PL249159B1 - Sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 oraz sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w wersji POC - Google Patents
Sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 oraz sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w wersji POCInfo
- Publication number
- PL249159B1 PL249159B1 PL446009A PL44600923A PL249159B1 PL 249159 B1 PL249159 B1 PL 249159B1 PL 446009 A PL446009 A PL 446009A PL 44600923 A PL44600923 A PL 44600923A PL 249159 B1 PL249159 B1 PL 249159B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- seq
- sars
- cov
- reaction
- primer
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
- C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Niniejsze zgłoszenie dotyczy sposobu wykrywania w warunkach nie-laboratoryjnych materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego, sposobu diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 z wykorzystaniem takiego sposobu wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 oraz zestawu do wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 lub diagnozowania zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego w warunkach nie-laboratoryjnych.
Description
Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy dziedziny medycyny, a w szczególności diagnostyki in vitro, zwłaszcza identyfikacji zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w środowisku nie-laboratoryjnym, tj. przy łóżku pacjenta. Dokładniej, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wykrywania w warunkach nie-laboratoryjnych, tj. przy łóżku pacjenta (ang. point of care, POC) materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego oraz sposobu diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 z wykorzystaniem takiego sposobu wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2. Opisano tu także zestaw do wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 lub diagnozowania zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego w warunkach nie-laboratoryjnych, tj. przy łóżku pacjenta, sposobami według wynalazku.
Obecnie na rynku istnieje wiele sposobów i zestawów diagnostycznych ukierunkowanych na nowego koronawirusa SARS-CoV-2, działających w oparciu o techniki genetyczne, immunologiczne czy białkowe (antygenowe). Testy serologiczne nie są testami diagnostycznymi, a jedynie świadczą o przebytym kontakcie z wirusem. Testy antygenowe cechują się niską czułością i mogą posłużyć jako metoda przesiewowa, niemniej jednak wymagająca potwierdzenia testem molekularnym. Jedynym wiarygodnym i rekomendowanym przez WHO oraz CDC testem stwierdzającym zakażenie SARS-CoV-2 w sposób ostateczny jest test molekularny polegający na detekcji fragmentów materiału genetycznego wirusa przy użyciu technologii NAAT (Nucleic acid amplification tests). Obecnie na rynku diagnostycznym funkcjonuje wiele testów opartych na technice jakościowej PCR w czasie rzeczywistym (ang. qualitative Real-Time PCR), działających w formule komercyjnych, certyfikowanych (CE) zestawów do diagnostyki in vitro (IVDR). Pomimo wysokiej czułości i specyficzności rutynowych testów RT-PCR, cechuje je szereg ograniczeń, a mianowicie:
• wieloetapowość całego procesu diagnostycznego stwarza duże ryzyko kontaminacji krzyżowych;
• czasochłonność - konieczne jest min. od 2 do 8 godzin;
• pracochłonność;
• konieczność posiadania kilku odseparowanych pomieszczeń laboratoryjnych w celu uniknięcia kontaminacji materiału genetycznego;
• konieczność stosowania wielu procedur zabezpieczających w celu uniknięcia wyników fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych;
• duże wymagania dotyczące przeszkolonego i doświadczonego personelu laboratoryjnego;
• wysoki koszt;
• zakup wysokospecjalistycznej, drogiej aparatury pomiarowej;
• brak możliwości wykonania testu poza profesjonalnym laboratorium, tj. w warunkach nie-laboratoryjnych, czyli przy łóżku pacjenta.
Innymi metodami analiz molekularnych, obok techniki PCR, coraz częściej wykorzystywanymi do detekcji patogenów u ludzi są: izotermalna amplifikacja materiału genetycznego, zwana LAMP (ang. Loop-Mediated Isothermal Amplification) oraz technika RPA (ang. Recombinase Polymerase Amplification). Z dokumentu Huang X et al. Developing RT-LAMP assays for rapid diagnosis of SARSCoV-2 in saliva. EBioMedicine. 2022; 75: 103736 znany jest sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego (w ślinie) z zastosowaniem reakcji RT-LAMP, w którym wykorzystuje się multipleksowy zestaw sześciu staterów LAMP swoistych dla genu N i genu M tego wirusa, (par. „Multiplexed RTLAMP to further improve assay sensitivity” s. 9-13). Pomimo, iż technologie te cechują się krótszym czasem przebiegu i wysoką czułością, to nie znoszą one głównych ograniczeń diagnostycznych, takich jak konieczność ekstrakcji RNA z próby biologicznej (co wiąże się z np. z ryzykiem kontaminacji krzyżowej, koniecznością dysponowania odpowiednimi warunkami pomieszczeń i koniecznością stosowania wielu procedur zabezpieczających w celu uniknięcia wyników fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych), jak również konieczność dysponowania przeszkolonym i doświadczonym personelem laboratoryjnym.
W związku z powyższym istnieje w dziedzinie realna potrzeba opracowania nowych, szybkich, bardzo czułych, specyficznych i stosunkowo prostych w użyciu narzędzi do wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego w warunkach nie-laboratoryjnych, jak również do wspomagania całego procesu diagnostycznego zakażenia wirusem SARS-CoV-2.
Celem wynalazku było zatem opracowanie sposobu wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego w warunkach nie-laboratoryjnych, tj. przy łóżku pacjenta (POC) oraz sposobu diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2, pozwalających na szybką, prostą, bardzo czułą i specyficzną diagnostykę zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w warunkach nie-laboratoryjnych.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego w warunkach nie-laboratoryjnych (przyłóżkowych), obejmujący następujące etapy, w których:
a) próbkę materiału biologicznego pobranego od osobnika badanego poddaje się lizie z uwolnieniem oraz stabilizacją RNA;
b) lizat otrzymany w etapie a) poddaje się reakcji odwrotnej transkrypcji (RT) z zastosowaniem mieszaniny do reakcji RT zawierającej trzy zestawy starterów do reakcji RT i izotermicznej amplifikacji za pośrednictwem pętli (Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP) swoistych do każdego z genów N i M wirusa SARS-CoV-2, przy czym każdy pierwszy zestaw starterów zawiera starter przedni zewnętrzny (F3) i starter przedni wewnętrzny (FIP), drugi zestaw starterów zawiera starter tylny zewnętrzny (B3) i starter tylny wewnętrzny (BIP), zaś trzeci zestaw starterów zawiera starter przedni zapętlający (FL) i starter tylny zapętlający (BL);
