PL248096B1 - Hybrydowe związki przeciwbakteryjne o wysokim potencjale antyoksydacyjnym, sposób ich otrzymywania i zastosowanie - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób otrzymywania hybrydowych związków przeciwbakteryjnych na bazie flawonoidów, o wysokim potencjale antyoksydacyjnym, złożonych z flawonoidu i środka przeciwbakteryjnego — sulfonamidu, połączonych wiązaniem kowalencyjnym z jonem metalu dedykowanych do terapii zakażeń miejscowych i ran, szczególnie zmian trądzikowych i stanów zapalnych przyzębia. Zgłoszenie obejmuje także związki hybrydowe zawierające sulfonamid oraz flawonoid, połączone wiązaniem kowalencyjnym z jonami metalu, gdzie stosunek molowy sulfonamid:flawonoid:jon metalu wynosi 1:1:1. Sposób otrzymywania związków hybrydowych według wynalazku polega na tym, że do wodnego roztworu soli sulfonamidu dodaje się wodny lub kwasowy roztwór soli metalu i całość miesza do momentu wytrącenia osadu, po czym kolejno dodaje się alkoholowy roztwór flawonoidu, całość miesza się do momentu wytrącenia osadu, następnie pozostawia na czas od 10 do 12 godzin w temperaturze pokojowej, przy czym składniki: sulfonamid, flawonoid, jon metalu użyte w roztworach stosuje się w stosunku molowym 1:1:1, a otrzymany osad przesącza się i przemywa co najmniej 5-krotnie wodą lub w przypadku środowiska kwasowego reakcji, najpierw wodnym roztworem wodorowęglanu sodu, a następnie co najmniej 5-krotnie wodą, po czym osad suszy się w temperaturze pokojowej. Zgłoszenie dotyczy też zastosowania związków według wynalazku do leczenia lokalnych infekcji i ran.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są hybrydowe związki o wielokierunkowym działaniu a w szczególności przeciwbakteryjnym oraz o wysokim potencjale antyoksydacyjnym, zawierające środek przeciwbakteryjny z grupy sulfonamidów i flawonoid, oraz sposób ich wytwarzania i ich zastosowanie do leczenia lokalnych infekcji i ran.

Antybiotyki, w tym sulfonamidy, są powszechnie stosowane zarówno w przemyśle farmaceutycznym jak i w rolnictwie. Pozostałości antybiotyków transferują do środowiska, skąd bardzo trudno je wyeliminować. Ze względu na obecność antybiotyków w naszym otoczeniu, jak również często nieodpowiednie ich stosowanie rośnie oporność bakterii oraz ryzyko pojawienia się nowych genów oporności bakteryjnej (Zhao X. et al. Environmental analysis of typical antibiotic-resistant bacteria and ARGs in farmland soil chronically fertilized with chicken manure, Science of the Total Environment, 2017, 593594, 10-17; Huang L. et al. Antibiotic resistance genes (ARGs) in duck and fish production ponds with integrated or non-integrated mode, Journal of Infection in Developing Countries, 2017, 11(2), 136-142).

W dobie coraz większej lekooporności bakterii na istniejące antybiotyki poszukuje się nowych rozwiązań, nowych połączeń substancji aktywnych, w tym przeciwbakteryjnych, które będą wykazywały oczekiwane działania terapeutyczne. Obiecującą grupą związków są kompleksy metali (Bormio Nunes J.H. Synthesis, spectroscopic characterization, crystallographic studies and antibacterial assays of new copper(II) complexes with sulfathiazole and nimesulide, Journal of Molecular Structure, 2016, 1112, 1420; Yasmeen S., Sumrra S.H. Antimicrobial metal-based thiophene derived compounds, Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 2017, 32(1), 106-112). Dostępne źródła donoszą, że kompleksy wykazują szereg istotnych efektów biologicznych, takich jak działanie antybakteryjne, przeciwgrzybiczne, przeciwnowotworowe, przeciwzapalne (Gaynor D., Griffith D. The Prevalence of Metal-Based Drugs as Therapeutic or Diagnostic Agents: Beyond Platinum, Dalton Transactions, 2012, 41(43), 13239-13257). Badania właściwości antybakteryjnych kompleksów dowodzą, że wolne ligandy mają potencjalną aktywność, która znacznie wzrasta po chelatacji (Chohan Z.H., Hazoor A Synthesis, characterization and biological studies of sulfonamide Schiff’s bases and some of their metal derivatives, Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 2012, 27(1), 58-68). Dodatkową zaletą kompleksów jest możliwość stworzenia związków zawierających większą liczbę ligandów. Daje to większe możliwości kojarzenia ze sobą leków, które mogą potęgować swoje działanie bądź je uzupełniać. W przypadku tworzenia kompleksów z antybiotykami i chemioterapeutykami przeciwbakteryjnymi potencjalnie redukuje się zjawisko lekooporności.

Sulfonamidy to grupa chemioterapeutyków biologicznie czynnych wykazujących różne aktywności biologiczne - przeciwdrobnoustrojowe (np. sulfatiazol), diuretyczne (np. acetazolamid), hipoglikemiczne (np. metformina), przeciwnowotworowe (indisulam w badaniach klinicznych), przeciwzapalne (salazopyrin), HIV przeciwwirusowe (np. darunavir), inhibitujące izoenzymy anhydrazy węglanowej (dorzolamid). Mechanizm działania sulfonamidów przeciwbakteryjnych wynika ze strukturalnego podobieństwa do kwasu para-aminobenzoesowego (PABA), który jest substratem syntezy kwasu foliowego witaminy B9 koniecznej do prawidłowego funkcjonowania organizmu. Bierze on udział w wielu reakcjach biochemicznych takich jak biosynteza nukleotydów, naprawa DNA i metylacja DNA, niezbędnych do podziału i różnicowania komórek bakteryjnych [Genę Y., Ozkanca R., Antimicrobial activity of some sulphonamide derivatives on clinical isolates of Staphylococus aureus, Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob., 2008, 7, 17; Ozbek N., Katircioglu H., Synthesis, characterization and antimicrobial activity of new aliphatic sulfonamide, Bioorg. Med. Chem., 2007, 15, 5105-5109].

