PL249160B1 - Sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 oraz sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w wersji laboratoryjnej - Google Patents

Sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 oraz sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w wersji laboratoryjnej

Info

Publication number
PL249160B1
PL249160B1 PL446010A PL44601023A PL249160B1 PL 249160 B1 PL249160 B1 PL 249160B1 PL 446010 A PL446010 A PL 446010A PL 44601023 A PL44601023 A PL 44601023A PL 249160 B1 PL249160 B1 PL 249160B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
seq
sars
cov
reaction
primer
Prior art date
Application number
PL446010A
Other languages
English (en)
Other versions
PL446010A1 (pl
Inventor
Radosław CHARKIEWICZ
Radosław Charkiewicz
Piotr Majewski
Joanna Reszeć-Giełażyn
Janusz Bogdan Dzięcioł
Jacek NIKLIŃSKI
Jacek Nikliński
Joanna KIŚLUK
Joanna Kiśluk
Anetta SULEWSKA
Anetta Sulewska
Piotr Karabowicz
Original Assignee
Akademicki Osrodek Diagnostyki Patomorfologicznej I Genetyczno Molekularnej Spolka Z Ograniczona Odp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Akademicki Osrodek Diagnostyki Patomorfologicznej I Genetyczno Molekularnej Spolka Z Ograniczona Odp filed Critical Akademicki Osrodek Diagnostyki Patomorfologicznej I Genetyczno Molekularnej Spolka Z Ograniczona Odp
Priority to PL446010A priority Critical patent/PL249160B1/pl
Publication of PL446010A1 publication Critical patent/PL446010A1/pl
Publication of PL249160B1 publication Critical patent/PL249160B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Niniejsze zgłoszenie dotyczy sposobu wykrywania w warunkach laboratoryjnych materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego, sposobu diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 z wykorzystaniem takiego sposobu wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 oraz zestawu do wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 lub diagnozowania zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego w warunkach laboratoryjnych.

Description

Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy dziedziny medycyny, a w szczególności diagnostyki in vitro, zwłaszcza identyfikacji zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w profesjonalnym środowisku laboratoryjnym. Dokładniej, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wykrywania w warunkach laboratoryjnych materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego od badanego osobnika oraz sposobu diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 z wykorzystaniem takiego sposobu wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2. Opisano tu także zestaw do wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 lub diagnozowania zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego w warunkach laboratoryjnych, sposobami według wynalazku.
Obecnie na rynku istnieje wiele sposobów i zestawów diagnostycznych ukierunkowanych na nowego koronawirusa SARS-CoV-2, działających w oparciu o techniki genetyczne, immunologiczne czy białkowe (antygenowe). Testy serologiczne nie są testami diagnostycznymi, a jedynie świadczą o przebytym kontakcie z wirusem. Testy antygenowe cechują się niską czułością i mogą posłużyć jako metoda przesiewowa, niemniej jednak wymagająca potwierdzenia testem molekularnym. Jedynym wiarygodnym i rekomendowanym przez WHO oraz CDC testem stwierdzającym zakażenie SARS-CoV-2 w sposób ostateczny jest test molekularny polegający na detekcji fragmentów materiału genetycznego wirusa przy użyciu technologii NAAT (Nucleic acid amplification tests). Obecnie na rynku diagnostycznym funkcjonuje wiele testów opartych na technice jakościowej PCR w czasie rzeczywistym (ang. qualitative Real-Time PCR), działających w formule komercyjnych, certyfikowanych (CE) zestawów do diagnostyki in vitro (IVDR). Pomimo wysokiej czułości i specyficzności rutynowych testów RT-PCR, cechuje je szereg ograniczeń, a mianowicie:
• wieloetapowość całego procesu diagnostycznego stwarza duże ryzyko kontaminacji krzyżowych;
• czasochłonność - konieczne jest min. od 2 do 8 godzin;
• pracochłonność;
• konieczność posiadania kilku odseparowanych pomieszczeń laboratoryjnych w celu uniknięcia kontaminacji materiału genetycznego;
• konieczność stosowania wielu procedur zabezpieczających w celu uniknięcia wyników fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych;
• duże wymagania dotyczące przeszkolonego i doświadczonego personelu laboratoryjnego;
• wysoki koszt;
• zakup wysokospecjalistycznej, drogiej aparatury pomiarowej.
Innymi metodami analiz molekularnych, obok techniki PCR, coraz częściej wykorzystywanymi do detekcji patogenów u ludzi są: izotermalna amplifikacja materiału genetycznego, zwana LAMP (ang. Loop-Mediated Isothermal Amplification) oraz technika RPA (ang. Recombinase Polymerase Amplification). Z dokumentu Huang X et al. Developing RT-LAMP assays for rapid diagnosis of SARSCoV-2 in saliva. EBioMedicine. 2022; 75: 103736 znany jest sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego (w ślinie) z zastosowaniem reakcji RT-LAMP, w którym wykorzystuje się multipleksowy zestaw sześciu staterów LAMP swoistych dla genu N i genu M tego wirusa, (par. „Multiplexed RTLAMP to further improve assay sensitivity” s. 9-13). Pomimo, iż technologie te cechują się krótszym czasem przebiegu i wysoką czułością, to nie znoszą one głównych ograniczeń diagnostycznych, takich jak konieczność ekstrakcji RNA z próby biologicznej (co wiąże się z np. z ryzykiem kontaminacji krzyżowej, koniecznością dysponowania odpowiednimi warunkami pomieszczeń i koniecznością stosowania wielu procedur zabezpieczających w celu uniknięcia wyników fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych), jak również konieczność dysponowania przeszkolonym i doświadczonym personelem laboratoryjnym.
W związku z powyższym istnieje w dziedzinie realna potrzeba opracowania nowych, szybkich, bardzo czułych, specyficznych i stosunkowo prostych w użyciu narzędzi do wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego w warunkach laboratoryjnych, jak również do wspomagania całego procesu diagnostycznego zakażenia wirusem SARS-CoV-2.
