepływ 6 ml roztworu), czas oczyszczenia (Purge time) - 60 sekund, ilość cykli - 3. Proces ekstrakcji materiału z każdym rozpuszczalnikiem powtórzono 5-krotnie, a po zagęszczeniu z wykorzystaniem wyparki próżniowej, ekstrakty przeniesiono do kolby o pojemności 25 ml, uzyskując takie same wyjściowe stężenia, jak w przypadku pierwszego rodzaju ekstrakcji, przeznaczając je, po odparowaniu rozpuszczalnika, dokładnym roztarciu w moździerzu i przeniesieniu do szczelnego opakowania do dalszych badań.

Przykład 2

W badaniach in vitro oceniono aktywność przeciwnowotworową ekstraktów Centaurea castriferrei Borbas & Waisb na komórkach ludzkiego glejaka (linia komórkowa LN229). Hodowla komórkowa prowadzona była w butelkach hodowlanych o pojemności 75 cm³ z wykorzystaniem medium hodowlanego Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) wzbogaconego 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS, ang. Fetal Bovine Serum) i antybiotykami (penicyliną, streptomycyną). Hodowla komórkowa prowadzona była w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C oraz atmosferze zawierającej 5% CO2. Po uzyskaniu właściwej konfluencji komórki linii LN229 wysiewano na płytki 96-dołkowe w stężeniu 1 x 105 komórek/ml. Ekstrakty do analizy cytotoksyczności (Tab. 1) przygotowano poprzez rozpuszczenie 50 mg suchego ekstraktu w 1 ml DMSO. Badane ekstrakty dodawano do hodowli komórkowej po osiągnięciu 70% - 80% konfluencji w szerokim zakresie stężeń (15,625 μg/ml; 31,25 μg/ml; 62,5 μg/ml; 125 μg/ml). Maksymalne stężenie zastosowanych ekstraktów wynosiło 125 μg/ml.

PL 247763 Β1

Tabela 1

Skróty ekstraktów stosowanych w badaniach

Badany gatunek	Ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika wspomagana ultradźwiękami (UAE) :	Przyspieszona ekstrakcja rozpuszczalnikiem (ASE) 1
metanol - woda 7:3v,'v	woda	metanol-woda 7:3 v/v	woda
C. casiriferrei Borbas & Waisb.	CASMUA	CASWUA	CASMAS	CASWAS

Po 48 godzinach inkubacji komórek linii LN229 z badanymi ekstraktami oceniono ich aktywność przeciwnowotworową poprzez analizę ich morfologii w mikroskopie kontrastowo-fazowym z odwróconą optyką Nikon Eclipse Ti. Uwzględniono zmiany morfologiczne komórek tj. obecność odklejonych i martwych komórek, obkurczenie komórek, zahamowanie wzrostu kolonii i proliferacji. Obserwację porównywano z kontrolą, którą stanowiły komórki glejaka hodowane w medium bez dodatku ekstraktów (Fig. 3). Następnie na podstawie testu MTT określano żywotność komórek poprzez pomiar aktywności metabolicznej badanych komórek glejaka linii LN229.

Test MTT jest oparty na zdolności enzymu - mitochondrialnej dehydrogenazy bursztynianowej do przekształcania pomarańczowej, rozpuszczalnej w wodzie soli tetrazolowej [bromek 3-4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylotetrazoliowy] do nierozpuszczalnego formazanu będącego ciemnoniebieskim produktem powyższej reakcji. Po rozpuszczeniu kryształów formazanu w DMSO, powstaje barwny roztwór, którego intensywność zabarwienia mierzona jest spektrofotometrycznie w zakresie długości fal 490-570 nm. Ilość barwnego zredukowanego MTT jest proporcjonalna do liczby aktywnych metabolicznie (żywych) komórek w populacji. Test MTT jest obecnie najczęściej stosowany do oceny działania cytotoksycznego i zalecany jako referencyjny przez międzynarodowe organizacje normotwórcze. Z otrzymanych w teście odczytów absorbancji wyliczono % żywotność komórek w obecności badanego związku, przyjmując absorbancję roztworu komórek kontrolnych za 100%.