Sulfatiazol jest przedstawicielem grupy sulfonamidów przeciwbakteryjnych. Był szeroko stosowany w zakażeniach tkanek miękkich spowodowanych bakterią E. coli, w sepsie oraz zapaleniach tkanki łącznej, szpiku i płuc wywołanych przez bakterie z rodziny Staphylococcus. Leczył infekcje dróg moczowych powodowanych przez E. aerogenes, P. aeruginosa, E. coli oraz gronkowce: S. epidermidis i S. ureus i infekcje narządów rozrodczych, szczególnie u mężczyzn, wywołanych bakterią N. gonorrhoeae. Czas gojenia i zasięg infekcji były równomiernie redukowane przez miejscowe wprowadzanie sproszkowanego sulfatiazolu do zanieczyszczonych lub zainfekowanych ran gronkowcowych. [Long P.H. The Clinical Use of Sulfanilamide, Sulfapyridine, Sulfathiazole, Sulfaguanidine, and Sulfadiazine in the Prophylaxis and Treatment of Infections, Canadian Medical Association Journal, 1941; 44(3): 217227]. Ze względu na silne działania niepożądane, reakcje alergiczne oraz szerzącą się oporność na sulfonamidy, sulfatiazol podawany ogólnoustrojowo został zastąpiony innymi lekami, i obecnie jest stosowany tylko miejscowo w postaci soli srebrowej, która wykazuje kilkadziesiąt razy większą aktywność przeciwbakteryjną niż sam sulfatiazol. W szczególności działa na pałeczki ropy błękitnej atakujące urazy spowodowane oparzeniami. Kompleks sulfatiazol-Ag jest wykorzystywany do miejscowego leczenia oparzeń. W Polsce istnieje krem z solą srebrową sulfatiazolu (Argosulfan), który zapobiega zakażeniu rany oparzeniowej i przyspiesza jej gojenie [Stożkowska W., Wroczyńska-Pałka M, Badania przeciwwirusowej aktywności soli srebrowej, Medycyna Doświadczalna i Mikrobiologia, 1999; 51(1-2): 167-174]. Innym preparatem zarejestrowanym w Polsce, zawierającym sulfatiazol jest Sulfarinol - krople donosowe z dodatkiem nafazoliny, aplikowane w leczeniu obrzęku błony śluzowej nosa wywołanej zakażeniem bakteryjnym.

Sulfonamidy były pierwszymi substancjami chemicznymi stosowanymi w lecznictwie w terapii i profilaktyce infekcji bakteryjnych. Stosowanie tych leków stopniowo się zmniejszało z powodu pojawienia się coraz większej ilości opornych bakterii. W celu zwiększenia siły działania sulfonamidów oraz zapobiegania dalszej oporności, opracowano lek złożony - trimetoprim (TMP), który zapewniał synergię działania. Preparaty tworzone przy użyciu TMP i sulfonamidów skutecznie leczyły infekcje dróg moczowych, bakteryjne zapalenie opon mózgowych, zapalenie płuc oraz były powszechnie stosowane jako profilaktyka przed nawracającymi i opornymi na leczenie infekcjami. Niestety, z czasem również zaczęła się pojawiać oporność na to połączenie. Aby chronić skuteczność działania sulfonamidów i rozszerzać ich stosowanie kliniczne, potrzebne są nowe wzmacniacze ich aktywności. Poszukiwanym wzmacniaczem okazują się jony metali, które oprócz własnego działania zwiększają działanie sulfonamidów. Dotychczasowe doświadczenia potwierdzają aktywność przeciwbakteryjną metali ciężkich, a także aktywność kompleksów tych metali. Ponadto, sulfatiazol i jego kompleksy posiadają wiele zastosowań, oprócz aktywności antybakteryjnej, wykazują działanie moczopędne, przeciwnowotworowe, przeciwpadaczkowe, przeciwgrzybiczne [Golzar Hossain G.M., Synthesis and characterisation of cobalt complex of sulfathiazole with acetic acid, Journal of Saudi Chemical Society, 2011; 17(3): 253-257].

Wykorzystanie kompleksów metali w medycynie zależy od kontroli ich właściwości kinetycznych i termodynamicznych poprzez wybór stanu utlenienia, typu i liczby związanych jonów z ligandami oraz geometrii koordynacji. W ten sposób możliwe jest osiągnięcie swoistej aktywności biologicznej i, co najważniejsze, zminimalizowanie skutków ubocznych wynikających z toksyczności metali ciężkich [Bellύ S., Rizzotto M., The interaction between sulfathiazole and cobalt(II): potentiometric studies, QuimicaNova, 2016; 30(5): 1136-1142].