Celem wynalazku było zatem opracowanie sposobu wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego w warunkach laboratoryjnych oraz sposobu diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2, pozwalających na szybką, prostą, bardzo czułą i specyficzną diagnostykę zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w warunkach laboratoryjnych.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego w warunkach laboratoryjnych, obejmujący następujące etapy, w których:
a) próbkę materiału biologicznego pobranego od osobnika badanego poddaje się lizie z uwolnieniem oraz stabilizacją RNA;
b) lizat otrzymany w etapie a) poddaje się reakcji odwrotnej transkrypcji (RT) z zastosowaniem mieszaniny do reakcji RT zawierającej trzy zestawy starterów do reakcji RT i izotermicznej amplifikacji za pośrednictwem pętli (Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP) swoistych do każdego z genów N i M wirusa SARS-CoV-2, przy czym każdy pierwszy zestaw starterów zawiera sta rter przedni zewnętrzny (F3) i starter przedni wewnętrzny (FIP), drugi zestaw starterów zawiera starter tylny zewnętrzny (B3) i starter tylny wewnętrzny (BIP), zaś trzeci zestaw starterów zawiera starter przedni zapętlający (FL) i starter tylny zapętlający (BL);
c) produkt otrzymany w etapie b) przenosi się do mieszaniny odczynników do reakcji LAMP zawierającą barwnik fluorescencyjny; przeprowadza się reakcję LAMP, a następnie detekcję fluorymetryczną produktu reakcji amplifikacji kwasu nukleinowego genów N i M wirusa SARS-CoV-2, przy czym wynik pozytywny oznacza wykrycie materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2, przy czym w etapie b) stosuje się następujące trzy zestawy starterów do genu N wirusa SARS-CoV-2: pierwszy zestaw starterów:
N-F3: CCCTCAGATTCAACTGGCAGTA (NR ID. SEKW.: 1)
N-FIP: GAGAGCGGTGAACGGGCGCGATCAAAACAACG (NR ID. SEKW.: 2) drugi zestaw starterów:
N-B3: TTCATTTTACCGTCACCACCAC (NR ID. SEKW.: 3)
N-BIP: TCGAGGACAAGGCTTCGGTAGTAGCCAATTTGGTC (NR ID. SEKW.: 4) trzeci zestaw starterów:
N-FL: GACGCAGTATTATTGGGTAAACCT (NR ID. SEKW.: 5)
N-BL: CCAATTAACACCAATAGCAGTCCA (NR ID. SEKW.: 6), oraz w etapie b) stosuje się następujące trzy zestawy starterów do genu M wirusa SARS-CoV-2: pierwszy zestaw starterów:
M-F3: GGCCAGTAACTTTAGCTTGTTTTG (NR ID. SEKW.: 7)
M-FIP: AAACAGTCTGAAAGAACGCAATGGCTTGTCTTGTAGG (NR ID. SEKW.: 8) drugi zestaw starterów:
M-B3: GTCCAGCAATACGAAGATGTCC (NR ID. SEKW.: 9)
M-BIP: TTCTCAACGTGCCCAGCTCCGATTACGAGTTCACT (NR ID. SEKW.: 10) trzeci zestaw starterów:
M-FL: TGAAGTAGCTGAGCCACATCAA (NR ID. SEKW.: 11)
M-BL: TATTCTGACCAGACCGCTTCTA (NR ID. SEKW.: 12), i przy czym reakcje RT i LAMP przeprowadza się sekwencyjnie w jednym naczyniu reakcyjnym, które zawiera wkład stanowiący pierwszą komorę reakcyjną do przeprowadzenia reakcji RT, który to wkład tworzy w naczyniu reakcyjnym pierwszą i drugą komorę reakcyjną, ma formę podłużnego walca zwężającego się ku dołowi (lejka) o pojemności w zakresie od 0,05 μΙ do 5 pl i posiada przy ścianie bocznej otwór wylotowy służący do przenoszenia produktu reakcji RT do drugiej komory reakcyjnej naczynia reakcyjnego do przeprowadzenia reakcji LAMP i detekcji fluorymetrycznej produktu reakcji, przy czym naczynie to zawiera także wieczko o właściwościach optycznych pozwalających na bezpośredni pomiar fluorymetryczny w naczyniu reakcyjnym, i przy czym dodatkowo stosuje się gen referencyjny jako kontrolę wewnętrzną, przy czym do kontroli wewnętrznej stosuje się następujące trzy zestawy starterów do reakcji RT-LAMP swoistych dla genu referencyjnego, ACTB, przy czym pierwszy zestaw starterów zawiera starter przedni zewnętrzny (F3) i starter przedni wewnętrzny (FIP), drugi zestaw starterów zawiera starter tylny zewnętrzny (B3) i starter tylny wewnętrzny (BIP), zaś trzeci zestaw starterów zawiera starter przedni zapętlający (FL) i starter tylny zapętlający (BL) i przy czym pierwszy zestaw starterów to:
ACTB-F3: AGTACCCCATCGAGCACG (NR ID. SEKW.: 13)
ACTB-FIP: GAGCCACACGCAGCTCATTGTATCACCAACTGGGACGACA (NR ID. SEKW.: 14) drugi zestaw starterów to:
ACTB-B3: AGCCTGGATAGCAACGTACA (NR ID. SEKW.: 15)
ACTB-BIP: CTGAACCCCAAGGCCAACCGGCTGGGGTGTTGAAGGTC (NR ID. SEKW.: 16), zaś trzeci zestaw starterów to:
ACTB-LF: TGTGGTGCCAGATTTTCTCCA (NR ID. SEKW.: 17)
ACTB-LB: CGAGAAGATGACCCAGATCATGT (NR ID. SEKW.: 18).
Korzystnie w takim sposobie według wynalazku stosuje się ponadto próbkę negatywną i pozytywną SARS-CoV-2 jako odpowiednio kontrolę negatywną i pozytywną.
Korzystnie w takim sposobie według wynalazku jako próbkę materiału biologicznego stosuje się wymaz z nosa, gardła lub noso-gardła.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest ponadto sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2, w którym
a) w próbce materiału biologicznego pobranego od osobnika badanego, korzystnie wymazu z nosa, gardła lub noso-gardła, wykrywa się obecność materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 sposobem jak zdefiniowano w dowolnym z zastrzeżeń 1 do 3;
b) diagnozuje się zakażenie wirusem SARS-CoV-2 w przypadku wykrycia obecności w próbce materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2.
Opisano tu także zestaw testowy do wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 lub diagnozowania zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego od osobnika badanego, sposobami według wynalazku, zawierający trzy zestawy starterów do reakcji RT i LAMP swoistych dla każdego z genów N i M wirusa SARS-CoV-2, przy czym każdy pierwszy zestaw starterów zawiera starter przedni zewnętrzny (F3) i starter przedni wewnętrzny (FIP), drugi zestaw starterów zawiera starter tylny zewnętrzny (B3) i starter tylny wewnętrzny (BIP), zaś trzeci zestaw starterów zawiera starter przedni zapętlający (FL) i starter tylny zapętlający (BL).Taki zestaw zawiera następujące trzy zestawy starterów do genu N wirusa SARS-CoV-2 oraz trzy zestawy starterów do genu M wirusa SARS-CoV-2: pierwszy zestaw starterów:
N-F3: CCCTCAGATTCAACTGGCAGTA (NR ID. SEKW.: 1)
N-FIP: GAGAGCGGTGAACGGGCGCGATCAAAACAACG (NR ID. SEKW.: 2) drugi zestaw starterów:
N-B3: TTCATTTTACCGTCACCACCAC (NR ID. SEKW.: 3)
N-BIP: TCGAGGACAAGGCTTCGGTAGTAGCCAATTTGGTC (NR ID. SEKW.: 4) trzeci zestaw starterów:
N-FL: GACGCAGTATTATTGGGTAAACCT (NR ID. SEKW.: 5)
N-BL: CCAATTAACACCAATAGCAGTCCA (NR ID. SEKW.: 6) oraz następujące trzy zestawy starterów do genu M wirusa SARS-CoV-2: pierwszy zestaw starterów:
M-F3: GGCCAGTAACTTTAGCTTGTTTTG (NR ID. SEKW.: 7)
M-FIP: AAACAGTCTGAAAGAACGCAATGGCTTGTCTTGTAGG (NR ID. SEKW.: 8) drugi zestaw starterów:
M-B3: GTCCAGCAATACGAAGATGTCC (NR ID. SEKW.: 9)
M-BIP: TTCTCAACGTGCCCAGCTCCGATTACGAGTTCACT (NR ID. SEKW.: 10) trzeci zestaw starterów:
M-FL: TGAAGTAGCTGAGCCACATCAA (NR ID. SEKW.: 11) M-BL: TATTCTGACCAGACCGCTTCTA (NR ID. SEKW.: 12).