c) produkt otrzymany w etapie b) przenosi się do mieszaniny odczynników do reakcji LAMP zawierającą barwnik kolorymetryczny; przeprowadza się reakcję LAMP, a następnie detekcję kalorymetryczną produktu reakcji amplifikacji kwasu nukleinowego genów N i M wirusa SARS-CoV-2, przy czym wynik pozytywny oznacza wykrycie materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2, przy czym w etapie b) stosuje się następujące trzy zestawy starterów do genu N wirusa SARS-CoV-2: pierwszy zestaw starterów:
N-F3: CCCTCAGATTCAACTGGCAGTA (NR ID. SEKW.: 1)
N-FIP: GAGAGCGGTGAACGGGCGCGATCAAAACAACG (NR ID. SEKW.: 2) drugi zestaw starterów:
N-B3: TTCATTTTACCGTCACCACCAC (NR ID. SEKW.: 3)
N-BIP: TCGAGGACAAGGCTTCGGTAGTAGCCAATTTGGTC (NR ID. SEKW.: 4) trzeci zestaw starterów:
N-FL: GACGCAGTATTATTGGGTAAACCT (NR ID. SEKW.: 5)
N-BL: CCAATTAACACCAATAGCAGTCCA (NR ID. SEKW.: 6), oraz w etapie b) stosuje się następujące trzy zestawy starterów do genu M wirusa SARS-CoV-2: pierwszy zestaw starterów:
M-F3: GGCCAGTAACTTTAGCTTGTTTTG (NR ID. SEKW.: 7)
M-FIP: AAACAGTCTGAAAGAACGCAATGGCTTGTCTTGTAGG (NR ID. SEKW.: 8) drugi zestaw starterów:
M-B3: GTCCAGCAATACGAAGATGTCC (NR ID. SEKW.: 9)
M-BIP: TTCTCAACGTGCCCAGCTCCGATTACGAGTTCACT (NR ID. SEKW.: 10) trzeci zestaw starterów:
M-FL: TGAAGTAGCTGAGCCACATCAA (NR ID. SEKW.: 11)
M-BL: TATTCTGACCAGACCGCTTCTA (NR ID. SEKW.: 12), i przy czym reakcje RT i LAMP przeprowadza się sekwencyjnie w jednym naczyniu reakcyjnym, które zawiera wkład stanowiący pierwszą komorę reakcyjną do przeprowadzenia reakcji RT, który to wkład tworzy w naczyniu reakcyjnym pierwszą i drugą komorę reakcyjną, ma formę podłużnego walca zwężającego się ku dołowi (lejka) o pojemności w zakresie od 0,05 μl do 5 μl i posiada przy ścianie bocznej otwór wylotowy służący do przenoszenia produktu reakcji RT do drugiej komory reakcyjnej naczynia reakcyjnego do przeprowadzenia reakcji LAMP i detekcji fluorymetrycznej produktu reakcji, przy czym naczynie to zawiera także wieczko o właściwościach optycznych pozwalających na bezpośredni pomiar fluorymetryczny w naczyniu reakcyjnym, i przy czym dodatkowo stosuje się gen referencyjny jako kontrolę wewnętrzną, przy czym do kontroli wewnętrznej stosuje się trzy zestawy starterów do reakcji RT-LAMP swoistych dla genu referencyjnego, korzystnie ACTB, przy czym pierwszy zestaw starterów zawiera starter przedni zewnętrzny (F3) i starter przedni wewnętrzny (FIP), drugi zestaw starterów zawiera starter tylny zewnętrzny (B3) i starter tylny wewnętrzny (BIP), zaś trzeci zestaw starterów zawiera starter przedni zapętlający (FL) i starter tylny zapętlający (BL), i przy czym pierwszy zestaw starterów to:
ACTB-F3: AGTACCCCATCGAGCACG (NR ID. SEKW.: 13)
ACTB-FIP: GAGCCACACGCAGCTCATTGTATCACCAACTGGGACGACA (NRID. SEKW.: 14) drugi zestaw starterów to:
ACTB-B3: AGCCTGGATAGCAACGTACA (NR ID. SEKW.: 15)
ACTB-BIP: CTGAACCCCAAGGCCAACCGGCTGGGGTGTTGAAGGTC (NR ID. SEKW.: 16), zaś trzeci zestaw starterów to:
ACTB-LF: TGTGGTGCCAGATTTTCTCCA (NR ID. SEKW.: 17)
ACTB-LB: CGAGAAGATGACCCAGATCATGT (NR ID. SEKW.: 18).
Korzystnie w takim sposobie według wynalazku stosuje się ponadto próbkę negatywną i pozytywną SARS-CoV-2 jako odpowiednio kontrolę negatywną i pozytywną.
Korzystnie w takim sposobie według wynalazku jako próbkę materiału biologicznego stosuje się wymaz z nosa, gardła lub noso-gardła.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest ponadto sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2, w którym
a) w próbce materiału biologicznego pobranego od osobnika badanego, korzystnie wymazu z nosa, gardła lub noso-gardła, wykrywa się obecność materiału genetycznego wirusa SARS- CoV-2 sposobem jak zdefiniowano w dowolnym z zastrzeżeń 1 do 3;
b) diagnozuje się zakażenie wirusem SARS-CoV-2 w przypadku wykrycia obecności w próbce materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2.
Opisano tu także zestaw testowy do wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 lub diagnozowania zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego od osobnika badanego, sposobami według wynalazku, zawierający trzy zestawy starterów do reakcji RT i LAMP swoistych dla każdego z genów N i M wirusa SARS-CoV-2, przy czym każdy pierwszy zestaw starterów zawiera starter przedni zewnętrzny (F3) i starter przedni wewnętrzny (FIP), drugi zestaw starterów zawiera starter tylny zewnętrzny (B3) i starter tylny wewnętrzny (BIP), zaś trzeci zestaw starterów zawiera starter przedni zapętlający (FL) i starter tylny zapętlający (BL). Taki zestaw zawiera następujące trzy zestawy starterów do genu N wirusa SARS-CoV-2 raz trzy zestawy starterów do genu M wirusa SARS- CoV-2:
pierwszy zestaw starterów:
N-F3: CCCTCAGATTCAACTGGCAGTA (NR ID. SEKW.: 1)
N-FIP: GAGAGCGGTGAACGGGCGCGATCAAAACAACG (NR ID. SEKW.: 2) drugi zestaw starterów:
N-B3: TTCATTTTACCGTCACCACCAC (NR ID. SEKW.: 3)
N-BIP: TCGAGGACAAGGCTTCGGTAGTAGCCAATTTGGTC (NR ID. SEKW.: 4) trzeci zestaw starterów:
N-FL: GACGCAGTATTATTGGGTAAACCT (NR ID. SEKW.: 5)
N-BL: CCAATTAACACCAATAGCAGTCCA (NR ID. SEKW.: 6) oraz następujące trzy zestawy starterów do genu M wirusa SARS-CoV-2: pierwszy zestaw starterów:
M-F3: GGCCAGTAACTTTAGCTTGTTTTG (NR ID. SEKW.: 7)
M-FIP: AAACAGTCTGAAAGAACGCAATGGCTTGTCTTGTAGG (NR ID. SEKW.: 8) drugi zestaw starterów:
M-B3: GTCCAGCAATACGAAGATGTCC (NR ID. SEKW.: 9)
M-BIP: TTCTCAACGTGCCCAGCTCCGATTACGAGTTCACT (NR ID. SEKW.: 10) trzeci zestaw starterów:
M-FL: TGAAGTAGCTGAGCCACATCAA (NR ID. SEKW.: 11)
M-BL: TATTCTGACCAGACCGCTTCTA (NR ID. SEKW.: 12).
Taki zestaw zawiera dodatkowo kontrolę pozytywną i kontrolę negatywną SARS-CoV-2 oraz kontrolę wewnętrzną. Do kontroli wewnętrznej zestaw taki zawiera trzy zestawy starterów do reakcji RT LAMP swoistych dla genu referencyjnego, korzystnie ACTB, przy czym pierwszy zestaw starterów zawiera starter przedni zewnętrzny (F3) i starter przedni wewnętrzny (FIP), drugi zestaw starterów zawiera starter tylny zewnętrzny (B3) i starter tylny wewnętrzny (BIP), zaś trzeci zestaw starterów zawiera starter przedni zapętlający (FL) i starter tylny zapętlający (BL), przy czym są to w szczególności następujące trzy zestawy starterów do genu referencyjnego ACTB:
pierwszy zestaw starterów:
ACTB-F3: AGTACCCCATCGAGCACG (NR ID. SEKW.: 13)
ACTB-FIP: GAGCCACACGCAGCTCATTGTATCACCAACTGGGACGACA (NR ID. SEKW.: 14) drugi zestaw starterów:
ACTB-B3: AGCCTGGATAGCAACGTACA (NR ID. SEKW.: 15)
ACTB-BIP: CTGAACCCCAAGGCCAACCGGCTGGGGTGTTGAAGGTC (NR ID. SEKW.: 16) trzeci zestaw starterów:
ACTB-LF: TGTGGTGCCAGATTTTCTCCA (NR ID. SEKW.: 17)
ACTB-LB: CGAGAAGATGACCCAGATCATGT (NR ID. SEKW.: 18).