Na przestrzeni ostatnich trzech dekad zostało przeanalizowanych wiele kompleksów sulfatiazolu z różnymi metalami, m.in. cynkiem, kobaltem, miedzią, platyną, srebrem, złotem, niklem. W strukturach kompleksowych sulfatiazol zachowuje się jako deprotonowany a nion (ugrupowanie -SO2NHsulfatiazolu ulega deprotonowaniu), lub jako protonowany kation (azot grupy -NH2 sulfatiazolu ulega protonowaniu) [Golzar Hossain G.M.: Synthesis and characterisation of cobalt complex of sulfathiazole with acetic acid. J. Saudi. Chem. Soc. 2013, 17, 253-257]. Kompleks sulfatiazolu z cynkiem Zn(sulfatiazol)2-H2O został zsyntetyzowany przez powolne odparowywanie mieszaniny wodnych roztworów soli sodowej sulfatiazolu i octanu cynku zmieszanych w stosunku 2:1 [Casanova J. et al.: Metal complexes of sulfanilamide derivatives. Crystal structure of [Zn(sulfathiazole)2]H2O, J. Inorg. Biochem. 1993, 51(4), 689-699]. Syntezę kompleksu sulfatiazolu ze srebrem - Ag2(sulfatiazol)2, przeprowadzono przez dodanie octanu srebra do rozpuszczonego w metanolu sulfatiazolu w stosunku 1: 1 i ogrzewanie mieszaniny w temperaturze bez dostępu światła. Wytrącony szary osad rozpuszczono w wodnym roztworze amoniaku, poddano rekrystalizacji otrzymując bezbarwne kryształy. Otrzymany kompleks wykazywał aktywność przeciwbakteryjną wobec bakterii Gram (+) i Gram (-) [Nunes J.H.B. et ah: Silver complexes with sulfathiazole and sulfamethoxazole: Synthesis, spectroscopic characterization, crystal structure and antibacterial assay. Polyhedron. 2015, 85, 437-444]. Kompleks sulfatiazolu z niklem i pirydyną: Ni(sulfatiazol)2(Pir)2]-2Pir otrzymano przez dodanie kilku kropli trietyloaminy do rozpuszczonego w metanolu sulfatiazolu, a następnie octan niklu w stosunku 2:1 i ogrzewanie przez 2 godziny. Następnie odsączono jasnoniebieski osad i poddano rekrystalizacji z mieszaniny etanol/pirydyna 1:1 [Manzoni de Oliveira G. et al.: On the Search of Metallated Sulfonamides: Synthesis and X-ray Characterizationof the New Sulfathiazolato Nickel(II)-Chelate Complex [Ni(STZ)2(Py)2]-2Py. ZAAC - Journal of Inorganic and General Chemistry. 2007, 633(9), 1326-1328]. W przypadku syntezy kompleksu sulfatiazolu z manganem, Mn(sulfatiazol)(pirolidyna), do rozpuszczonego w metanolu sulfatiazolu dodano chlorek manganu, a następnie pirolidynę/piperydynę/ etylenodiaminę w stosunku reagentów 1:1:1. Mieszaninę ogrzewano pod chłodnicą zwrotną przez dwa dni, następnie przesączono, a kompleks poddano rekrystalizacji z udziałem dimetyloformamidu. Otrzy mane kompleksy wykazywały aktywność enzymu dysmutazy ponadtlenkowej (metaloproteinaza zawierająca mangan) [Anacona J.R., Diaz J., Synthesis, characterization and superoxide dismutase activity of the manganese (II) mixed ligand complexes containing sulfathiazole, Journal of the Chilean Chemical Society, 2008; 54(4): 1565-1567]. Kompleks sulfatiazolu z kobaltem, (sulfatiazolH)2(CoCl4)CH3COOH, otrzymano przez rozpuszczenie w gorącym metanolu sulfatiazolu i dodawanie metanolowego roztworu chlorku kobaltu. Fioletowy osad odsączono, wysuszono i ponownie rozpuszczono w wodzie w obecności kwasu octowego, odsączono i pozostawiono do krystalizacji z powolnym odparowywaniem w temperaturze pokojowej [Golzar Hossain G.M., Synthesis and characterisation of cobalt complex of sulfathiazole with acetic acid, 2011, Journal of Saudi Chemical Society, 17(3), str. 253-257]. Synteza kompleksu z miedzią, Cu(sulfatiazol)2(bipir), polegała na zmieszaniu metanolowych roztworów azotanu miedzi, 2,2’-bipirydyny i sulfatiazolu w stosunku 1:1:2 i pozostawieniu w temp. pokojowej przez 3 godziny. Osad przesączono próżniowo, przemyto metanolem i wysuszono w eksykatorze. Testy mikrobiologiczne potwierdziły aktywność kompleksu przeciw szczepom bakterii Gram (+) i Gram (-) [Bormio Nunes J. H., Ferraz de Paiva R. E., Synthesis, spectroscopic characterization, crystallographic studies and antibacterial assays of new copper (II) complexes with sulfathiazole and nimesulide, 2016, Journal of Molecular Structure, 1112, str. 14-20].

Przedstawione w stanie techniki kompleksy sulfatiazolu z metalami w większości przypadków wykazywały większą aktywność mikrobiologiczną niż sulfatiazol wolny. Obecność więc metalu jest kluczowa w intensyfikacji działania kompleksu.

Ciekawym pomysłem wykorzystania istniejących już leków do otrzymywania nowych działań terapeutycznych jest komponowanie tzw. hybryd o pożądanym złożonym profilu leczniczym. Badacze przeprowadzili kondensację sulfatiazolu z cefaleksyną, a powstały związek poddali kompleksowaniu z różnymi metalami. Otrzymane kompleksy poddano badaniom mikrobiologicznym wykazując wyższą aktywność bakteriobójczą kompleksu niż połączenia cefaleksyny z sulfatiazolem. Dzięki skojarzeniu ze sobą tych dwóch leków ich działanie zostało uzupełnione, a chelatacja spowodowała wzmocnienie działania [Anacona J.R., Rodriguez J. L., Synthesis, characterization and antibacterial activity of a Schiff base derived from cephalexin and sulphathiazole and its transition metal complexes, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2014; 129: 96-102].

Żelazo z wolnymi miejscami koordynacji powoduje powstawanie rodników hydroksylowych i jest to efekt niepożądany w lecznictwie [Graf E., Mahoney J.R., Iron-catalyzed Hydroxyl Radical Formation, The Journal of Biological Chemistry, 1984; 259(6): 3620-3624]. Natomiast po zablokowaniu miejsc koordynacji - po skompleksowaniu, żelazo traci takie zdolności i może być wykorzystywane w celach antybakteryjnych (Kondori T. et al. A novel iron(III) complex: synthesis, spectra, X-ray structure photoluminescence study, and antibacterial properties, Chemical Papers, 2019; 73: 1639-1646).

Polifenole należące do metabolitów wtórnych roślin są szeroko stosowane zarówno w celach kosmetycznych, jak i leczniczych (m.in. galusan epigallokatechiny, kwercetyna). Mają wiele właściwości biologicznych korzystnych dla organizmu, w tym antyoksydacyjne, immunomodulacyjne, działają przeciwnowotworowo i przeciwdrobnoustrojowo. Istnieją przesłanki wskazujące na możliwość stosowania ich we wspomaganiu gojenia ran wykorzystując ich właściwości immunomodulujące [Paszkiewicz M. Immunomodulacyjna rola polifenoli roślinnych, Postępy Hig Med. Dosw 2012; 66: 637-646]. Proces gojenia rany obejmuje sekwencję nakładających się na siebie etapów, w tym fazę zapalną, proliferacyjną oraz etap odbudowy i epitelializacji [wytyczne Polskiego Towarzystwa Leczenia Ran, Leczenie Ran 2021; 18 (3): 71-114]. Polifenole roślinne dzięki swoim właściwościom immunomodulacyjnym mogą interferować z kolejnymi etapami gojenia ran, przyspieszając ten proces i dając lepsze efekty gojenia, zarówno przy prawidłowym, jak i zaburzonym przebiegu poszczególnych faz. Znaczące jest w tym przypadku działanie antyoksydacyjne, p/drobnoustrojowe i p/bólowe. Polifenole, np. kwercetyna, hamują ekspresję COX-2, enzymu zaangażowanego w proces gojenia ran. Badania wykazały, że hamowanie aktywności COX-2 sprzyja procesom naprawczym [Ullah M.F., Khan M.W.: Food as medicine: potential therapeutic tendencies of plant derived polyphenolic compounds. Asian Pac. J. Cancer Prev., 2008; 9: 187-196].