Taki zestaw zawiera dodatkowo kontrolę pozytywną i kontrolę negatywną SARS-CoV-2 oraz kontrolę wewnętrzną. Do kontroli wewnętrznej zestaw taki zawiera trzy zestawy starterów do reakcji RT-LAMP swoistych dla genu referencyjnego, korzystnie ACTB, przy czym pierwszy zestaw starterów zawiera starter przedni zewnętrzny (F3) i starter przedni wewnętrzny (FIP), drugi zestaw starterów zawiera starter tylny zewnętrzny (B3) i starter tylny wewnętrzny (BIP), zaś trzeci zestaw starterów zawiera starter przedni zapętlający (FL) i starter tylny zapętlający (BL), przy czym są to w szczególności następujące trzy zestawy starterów do genu referencyjnego ACTB: pierwszy zestaw starterów: ACTB-F3: AGTACCCCATCGAGCACG (NR ID. SEKW.: 13) ACTB-FIP: GAGCCACACGCAGCTCATTGTATCACCAACTGGGACGACA (NR ID. SEKW.: 14) drugi zestaw starterów:
ACTB-B3: AGCCTGGATAGCAACGTACA (NR ID. SEKW.: 15)
ACTB-BIP: CTGAACCCCAAGGCCAACCGGCTGGGGTGTTGAAGGTC (NR ID. SEKW.: 16) trzeci zestaw starterów:
ACTB-LF: TGTGGTGCCAGATTTTCTCCA (NR ID. SEKW.: 17)
ACTB-LB: CGAGAAGATGACCCAGATCATGT (NR ID. SEKW.: 18).
Nieoczekiwanie w obecnym wynalazku udało się rozwiązać istniejące do tej pory problemy diagnostyczne wynikające z przedstawionego stanu techniki. Sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego w warunkach laboratoryjnych oraz sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2(Test SARS-Hyb-45 w wersji laboratoryjnej, v. LAB). To innowacyjne rozwiązania diagnostyczne, służące do jednoznacznej identyfikacji specyficznych fragmentów genomu wirusa SARS-CoV-2 w próbkach materiału biologicznego, takich jak wymaz z nosa, gardła lub noso-gardła, które pozwalają na szybką, bardzo czułą, specyficzną i prostą diagnostykę SARS-CoV-2. Sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego w warunkach laboratoryjnych oraz sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 oparte są na integracji dwóch, zachodzących niezależnie i sekwencyjnie, technik molekularnych: reakcji odwrotnej transkrypcji (RT, ang. reverse transcription) oraz izotermalnej amplifikacji materiału genetycznego (LAMP, ang. Loop-Mediated Isothermal Amplification). Połączenie metod RT i LAMP pozwala na uzyskanie wyniku badania bardzo szybko, np. ok. 45 minut, i nie wymaga ani specjalnych warunków lokalowych, ani specjalistycznego sprzętu. Obie reakcje, tj. RT i LAMP, nie zachodzą jednocześnie, ale w dwóch odrębnych etapach, jedna po drugiej (czyli sekwencyjnie), co zwiększa wydajność całego procesu amplifikacji, i co ma swoje bezpośrednie przełożenie na wyższą czułość całego sposobu wykrywania.
Zgodnie z wynalazkiem te dwie niezależne reakcje molekularne przeprowadzane są korzystnie w dwóch niezależnych komorach reakcyjnych w jednym naczyniu reakcyjnym, w sposób sekwencyjny, tzn. po zajściu pierwszej reakcji - RT - w pierwszej komorze reakcyjnej, produkt pierwszej reakcji wprowadzany jest, np. z zastosowaniem siły odśrodkowej wirowania, do drugiej komory reakcyjnej, gdzie przeprowadzana jest druga reakcja - LAMP. Pierwsza komora reakcyjna jest korzystnie utworzona przez wkład do naczynia reakcyjnego, który to wkład ma formę podłużnego walca zwężającego się ku dołowi (lejka) o pojemności w zakresie od 0,05 pl do 5 pl i posiada przy ścianie bocznej otwór wylotowy, poprzez który produkt pierwszej reakcji otrzymany w etapie b) sposobu według wynalazku może być przenoszony poprzez działanie siły odśrodkowej (wirowanie) do drugiej komory reakcyjnej, w której zachodzi etap c) sposobu według wynalazku. Wkład ten pełni zatem funkcję jednocześnie separatora tworzącego pierwszą i drugą komorę reakcyjną w naczyniu reakcyjnym (rozdziela powierzchnię roboczą wnętrza pierwszej komory reakcyjnej od powierzchni roboczej wnętrza drugiej komory reakcyjnej), jak i lejka pozwalającego na przejście (przepływ) produktu reakcji zachodzącej w pierwszej komorze reakcyjnej do drugiej komory reakcyjnej, w której zachodzi druga reakcja i przeprowadzana jest detekcja fluorymetryczna. Zatem, w końcowym etapie c), po zakończeniu reakcji LAMP, tj. w drugiej mieszaninie reakcyjnej, przeprowadza się bezpośrednio odczyt fluorymetryczny wskazujący na status amplifikacji materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2, przy czym odczyt pozytywny wskazuje na obecność materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w badanej próbce materiału biologicznego, i pozwala na zdiagnozowania zakażenia wirusem SARS-CoV-2. Dzięki połączeniu tych technik niniejszy wynalazek pozwala na uproszczenie i radyklane skrócenie całego procesu diagnostycznego poprzez bezpośrednie wykorzystanie materiału biologicznego (z pominięciem izolacji RNA) przy jednoczesnym wysokim poziomie wykrywalności wirusa, wysokiej czułości, swoistości i dokładności.
Opisane tu laboratoryjne naczynia reakcyjne z wkładem tworzącym niezależne komory reakcyjne do przeprowadzenia dwóch reakcji molekularnych w jednej probówce („two-stage in one tube”), w których korzystnie przeprowadza się sposoby według wynalazku, są przedmiotem odrębnego zgłoszenia wynalazku. Zalety rozwiązań według wynalazku dotyczą zarówno prostoty wykonania jak i skrócenia czasu badania od pobrania materiału do uzyskania jednoznacznego wyniku (zmniejszenie etapowości badania w kierunku wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2), poprzez bezpośrednie wykorzystanie materiału biologicznego (z pominięciem izolacji RNA) oraz osiągnięcie wysokiego poziomu wykrywalności wirusa (niższa liczba kopii wykrywanego fragmentu genu wirusa świadczy o wyższej czułości testu).