Wyniki uzyskane w teście MTT analizowano statystycznie w aplikacji STATISTICA v. 13.0 (StaftSoft, Kraków) przy użyciu średnich i standardowych wartości odchylenia. Statystyczną istotność różnic między grupą kontrolną a grupami badanymi oceniono za pomocą testu t-Studenta. Różnice dla p<0,05 przyjęto za istotne statystycznie. Analizę wykonano dla 3 powtórzeń biologicznych i 3 technicznych (n = 9) (Fig. 2).

Wyniki:

Po 48 godzinnej ekspozycji komórek glejaka linii LN229 na działanie ekstraktów wodnych oraz metanolowo-wodnych (7 :3 v/v) otrzymanych na drodze ekstrakcji ASE i UAE z nadziemnych części rośliny Centaurea castriferrei Borbas & Waisb nieoczekiwanie zaobserwowano istotny statystycznie spadek żywotności komórek LN229 w porównaniu do komórek grupy kontrolnej w odniesieniu do każdego zastosowanego ekstraktu (Fig. 2). Nasilenie zmian było wprost proporcjonalne do użytego stężenia ekstraktu. Wartości IC50 dla wszystkich badanych ekstraktów dla linii LN229 podano w tabeli 2.

Tabela 2

Wartości IC50 dla badanych ekstraktów dla linii glejaka LN229

Linia komórkowa	'' ASE	UAE
CASMAS	CASWAS	CASMUA	CASWLA .
IC50 (pg/tni)	ICso (pg/rnl)
LN229	120,6799 | 104,2451	123,2114 | 112,6932

Wraz ze wzrostem stężenia badanej substancji nasilały się także zmiany w morfologii komórek glejaka (Fig. 3). Przy stężeniu odpowiadającym wartości IC50 komórki zaczynały się kurczyć i stopniowo zmieniać swój prawidłowy wrzecionowaty kształt w bardziej zwinięty i kulisty. W podłożu hodowlanym obserwowano odklejone, martwe komórki.

PL 247763 Β1

Kolejnym etapem badań in vitro była ocena aktywności ekstraktów na komórki prawidłowe - ludzkie fibroblasty linii BJ. Badanie przeprowadzono w sposób analogiczny jak w przypadku komórek glejaka LN229. Po osiągnięciu właściwego stanu konfluencji komórki wysiewano na płytki 96-dołkowe w ilości 1 x 10⁵ komórek/ml i hodowano do uzyskania pojedynczej, adherentnej warstwy komórek w każdym dołku. Następnie do poszczególnych dołków z komórkami dodawano pożywkę hodowlaną z wybranymi na podstawie wcześniejszych badań na glejaku stężeniami ekstraktów (15,625 pg/ml; 31,25 pg/ml; 62,5 pg/ml; 125 pg/ml).

Po 48 godzinach inkubacji oceniono wpływ badanych ekstraktów na komórki fibroblastów poprzez analizę morfologii komórek w mikroskopie kontrastowo-fazowym z odwróconą optyką Nikon Eclipse Ti oraz wyniki testu MTT. Wyniki porównywano z kontrolą, którą stanowiły komórki fibroblastów hodowane w identycznych warunkach, ale bez dodatku ekstraktów (Fig. 4).

Uzyskane za pomocą testu MTT wyniki wskazują na brak znaczącego działania toksycznego ekstraktów w stosunku do prawidłowych komórek ludzkich fibroblastów.

Ekstrakty w stężeniach 15,625, 31,25, 62,5, 125 pg/ml nie powodowały widocznych zmian morfologii komórek fibroblastów w porównaniu z kontrolą.

Tabela 3

Ocena morfologii komórek glejaka wykonana na podstawie zdjęć z mikroskopu kontrastowo-fazowego po inkubacji komórek z badanymi ekstraktami w stężeniu równym IC50-⁺⁺⁺ >50%, ++ >25%, + 10%.