Galusan epigallokatechiny (EGCG) należy do pochodnych katechiny i jest głównym związkiem aktywnym wyciągu zielonej herbaty. Katechiny działają antyoksydacyjnie, przeciwbakteryjnie, przeciwzapalnie, przeciwalergicznie, przeciwnowotworowo, przeciwwirusowo, przeciwdepresyjnie, ochronnie na skórę i układ sercowo-naczyniowy, obniżają poziom cholesterolu, wspomagają odchudzanie oraz wspierają działanie układu odpornościowego. W dermatologii, katechiny, a szczególnie EGCG łagodzi objawy trądziku i stanów zapalnych skóry. EGCG wykazuje wysoką aktywność antyoksydacyjną, znacznie silniejszą niż witamina C i E, chroniąc organizm przed uszkodzeniami spowodowanymi wolnymi rodnikami. Wysoka aktywność antyoksydacyjna prawdopodobnie wynika z niskiego potencjału redukcyjnego wywołanego dużą zdolnością do oddawania protonu oraz w mniejszym stopniu ze zdolności do chelatowania jonów metali. Wychwytywanie wolnych rodników spowalnia rozwój procesów nowotworowych, chorób serca oraz starzenie się organizmu. Galusan przyspiesza gojenie się ran oraz zmniejsza stany zapalne, poprzez hamowanie szlaków reakcji zapalnej. Uważa się, że zmniejsza uwalnianie prozapalnych cytokin (IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNF-α) i prostaglandyny PGE-2. Istnieją badania mówiące o hamowaniu przez galusan nadaktywności metaloproteinazy macierzy, odpowiedzialnej za uszkodzenia skóry, jej stany zapalne i nowotwory. Ponadto galusan chroni skórę przed niebezpiecznym promieniowaniem UV, wywołującym stres oksydacyjny oraz mikrouszkodzenia w jej strukturze. Dzięki temu zapobiega zapaleniom, rakowi oraz przedwczesnemu starzeniu się skóry. Galusan wykazuje także działanie przeciwko Streptococcus mutans i Fusobacterium nucleatum - bakteriom odpowiedzialnym za powstawanie próchnicy zębów, chorób i stanów zapalnych przyzębia. Potwierdziły to badania przeprowadzone na dużej grupie pacjentów - badani mężczyźni, którzy regularnie pili herbatę mieli zdrowszą jamę ustną. Dodatkowo zaobserwowano zmniejszenie nieprzyjemnego oddechu, co świadczy o aktywności związków herbaty wobec bakterii produkujących lotne związki siarki np. H2S [Zhang X, Wang J., Hu J.-M., Synthesis and Biological Testing of Novel Glucosylated Epigallocatechin Gallate (EGCG) Derivatives, Molecules, 2016; 21(5): 620; Jigisha A, Nishant R., Green tea: A magical herb with miraculous outcomes, International Research Journal of Pharmacy, 2012; 3(5): 139-148].

Kwercetyna to jeden z najczęściej naturalnie występujących flawonoidów roślinnych. Powszechność tego związku wynika z funkcji, jakie pełni w przyrodzie chroniąc nieosłonięte części roślin przed szkodliwym wpływem promieniowania UV, działa przeciwgrzybiczo i przeciwbakteryjnie. Kwercetyna działa przede wszystkim przeciwutleniająco, wspierając procesy neutralizowania wolnych rodników. W ten sposób kwercetyna chroni m.in. przed rozwojem zmian miażdżycowych i nowotworowych - jej właściwości antyoksydacyjne zmniejszają do minimum powstające pod wpływem wolnych rodników mutacje w kodzie DNA. Wykazuje również silne właściwości przeciwzapalne - hamuje powstawanie cytokin prozapalnych i napływ leukocytów, działa ochronnie na komórki nerwowe zapobiegając degradacji neuronów - chorób neurodegeneracyjnych, działa przeciwalergiczne - blokuje aktywność alergenów i hamuje wydzielanie histaminy, działa właściwościach przeciwbakteryjnych i przeciwwirusowo - ma zdolność do wiązania się z białkami płaszcza wirusa hamując aktywność wirusów m.in. opryszczki HSV, grypy, wścieklizny, polio, HIV-1.

Wynalazek rozwiązuje problem otrzymywania hybrydowych związków przeciwbakteryjnych na bazie flawonoidów, o wysokim potencjale antyoksydacyjnym, złożonych z flawonoidu i środka przeciwbakteryjnego - sulfonamidu, połączonych wiązaniem kowalencyjnym z jonem metalu w postaci metaloorganicznego, mieszanego kompleksu o potencjalnej aktywności wobec bakterii lekoopornych, dedykowanych do terapii zakażeń miejscowych i ran, szczególnie zmian trądzikowych i stanów zapalnych przyzębia.

Związki hybrydowe według wynalazku zawierają środek przeciwbakteryjny sulfonamid gdzie jako sulfonamid zawierają sulfatiazol, zaś jako flawonoid zawierają galusan epigallokatechiny lub kwercetynę połączone wiązaniem kowalencyjnym z jonami metalu, przy czym stosunek molowy składników wynosi: sulfonamid: flawonoid: jony metalu wynosi 1:1:1. Korzystnie, gdy jon metalu stanowi jon żelaza(III), żelaza(II), bizmutu(III), cynku(II) lub miedzi(II).

Wynalazek dotyczy też sposobu otrzymywania związków hybrydowych, który polega na tym, że do wodnego roztworu soli sulfonamidu w postaci sulfatiazolu dodaje się wodny lub kwasowy roztwór soli metalu, i całość miesza do momentu wytrącenia osadu, po czym kolejno dodaje się alkoholowy roztwór flawonoidu, który stanowi roztwór galusanu epigallokatechiny lub kwercetyny, całość miesza się do momentu wytrącenia osadu, następnie pozostawia na czas od 10 do 12 godzin w temperaturze pokojowej, przy czym składniki: sulfonamid, flawonoid, jon metalu użyte w roztworach stosuje się w stosunku molowym 1:1:1, a otrzymany osad przesącza się i przemywa co najmniej 5-krotnie wodą, lub w przypadku środowiska kwasowego reakcji najpierw wodnym roztworem wodorowęglanu sodu, a następnie co najmniej 5-krotnie wodą, po czym osad suszy się w temperaturze pokojowej.