Zalety sposobów w wersji laboratoryjnej według wynalazku polegają też na tym, że nie jest wymagana skomplikowana organizacja pomieszczeń laboratoryjnych, nie jest wymagane również skomplikowane wyposażenie, ponieważ elementy pomiarowe testu bazują na powszechnie dostępnych na rynku rozwiązaniach aparaturowych (proste i niedrogie urządzenia). Ponadto otrzymany wynik ze względu na prostą interpretację wyniku opartą o odczyt fluorymetryczny po amplifikacji (detekcja fluorymetryczna) nie wymaga doświadczonego personelu laboratoryjnego, a jedynie osób przeszkolonych pod kątem wykonania sposobu i interpretacji wyniku testu.
Sposób diagnostyczny według wynalazku przeprowadza się w kolejnych etapach opisanych poniżej.
a) Szybka liza materiału biologicznego wraz z uwolnieniem oraz stabilizacją RNA
Próbkę materiału biologicznego do badania zgodnie z wynalazkiem pobiera się w standardowy sposób, np. za pomocą komercyjnej wymazówki poliuretanowej lub nylonowej z nosa, gardła, lub noso-gardła, do probówki, np. Falcon 15 ml, w której znajduje się odpowiednie medium, np. w postaci roztworu 0,9% NaCl w objętości od 0,5 do 1,0 ml. Pobrany materiał wytrząsa się przez kilka sekund. Następnie materiał biologiczny, np. w proporcji objętościowej 10 μΙ do 90 μΙ, przenosi się do zimnego roztworu ekstrakcyjnego, np. Quick Extract RNA (BIOSEARCH TECHNOLOGIES, Cat. No. QER090150). Otrzymany lizat następnie krótko wytrząsa się, np. przez 1 min. Tak przygotowany materiał (lizat) służy jako matryca do badania w kolejnych etapach.
b) Reakcja odwrotnej transkrypcji (RT)
W kolejnym etapie lizat otrzymany w etapie a) poddaje się reakcji odwrotnej transkrypcji w standardowy sposób. Etap ten przeprowadza się w jednym naczyniu reakcyjnym, które zawiera wkład tworzący pierwszą komorę reakcyjną do przeprowadzenia reakcji RT, który to wkład ma formę podłużnego walca (lejka) posiadającego przy ścianie bocznej otwór wylotowy do przenoszenia produktu reakcji RT do drugiej komory reakcyjnej naczynia reakcyjnego do przeprowadzenia reakcji LAMP i detekcji fluorymetrycznej produktu reakcji, oraz wieczko o właściwościach optycznych pozwalających na bezpośredni pomiar fluorymetryczny bezpośrednio w naczyniu reakcyjnym.
Przykładowe składowe reakcji odwrotnej transkrypcji (RT) z trzema zestawami starterów do każdego z genów N i M wirusa SARS-CoV-2 oraz kontrolą endogenną są następujące:
1. Woda wolna od nukleaz - może to być dowolna woda odpowiednia do przeprowadzania reakcji RT;
2. Mieszanina do odwrotnej transkrypcji (RT) zawierająca odpowiednie enzymy do rekacji RT - może to być np. RT Mix - SuperScript™ VILO™ Master Mix, nr kat. 11755050 (Invitrogen);
3. Mieszanina starterów LAMP do genu N i M wirusa SARS-CoV-2;
4. Mieszania starterów do kontroli endogennej - np. genu referencyjnego, np. genu beta-aktyny (ACTB).
Należy zauważyć, że każdy z trzech zestawów starterów do każdego z genów N i M wirusa SARS-CoV-2 zawiera:
pierwszy zestaw starterów: starter przedni zewnętrzny (F3) i starter przedni wewnętrzny (FIP), drugi zestaw starterów: starter tylny zewnętrzny (B3) i starter tylny wewnętrzny (BIP), trzeci zestaw starterów: starter przedni zapętlający (FL) i starter tylny zapętlający (BL).
Zgodnie z wynalazkiem stosuje się następujące sekwencje opisanych powyżej zestawów starterów do genów N i M wirusa SARS-CoV-2 oraz genu ACTB.
Sekwencje zestawów starterów dla genu N:
pierwszy zestaw starterów:
N-F3: CCCTCAGATTCAACTGGCAGTA (NR ID. SEKW.: 1)
N-FIP: GAGAGCGGTGAACGGGCGCGATCAAAACAACG (NR ID. SEKW.: 2) drugi zestaw starterów:
N-B3: TTCATTTTACCGTCACCACCAC (NR ID. SEKW.: 3)
N-BIP: TCGAGGACAAGGCTTCGGTAGTAGCCAATTTGGTC (NR ID. SEKW.: 4) trzeci zestaw starterów:
N-FL: GACGCAGTATTATTGGGTAAACCT (NR ID. SEKW.: 5)
N-BL: CCAATTAACACCAATAGCAGTCCA (NR ID. SEKW.: 6).
Sekwencje zestawów starterów dla genu M:
pierwszy zestaw starterów:
M-F3: GGCCAGTAACTTTAGCTTGTTTTG (NR ID. SEKW.: 7)
M-FIP: AAACAGTCTGAAAGAACGCAATGGCTTGTCTTGTAGG (NR ID. SEKW.: 8) drugi zestaw starterów:
M-B3: GTCCAGCAATACGAAGATGTCC (NR ID. SEKW.: 9)
M-BIP: TTCTCAACGTGCCCAGCTCCGATTACGAGTTCACT (NR ID. SEKW.: 10) trzeci zestaw starterów:
M-FL: TGAAGTAGCTGAGCCACATCAA (NR ID. SEKW.: 11)
M-BL: TATTCTGACCAGACCGCTTCTA (NR ID. SEKW.: 12).
Sekwencje zestawów starterów dla genu kontroli wewnętrznej - ACTB: pierwszy zestaw starterów:
ACTB-F3: AGTACCCCATCGAGCACG (NR ID. SEKW.: 13)
ACTB-FIP: GAGCCACACGCAGCTCATTGTATCACCAACTGGGACGACA (NR ID. SEKW.: 14) drugi zestaw starterów:
ACTB-B3: AGCCTGGATAGCAACGTACA (NR ID. SEKW.: 15)
ACTB-BIP: CTGAACCCCAAGGCCAACCGGCTGGGGTGTTGAAGGTC (NR ID. SEKW.: 16) trzeci zestaw starterów:
ACTB-LF: TGTGGTGCCAGATTTTCTCCA (NR ID. SEKW.: 17)
ACTB-LB: CGAGAAGATGACCCAGATCATGT (NR ID. SEKW.: 18)
Proporcje mieszaniny RT (1 rxn.) Woda - 1,38 μl
Mieszanina do RT - 0,12 μΙ
Mieszanina starterów (10X) - 2,5 μΙ
Całkowita objętość: 4 μΙ
Do mieszaniny RT należy dodać 1 μΙ lizatu otrzymanego w etapie a). Reakcję w etapie b) przeprowadza się w komorze pierwszej (górna komora).
Profil termiczny reakcji RT: 42°C (termocykler do PCR, grzanie góra/dół) przez 20 min.
c) Reakcja LAMP
W kolejnym etapie materiał otrzymany w etapie b) w wyniku reakcji RT przenosi się z pierwszej, górnej, komory reakcyjnej do drugiej, dolnej, komory reakcyjnej, gdzie przeprowadza się reakcję LAMP. Przenoszenie to przeprowadza się przez wirowanie naczynia reakcyjnego przez 30 s przy 2500 g.