Nieoczekiwanie w obecnym wynalazku udało się rozwiązać istniejące do tej pory problemy diagnostyczne wynikające z przedstawionego stanu techniki. Sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego w warunkach nie-laboratoryjnych, tj. przy łóżku pacjenta (POC) (inaczej w warunkach „przyłóżkowych”) oraz sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 (Test SARS-Hyb-45 w wersji przyłóżkowej, v. POC). To innowacyjne rozwiązania diagnostyczne, służące do jednoznacznej identyfikacji specyficznych fragmentów genomu wirusa SARS-CoV-2 w próbkach materiału biologicznego, takich jak wymaz z nosa, gardła lub noso-gardła, które pozwalają na szybką, bardzo czułą, specyficzną i prostą diagnostykę SARS-CoV-2 w warunkach nie-laboratoryjnych. Sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego w warunkach nie-laboratoryjnych oraz sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w warunkach nie-laboratoryjnych oparte są na integracji dwóch, zachodzących niezależnie i sekwencyjnie, technik molekularnych: reakcji odwrotnej transkrypcji (RT, ang. reverse transcription) oraz izotermalnej amplifikacji materiału genetycznego (LAMP, ang. Loop-Mediated Isothermal Amplification). Połączenie metod RT i LAMP pozwala na uzyskanie wyniku badania bardzo szybko, np. ok. 45 minut, i nie wymaga ani specjalnych warunków lokalowych, ani specjalistycznego sprzętu. Obie reakcje, tj. RT i LAMP, nie zachodzą jednocześnie, ale w dwóch odrębnych etapach, jedna po drugiej (czyli sekwencyjnie), co zwiększa wydajność całego procesu amplifikacji, i co ma swoje bezpośrednie przełożenie na wyższą czułość całego sposobu wykrywania.
Zgodnie z wynalazkiem te dwie niezależne reakcje molekularne przeprowadzane są korzystnie w dwóch niezależnych komorach reakcyjnych w jednym naczyniu reakcyjnym, w sposób sekwencyjny, tzn. po zajściu pierwszej reakcji - RT - w pierwszej komorze reakcyjnej, produkt pierwszej reakcji wprowadzany jest, np. z zastosowaniem siły odśrodkowej wirowania, do drugiej komory reakcyjnej, gdzie przeprowadzana jest druga reakcja - LAMP. Pierwsza komora reakcyjna jest korzystnie utworzona przez wkład do naczynia reakcyjnego, który to wkład ma formę podłużnego walca zwężającego się ku dołowi (lejka) o pojemności w zakresie od 0,05 μl do 5 μl i posiada przy ścianie bocznej otwór wylotowy, poprzez który produkt pierwszej reakcji otrzymany w etapie b) sposobu według wynalazku może być przenoszony poprzez działanie siły odśrodkowej (wirowanie) do drugiej komory reakcyjnej, w której zachodzi etap c) sposobu według wynalazku. Wkład ten pełni zatem funkcję jednocześnie separatora tworzącego pierwszą i drugą komorę reakcyjną w naczyniu reakcyjnym (rozdziela powierzchnię roboczą wnętrza pierwszej komory reakcyjnej od powierzchni roboczej wnętrza drugiej komory reakcyjnej), jak i lejka pozwalającego na przejście (przepływ) produktu reakcji zachodzącej w pierwszej komorze reakcyjnej do drugiej komory reakcyjnej, w której zachodzi druga reakcja i bezpośrednio po zakończeniu reakcji przeprowadzana jest detekcja kolorymetryczna (obserwowana zmiana zabarwienia), przy czym zmiana zabarwienia oznacza wyniki pozytywny na obecność wirusa SARS-CoV-2 w badanej próbce. Zatem, w końcowym etapie c), po zakończeniu reakcji LAMP, tj. w drugiej mieszaninie reakcyjnej, przeprowadza się bezpośrednio odczyt kalorymetryczny wskazujący, poprzez zmianę barwy mieszaniny reakcyjnej, na status amplifikacji materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2, przy czym odczyt pozytywny (występuje zmiana barwy) wskazuje na obecność materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w badanej próbce materiału biologicznego, co pozwala na zdiagnozowania zakażenia wirusem SARS- CoV-2. Dzięki połączeniu tych technik niniejszy wynalazek pozwala na uproszczenie i radyklane skrócenie całego procesu diagnostycznego poprzez bezpośrednie wykorzystanie materiału biologicznego (z pominięciem izolacji RNA) przy jednoczesnym wysokim poziomie wykrywalności wirusa, wysokiej czułości, swoistości i dokładności, i pozwala na realizację w przy łóżku pacjenta. Opisane tu laboratoryjne naczynia reakcyjne z wkładem tworzącym niezależne komory reakcyjne do przeprowadzenia dwóch reakcji molekularnych w jednej probówce („two-stage in one tube”), w których korzystnie przeprowadza się sposoby według wynalazku, są przedmiotem odrębnego zgłoszenia wynalazku.
Zalety rozwiązań według wynalazku dotyczą zarówno prostoty wykonania jak i skrócenia czasu badania od pobrania materiału do uzyskania jednoznacznego wyniku (zmniejszenie etapowości badania w kierunku wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2), poprzez bezpośrednie wykorzy stanie materiału biologicznego (z pominięciem izolacji RNA) oraz osiągnięcie wysokiego poziomu wykrywalności wirusa (niższa liczba kopii wykrywanego fragmentu genu wirusa świadczy o wyższej czułości testu).
Zalety sposobów w wersji nie-laboratoryjnej (przyłóżkowej) według wynalazku polegają też na tym, że nie jest wymagane posiadanie pomieszczeń laboratoryjnych, nie jest wymagana skomplikowana organizacja takich pomieszczeń laboratoryjnych, nie jest wymagane również skomplikowane wyposażenie, ponieważ elementy pomiarowe testu bazują na powszechnie dostępnych na rynku rozwiązaniach aparaturowych (proste i niedrogie urządzenia). Ponadto otrzymany wynik ze względu na prostą interpretację wyniku opartą o odczyt kalorymetryczny po amplifikacji (detekcja kalorymetryczna bazująca na zmianie zabarwienia mieszaniny reakcyjnej po zajściu reakcji) nie wymaga doświadczonego personelu laboratoryjnego, a jedynie osób przeszkolonych pod kątem wykonania sposobu i interpretacji wyniku testu.
Istotną zaletą jest możliwość realizacji wynalazku w warunkach nie-laboratoryjnych, tj. w warunkach pierwszego kontaktu diagnostycznego, gdzie istotny jest czas szybkiej diagnostyki pacjenta, np. w szpitalnych oddziałach ratunkowych, oddziałach szpitalnych, POZ, lotniskach, przejściach granicznych itp.
Sposób diagnostyczny według wynalazku przeprowadza się w kolejnych etapach opisanych poniżej.
a) Szybka liza materiału biologicznego wraz z uwolnieniem oraz stabilizacją RNA
Próbkę materiału biologicznego do badania zgodnie z wynalazkiem pobiera się w standardowy sposób, np. za pomocą komercyjnej wymazówki poliuretanowej lub nylonowej z nosa, gardła, lub nosogardła, do probówki, np. Falcon 15 ml, w której znajduje się odpowiednie medium, np. w postaci roztworu 0,9% NaCl w objętości od 0,5 do 1,0 ml. Pobrany materiał wytrząsa się przez kilka sekund. Następnie materiał biologiczny, np. w proporcji objętościowej 10 μl do 90 μl, przenosi się do zimnego roztworu ekstrakcyjnego, np. Quick Extract RNA (BIOSEARCH TECHNOLOGIES, Cat. No. QER090150). Otrzymany lizat następnie krótko wytrząsa się, np. przez 1 min. Tak przygotowany materiał (lizat) służy jako matryca do badania w kolejnych etapach.
b) Reakcja odwrotnej transkrypcji (RT)
W kolejnym etapie lizat otrzymany w etapie a) poddaje się reakcji odwrotnej transkrypcji w standardowy sposób. Etap ten przeprowadza się w jednym naczyniu reakcyjnym, które zawiera wkład tworzący pierwszą komorę reakcyjną do przeprowadzenia reakcji RT, który to wkład ma formę podłużnego walca (lejka) posiadającego przy ścianie bocznej otwór wylotowy do przenoszenia produktu reakcji RT do drugiej komory reakcyjnej naczynia reakcyjnego do przeprowadzenia reakcji LAMP i detekcji kalorymetrycznej produktu reakcji, oraz dopasowane wieczko.