Korzystnie, gdy jako jon metalu stosuje się jon żelaza(III), żelaza(II), bizmutu(III), cynku(II) lub miedzi(II).

Korzystnie, gdy jako roztwór kwasowy metalu w postaci soli stosuje się roztwór metalu w postaci soli w 5% roztworze kwasu solnego.

Korzystnie, gdy jako alkoholowy roztwór flawonoidu stosuje się etanolowy roztwór flawonoidu.

Korzystnie, jeśli związki hybrydowe otrzymuje się w temperaturze pokojowej.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie związków hybrydowych otrzymywanych według wynalazku w leczeniu zakażeń miejscowych i ran, szczególnie zmian trądzikowych i stanów zapalnych przyzębia.

Korzyścią otrzymanych związków hybrydowych w formie metaloorganicznych, mieszanych kompleksów jest połączenie w swojej budowie dwóch związków aktywnych o różnych kierunkach działania, jednej o właściwościach antybakteryjnych i drugiej o właściwościach antyoksydacyjnych, immunomodulacyjnych, przeciwzapalnych, przeciwalergicznych i przeciwdrobnoustrojowych. Połączenie związków aktywnych z jonami metalu pozwala uzyskać hybrydę o wielokierunkowym działaniu w stabilnej postaci dogodnej do stosowania w przemyśle farmaceutycznym.

Z uwagi na potencjalną aktywność immunomodulacyjną i przeciwzapalną otrzymanych hybryd istnieje możliwość stosowania ich we wspomaganiu gojenia ran, w tym ran trądzikowych.

Otrzymane struktury hybrydowe wykazują różnokierunkowe działania, szczególnie antyoksydacyjne - eliminacja wolnych rodników i tym samym aktywność anty-aging.

Otrzymane hybrydy pochłaniają również niekorzystne promieniowanie nadfioletowe z zakresu UVA i UVB, tym samym wykazują ochronę przed fotostarzeniem skóry - ochronę przed nadmierną pigmentacją i zmianami nowotworowymi skóry.

Ze względu zaś na modyfikację sulfonamidu przeciwbakteryjnego w strukturze hybrydowej otrzymane związki zapobiegają progresji oporności wykazując aktywność wobec szczepów bakterii lekoopornych w porównaniu do ich prekursorów „niehybrydowych”.

Otrzymane związki hybrydowe są praktycznie nierozpuszczalne w wodzie co pozwala utrzymać stałe ich stężenie w miejscu podania - w ranie, zmianie infekcyjnej i tym samym wykorzystać cały ich potencjał terapeutyczny i pielęgnacyjny - zwiększenie skuteczności i możliwość redukcji czasu kuracji.

Ponadto, potencjalny brak wnikania hybrydy do organizmu skutkuje stosunkowo niewielkim działaniem niepożądanym.

Dodatkowo, związanie flawonoidu w strukturze hybrydowej potencjalnie zwiększa jego stabilność, szczególnie wobec światła (tym samym aktywność) w odniesieniu do jego formy „niehybrydowej”.

Otrzymane połączenia hybrydowe są stosunkowo trwałe - nie ulegają rozpadowi pod wpływem rozcieńczonych kwasów, zasad.

Z uwagi zaś na możliwość hydrolizy połączenia hybrydowego, zsyntetyzowane związki mogą być traktowane jako nośniki powolnego uwalniania prekursorów „niehybrydowych” wpływając na wydłużenie ich biologicznego działania. Związki hybrydowe należy inkorporować w strukturę macierzy, korzystnie żelowej lub oleożelowej celem otrzymania leczniczo-pielęgnacyjnych form farmaceutycznych dedykowanych terapii miejscowej.

Wynalazek przedstawiono w poniższych przykładach oraz na rysunku, gdzie Fig. 1 przedstawia Widmo substratu - STZ w postaci soli (A) i produktu pośredniego reakcji - kompleks STZ-Fe (A’), Fig. 2 Widma substratów: STZ (A) w postaci soli i EGCG (B) oraz produktu końcowego reakcji - kompleks mieszany STZ-Fe-EGCG (C), Fig. 3 wykres zależności % inhibicji rodnika DPPH od zawartości STZ-Fe(III)-EGCG, Fig. 4 Porównanie właściwości przeciwutleniających hybrydy STZ-Fe(III)-EGCG w odniesieniu do substancji wzorcowych - troloksu i witaminy C, Fig. 5 Analiza spektrofotometryczna roztworu EGCG i hybrydy STZ-Fe(III)-EGCG w DMSO o stężeniu 0,001% w zakresie długości fali 230400 nm. Widma absorpcji EGCG zarejestrowane w 1, 3 i 30 dniu badania (A). Absorbancja STZ-Fe(III)EGCG w funkcji czasu (B). Fig. 6 pokazuje trwałość roztworu STZ-Fe(III)-EGCG, który charakteryzował się znacznie większą trwałością, zabarwienie i spektrum absorpcji bez istotnych zmian.

Otrzymywanie hybrydowych związków przeciwbakteryjno-antyoksydacyjnych.

Przykład 1

Kompleks STZ-Fe(III) otrzymano w reakcji soli metalu - chlorku żelaza (FeCl3x6H2O) z sulfatiazolem sodu w wodnym środowisku. Do 0,11 g sulfatiazolu sodu (zawiera 0,1 g sulfatiazolu, co odpowiada 0,39 mmola) rozpuszczonego w wodzie dodano roztwór chlorku żelaza otrzymany przez rozpuszczenie w wodzie 0,11 g FeCl3x6H2O (zawiera 0,02 g żelaza, co odpowiada 0,39 mmola) mieszając delikatnie na mieszadle magnetycznym, wytrąca się osadl. Kompleks mieszany STZ-Fe(III)-EGCG otrzymano dodając do mieszaniny reakcyjnej z osadem STZ-Fe(III) alkoholowy roztwór galusanu epigallokatechiny (EGCG), który przygotowano przez rozpuszczenie 0,24 g EGCG w etanolu (co odpowiada 0,39 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano delikatnie na mieszadle magnetycznym strącając osad2 i następnie pozostawiono ok. 12 h w temperaturze pokojowej, chroniąc od światła. Uzyskany osad przesączono, przemyto kilkakrotnie wodą i wysuszono w eksykatorze, w temperaturze pokojowej.