Przykładowe składowe reakcji LAMP:
1. Woda wolna od nukleaz - może to być dowolna woda odpowiednia do przeprowadzania reakcji RT lub LAMP;
2. Mieszanina do amplifikacji izotermalnej LAMP mogąca zawierać barwnik fluorescencyjny do detekcji fluorymetrycznej - może to być np. Zestaw WarmStart® Fluorescent LAMP/RT-LAMP Kit (z UDG) (New England of BioLabs, UK, nr kat. E1708L);
3. Roztwór chlorowodorku guanidyny - np. Guanidine hydrochloride solution, 6M, Merck, nr kat. SRE0066-100ML;
4. LAMP Fluorescent Dye (New England BioLabs, UK, Cat. No. B1700S).
Proporcje mieszaniny LAMP (1 rxn.)
Woda - 4,5 μl
Mieszanina do reakcji LAMP (LAMP Master Mix) - 12,5 μl
Roztwór chlorowodorku guanidyny (840 mM) - 2,5 μl
Barwnik fluorescencyjny -0,5 μl
Całkowita objętość: 20 μl
Do mieszaniny LAMP należy dodać materiał otrzymany w etapie b) sposobu według wynalazku, tj. produkt reakcji RT, przeprowadzanej w pierwszej, górnej, komorze reakcyjnej. Następuje to przez wirowanie naczynia reakcyjnego przez 30 s przy 2500 g.
Profil termiczny reakcji LAMP: 65°C (można wykorzystać np. dowolny aparat typu Real-Time) przez 25 min.
Odczyt wyniku przeprowadza się fluorescencyjnie w kanale zielonym.
W sposobie według wynalazku stosuje się kontrolę wewnętrzną (endogenną) w postaci genu referencyjnego, a korzystnie także odpowiednią kontrolę pozytywną i negatywną, jak wiadomo w dziedzinie. Każdą z reakcji kontroli wewnętrznej, kontroli negatywnej, kontroli pozytywnej i próbki badanej przeprowadza się w osobnym naczyniu reakcyjnym.
W sposobach według wynalazku można wykorzystać dowolne odpowiednie do reakcji RT i LAMP laboratoryjne naczynia reakcyjne, takie jak probówki. Dogodnie stosuje się jednak do tego celu naczynia reakcyjne dostosowane do przeprowadzania sposobów według wynalazku jak opisano powyżej. Niwelują one konieczność manualnego przenoszenia produktu pierwszej reakcji z pierwszej komory reakcyjnej do drugiej komory reakcyjnej. Takie naczynie reakcyjne zawiera specjalny wkład, który to wkład tworzy pierwszą komorę reakcyjną, ma formę podłużnego walca zwężającego się ku dołowi (lejka) o pojemności w zakresie od 0,05 μl do 5 μl i posiada przy ścianie bocznej otwór wylotowy do przenoszenia produktu pierwszej reakcji - RT - do drugiej komory reakcyjnej, oddzielonej od pierwszej komory reakcyjne ww. wkładem, gdzie przeprowadzana jest reakcja LAMP i detekcja fluorymetryczna, oraz wieczko o właściwościach optycznych pozwalających na bezpośredni pomiar fluorescencji bez konieczności otwierania naczynia reakcyjnego, co upraszcza, skraca i ułatwia proces diagnostyczny. Wkład do naczynia reakcyjnego tworzy zatem jednocześnie pierwszą komorę reakcyjną i oddzielają od drugiej komory reakcyjnej znajdującej się w tym samym naczyniu reakcyjnym, zaś znajdujący się w nim otwór wylotowy pozwala, poprzez działanie siły odśrodkowej podczas wirowania, na przeniesienie produktu pierwszej reakcji z pierwszej komory reakcyjnej do drugiej komory reakcyjnej bez konieczności otwierania naczynia reakcyjnego.
Opisane tu naczynie reakcyjne może mieć postać układu naczyń reakcyjnych w postaci paska, który zawiera wiele naczyń reakcyjnych położonych równolegle względem siebie, oraz dopasowane do nich wieczka. Dopasowane do nich wieczka mają właściwości optyczne pozwalających na bezpośredni pomiar fluorescencji bez konieczności otwierania naczyń reakcyjnych w takim układzie naczyń reakcyjnych. Przykładowo, układ ten może mieć postać 8 naczyń reakcyjnych o pojemności 0,1 lub 0,2 ml, położonych względem siebie równolegle w postaci paska, albo płytki, zawierającej np. 96 naczyń reakcyjnych o pojemności 0,1 lub 0,2 ml.
Przykładowe naczynia reakcyjne tu opisane przedstawione są na figurach 1-7:
Fig. 1: Płytka 96-dołkowa z naczyniami reakcyjnymi o pojemności 0,1 ml
Fig. 2: Płytka 96-dołkowa z naczyniami reakcyjnymi o pojemności 0,2 ml
Fig. 3: Wkład do naczyń reakcyjnych w płytkach 96-dołkowych o pojemności 0,1 ml
Fig. 4: Wkład do naczyń reakcyjnych w płytkach 96-dołkowych o pojemności 0,2 ml
Fig. 5: Wieczko zamykające naczynia reakcyjne w płytce 96-dołkowej w dwóch pojemnościach. Wieczko to ma właściwości optyczne, pozwalające na przenikanie mierzonej wiązki fluorescencji.
Fig. 6: Naczynia reakcyjne o pojemności 0,1 i 0,2 ml z wkładem (lejkiem).
Fig. 7: Przykładowy układ naczyń reakcyjnych wraz z testowanymi próbkami do przeprowadzenia sposobów według wynalazku z wykorzystaniem opisanego tu zestawu testowego.
Wynalazki według niniejszego zgłoszenia oparte są na pomiarze amplifikacji wyselekcjonowanych obszarów genomowych wirusa SARS-CoV-2 przy użyciu innowacyjnego, autorskiego protokołu technologiczno-metodologicznego.
Wynalazki według niniejszego zgłoszenia są tak zaprojektowane, aby m óc je użyć bezpośrednio po pobraniu próbki materiału biologicznego, tj. wymazu, od osobnika badanego, np. pacjenta, z pominięciem dodatkowych czynności pipetowania mieszanin reakcyjnych. Komory naczynia reakcyjnego są napełnione reagentami, co czyni je łatwymi i przystępnymi użytkownikowi. Naczynie reakcyjne zawiera dwie odseparowane od siebie przestrzennie za pomocą wkładu (separatora pełniącego jednocześnie funkcję lejka) komory reakcyjne, w których zachodzą dwie niezależne następujące po sobie sekwencyjnie reakcje molekularne. Technologie zastosowane zgodnie z wynalazkiem współdziałają ze sobą w sposób hybrydowy, powodując szybkie i czułe zajście reakcji amplifikacji (czas przeprowadzenia testu to 45 min) i są opracowane w formie wielkoprzepustowej. Dzięki zintegrowaniu innowacyjnych komór reakcyjnych w formacie płytki 96-dołkowej kompatybilnej z powszechnie dostępnymi aparatami typu Real-Time PCR obecnymi w specjalistycznych laboratoriach diagnostycznych, możliwe jest szybkie, proste i dokładne badanie wielu próbek jednocześnie.