	CASMAS	CASWAS	CASMUA	CASWUA
TEST MTT	IC50 (pg/ml)	120,6799	104,2451	123,2114	112,6932
MORFOLOGIA PRZY STĘŻENIU ICso	Martwe komórki	++	++	++	++
Zmieniony kształt komórek	+++	4-+4-	++4-	+++
Zahamowany wzrost	++	+++	+++	++

Literatura:

Gurbuz I, Yesilada E. Evaluation of the anti-ulcerogenic effect of sesquiterpene lactones from Centaurea solstitialis L. ssp. solstitialis by using various in vivo and biochemical techniques. J Ethnopharmacol. 2007 Jun 13; 112(2): 284-91. doi: 10.1016/j.jep.2007.03.009. Epub 2007 Mar 12. PMID: 17418988.

Alper M, Giineę H. The Anticancer and Anti-inflammatory Effects of Centaurea solstitialis Extract on Humań Cancer Celi Lines. Turk J Pharm Sci. 2019 Sep;16(3):273-281. doi: 10.4274/tjps.galenos.2018.27146. Epub 2019 Jul 10. PMID: 32454725; PMCID: PMC7227956.

Ahmed SA, Kamei EM. Cytotoxic activities of flavonoids from Centaurea scoparia. ScientificWorldJournal. 2014; 2014: 274207. doi: 10.1155/2014/274207. Epub 2014 Jun 11. PMID: 25114960; PMCID: PMC4075006.

Radan, Mila; Carev, lvana; Teśević, Vele; Politeo, Olivera; Ćikeś Ćulić, Vedrana (2017). Qualitative HPLC-DAD-ESI-TOF-MS analysis, cytotoxic and apoptotic effects of Croatian endemic <i>Centaurea ragusina</i> L. aqueous extracts. Chemistry & Biodiversity, 0, - doi: 10.1002/cbdv.201700099.

Zater H, Huet J, Fontaine V, Benayache S, Stevigny C, Duez P, Benayache F. Chemical constituents, cytotoxic, antifungal and antimicrobial properties of Centaurea diluta Ait. subsp. algeriensis (Coss. & Dur.) Maire. Asian Pac J Trop Med. 2016 Jun; 9(6):554-61. doi: 10.1016/j.apjtm.2016.04.016. Epub 2016 Apr 23. PMID: 27262066.

Claims (5)

1. Ekstrakt z nadziemnych części roślin z gatunku chaber kastrifereryjski (Centaurea castriferrei Borbas & Waisb) otrzymywany przy użyciu rozpuszczalników woda destylowana oraz mieszanina metanol-woda do zastosowania w leczeniu glejaka.

2. Ekstrakt według zastrz. 1, znamienny tym, że otrzymywany jest przy użyciu mieszaniny metanol-woda w proporcji 7 : 3 v/v.

3. Sposób otrzymywania ekstraktu z nadziemnych części znamienny tym, że rozdrobniony i wysuszony materiał roślinny z roślin z gatunku chaber kastrifereryjski (Centaurea castriferrei Borbas & Waisb) przesiewa się przez sita i prowadzi proces ekstrakcji, stosując proporcje składników: substancja roślinna : rozpuszczalnik jak 1 : 6-10 oraz stosując jako rozpuszczalniki wodę destylowaną oraz mieszaninę metanol-woda korzystnie w proporcji 7 : 3 v/v, przy czym proces ekstrakcji powtarza się co najmniej dwukrotnie, w temperaturze nie przekraczającej 75°C.

4. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że ekstrakcję prowadzi się przy udziale fal ultradźwiękowych o częstotliwości 50 Hz w czasie 20-40 minut, korzystnie 30 minut, w temperaturze 60°C - 70°C, korzystnie 65°C powtarzając proces trzykrotnie, a otrzymane ekstrakty łączy się i przesącza oraz odparowuje do otrzymania postaci suchego proszku.

5. Sposób, według zastrz. 2, znamienny tym, że ekstrakcję prowadzi się z wykorzystaniem techniki ASE (ang. Accelerated Solvent Extraction - przyspieszona ekstrakcja rozpuszczalnikiem, stosując ciśnienie 100 bar, temperaturę ekstrakcji od 60 do 75°C, korzystnie 65°C, czas stacjonarny - 5 minut, objętość przepływowa - 60%, stosując trzy cykle, a otrzymane ekstrakty łączy się i przesącza oraz odparowuje do otrzymania postaci suchego proszku.