Wydajność: ok. 76%.

Przykład 2

Kompleks STZ-Fe(II) otrzymano w reakcji soli metalu - siarczanu żelaza (FeSO4x7H2O lub [(NH4)2Fe(SO4]) z sulfatiazolem sodu w wodnym środowisku. Do 0,11 g sulfatiazolu sodu (zawiera 0,1 g sulfatiazolu, co odpowiada 0,39 mmola) rozpuszczonego w wodzie dodano roztwór siarczanu żelaza (lub siarczanu żelaza i amonu) otrzymany przez rozpuszczenie w wodzie 0,11 g FeSO4x7H2O lub 0,11 g [(NH4)2Fe(SO4)] (zawiera 0,02 g żelaza, co odpowiada 0,39 mmola) mieszając delikatnie na mieszadle magnetycznym, wytrąca się osad1. Kompleks mieszany STZ-Fe(II)-EGCG otrzymano dodając do mieszaniny reakcyjnej z osadem STZ-Fe(II) alkoholowy roztwór galusanu epigallokatechiny (EGCG), który przygotowano przez rozpuszczenie 0,24 g EGCG w etanolu (co odpowiada 0,39 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano delikatnie na mieszadle magnetycznym strącając osad2 i następnie pozostawiono ok. 12 h w temperaturze pokojowej, chroniąc od światła. Uzyskany osad przesączono, przemyto kilkakrotnie wodą i wysuszono w eksykatorze, w temperaturze pokojowej.

Wydajność: ok. 85%.

Przykład 3

Kompleks STZ-Bi(III) otrzymano w reakcji soli metalu - cytrynianu bizmutu ([O2CCH2C(OH)-(CO2)CH2CO2]Bi) z sulfatiazolem sodu w środowisku kwasowym. Do 0,11 g sulfatiazolu sodu (zawiera 0,1 g sulfatiazolu, co odpowiada 0,39 mmola) rozpuszczonego w wodzie dodano roztwór cytrynianu bizmutu w 5% roztworze kwasu solnego, otrzymany przez rozpuszczenie w wodzie 0,16 g [O2CCH2C(OH)(CO2)CH2CO2]Bi) (zawiera 0,08 g bizmutu, co odpowiada 0,39 mmola) mieszając delikatnie na mieszadle magnetycznym, wytrąca się osad1. Kompleks mieszany STZ-Bi(III)-EGCG otrzymano dodając do mieszaniny reakcyjnej z osadem STZ-Bi(III) alkoholowy roztwór galusanu epigallokatechiny (EGCG), który przygotowano przez rozpuszczenie 0,24 g EGCG w etanolu (co odpowiada 0,39 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano delikatnie na mieszadle magnetycznym strącając osad2 i następnie pozostawiono ok. 12 h w temperaturze pokojowej, chroniąc od światła. Uzyskany osad przesączono, przemyto roztworem wodnym wodorowęglanu sodu, następnie kilkakrotnie wodą i wysuszono w eksykatorze, w temperaturze pokojowej.

Wydajność: ok. 78%.

Przykład 4

Kompleks STZ-Fe(III) otrzymano w reakcji soli metalu - chlorku żelaza (FeCl3x6H2O) z sulfatiazolem sodu w wodnym środowisku. Do 0,11 g sulfatiazolu sodu (zawiera 0,1 g sulfatiazolu, co odpowiada 0,39 mmola) rozpuszczonego w wodzie dodano roztwór chlorku żelaza otrzymany przez rozpuszczenie w wodzie 0,11 g FeChx6H2O (zawiera 0,02 g żelaza, co odpowiada 0,39 mmola) mieszając delikatnie na mieszadle magnetycznym, wytrąca się osad1. Kompleks mieszany STZ-Fe(III)-kwercetyna otrzymano dodając do mieszaniny reakcyjnej z osadem STZ-Fe(III) alkoholowy roztwór kwercetyny, który przygotowano przez rozpuszczenie 0,12 g kwercetyny w etanolu (co odpowiada 0,39 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano delikatnie na mieszadle magnetycznym strącając osad2 i następnie pozostawiono ok. 12 h w temperaturze pokojowej, chroniąc od światła. Uzyskany osad przesączono, przemyto kilkakrotnie wodą i wysuszono w eksykatorze, w temperaturze pokojowej.

Wydajność: ok. 75%.

Przykład 5

Opis sposobu otrzymania przykładowego preparatu w formie żelu z użyciem hybrydowego związku według wynalazku.

Przykład nośnika żelowego z hybrydą STZ-Fe-EGCG. Do 2% roztworu chitozanu, który uzyskano przez rozpuszczenie 0,2 g chitozanu w 10 ml 1% kwasu octowego, dodano 2,5 ml 3% aldehydu glutarowego. Powstałą mieszaninę pozostawiono do sieciowania na ok. 2 h w temperaturze pokojowej, mieszając od czasu do czasu. Następnie dodano kilka kropli gliceryny w celu otrzymania łatwej do rozprowadzania na skórze, żelowej konsystencji i dokładnie wymieszano. Do 1,6 g otrzymanego żelu dodano roztwór hybrydy STZ-Fe-EGCG otrzymany przez rozpuszczenie 20 mg substancji w 2 ml DMSO i pozostawiono 24 h (stężenie hybrydy w nośniku 0,5%). Żel chitozanowy umieszczono w strzykawce praktyczny sposób aplikacji, zwłaszcza do zewnętrznego stosowania miejscowego w leczeniu zakażeń miejscowych i ran.

PL 248096 Β1

Ocena struktury metodą FT-IR

Widma FT-IR rejestrowano w zakresie spektralnym 4000 - 600 cm'¹ dla hybryd STZ-Me-EGCG i porównawczo substratów użytych do ich syntez oraz produktów pośrednich syntez z użyciem aparatu Nicolet 6700 z przystawką ATR.

Tab. 1. Pasma drgań zarejestrowane dla STZ, STZ-Na i kompleksów sulfatiazolu z metalami

Pasma	Vas NH2	VsNH2	SO2NH (vN-H)	6NH2	O vC=N	YasSOz	YsSOz	vS-N	ωΝΗ
STZ*	3354	3321	3282	1626	1532	1323	1140	920	732
STZ-Na	3339	3170	-	1616	1445	1307	1124	933	676
STZ- Fe	3317	3274	-	1594	1423	1321	1131	924	677
STZ- Zn	3459	3370	-	1628	1447	1320	1123	934	689
STZ-Bi	3317	3276	-	1594	1495	1321	1130	925	677
STZ-Cu	3462	3378	-	1621	1465	1317	1123	940	688
* wg Bormio Nuncs J. at al..	J. Mol. Struci. 2016, 1112, 14-20.