Niniejszy wynalazek zostanie teraz zilustrowany w poniższym przykładzie, który jednak nie ma na celu ograniczenia w żaden sposób zakresu wynalazku zdefiniowanego w zastrzeżeniach patentowych.
Przykład - Sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce od pacjenta i sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 z zastosowaniem opisanego tu zestawu testowego
Wszystkie opisane poniżej procedury przeprowadzono z zastosowaniem komercyjnie dostępnych zestawów testowych, odczynników i aparatury, postępując zgodnie z zaleceniami producentów stosowanych zestawów, odczynników i aparatury, o ile nie wskazano wyraźnie inaczej, przy czym stosowano standardowe, powszechnie znane metody wykorzystywane w dziedzinie, do której należy niniejszy wynalazek.
Sposób według wynalazku przeprowadzono w kolejnych etapach opisanych poniżej. Do badania sposobem według wynalazku i oceny jego skuteczności wykorzystano 400 próbek wymazu z nosa/gardła/noso-gardła, w tym 100 próbek pozytywnych na obecność wirusa SARS-CoV-2 (wyniki potwierdzone za pomocą testu RT-PCR CE IVD) oraz 300 próbek negatywnych na obecność wirusa (wyniki również potwierdzone przy użyciu testu RT-PCR CE IVD). W toku badania nie stwierdzono próbek utraconych.
a) Szybka liza materiału biologicznego wraz z uwolnieniem oraz stabilizacją RNA
Materiał biologiczny do badania zgodnie z wynalazkiem pobrano w standardowy sposób, za pomocą komercyjnej wymazówki z nosa i/lub gardła, lub z noso-gardła, do probówki Falcon 15 ml z medium, w postaci roztworu 0,9% NaCl w objętości 0,5 ml. Pobrany materiał wytrząsano przez kilka sekund. Następnie materiał biologiczny w objętości 10 pl przenoszono do 90 pl zimnego roztworu ekstrakcyjnego - Quick Extract RNA (BIOSEARCH TECHNOLOGIES, Cat. No. QER090150). Otrzymany lizat następnie krótko wytrząsano przez 1 min. Tak przygotowany materiał (lizat) wykorzystano jako matrycę w dalszych etapach, tj. reakcji RT i LAMP.
b) Reakcja odwrotnej transkrypcji (RT)
W kolejnym etapie lizat otrzymany w etapie a) poddano reakcji odwrotnej transkrypcji w standardowy sposób, w pierwszej komorze reakcyjnej którą stanowił wkład naczynia reakcyjnego z otworem pozwalającym na przejście materiału po reakcji RT do drugiej komory reakcyjnej, w której przeprowadzano reakcję LAMP. Zastosowane składowe reakcji odwrotnej transkrypcji (RT) z trzema zestawami starterów do każdego z genów N i M wirusa SARS-CoV-2 oraz do genu referencyjnego - ACTB - kontroli endogennej - były następujące:
1. Woda wolna od nukleaz - do przeprowadzania reakcji RT;
2. Mieszanina do odwrotnej transkrypcji (RT) - RT Mix - SuperScript™ VILO™ Master Mix, nr kat. 11755050 (Invitrogen);
3. Mieszanina starterów LAMP do genu N i M;
4. Mieszania starterów dla kontroli endogennej - ACTB.
W reakcji zastosowano następujące zestawy starterów do genów N i M wirusa SARS-CoV-2 oraz genu ACTB.
Sekwencje zestawów starterów do genu N: pierwszy zestaw starterów:
N-F3: CCCTCAGATTCAACTGGCAGTA (NR ID. SEKW.: 1)
N-FIP: GAGAGCGGTGAACGGGCGCGATCAAAACAACG (NR ID. SEKW.: 2) drugi zestaw starterów:
N-B3: TTCATTTTACCGTCACCACCAC (NR ID. SEKW.: 3)
N-BIP: TCGAGGACAAGGCTTCGGTAGTAGCCAATTTGGTC (NR ID. SEKW.: 4) trzeci zestaw starterów:
N-FL: GACGCAGTATTATTGGGTAAACCT (NR ID. SEKW.: 5)
N-BL: CCAATTAACACCAATAGCAGTCCA (NR ID. SEKW.: 6).
Sekwencje zestawów starterów do genu M: pierwszy zestaw starterów:
M-F3: GGCCAGTAACTTTAGCTTGTTTTG (NR ID. SEKW.: 7)
M-FIP: AAACAGTCTGAAAGAACGCAATGGCTTGTCTTGTAGG (NR ID. SEKW.: 8) drugi zestaw starterów:
M-B3: GTCCAGCAATACGAAGATGTCC (NR ID. SEKW.: 9)
M-BIP: TTCTCAACGTGCCCAGCTCCGATTACGAGTTCACT (NR ID. SEKW.: 10) trzeci zestaw starterów:
M-FL: TGAAGTAGCTGAGCCACATCAA (NR ID. SEKW.: 11)
M-BL: TATTCTGACCAGACCGCTTCTA (NR ID. SEKW.: 12).
Sekwencje zestawów starterów dla genu referencyjnego ACTB: pierwszy zestaw starterów:
ACTB-F3: AGTACCCCATCGAGCACG (NR ID. SEKW.: 13)
ACTB-FIP: GAGCCACACGCAGCTCATTGTATCACCAACTGGGACGACA (NR ID. SEKW.: 14) drugi zestaw starterów:
ACTB-B3: AGCCTGGATAGCAACGTACA (NR ID. SEKW.: 15)
ACTB-BIP: CTGAACCCCAAGGCCAACCGGCTGGGGTGTTGAAGGTC (NR ID. SEKW.: 16) trzeci zestaw starterów:
ACTB-LF: TGTGGTGCCAGATTTTCTCCA (NR ID. SEKW.: 17)
ACTB-LB: CGAGAAGATGACCCAGATCATGT (NR ID. SEKW.: 18)
Proporcje mieszaniny RT (1 rxn.) były następujące:
Woda - 1,38 pl
Mieszanina do RT - 0,12 pl
Mieszanina starterów (10X) - 2,5 pl
Całkowita objętość reakcji: 4 pl
Do mieszaniny RT dodano 1 pl lizatu otrzymanego w etapie a). Reakcję przeprowadzono w komorze pierwszej (górna komora) z zastosowaniem następującego profilu termicznego reakcji RT: 42°C (termocykler SimpliAmp Thermal Cycler, grzanie góra/dół) przez 20 min.
PL 249160 Β1
c) Reakcja LAMP
W kolejnym etapie materiał otrzymany w etapie b) w wyniku reakcji RT przeniesiono z pierwszej, górnej, komory reakcyjnej w postaci wkładu do naczynia reakcyjnego, poprzez wirowanie, do drugiej, dolnej, komory reakcyjnej, gdzie przeprowadzano reakcję LAMP. Przenoszenie to przeprowadzano poprzez wirowanie naczynia reakcyjnego przez 30 sekund przy 2500 g.