Przykładowe składowe reakcji odwrotnej transkrypcji (RT) z trzema zestawami starterów do każdego z genów N i M wirusa SARS-CoV-2 oraz kontrolą endogenną są następujące:
1. Woda wolna od nukleaz - może to być dowolna woda odpowiednia do przeprowadzania reakcji RT;
2. Mieszanina do odwrotnej transkrypcji (RT) zawierająca odpowiednie enzymy do rekacji RT może to być np. RT Mix - SuperScript™ VILO™ Master Mix, nr kat. 11755050 (Invitrogen);
3. Mieszanina starterów LAMP do genu N i M wirusa SARS-CoV-2;
4. Mieszania starterów do kontroli endogennej - np. genu referencyjnego, np. genu beta-aktyny (ACTB).
Należy zauważyć, że każdy z trzech zestawów starterów do każdego z genów N i M wirusa SARSCoV-2 zawiera:
pierwszy zestaw starterów: starter przedni zewnętrzny (F3) i starter przedni wewnętrzny (FIP), drugi zestaw starterów: starter tylny zewnętrzny (B3) i starter tylny wewnętrzny (BIP), trzeci zestaw starterów: starter przedni zapętlający (FL) i starter tylny zapętlający (BL).
Zgodnie z wynalazkiem stosuje się następujące sekwencje opisanych powyżej zestawów starterów do genów N i M wirusa SARS-CoV-2 oraz genu referencyjnego - ACTB.
Sekwencje zestawów starterów dla genu N:
pierwszy zestaw starterów:
N-F3: CCCTCAGATTCAACTGGCAGTA (NR ID. SEKW.: 1)
N-FIP: GAGAGCGGTGAACGGGCGCGATCAAAACAACG (NR ID. SEKW.: 2) drugi zestaw starterów:
N-B3: TTCATTTTACCGTCACCACCAC (NR ID. SEKW.: 3)
N-BIP: TCGAGGACAAGGCTTCGGTAGTAGCCAATTTGGTC (NR ID. SEKW.: 4) trzeci zestaw starterów:
N-FL: GACGCAGTATTATTGGGTAAACCT (NR ID. SEKW.: 5)
N-BL: CCAATTAACACCAATAGCAGTCCA (NR ID. SEKW.: 6).
Sekwencje zestawów starterów dla genu M:
pierwszy zestaw starterów:
M-F3: GGCCAGTAACTTTAGCTTGTTTTG (NR ID. SEKW.: 7)
M-FIP: AAACAGTCTGAAAGAACGCAATGGCTTGTCTTGTAGG (NR ID. SEKW.: 8) drugi zestaw starterów:
M-B3: GTCCAGCAATACGAAGATGTCC (NR ID. SEKW.: 9)
M-BIP: TTCTCAACGTGCCCAGCTCCGATTACGAGTTCACT (NR ID. SEKW.: 10) trzeci zestaw starterów:
M-FL: TGAAGTAGCTGAGCCACATCAA (NR ID. SEKW.: 11)
M-BL: TATTCTGACCAGACCGCTTCTA (NR ID. SEKW.: 12).
Sekwencje zestawów starterów dla genu kontroli wewnętrznej - ACTB:
pierwszy zestaw starterów:
ACTB-F3: AGTACCCCATCGAGCACG (NR ID. SEKW.: 13)
ACTB-FIP: GAGCCACACGCAGCTCATTGTATCACCAACTGGGACGACA (NR ID. SEKW.: 14) drugi zestaw starterów:
ACTB-B3: AGCCTGGATAGCAACGTACA (NR ID. SEKW.: 15)
ACTB-BIP: CTGAACCCCAAGGCCAACCGGCTGGGGTGTTGAAGGTC (NR ID. SEKW.: 16) trzeci zestaw starterów:
ACTB-LF: TGTGGTGCCAGATTTTCTCCA (NR ID. SEKW.: 17)
ACTB-LB: CGAGAAGATGACCCAGATCATGT (NR ID. SEKW.: 18)
Proporcje mieszaniny RT (1 rxn.)
Woda - 1,38 μl
Mieszanina do RT - 0,12 μl
Mieszanina starterów (10X) - 2,5 μl
Całkowita objętość: 4 μl
Do mieszaniny RT należy dodać 1 μl lizatu otrzymanego w etapie a). Reakcję w etapie b) przeprowadza się w komorze pierwszej (górna komora).
Profil termiczny reakcji RT: 42°C (termocykler typu PCR, grzanie góra/dół) przez 20 min.
c) Reakcja LAMP
W kolejnym etapie materiał otrzymany w etapie b) w wyniku reakcji RT przenosi się do drugiej, dolnej, komory reakcyjnej, gdzie przeprowadza się reakcję LAMP.
Przenoszenie to przeprowadza się poprzez wirowanie naczynia reakcyjnego, np. przez 30 sekund przy 2500 g.
Przykładowe składowe reakcji LAMP:
1. Woda wolna od nukleaz - może to być dowolna woda odpowiednia do przeprowadzania reakcji RT lub LAMP;
2. Mieszanina do amplifikacji izotermalnej LAMP dedykowana do detekcji kalorymetrycznej może to być np. Zestaw WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG (New England BioLabs, UK, No. Cat. M1804S);
3. Roztwór chlorowodorku guanidyny - np. Guanidine hydrochloride solution, 6M, Merck, nr kat. SRE0066-100ML;
Proporcje mieszaniny LAMP (1 rxn.)
Woda - 5,0 μl
Mieszanina do reakcji LAMP (LAMP Master Mix) - 12,5 μl
Roztwór chlorowodorku guanidyny (840 mM) - 2,5 μl
Całkowita objętość: 20 μl
Do mieszaniny LAMP należy dodać materiał otrzymany w etapie b) sposobu według wynalazku, tj. produkt reakcji RT, przeprowadzanej w pierwszej, górnej, komorze reakcyjnej, poprzez wirowanie przez 30 s przy 2500 g.
Profil termiczny reakcji LAMP: 65°C (można wykorzystać termocykler typu PCR z grzaniem góra/dół) przez 25 min.
Odczyt wyniku przeprowadza się kalorymetrycznie.
W sposobie według wynalazku stosuje się kontrolę wewnętrzną (endogenną) w postaci genu referencyjnego oraz korzystnie odpowiednią kontrolę pozytywną i negatywną, jak wiadomo w dziedzinie. Każdą z reakcji kontroli wewnętrznej, kontroli negatywnej, kontroli pozytywnej i próbki badanej przeprowadza się w osobnym naczyniu reakcyjnym.
W sposobach według wynalazku można wykorzystać dowolne odpowiednie do reakcji RT i LAMP laboratoryjne naczynia reakcyjne, takie jak probówki. Dogodnie stosuje się jednak do tego celu naczynia reakcyjne dostosowane do przeprowadzania sposobów według wynalazku jak opisano powyżej. Niwelują one konieczność manualnego przenoszenia produktu pierwszej reakcji z pierwszej komory reakcyjnej do drugiej komory reakcyjnej. Takie naczynie reakcyjne zawiera specjalny wkład, który to wkład tworzy pierwszą komorę reakcyjną, ma formę podłużnego walca zwężającego się ku dołowi (lejka) o pojemności w zakresie od 0,05 μl do 5 μl i posiada przy ścianie bocznej otwór wylotowy do przenoszenia produktu pierwszej reakcji - RT - do drugiej komory reakcyjnej, oddzielonej od pierwszej komory reakcyjne ww. wkładem, gdzie przeprowadzana jest reakcja LAMP i detekcja kalorymetryczna, oraz dopasowane wieczko. Wkład do naczynia reakcyjnego tworzy zatem jednocześnie pierwszą komorę reakcyjną i oddzielają od drugiej komory reakcyjnej znajdującej się w tym samym naczyniu reakcyjnym, zaś znajdujący się w nim otwór wylotowy pozwala, poprzez działanie siły odśrodkowej podczas wirowania, na przeniesienie produktu pierwszej reakcji z pierwszej komory reakcyjnej do drugiej komory reakcyjnej bez konieczności otwierania naczynia reakcyjnego. Zastosowanie takiego naczynia reakcyjnego upraszcza, skraca i ułatwia proces diagnostyczny.