I etap syntezy - kompleksy sulfatiazol-metal (STZ-Me): pasma drgań rozciągających, asymetrycznych (oas) i symetrycznych (o_s) grupy aminowej NH2 dla nieskoordynowanego liganda-STZ obserwuje się odpowiednio przy 3354 cm'¹ i 3321 cm^-1, podczas gdy w widmie kompleksów z metalami (STZMe) pasma te uległy przesunięciu się w kierunku wyższych częstotliwości dla kompleksów STZ-Zn, STZ-Cu lub w kierunku niższych częstotliwości dla kompleksów STZ-Fe, STZ-Bi (rycina 1 - widma A/A’ i tabela 1), co może być wynikiem tworzenia wiązań wodorowych i/lub efektem konfiguracji cząsteczek w krysztale. Drgania deformacyjne grupy aminowej 5NH² występują przy 1625 cm'¹ dla STZ i przy podobnych częstotliwościach również dla STZ-Me.

Pasma drgań rozciągających grupy sulfonylowej dla STZ i STZ-Me pojawiają się przy ok. 1320 cm^-1 (uas,S=O=S) i przy ok. 1130 cm^-1 (us,S=O=S). We wszystkich kompleksach pasma przypisane grupie -SO2 zostały w nieznacznym stopniu zmienione pod wpływem koordynacji, co sugeruje brak interakcji atomów tlenu ugrupowania sulfonamidowego z jonami metali.

Pasma drgań rozciągających ugrupowania C=N pierścienia tiazol owego przy 1532 cm'¹ dla STZ i znacznie przesunięte w kierunku niższych częstotliwości dla kompleksów STZ-Me wskazują na rozluźnienie wiązania C=N spowodowane najprawdopodobniej koordynowaniem do jonu metalu.

Zaś zauważone różnice pomiędzy drganiami grupy NH2 i SO2 w widmie STZ i STZ-Me mogą być wynikiem interakcji między cząsteczkowych.

Widmo STZ wykazuje również pasmo drgań rozciągających N-H ugrupowania sulfonamidowego SO2-N-H przy ok. 3210 cm'¹. Brak tego pasma w widmach STZ-Me wskazuje na deprotonizację grupy SO2-N-H i koordynację do jonu metalu.

II etap syntezy - kompleksy mieszane sulfatiazol-metal-flawonoid (STZ-Fe-EGCG):

Dla nieskoordynowanego liganda-EGCG (rycina 2 - widmo B) obserwuje się pasma charakterystycznych grup funkcyjnych:

• pasmo drgań rozciągających ugrupowania Ar-OH (grupa hydroksylowa w pierścieniu aromatycznym) z wyraźnym maksimum przy 3350 cm'¹ • pasmo drgań rozciągających grupy karbonylowej C=O przy 1691,3 cm'¹ i pasma drgań rozciągających grupy -O-C(=O) przy 1348,0 cm^-1 i 1222,6 cm^-1 (ugrupowanie estrowe -O-C=O łączące trihydroksybenzoesan z chromanem (benzodihydropiranem) • pasmo drgań rozciągających ugrupowania -C-O-C- przy 1041,4 w układzie chromanu

W widmie C hybrydy STZ-Fe(lll)-EGCG (rycina 2), odnosząc je do widma A’ kompleksu STZFe(lll), pojawia się szerokie pasmo drgań rozciągających grup -OH z maksimum przy ok. 3200 cm'¹, charakterystycznych dla katechiny oraz piki przy ok. 1050 cm'¹, 1200 cm^-1 i 1340 cm^-1 należący do ugrupowań-C-O-C- i -O-C(=O) obecnych również w strukturze katechiny. Odnosząc z kolei widmo C hybrydy STZ-Fe(lll)-EGCG do widma B substratu EGCG obserwuje się zanik wyraźnego pasma drgań

PL 248096 Β1 rozciągających grup fenolowych Ar-OH przy 3350 cm'¹, co może sugerować tworzenie fenolanu żelaza i wiązań koordynacyjnych pomiędzy grupami fenolowymi, a jonem żelaza. Na tworzenie soli kompleksowej w strukturze EGCG wskazują także przesunięcia pasm charakterystycznych ugrupowań w cząsteczce EGCG. Wniosek: Analiza FT-IR hybrydy STZ-Fe(lll)-EGCG potwierdziła obecność w strukturze zarówno STZ jak i EGCG oraz tworzenie połączenia kompleksowego między STZ i Fe oraz pomiędzy EGCG i Fe.

Struktura, spektrum absorpcji UV, spektrum aktywności i trwałość dla wybranego związku hybrydowego STZ-Fe(lll)-EGCG oceniona odpowiednio na podstawie analizy FT-IR, analizy spektroskopii UV, testów mikrobiologicznych, testów antyoksydacyjnych i oceny trwałości.

Struktura hybrydy STZ-Fe(lll)-EGCG oceniona wtoku analizy FT-IR

Wzór sumaryczny: C3iH24FeN3Oi3S2

Masa molowa: 766,5079 g/mol

Skład: C(48,57%) H(3,16%) Fe(7,29%) N(5,48%) 0(27,13%) S(8,37%)

Ocena właściwości przeciwutleniających z użyciem metody DPPH

Właściwości przeciwutleniające badanych związków hybrydowych, substratów i substancji wzorcowych określono na podstawie ich zdolności do wygaszania (inhibicji, redukcji) 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazylu (rodnika DPPH·) według reakcji:

Ar-N-N· -Ar + Ar-OH Ar-N-NH-Ar + Ar-O·

Metanolowy roztwór rodnika wykazuje pasmo absorpcji w zakresie widzialnym, z maksimum przy 515-520 nm (fioletowe zabarwienie). W wyniku przebiegu reakcji z antyoksydantem obserwuje się spadek intensywności zabarwienia, proporcjonalny do zawartości antyoksydanta. W wyniku reakcji powstaje zredukowana forma rodnika DPPH· o zabarwieniu żółtym.

Do serii prób zawierających wzrastające stężenia badanych związków, dodano rodnik DPPH o stężeniu 0,2 mmol/l, pozostawiono w temp. 22°C chroniąc od światła i zmierzono absorbancję przy analitycznej długości fali - 517 nm wobec metanolu jako odnośnika.

