PL249024B1

PL249024B1 - 4-Chloro-2’-hydroksy-3-O-β-D-(4’’-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkon i sposób wytwarzania 4-chloro-2’-hydroksy-3-O-β-D-(4’’-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkonu

Info

Publication number: PL249024B1
Application number: PL443912A
Authority: PL
Inventors: Agnieszka Krawczyk-Łebek; Edyta Kostrzewa-Susłow; Monika Dymarska; Tomasz Janeczko
Original assignee: Wrocław University Of Environmental And Life Sciences
Priority date: 2023-02-28
Filing date: 2023-02-28
Publication date: 2026-02-23
Also published as: PL443912A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest 4-chloro-2'-hydroksy-3-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkon o wzorze 2 oraz sposób wytwarzania 4-chloro-2'-hydroksy-3-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkonu, charakteryzujący się tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCH J1.5, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 4-chloro-2'-hydroksychalkon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie, przy czym 4-chloro-2'-hydroksy-3-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkon o wzorze 2 znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w trzecim paśmie od linii startu.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest 4-chloro-2’-hydroksy-3-O-/>-D-(4^::-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkon o wzorze 2 przedstawionym na rysunku.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania 4-chloro-2’-hydroksy-3-O-/>-D-(4^::-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkonu.

4-Chloro-2’-hydroksy- O-/>-D-(4^::-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkon może znaleźć zastosowanie jako związek przeciwdrobnoustrojowy, analeptyk oddechowy, przeciwdziałający hipercholesterolemii w preparatach farmaceutycznych i kosmetycznych oraz produktach spożywczych.

Neutrofile w trakcie procesu zapalnego produkują kwas chlorowy(l) w odpowiedzi immunologicznej na czynniki uznane za patogenne. Jego nadprodukcja może wywoływać oksydację/chlorowanie tkanek w miejscu zapalenia i je uszkadzać. Badania in vitro wykazały, że flawonoidy unieszkodliwiają kwas chlorowy(l) same ulegając mono- i dichlorowaniu. Niektóre powstające w ten sposób chlorowane flawonoidy zachowują, a nawet wzmacniają swój potencjał przeciwutleniający. Zsyntezowane chlorowane flawonoidy takie jak: 8-chloro-3',4’,5,7-tetrahydroksyflawon, 6,8-dichloro-3’,4’,5,7-tetrahydroksyflawon, 3-chloro-3',4’,5,7-tetrahydroksyflawon, 3,8-dichloro-3',4’,5,7-tetrahydroksyflawon, a także chlorowane naturalne flawonoidy: luteolina, rutyna i kwercetyna (po chlorowaniu kwasem chlorowym(l)) są bardziej efektywne w regulacji żywotności neutrofili i uwalniania przez nie reaktywnych form tlenu, niż ich niechlorowane odpowiedniki (Krych-Madej, J.; Stawowska, K.; Gebicka, L. Oxidation of flavonoids by hypochlorous acid: reaction kinetics and antioxidant studies. Free Radical Research, 2016, 50(8), 898908; Freitas, M.; Ribeiro, D.; Tome, S.M.; Silva, A.M.S.; Fernandes, E. Synthesis of chlorinated flavonoids with anti-inflammatory and proapoptotic acitivities in human neutrophils. European Journal of Medicinal Chemistry, 2014, 86, 153-164).

Chloroflawonina to naturalny chlorowany związek flawonoidowy izolowany z endofitycznych grzybów strzępkowych z gatunku Mucor irregularis wykazuje silną aktywność bakteriostatyczną in vitro przeciwko prątkom gruźlicy. Nie powoduje przy tym efektu cytotoksycznego w stężeniu do 100 μΜ na ludzkich liniach komórkowych: MRC-5 (linia komórek fibroblastów pochodząca z tkanki płuc męskiego zarodka ludzkiego) i THP-1 (linia komórek monocytarno-makrofagowych pochodzących od człowieka chorego na ostrą białaczkę monocytową) (Rehberg, N.; Akone, H.S.; loerger, T.R.; Erlenkamp, G.; Daletos, G.; Gohlke, H.; Proksch, P.; Kalscheuer, R. Chloroflavonin targets acetohydroxyacid synthase catalytic subunit IIvB1 for synergistic killing of Mycobacterium tuberculosis. ACS Infectious Diseases. 2017, 4(2), 123-134).