Zastosowane składowe reakcji LAMP:
1. Woda wolna od nukleaz - odpowiednia do przeprowadzania reakcji LAMP;
2. Mieszanina do amplifikacji izotermalnej LAMP dedykowana do detekcji fluorymetrycznej - Zestaw WarmStart® Fluorescent LAMP/RT-LAMP Kit (zUDG) (NewEngland of BioLabs, UK, nr kat. E1708L)
3. 6M roztwór chlorowodorku guanidyny - Guanidine hydrochloride solution, 6M, Merck, nr kat. SRE0066-100ML.
4. LAMP Fluorescent Dye (New England BioLabs, UK, Cat. No. B1700S).
Proporcje mieszaniny LAMP (1 rxn.) były następujące:
Woda - 4,5 pi
Mieszanina do reakcji LAMP (LAMP Master Mix) - 12,5 pi
Roztwór chlorowodorku guanidyny (840 mM) - 2,5 μΙ
Barwnik fluorescencyjny - 0,5 μΙ
Całkowita objętość: 20 μΙ
Do mieszaniny LAMP dodano produkt otrzymany w etapie b) sposobu według wynalazku, tj. produkt reakcji RT, przeprowadzanej w pierwszej, górnej, komorze reakcyjnej (wirowanie: 30 s, 2500 g).
Reakcję LAMP przeprowadzono w aparacie typu termocykler do PCR w czasie rzeczywistym (CFX96™ Dx) z zastosowaniem następującego profilu termicznego reakcji LAMP: 65°C przez 25 min.
Odczyt wyniku przeprowadzono fluorescencyjnie w kanale zielonym (Green/FAM).
Jak pokazano na Fig. 6 zastosowano także odpowiednią kontrolę pozytywną i negatywną oraz kontrolę wewnętrzną. Każdą z reakcji kontroli wewnętrznej, kontroli negatywnej, kontroli pozytywnej i próbki badanej przeprowadzano w osobnym naczyniu reakcyjnym.
Następnie przeprowadzono walidację kliniczną opracowanych rozwiązań według wynalazku. Celem walidacji klinicznej była ocena skuteczności działania rozwiązań według wynalazku do wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego, tj. z wymazu nosowego/gardłowego/noso-gardłowego, w porównaniu z komercyjnym testem RT-qPCR CE IVD.
Punkty końcowe/poznawcze
Punktem końcowym walidacji było otrzymanie zestawienia wyników zestawów testowych w konfrontacji z wynikami komparatora RT-qPCR, na podstawie którego można było wyliczyć podstawowe parametry diagnostyczne zestawu testowego, tj. Czułość, Specyficzność, Prawdopodobieństwo otrzymania wyniku negatywnego (NLR, Negative Likelihood Ratio), Wartość predykcji wyników pozytywnych (PPV, Positive Predictive Value), Wartość predykcji wyników negatywnych (NPV, Negative Predictive Value), dokładność (Accuracy).
Metoda statystyczna
Próbki skolekcjonowane podczas projektu (ponad 500 próbek) zostały wybrane w sposób randomowy do przeprowadzenia właściwego badania, przy założeniu, że grupa badana będzie obejmowała 400 wymazów, w tym 100 prób pozytywnych na obecność wirusa SARS-CoV-2 oraz 300 próbek negatywnych na obecność wirusa. Badanie miało charakter retrospektywny.
Otrzymana czułość i specyficzność została przeanalizowana w świetle aktualnego stanu techniki i zaleceń MDCG-21 Rev.1.
Czułość w odniesieniu do rozwiązań według wynalazku dotyczących wykrywania koronawirusa oznacza odsetek próbek dodatnich na obecność koronawirusa wykrytych przez komparator RT-qPCR, które są prawidłowo identyfikowane przez test, obliczony za pomocą następującego równania.
Liczba wyników prawdziwie pozytywnych
Czułość % = -----------------------------------------x 100
Liczba wyników prawdziwie pozytywnych +
Liczba wyników fałszywie negatywnych)
Specyficzność (swoistość) w odniesieniu do rozwiązań według wynalazku dotyczących wykrywania koronawirusa oznacza odsetek próbek ujemnych na koronawirusa sklasyfikowanych przez komparator RT-qPCR, które zostały prawidłowo zidentyfikowane jako ujemne w teście, obliczona przy użyciu następującego równania.
PL 249160 Β1
Liczba wyników prawdziwie negatywnych
Specyficzność % = --------------------—---------------- x 100
Liczba wyników prawdziwie negatywnych + Liczba wyników fałszywie pozytywnych)
Dokładny przebieg analiz zapisany jest w następujących punktach:
1) Wybór prób do walidacji
2) Przeprowadzenie izolacji RNA do wykonania reakcji komparatora RT-qPCR
3) Wykonanie oznaczeń RT-qPCR
4) Zestawienie wyników komparatora RT-qPCR w arkuszu CRF
5) Wykonanie oznaczeń zestawu testowego dla wersji LAB
6) Zestawienie wyników zestawu testowego dla wersji LAB w arkuszu CRF
Liczba próbek do każdego ramienia
Ramię komparatora - 400 prób - zestaw RT-qPCR
I Ramię testowe - 400 prób - sposób według wynalazku w wersji laboratoryjnej i opisany tu zestaw Ocena skuteczności działania z zastosowaniem analizy statystycznej otrzymanych wyników z badania 400 próbek jak wskazano powyżej pozwoliła stwierdzić, że sposób według wynalazku wykazał 99% czułości i 100% specyficzności (brak wyników fałszywie dodatnich oraz 1 wynik fałszywie ujemny). Wyniki podsumowane są w Tabelach 1 i 2.
Tabela 1. Podsumowanie wyników badania
Referencyjna reakcja RT-PCR
Próbka --------------------------------- Łącznie
Pozytywna Negatywna
Pozytywna 99 099
Negatywna 1 300301
Łącznie 100 300400
Tabela 2. Analiza wyników badania
Wynik Przedział ufności (CI) 95%
Czułość 99,00% 94,55% do 99,97%
Specyficzność 100,00% 98,78% do 100,00%
Prawdopodobieństwo otrzymania wyniku pozytywnego (Positive Likelihood Ratio) N/A N/A
Prawdopodobieństwo otrzymania wyniku negatywnego (Negative Likelihood Ratio) 0,01 0,00 do 0,07
Wartość predykcji wyników pozytywnych (Positive Predictive Value) 100,00%
Wartość predykcji wyników negatywnych (Negative Predictive Value) 99,67% 97,71% do 99,95%
Dokładność 99,75% 98,62% do 99,99%
Uzyskane wyniki potwierdzają zatem, że sposoby według wynalazku oraz opisany tu zestaw testowy do przeprowadzania takich sposobów pozwalają na szybkie, proste, bardzo czułe i specyficzne wykrywanie materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego do badania w warunkach laboratoryjnych, jak również diagnozowanie in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2.
PL 249160 Β1
WYKAZ SEKWENCJI < 110> Akademicki Ośrodek Diagnostyki Patomorfologicznej i
Genetyczno-Molekularnej Sp. z o.o.