Opisane tu naczynie reakcyjne może mieć korzystnie postać układu naczyń reakcyjnych w postaci paska, zawierającego wiele naczyń reakcyjnych położonych równolegle względem siebie, np. 8 naczyń reakcyjnych o pojemności 0,1 lub 0,2 ml, tworzących pasek naczyń reakcyjnych, oraz dopasowane do nich wieczka.
Przykładowe naczynia reakcyjne tu opisane przedstawione sa na figurach 1-7:
Fig. 1: Pasek z naczyniami reakcyjnymi o pojemności 0,1 ml
Fig. 2: Pasek z naczyniami reakcyjnymi o pojemności 0,2 ml
Fig. 3: Wkład do naczyń reakcyjnych o pojemności 0,1 ml
Fig. 4: Wkład do naczyń reakcyjnych o pojemności 0,2 ml
Fig. 5: Wieczko zamykające naczynia reakcyjne w dwóch pojemnościach
Fig. 6: Naczynia reakcyjne o pojemności 0,1 i 0,2 ml z wkładem (lejkiem)
Fig. 7: Przykładowy pasek z naczyniami reakcyjnymi wraz z testowanymi próbkami do przeprowadzenia sposobów według wynalazku z wykorzystaniem zestawu testowego tu opisanego.
Wynalazki według niniejszego zgłoszenia oparte są na pomiarze amplifikacji wyselekcjonowanych obszarów genomowych wirusa SARS-CoV-2 przy użyciu innowacyjnego, autorskiego protokołu technologiczno-metodologicznego. Wynalazki według niniejszego zgłoszenia są tak zaprojektowane, aby mocje użyć bezpośrednio po pobraniu próbki materiału biologicznego, tj. wymazu, od osobnika badanego, np. pacjenta, z pominięciem dodatkowych czynności pipetowania mieszanin reakcyjnych. Komory naczynia reakcyjnego są napełnione reagentami, co czyni je łatwymi i przystępnymi użytkownikowi. Naczynie reakcyjne zawiera dwie odseparowane od siebie przestrzennie za pomocą wkładu (separatora pełniącego jednocześnie funkcję lejka) komory reakcyjne, w których zachodzą dwie niezależne następujące po sobie sekwencyjnie reakcje molekularne. Technologie zastosowane zgodnie z wynalazkiem współdziałają ze sobą w sposób hybrydowy, powodując szybkie i czułe zajście reakcji amplifikacji (czas przeprowadzenia testu to 45 min). Dzięki opracowaniu niniejszych rozwiązań w formie indywidualnych oznaczeń pomiarowych i zintegrowaniu innowacyjnych naczyń reakcyjnych z komorami reakcyjnymi, korzystnie w formacie 8-dołkowych pasków, kompatybilnych z powszechnie dostępnymi aparatami do PCR, niniejszy wynalazek dedykowany jest do wykonywania w warunkach nie-laboratoryjnych (przyłóżkowych), tj. w warunkach np. pierwszego kontaktu diagnostycznego, gdzie istotny jest czas szybkiej diagnostyki pacjenta, np. w szpitalnych oddziałach ratunkowych, oddziałach szpitalnych, POZ, lotniskach, przejściach granicznych itp.
Niniejszy wynalazek zostanie teraz zilustrowany w poniższym przykładzie, który jednak nie ma na celu ograniczenia w żaden sposób zakresu wynalazku zdefiniowanego w zastrzeżeniach patentowych.
Przykład - Sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce od pacjenta i sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 z zastosowaniem opisanego tu zestawu testowego
Wszystkie opisane poniżej procedury przeprowadzono z zastosowaniem komercyjnie dostępnych zestawów testowych, odczynników i aparatury, postępując zgodnie z zaleceniami producentów stosowanych zestawów, odczynników i aparatury, o ile nie wskazano wyraźnie inaczej, przy czym stosowano standardowe, powszechnie znane metody wykorzystywane w dziedzinie, do której należy niniejszy wynalazek.
Sposób według wynalazku przeprowadzono w kolejnych etapach opisanych poniżej. Do badania sposobem według wynalazku i oceny jego skuteczności wykorzystano 400 próbek wymazu z nosa/gardła/noso-gardła, w tym 100 próbek pozytywnych na obecność wirusa SARS-CoV-2 (wyniki potwierdzone za pomocą testu RT-PCR CE IVD) oraz 300 próbek negatywnych na obecność wirusa (wyniki również potwierdzone przy użyciu testu RT-PCR CE IVD). W toku badania nie stwierdzono próbek utraconych. Każdą z reakcji kontroli wewnętrznej, kontroli negatywnej, kontroli pozytywnej i próbek badanych przeprowadzano w osobnym naczyniu reakcyjnym.
a) Szybka liza materiału biologicznego wraz z uwolnieniem oraz stabilizacją RNA
Materiał biologiczny do badania zgodnie z wynalazkiem pobrano w standardowy sposób, za pomocą komercyjnej wymazówki z nosa i/lub gardła, lub z noso-gardła, do probówki Falcon 15 ml z medium, w postaci roztworu 0,9% NaCl w objętości 0,5 ml. Pobrany materiał wytrząsano przez kilka sekund. Następnie materiał biologiczny w objętości 10 μl, przenoszono do 90 μl zimnego roztworu ekstrakcyjnego do ekstrakcji całkowitego wirusowego RNA - Quick Extract RNA (BIOSEARCH TECHNOLOGIES, Cat. No. QER090150). Otrzymany lizat następnie krótko wytrząsano przez 1 min. Tak przygotowany materiał (lizat) wykorzystano jako matrycę w dalszych etapach, tj. reakcji RT i LAMP.
b) Reakcja odwrotnej transkrypcji (RT)
W kolejnym etapie lizat otrzymany w etapie a) poddano reakcji odwrotnej transkrypcji w standardowy sposób, w pierwszej komorze reakcyjnej, którą stanowił wkład naczynia reakcyjnego z otworem pozwalającym na przejście materiału po reakcji RT do drugiej komory reakcyjnej, w której przeprowadzano reakcję LAMP. Zastosowane składowe reakcji odwrotnej transkrypcji (RT) z trzema zestawami starterów do każdego z genów N i M wirusa SARS-CoV-2 oraz do genu referencyjnego - ACTB - kontroli endogennej - były następujące:
1. Woda wolna od nukleaz - do przeprowadzania reakcji RT;
2. Mieszanina do odwrotnej transkrypcji (RT) - RT Mix - SuperScript™ VILO™ Master Mix, nr kat. 11755050 (Invitrogen);
3. Mieszanina starterów LAMP do genu N i M;
4. Mieszania starterów dla kontroli endogennej - ACTB.
W reakcji zastosowano następujące zestawy starterów do genów N i M wirusa SARS-C-V-2 i geny ACTB:
Sekwencje zestawów starterów do genu N:
pierwszy zestaw starterów:
N-F3: CCCTCAGATTCAACTGGCAGTA (NR ID. SEKW.: 1)
N-FIP: GAGAGCGGTGAACGGGCGCGATCAAAACAACG (NR ID. SEKW.: 2) drugi zestaw starterów:
N-B3: TTCATTTTACCGTCACCACCAC (NR ID. SEKW.: 3)
N-BIP: TCGAGGACAAGGCTTCGGTAGTAGCCAATTTGGTC (NR ID. SEKW.: 4) trzeci zestaw starterów:
N-FL: GACGCAGTATTATTGGGTAAACCT (NR ID. SEKW.: 5)
N-BL: CCAATTAACACCAATAGCAGTCCA (NR ID. SEKW.: 6).