Dihydrochalkony wykazują słodki smak i mogą znaleźć zastosowanie jako prozdrowotne słodziki (Janeczko T., Gładkowski W., Kostrzewa-Susłow E. Microbial transformations of chalcones to produce food sweetener derivatives. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2013, 98, 55-61; Łużny M., Kozłowska E., Kostrzewa-Susłow E., Janeczko T. Highly efective, regiospecific hydrogenation of methoxychalcone by Yarrowia lipolytica enables production of food sweeteners. Catalysts 2020, 10, 1135). Najlepiej poznany i zbadany dihydrochalkon pozyskiwany ze skórek owoców cytrusowych - dihydrochalkon neohesperydyny (E-959) został dopuszczony do stosowania jako słodzik i substancja wzmacniająca smak, a jego zastosowanie reguluje Rozporządzenie Komisji Europejskiej nr 1129/2011 z 11 listopada 2011 r.

Większość flawonoidów, poza katechinami, jest obecna w roślinach w połączeniu z cukrami, jako ^-glikozydy. Glikozylacja skutkuje wzrostem rozpuszczalności w wodzie i stabilności cząsteczki flawonoidu oraz przyswajalności przyjmowanych z pokarmem związków flawonoidowych. Zasadniczo glukozydy są jedynymi glikozydami, które mogą być absorbowane w jelicie cienkim. Natomiast fl awonoidy niezaabsorbowane w jelicie cienkim oraz zaabsorbowane flawonoidy wydzielone z żółcią ulegają degradacji wraz z rozerwaniem struktury pierścieniowej przez mikroorganizmy (Hollman, P. C. Absorption, bioavailability, and metabolism of flavonoids. Pharmaceutical Biology, 2004, 42, 74-83, Plaza, M.; Pozzo, T.; Liu, J.; Gulshan Ara, K. Z.; Turner, C.; Nordberg Karlsson, E. Substituent effects on in vitro antioxidizing properties, stability, and solubility in flavonoids. Journal of Agricultural Food Chemistry, 2014, 62, 3321-3333).

Znany jest szczep Beauveria bassiana KCH J1.5 ujawniony w literaturze (Kozłowska E., Urbaniak M., Hoc N., Grzeszczuk J., Dymarska M., Stępień Ł., Pląskowska E., Kostrzewa-Susłow E., Janeczko T. Cascade biotransformation of dehydroepiandrosterone (DHEA) by Beauveria species. Scientific Reports, 2018, 8:13449).

PL 249024 Β1

W ostatnich latach, w leczeniu różnych chorób i ich zapobieganiu, coraz większe znaczenie zyskują związki pochodzenia naturalnego oraz ich odpowiedniki uznawane za naturalne, które uzyskano na drodze przekształceń mikrobiologicznych. Dlatego istotne jest opracowywanie nowych metod wytwarzania związków aktywnych biologicznie na drodze biotransformacji, użytecznych dla przemysłu farmaceutycznego, kosmetycznego i spożywczego.

W dostępnej literaturze brak jest informacji na temat otrzymywania 4-chloro-2’-hydroksy-3-O-/?-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkonu.

Istotą wynalazku jest 4-chloro-2’-hydroksy-3-O-/?-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkon.

Istotą wynalazku jest również sposób, który polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCH J1.5. Po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 4-chloro-2’-hydroksychalkon, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, przez co najmniej 96 godzin. Następnie produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą oraz oczyszcza chromatograficznie. 4-Chloro-2’-hydroksy-3-O-/?-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkon znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w trzecim paśmie od linii startu.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg:1 cm³.

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 8 dni.

Korzystnie również jest, gdy oczyszczanie prowadzi się wykorzystując cienkowarstwową chromatografię preparatywną w układzie eluującym z chloroformem i metanolem w stosunku objętościowym 9:1.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Beauveria bassiana KCH J1.5, następuje hydroksylacja i przyłączenie 4-metoksy-/?-D-glukozy przy C-3 oraz redukcja wiązania podwójnego. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 4-chloro-2’-hydroksy-3 O-/?-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkonu w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu oraz wykorzystując mikroorganizm niebędący patogenem ludzkim.

Wykorzystanie biotransformacji, zamiast syntezy chemicznej, umożliwia, w sposób przyjazny dla środowiska, uzyskanie związków o większej biodostępności i aktywności biologicznej, niż użyte substraty. Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

Przykład. Do kolby stożkowej o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 10 g aminobaku i 30 g sacharozy, wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCH J1.5. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje się 50 mg 4-chloro-2’-hydroksychalkon o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm³ dimetylosulfotlenku. Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 8 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się dwukrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie z zastosowaniem jako eluentu mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku objętościowym 9:1. Produkt znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w trzecim paśmie od linii startu.

Na tej drodze otrzymuje się 8,5 mg 4-chloro-2’-hydroksy-3-O-/?-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)dihydrochalkonu (wydajność 9,7%). Stopień konwersji substratu według HPLC >99%.

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi.