Odnosząc absorbancję badanej próby (Abs próby) do absorbancji próby kontrolnej (Abs DPPH) wykreślono krzywe (Fig. 3) i równania regresji opisujące zależności wygaszania rodnika DPPH·, w procentach (% inhibicji, 1%) od stężenia substancji antyutleniającej (C): 1% = aC + b, gdzie 1% = (Abs dpph - Abs próby/ Abs dpph)* 100. Z równania regresji wyznaczono stężenia antyutleniacza (C— (1% — b)/a) powodujące spadek początkowego stężenia rodnika DPPH· o 50% w pg/ml i pmol/1 (μΜ). Im mniejsza wartość ICso, tym bardziej reaktywny antyoksydant.

• dla STZ-Fe(lll)-EGCG

Równanie regresji: 1%= 33,335C (±2,69) ± 4,779 (±3,58), współczynnik korelacji = 0,9683 Wartość IC50· 1,36 pg/ml (1,77 μΜ).

Szereg aktywności antyoksydacyjnej (IC50 w μΜ) hybrydy w odniesieniu do znanych antyoksydantów: STZ-Fe(lll)-EGCG > Troloks > Witamina C (Fig. 4.)

Potencjał antyoksydacyjny STZ-Fe(lll)-EGCG jest większy od troloksu i witaminy C.

Badanie pod kątem potencjalnej aktywności ochrony przeciwsłonecznej UV

Działanie fotoochronne EGCG na skórę zostały potwierdzone w badaniach końcowego produktu utleniania tłuszczy - MDA [Shin S., Wang L.-X., Protective Effect of (-)-Epigallocatechin Gallate against Photo-Damage Induced by Ultraviolet A in Humań Skin Fibroblasts, 2014, Tropical Journal of Pharmaceutical, 13(7), str. 1079-1084],

PL 248096 Β1

Otrzymane związki hybrydowe, szczególnie z udziałem EGCG, mają zwiększony potencjał fotochronny w odniesieniu do EGCG z uwagi na większą zdolność pochłaniania promieniowania UV (Fig. 5) przy jednoczesnej znacznej aktywności antyoksydacyjnej i zwiększonej trwałości (badania powyżej).

Ocena aktywności mikrobiologicznej

Testowane związki wykazywały różny stopień inhibicji wzrostu badanych szczepów bakteryjnych (tabela 2). Większą aktywność odnotowano wobec Gram ujemnych (E. coli) niż Gram dodatnich (S. aureus) bakterii. Najsilniejszą aktywnością wyróżniały się kompleksy z żelazem i miedzią.

Tab. 2. Strefy zahamowania wzrostu bakterii [mm] dla testowanych związków

Testowane kompleksy -	G(+) Straphylococus aureus	G(-) Eschericha coli
STZ-Na	0	8
Kompleks z Fe	14	20
Kompleks z Zn	9	11
Kompleks z Bi	8	10
Kompleks z Cu	12	16

Testy mikrobiologiczne potwierdziły zintensyfikowaną aktywność przeciwbakteryjną i rozszerzenie spektrum działania kompleksów w odniesieniu do nieskoordynowanej cząsteczki sulfatiazolu (wzorca).

Ocena trwałości

Roztwór EGCG w etanolu i hybrydy STZ-Fe(lll)-EGCG w DMSO o stężeniach 0,001% poddano analizie spektrofotometrycznej w zakresie długości fali 230-400 nm rejestrując absorbancję przy długości fali 276 nm w dniu przygotowania i następnie w różnych odstępach czasowych przez miesiąc, przechowując w świetle dziennym i w temperaturze pokojowej. Roztwór EGCG charakteryzował się znaczną nietrwałością - zmiana zabarwienie na różowo (już w trzecim dniu badania) pogłębiająca się w czasie i zmiana spektrum absorpcji - wzrost pasma absorpcji w zakresie 250-320 nm. Natomiast roztwór STZFe(lll)-EGCG charakteryzował się znacznie większą trwałością - zabarwienie i spektrum absorpcji bez istotnych zmian (Fig. 6).

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Hybrydowe związki przeciwbakteryjne na bazie sulfonamidu z przyłączonymi jonami metalu, znamienne tym, że zawierają jako sulfonamid sulfatiazol, zaś jako flawonoid zawierają galusan epigallokatechiny lub kwercetynę połączone wiązaniem kowalencyjnym z jonami metalu, przy czym stosunek molowy sulfonamid : flawonoid : jon metalu wynosi 1:1:1.
2. 2. Hybrydowe związki według zastrz. 1, znamienne tym, że jon metalu stanowi jon żelaza(lll), żelaza(ll), bizmutu(lll), cynku(ll) lub miedzi(ll).
3. 3. Sposób otrzymywania hybrydowych związków przeciwbakteryjnych na bazie sulfonamidu z przyłączonym jonem metalu, znamienne tym, że do wodnego roztworu soli sulfonamidu w postaci sulfatiazolu dodaje się wodny lub kwasowy roztwór soli metalu, i całość miesza do momentu wytrącenia osadu, po czym kolejno dodaje się alkoholowy roztwór flawonoidu, który stanowi roztwór galusanu epigallokatechiny lub kwercetyny, całość miesza się do momentu wytrącenia osadu, następnie pozostawia na czas od 10 do 12 godzin w temperaturze pokojowej, przy czym składniki: sulfonamid, flawonoid, jon metalu użyte w roztworach stosuje się w stosunku molowym 1:1:1, a otrzymany osad przesącza siei przemywa co najmniej 5-krotnie wodą, lub w przypadku środowiska kwasowego reakcji najpierw wodnym roztworem wodorowęglanu sodu, a następnie co najmniej 5-krotnie wodą, po czym osad suszy się w temperaturze pokojowej.

   PL 248096 Β1
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że korzystnie stosuje się sól metalu w 5% roztworze kwasu solnego, w przypadku soli metalu nierozpuszczalnej w wodzie.
5. 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jon metalu stanowi jon żelaza(lll), żelaza(ll), bizmutu(lII), cynku(ll) lub miedzi(ll).
6. 6. Hybrydowe związki przeciwbakteryjne opisane w zastrzeżeniu 1 do zastosowania w leczeniu zakażeń miejscowych i ran, szczególnie zmian trądzikowych i stanów zapalnych przyzębia.