Sekwencje zestawów starterów do genu M:
pierwszy zestaw starterów:
M-F3: GGCCAGTAACTTTAGCTTGTTTTG (NR ID. SEKW.: 7)
M-FIP: AAACAGTCTGAAAGAACGCAATGGCTTGTCTTGTAGG (NR ID. SEKW.: 8) drugi zestaw starterów:
M-B3: GTCCAGCAATACGAAGATGTCC (NR ID. SEKW.: 9)
M-BIP: TTCTCAACGTGCCCAGCTCCGATTACGAGTTCACT (NR ID. SEKW.: 10) trzeci zestaw starterów:
M-FL: TGAAGTAGCTGAGCCACATCAA (NR ID. SEKW.: 11)
M-BL: TATTCTGACCAGACCGCTTCTA (NR ID. SEKW.: 12).
Sekwencje zestawów starterów dla genu referencyjnego ACTB:
pierwszy zestaw starterów:
ACTB-F3: AGTACCCCATCGAGCACG (NR ID. SEKW.: 13)
ACTB-FIP: GAGCCACACGCAGCTCATTGTATCACCAACTGGGACGACA (NR ID. SEKW.: 14) drugi zestaw starterów:
ACTB-B3: AGCCTGGATAGCAACGTACA (NR ID. SEKW.: 15)
ACTB-BIP: CTGAACCCCAAGGCCAACCGGCTGGGGTGTTGAAGGTC (NR ID. SEKW.: 16) trzeci zestaw starterów:
ACTB-LF: TGTGGTGCCAGATTTTCTCCA (NR ID. SEKW.: 17)
ACTB-LB: CGAGAAGATGACCCAGATCATGT (NR ID. SEKW.: 18)
Reakcję kontroli endogennej przeprowadza się w odrębnym naczyniu reakcyjnym niż reakcję próbki badanej.
Proporcje mieszaniny RT (1 rxn.) były następujące:
Woda - 1,38 μl
Mieszanina do RT - 0,12 μl
Mieszanina starterów (10X) - 2,5 μl
Całkowita objętość reakcji: 4 μl
Do mieszaniny RT dodano 1 μl lizatu otrzymanego w etapie a). Reakcję przeprowadzono w komorze pierwszej (górna komora) z zastosowaniem następującego profilu termicznego reakcji RT: 42°C (termocykler SimpliAmp Thermal Cycler, grzanie góra/dół) przez 20 min.
c) Reakcja LAMP
W kolejnym etapie materiał otrzymany w etapie b) w wyniku reakcji RT przeniesiono z pierwszej, górnej, komory reakcyjnej w postaci wkładu do naczynia reakcyjnego, poprzez wirowanie (30 s, 2500 g), do drugiej, dolnej, komory reakcyjnej, gdzie przeprowadzano reakcję LAMP.
Zastosowane składowe reakcji LAMP:
1. Woda wolna od nukleaz - odpowiednia do przeprowadzania reakcji LAMP;
2. Mieszanina do amplifikacji izotermalnej LAMP z barwnikiem do detekcji kalorymetrycznej Zestaw WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG (New England BioLabs, UK, No. Cat. M1804S)
3. 6M roztwór chlorowodorku guanidyny - Guanidine hydrochloride solution, 6M, Merck, nr kat. SRE0066-100ML;
Proporcje mieszaniny LAMP (1 rxn.) były następujące:
Woda - 5,0 μl
Mieszanina do reakcji LAMP (LAMP Master Mix) - 12,5 μl
Roztwór chlorowodorku guanidyny (840 mM) - 2,5 μl
Całkowita objętość: 20 μl
Do mieszaniny LAMP dodano produkt otrzymany w etapie b) sposobu według wynalazku, tj. produkt reakcji RT, przeprowadzanej w pierwszej, górnej, komorze reakcyjnej.
Reakcję LAMP przeprowadzono w aparacie typu termocykler do PCR (termocykler SimpliAmp Thermal Cycler) z zastosowaniem następującego profilu termicznego reakcji LAMP: 65°C przez 25 min.
Odczyt wyniku przeprowadzono od razu po zakończeniu reakcji kalorymetrycznie (zmiana zabarwienia mieszaniny reakcyjnej po zajściu reakcji z różowej na żółtą). Zmiana koloru oznacza wyniki pozytywny na obecność wirusa SARS-CoV-2 w badanej próbce.
Jak pokazano na Fig. 6 zastosowano także odpowiednią kontrolę pozytywną i negatywną oraz kontrolę wewnętrzną.
Następnie przeprowadzono walidację kliniczną opracowanych rozwiązań według wynalazku. Celem walidacji klinicznej była ocena skuteczności działania rozwiązań według wynalazku do wykrywania materiału genetycznego wirusa SAR-CoV-2 w próbce materiału biologicznego, tj. z wymazu nosowego/gardłowego/noso-gardłowego, w porównaniu z komercyjnym testem RT-qPCR CE IVD.
Punkty końcowe/poznawcze
Punktem końcowym walidacji było otrzymanie zestawienia wyników zestawów testowych w konfrontacji z wynikami komparatora RT-qPCR, na podstawie którego można było wyliczyć podstawowe
PL 249159 Β1 parametry diagnostyczne zestawu testowego, tj. Czułość, Specyficzność, Prawdopodobieństwo otrzymania wyniku negatywnego (NLR, Negative Likelihood Ratio), Wartość predykcji wyników pozytywnych (PPV, Positive Predictive Value), Wartość predykcji wyników negatywnych (NPV, Negative Predictive Value), dokładność (Accuracy).
Metoda statystyczna
Próbki skolekcjonowane podczas projektu (ponad 500 próbek) zostały wybrane w sposób randomowy do przeprowadzenia właściwego badania, przy założeniu, że grupa badana będzie obejmowała 400 wymazów, w tym 100 prób pozytywnych na obecność wirusa SARS-CoV-2 oraz 300 próbek negatywnych na obecność wirusa. Badanie miało charakter retrospektywny.
Otrzymana czułość i specyficzność została przeanalizowana w świetle aktualnego stanu techniki i zaleceń MDCG-21 Rev. 1.
Czułość w odniesieniu do rozwiązań według wynalazku dotyczących wykrywania koronawirusa oznacza odsetek próbek dodatnich na obecność koronawirusa wykrytych przez komparator RT-qPCR, które są prawidłowo identyfikowane przez test, obliczony za pomocą następującego równania.
Liczba wyników prawdziwie pozytywnych
Czułość % = -----------------------------------------x 100
Liczba wyników prawdziwie pozytywnych +
Liczba wyników fałszywie negatywnych)
Specyficzność (swoistość) w odniesieniu do rozwiązań według wynalazku dotyczących wykrywania koronawirusa oznacza odsetek próbek ujemnych na koronawirusa sklasyfikowanych przez komparator RT-qPCR, które zostały prawidłowo zidentyfikowane jako ujemne w teście, obliczona przy użyciu następującego równania.
Liczba wyników prawdziwie negatywnych
Specyficzność % = ------------------------------------------- x 100
Liczba wyników prawdziwie negatywnych Liczba wyników fałszywie pozytywnych)
Dokładny przebieg analiz zapisany jest w następujących punktach:
1) Wybór prób do walidacji
2) Przeprowadzenie izolacji RNA do wykonania reakcji komparatora RT-qPCR
3) Wykonanie oznaczeń RT-qPCR
4) Zestawienie wyników komparatora RT-qPCR w arkuszu CRF
5) Wykonanie oznaczeń zestawu testowego dla wersji POC
6) Zestawienie wyników zestawu testowego dla wersji POC w arkuszu CRF
Liczba próbek do każdego ramienia
Ramię komparatora - 400 prób - zestaw RT-qPCR
I Ramię testowe - 400 prób - sposób według wynalazku w wersji Point of Care (POC) i opisany tu zestaw
Ocena skuteczności działania z zastosowaniem analizy statystycznej otrzymanych wyników z badania 400 próbek jak wskazano powyżej pozwoliła stwierdzić, że sposób według wynalazku wykazał 100% czułości i 100% specyficzności (brak wyników fałszywie dodatnich oraz brak wyników fałszywie ujemnych). Wyniki podsumowane są w Tabelach 1 i 2.