Opis sygnałów pochodzących z widma ¹H NMR (601 MHz, Aceton-de)

Sygnały pochodzące od protonów szkieletu flawonoidowego	Sygnały pochodzące od protonów jednostki cukrowej
δ [ppm]	J [Hz]	H	δ [ppm]	J [Hz]	H
3,47 (m)		a	5,05 (d)	7,6	1”
3,02 (t)	7,6	β	3,52 (m)		2”

PL 249024 Β1

Sygnały pochodzące od protonów szkieletu flawonoidowego	Sygnały pochodzące od protonów jednostki cukrowej
δ [ppm]	J[Hz]	H	δ [ppm]	J[Hz]	H
7,26 (d)	1,8	2	3,61 (m)		3”
7,30 (d)	8,1	5	3,20 (dd)	9,8; 8,9	4”
6,96 (m)		6	3,47 (m)		5”
6,96 (m)		3’	3,82 (m) 3,67 (m)		6”
7,53 (m)		4’	3,55 (s)		4”-OCH3
6,96 (m)		5’	4,61 (d)	4,3	2-OH
8,00 (dd)	8,4; 1,6	6’	4,46 (d)	4,1	3-OH
12,24 (s)		2’-OH	3,82 (m)		6”- OH

Symulacje komputerowe przy użyciu platformy SwissADME, służącej do oceny farmakokinetyki i przydatności małych cząsteczek jako leków, wykazały większą rozpuszczalność w wodzie 4-chloro-2’-hydroksy-3-O-/?-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkonu w stosunku do substratu biotransformacji - 4-chloro-2’-hydroksychalkonu. Ponadto związek ten może być aktywnie transportowany w organizmie przez glikoproteinę P w przeciwieństwie do swojego aglikonu i w wysokim stopniu absorbowany w układzie pokarmowym człowieka.

Symulacje przeprowadzone z użyciem programu Way2Drug PASS online służącego do przewidywania m.in. biologicznej aktywności, efektów farmakologicznych i mechanizmu działania związków chemicznych na podstawie ich struktury wykazały, że 4-chloro-2’-hydroksy-3-O-/?-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkon z 93% prawdopodobieństwem będzie wykazywał działanie przeciwbakteryjne, na przykład jako inhibitor glicerofosfotransferazy CDP-glicerolu odpowiedzialnej za polimeryzację łańcuchów kwasów tejchojowych. Enzym ten odgrywa kluczową rolę w nadawaniu kształtu komórce bakteryjnej, integracji jej otoczki, tworzeniu biofilmu bakteryjnego, a w konsekwencji patogenezie bakterii gram-dodatnich (Brown S., Meredith T., Swoboda J., Walker S. Staphylococcus aureus and Bacillus subtills W23 make polyribitol wali teichoic acids using different enzymatic pathways. Chemistry & biology 2010, 77(10), 1101-1110).

4-Chloro-2’-hydroksy-3-O-/?-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkon ma również potencjał do zastosowania jako antagonista receptorów anafilatoksyn (prawdopodobieństwo 85%), ograniczając ich nadaktywność. Anafilatoksyny odgrywają istotną rolę w trakcie odpowiedzi na infekcje bakteryjne i procesach zapalnych, ale także w sepsie, uszkodzeniach niedokrwienno-reperfuzyjnych, złożonych chorobach immunologicznych i astmie (Haas P.J., van Strijp J. Anaphylatoxins. Immunologie Research 2007, 37, 161-175).

Przeprowadzone symulacje wykazały również, że może działać jako antagonista cholesterolu w leczeniu hipercholesterolemii (prawdopodobieństwo 79%) oraz jako analeptyk pobudzający główny ośrodek oddechowy (prawdopodobieństwo 74%). Ze względu na liczne przypadki przedawkowania stosowanych leków powodujących depresję oddechową, takich jak opioidy czy benzodiazepiny obserwowany jest wzrost zainteresowania poszukiwaniem nowych stymulantów układu oddechowego (Peppin J.F., Pergolizzi Jr J.V., Fudin J., Meyer T.A., Raffa R.B. History of respiratory stimulants. Journal of Pain Research 2021, 14, 1043-1049).

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. 4-Chloro-2’-hydroksy-3-O-β-Ό-(4-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkon o wzorze 2.
2. Sposób wytwarzania 4-chloro-2’-hydroksy-3-O-β-ϋ-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-dihydro- chalkonu, znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCH J1.5, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 4-chloro-2’-hydroksychalkon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie, przy czym 4-chloro-2’-hydroksy-3-O-/>-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkon o wzorze 2 znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w trzecim paśmie od linii startu.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg : 1 cm³.
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że transformację prowadzi się przez 8 dni.
6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że oczyszczanie prowadzi się wykorzystując cienkowarstwową chromatografię preparatywną w układzie eluującym chloroform : metanol w stosunku objętościowym 9:1.