Tabela 1. Podsumowanie wyników badania
| Próbka | Referencyjna reakcja RT-PCR | Łącznie | |
| Pozytywna | Negatywna | ||
| Pozytywna | 100 | 0 | 100 |
| Negatywna | 0 | 300 | 300 |
| Łącznie | 100 | 300 | 400 |
PL 249159 Β1
Tabela 2. Analiza wyników badania
| Wynik | Przedział ufności (CI) 95% | |
| Czułość | 100,00% | 96,38% do 100,00% |
| Specyficzność | 100,00% | 98,78% do 100,00% |
| Prawdop od ob i eń sfwo otrzymania wyniku pozytywnego (Positive Likelihood Ratio) | N/A | N/A |
| Prawdop od ob i eń stwo otrzymania wyniku negatywnego (Negative Likelihood Ratio) | 0,00 | |
| Wartość predykcji wyników pozytywnych (Positive Predictive Value) | 100,00% | |
| Wartość predykcji wyników negatywnych (Negative Predictive Value) | 100,00% | |
| Dokładność | 100,00% | 99,08% to 100,00% |
Uzyskane wyniki potwierdzają zatem, że sposoby według wynalazku oraz zestaw testowy do przeprowadzania takich sposobów pozwalają na szybkie, proste, bardzo czułe i specyficzne wykrywanie materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego do badania w warunkach nie-laboratoryjnych, tj. przy łóżku pacjenta (tj. przy łóżku pacjenta, POC), jak również diagnozowanie in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w takich warunkach.
PL 249159 Β1
WYKAZ SEKWENCJI <110> Akademicki Ośrodek Diagnostyki Genetyczno-Molekularnej Sp. z o.o.
Patomorfologicznej <120> Sposób wykrywania materiału genetycznego SARS-CoV-2, sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w wersji POC <130> 17P52232PL00 <160> 1S < 170> BiSSAP 1.3.6 < 210> 1 < 211> 22 < 212> DNA < 213> Sekwencja sztuczna <220>
< 223> N-F3 < 400> 1 ccctcagatt caactggcag ta < 210> 2 < 211> 32 < 212> DNA < 213> Sekwencja sztuczna <220>
< 223> N-FIP < 400> 2 gagagcggtg aacgggcgcg atcaaaacaa cg <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
PL 249159 Β1 <220 <223> N-B3 < 400> 3 ttcattttac cgtcaccacc ac 22 <210 4 < 211> 35 < 212> DNA < 213> Sekwencja sztuczna <220 < 223> N-BIP <400 4 tcgaggacaa ggcttcggta gtagccaatt tggtc 35 < 210 5 <211> 24 < 212> DNA < 213> Sekwencja sztuczna <220 < 223> N-FL <40 0 5 gacgcagtat tattgggtaa acct 24 <210 6 <211> 24 < 212> DNA < 213> Sekwencja sztuczna <220 < 223> N-BL < 40 0 6 ccaattaaca ccaatagcag tcca 24 <210> 7 <211> 24
PL 249159 Β1 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> M-F3 <400> 7 ggccagtaac tttagcttgt tttg 24 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> M-FIP <400> 8 aaacagtctg aaagaacgca atggcttgtc ttgtagg 37 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> M-B3 <400> 9 gtccagcaat acgaagatgt cc 22 <210> 10 <211> 35 < 212> DNA < 213> Sekwencja sztuczna <220>
< 223> M-BIP < 400> 10 ttctcaacgt gcccagctcc gattacgagt tcact
PL 249159 Β1 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> M-FL <400> 11 tgaagtagct gagccacatc aa 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> M-BL <400> 12 tattctgacc agaccgcttc ta 22 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> ACTB-F3 <400> 13 agtaccccat cgagcacg 18 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> ACTB-FIP
PL 249159 Β1 < 40O> 14 gagccacacg cagctcattg tatcaccaac tgggacgaca 40 < 210> 15 < 211> 20 < 212> DNA < 213> Sekwencja sztuczna <220>
< 223> ACTB-B3 < 400> 15 agcctggata gcaacgtaca 20 < 210> 16 < 211> 38 < 212> DNA < 213> Sekwencja sztuczna <220>
< 223> ACTB-BIP < 400> 16 ctgaacccca aggccaaccg gctggggtgt tgaaggtc 38 < 210> 17 < 211> 21 < 212> DNA < 213> Sekwencja sztuczna <220>
< 223> ACTB-LF < 400> 17 tgtggtgcca gattttctcc a 21 <210> 18 <211> 23 < 212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
PL 249159 Β1 <220>
<223> ACTB-LB <400> 18 cgagaagatg acccagatca tgt 23
Claims (4)
1. Sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego w warunkach nie-laboratoryjnych (przyłóżkowych), obejmujący następujące etapy, w których:
a) próbkę materiału biologicznego pobranego od osobnika badanego poddaje się lizie z uwolnieniem oraz stabilizacją RNA;
b) lizat otrzymany w etapie a) poddaje się reakcji odwrotnej transkrypcji (RT) z zastosowaniem mieszaniny do reakcji RT zawierającej trzy zestawy starterów do reakcji RT i izotermicznej amplifikacji za pośrednictwem pętli (Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP) swoistych do każdego z genów N i M wirusa SARS-CoV-2, przy czym każdy pierwszy zestaw starterów zawiera starter przedni zewnętrzny (F3) i starter przedni wewnętrzny (FIP), drugi zestaw starterów zawiera starter tylny zewnętrzny (B3) i starter tylny wewnętrzny (BIP), zaś trzeci zestaw starterów zawiera starter przedni zapętlający (FL) i starter tylny zapętlający (BL);
c) produkt otrzymany w etapie b) przenosi się do mieszaniny odczynników do reakcji LAMP zawierającą barwnik kolorymetryczny; przeprowadza się reakcję LAMP, a następnie detekcję kalorymetryczną produktu reakcji amplifikacji kwasu nukleinowego genów N i M wirusa SARS-CoV-2, przy czym wynik pozytywny oznacza wykrycie materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2, przy czym w etapie b) stosuje się następujące trzy zestawy starterów do genu N wirusa SARS- CoV-2:
pierwszy zestaw starterów:
N-F3: CCCTCAGATTCAACTGGCAGTA (NR ID. SEKW.: 1)
N-FIP: GAGAGCGGTGAACGGGCGCGATCAAAACAACG (NR ID. SEKW.: 2) drugi zestaw starterów:
N-B3: TTCATTTTACCGTCACCACCAC (NR ID. SEKW.: 3)
N-BIP: TCGAGGACAAGGCTTCGGTAGTAGCCAATTTGGTC (NR ID. SEKW.: 4) trzeci zestaw starterów:
N-FL: GACGCAGTATTATTGGGTAAACCT (NR ID. SEKW.: 5)
N-BL: CCAATTAACACCAATAGCAGTCCA (NR ID. SEKW.: 6), oraz w etapie b) stosuje się następujące trzy zestawy starterów do genu M wirusa SARS-CoV-2:
pierwszy zestaw starterów:
M-F3: GGCCAGTAACTTTAGCTTGTTTTG (NR ID. SEKW.: 7)
M-FIP: AAACAGTCTGAAAGAACGCAATGGCTTGTCTTGTAGG (NR ID. SEKW.: 8) drugi zestaw starterów:
M-B3: GTCCAGCAATACGAAGATGTCC (NR ID. SEKW.: 9)
M-BIP: TTCTCAACGTGCCCAGCTCCGATTACGAGTTCACT (NR ID. SEKW.: 10) trzeci zestaw starterów:
M-FL: TGAAGTAGCTGAGCCACATCAA (NR ID. SEKW.: 11)
M-BL: TATTCTGACCAGACCGCTTCTA (NR ID. SEKW.: 12), i przy czym reakcje RT i LAMP przeprowadza się sekwencyjnie w jednym naczyniu reakcyjnym, które zawiera wkład stanowiący pierwszą komorę reakcyjną do przeprowadzenia reakcji RT, który to wkład tworzy w naczyniu reakcyjnym pierwszą i drugą komorę reakcyjną, ma formę podłużnego walca zwężającego się ku dołowi (lejka) o pojemności w zakresie od 0,05 μΙ do 5 μΙ i posiada przy ścianie bocznej otwór wylotowy służący do przenoszenia produktu reakcji RT do drugiej komory reakcyjnej naczynia reakcyjnego do przeprowadzenia reakcji LAMP i detekcji fluorymetrycznej produktu reakcji, przy czym naczynie to zawiera także wieczko o właściwościach optycznych pozwalających na bezpośredni pomiar fluorymetryczny w naczyniu reakcyjnym, i przy czym dodatkowo stosuje się gen referencyjny jako kontrolę wewnętrzną, przy czym do kontroli wewnętrznej stosuje się trzy zestawy starterów do reakcji RT-LAMP swoistych dla genu referencyjnego, korzystnie ACTB, przy czym pierwszy zestaw starterów zawiera starter przedni zewnętrzny (F3) i starter przedni wewnętrzny (FIP), drugi zestaw starterów zawiera starter tylny zewnętrzny (B3) i starter tylny wewnętrzny (BIP), zaś trzeci zestaw starterów zawiera starter przedni zapętlający (FL) i starter tylny zapętlający (BL), i przy czym pierwszy zestaw starterów to:
ACTB-F3: AGTACCCCATCGAGCACG (NR ID. SEKW.: 13)
ACTB-FIP: GAGCCACACGCAGCTCATTGTATCACCAACTGGGACGACA (NR ID. SEKW.: 14) drugi zestaw starterów to:
ACTB-B3: AGCCTGGATAGCAACGTACA (NR ID. SEKW.: 15)
ACTB-BIP: CTGAACCCCAAGGCCAACCGGCTGGGGTGTTGAAGGTC (NR ID. SEKW.: 16), zaś trzeci zestaw starterów to:
ACTB-LF: TGTGGTGCCAGATTTTCTCCA (NR ID. SEKW.: 17)
ACTB-LB: CGAGAAGATGACCCAGATCATGT (NR ID. SEKW.: 18).
2. Sposób według zastrz. 1, w którym stosuje się ponadto próbkę negatywną i pozytywną SARS- CoV-2 jako odpowiednio kontrolę negatywną i pozytywną.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, w którym jako próbkę materiału biologicznego stosuje się wymaz z nosa, gardła lub noso-gardła.
4. Sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2, w którym
a) w próbce materiału biologicznego pobranego od osobnika badanego, korzystnie wymazu z nosa, gardła lub noso-gardła, wykrywa się obecność materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 sposobem jak zdefiniowano w dowolnym z zastrzeżeń 1 do 3;
b) diagnozuje się zakażenie wirusem SARS-CoV-2 w przypadku wykrycia obecności w próbce materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL446009A PL249159B1 (pl) | 2023-09-01 | 2023-09-01 | Sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 oraz sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w wersji POC |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL446009A PL249159B1 (pl) | 2023-09-01 | 2023-09-01 | Sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 oraz sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w wersji POC |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL446009A1 PL446009A1 (pl) | 2025-03-03 |
| PL249159B1 true PL249159B1 (pl) | 2026-03-02 |
Family
ID=94771161
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL446009A PL249159B1 (pl) | 2023-09-01 | 2023-09-01 | Sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 oraz sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w wersji POC |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL249159B1 (pl) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112760420A (zh) * | 2021-02-05 | 2021-05-07 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的引物、探针和试剂盒 |
| CN113186357A (zh) * | 2021-06-02 | 2021-07-30 | 上海真测生物科技有限公司 | 一种新型冠状病毒多重检测的rt-lamp引物组合及其试剂盒 |
| WO2021245708A1 (en) * | 2020-06-05 | 2021-12-09 | Indian Council Of Medical Research | A rapid and sensitive method for detecting sars-cov-2 |
-
2023
- 2023-09-01 PL PL446009A patent/PL249159B1/pl unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021245708A1 (en) * | 2020-06-05 | 2021-12-09 | Indian Council Of Medical Research | A rapid and sensitive method for detecting sars-cov-2 |
| CN112760420A (zh) * | 2021-02-05 | 2021-05-07 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的引物、探针和试剂盒 |
| CN113186357A (zh) * | 2021-06-02 | 2021-07-30 | 上海真测生物科技有限公司 | 一种新型冠状病毒多重检测的rt-lamp引物组合及其试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HUANG X ET AL.: "EBioMedicine. 2022; 75: 103736", DEVELOPING RT-LAMP ASSAYS FOR RAPID DIAGNOSIS OF SARS-COV-2 IN SALIVA. * |
| LALLI MA ET AL.: "Clin Chem. 2021; 67(2): 415-424", RAPID AND EXTRACTION-FREE DETECTION OF SARS-COV-2 FROM SALIVA BY COLORIMETRIC REVERSE-TRANSCRIPTION LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL446009A1 (pl) | 2025-03-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110468237B (zh) | 检测中东呼吸综合征冠状病毒的引物探针混合液及试剂盒 | |
| Yamazaki et al. | Development of a point-of-care test to detect SARS-CoV-2 from saliva which combines a simple RNA extraction method with colorimetric reverse transcription loop-mediated isothermal amplification detection | |
| CN109576397B (zh) | 一种人类免疫缺陷病毒1型核酸定量检测试剂盒 | |
| Feagins et al. | Next generation rapid diagnostic tests for meningitis diagnosis | |
| Romero-Montoya et al. | Relationship of spermatoscopy, prostatic acid phosphatase activity and prostate-specific antigen (p30) assays with further DNA typing in forensic samples from rape cases | |
| WO2019075868A1 (zh) | 一种检测布鲁菌感染的方法及其应用 | |
| Graham et al. | Use of emerging testing technologies and approaches for SARS-CoV-2: review of literature and global experience in an Australian context | |
| WO2017023194A1 (ru) | Способ диагностики иммунной системы и набор для оценки днк молекул trec, krec и количество геном эквивалентов днк | |
| WO2023167250A1 (ja) | 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する細胞性免疫応答活性の測定方法 | |
| PL249159B1 (pl) | Sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 oraz sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w wersji POC | |
| Estrela et al. | A multiplex point-of-care test for discriminatory inference of SARS-CoV-2 Omicron lineages using reverse transcription loop-mediated isothermal amplification and lateral flow detection | |
| US7393638B2 (en) | Assay system and methods for detecting SARS-CV | |
| Mapes et al. | Nucleic acid extraction methods for detection of EHV-1 from blood and nasopharyngeal secretions | |
| PL249160B1 (pl) | Sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 oraz sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w wersji laboratoryjnej | |
| JP2023517053A (ja) | Ｃｄｉ増強ｃｏｖｉｄ－１９検査 | |
| KR20190037027A (ko) | 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 검출방법 | |
| US20250001417A1 (en) | At-Home Covid Nucleic Acid Detection Kit for Rapid Molecular Diagnostics | |
| Joseph et al. | Comparison of automated and manual viral nucleic acid extraction kits for COVID-19 detection using QRT-PCR | |
| US20230147242A1 (en) | Colorimetric detection of nucleic acids | |
| CN111893201B (zh) | 等温扩增检测4种巴贝虫的试剂、试剂盒及其应用 | |
| RU2663454C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения ДНК возбудителей вульвовагинального кандидоза в слизистой оболочке влагалища | |
| CN106191305A (zh) | 优生优育检测试剂盒、检测用寡核苷酸和方法 | |
| RU2842886C1 (ru) | Способ выявления вируса Mammarenavirus machupoense методом, основанным на применении дезоксирибозима 10-23 | |
| CN109055584A (zh) | 基于数字lamp技术检测猪链球菌的引物及其试剂盒与方法 | |
| Kikuchi et al. | Analysis of microRNAs by the Stem-Loop Real-Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Using A Double Quencher Probe |