< 120> Sposób wykrywania materiału genetycznego SARS-CoV-2, sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w wersji laboratoryj ne j < 130> 17P52231PL00 < 160> 18 < 170> BiSSAP 1.3.6 < 210> 1 < 211> 22 < 212> DNA < 213> Sekwencja sztuczna <220>
< 223> N-F3 < 400> 1 ccctcagatt caactggcag ta 22 < 210> 2 < 211> 32 < 212> DNA < 213> Sekwencja sztuczna <220>
< 223> N-FIP < 400> 2 gagagcggtg aacgggcgcg atcaaaacaa cg < 210> 3 < 211> 22 < 212> DNA < 213> Sekwencja sztuczna
PL 249160 Β1 <220>
<223> N-B3 <400> 3 ttcattttac cgtcaccacc ac <210> 4 <211> 35 < 212> DNA < 213> Sekwencja sztuczna <220>
< 223> N-BIP < 400> 4 tcgaggacaa ggcttcggta gtagccaatt tggtc <210> 5 < 211> 24 < 212> DNA < 213> Sekwencja sztuczna <220>
< 223> N-FL < 400> 5 gacgcagtat tattgggtaa acct <210> 6 <211> 24 < 212> DNA < 213> Sekwencja sztuczna <220>
< 223> N-BL < 400> 6 ccaattaaca ccaatagcag tcca
PL 249160 Β1 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<22 3> M-F3 <400> 7 ggccagtaac tttagcttgt tttg 24 <210> 8 <21i> 37 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> M-FIP <400> 8 aaacagtctg aaagaacgca atggcttgtc ttgtagg 37 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> M-B3 <400> 9 gtccagcaat acgaagatgt cc 22 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> M-BIP
PL 249160 Β1 <400> 10 ttctcaacgt gcccagctcc gattacgagt tcact <210> 11 <211> 22 < 212> DNA < 213> Sekwencja sztuczna <220>
< 223> M-FL < 400> 11 tgaagtagct gagccacatc aa <210> 12 < 211> 22 < 212> DNA < 213> Sekwencja sztuczna <220>
< 223> M-BL < 400> 12 tattctgacc agaccgcttc ta <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> ACTB-F3 <400> 13 agtaccccat cgagcacg <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
PL 249160 Β1 <220>
<223> ACTB-FIP <400> 14 gagccacacg cagctcattg tatcaccaac tgggacgaca <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> ACTB-B3 <400> 15 agcctggata gcaacgtaca <210> 16 <211> 38 < 212> DNA < 213> Sekwencja sztuczna <220>
< 223> ACTB-BIP < 400> 16 ctgaacccca aggccaaccg gctggggtgt tgaaggtc <210> 17 <211> 21 < 212> DNA < 213> Sekwencja sztuczna <220>
< 223> ACTB-LF < 400> 17 tgtggtgcca gattttctcc a
PL 249160 Β1 <210> 18 <211> 23 < 212> DNA < 213> Sekwencja sztuczna <220>
< 223> ACTB-LB <400> 18 cgagaagatg acccagatca tgt

Claims (4)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w próbce materiału biologicznego w warunkach laboratoryjnych, obejmujący następujące etapy, w których:
    a) próbkę materiału biologicznego pobranego od osobnika badanego poddaje się lizie z uwolnieniem oraz stabilizacją RNA;
    b) lizat otrzymany w etapie a) poddaje się reakcji odwrotnej transkrypcji (RT) z zastosowaniem mieszaniny do reakcji RT zawierającej trzy zestawy starterów do reakcji RT i izotermicznej amplifikacji za pośrednictwem pętli (Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP) swoistych do każdego z genów N i M wirusa SARS-CoV-2, przy czym każdy pierwszy zestaw starterów zawiera starter przedni zewnętrzny (F3) i starter przedni wewnętrzny (FIP), drugi zestaw starterów zawiera starter tylny zewnętrzny (B3) i starter tylny wewnętrzny (BIP), zaś trzeci zestaw starterów zawiera starter przedni zapętlający (FL) i starter tylny zapętlający (BL);
    c) produkt otrzymany w etapie b) przenosi się do mieszaniny odczynników do reakcji LAMP zawierającą barwnik fluorescencyjny; przeprowadza się reakcję LAMP, a następnie detekcję fluorymetryczną produktu reakcji amplifikacji kwasu nukleinowego genów N i M wirusa SARS-CoV-2, przy czym wynik pozytywny oznacza wykrycie materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2, przy czym w etapie b) stosuje się następujące trzy zestawy starterów do genu N wirusa SARS-CoV-2:
    pierwszy zestaw starterów:
    N-F3: CCCTCAGATTCAACTGGCAGTA (NR ID. SEKW.: 1)
    N-FIP: GAGAGCGGTGAACGGGCGCGATCAAAACAACG (NR ID. SEKW.: 2) drugi zestaw starterów:
    N-B3: TTCATTTTACCGTCACCACCAC (NR ID. SEKW.: 3)
    N-BIP: TCGAGGACAAGGCTTCGGTAGTAGCCAATTTGGTC (NR ID. SEKW.: 4) trzeci zestaw starterów:
    N-FL: GACGCAGTATTATTGGGTAAACCT (NR ID. SEKW.: 5)
    N-BL: CCAATTAACACCAATAGCAGTCCA (NR ID. SEKW.: 6), oraz w etapie b) stosuje się następujące trzy zestawy starterów do genu M wirusa SARS-CoV-2: pierwszy zestaw starterów:
    M-F3: GGCCAGTAACTTTAGCTTGTTTTG (NR ID. SEKW.: 7)
    M-FIP: AAACAGTCTGAAAGAACGCAATGGCTTGTCTTGTAGG (NR ID. SEKW.: 8) drugi zestaw starterów:
    M-B3: GTCCAGCAATACGAAGATGTCC (NR ID. SEKW.: 9)
    M-BIP: TTCTCAACGTGCCCAGCTCCGATTACGAGTTCACT (NR ID. SEKW.: 10) trzeci zestaw starterów:
    M-FL: TGAAGTAGCTGAGCCACATCAA (NR ID. SEKW.: 11)
    M-BL: TATTCTGACCAGACCGCTTCTA (NR ID. SEKW.: 12), i przy czym reakcje RT i LAMP przeprowadza się sekwencyjnie w jednym naczyniu reakcyjnym, które zawiera wkład stanowiący pierwszą komorę reakcyjną do przeprowadzenia reakcji RT, który to wkład tworzy w naczyniu reakcyjnym pierwszą i drugą komorę reakcyjną, ma formę podłużnego walca zwężającego się ku dołowi (lejka) o pojemności w zakresie od 0,05 μΙ do 5 μΙ i posiada przy ścianie bocznej otwór wylotowy służący do przenoszenia produktu reakcji RT do drugiej komory reakcyjnej naczynia reakcyjnego do przeprowadzenia reakcji LAMP i detekcji fluorymetrycznej produktu reakcji, przy czym naczynie to zawiera także wieczko o właściwościach optycznych pozwalających na bezpośredni pomiar fluorymetryczny w naczyniu reakcyjnym, i przy czym dodatkowo stosuje się gen referencyjny jako kontrolę wewnętrzną, przy czym do kontroli wewnętrznej stosuje się następujące trzy zestawy starterów do reakcji RT-LAMP swoistych dla genu referencyjnego, ACTB, przy czym pierwszy zestaw starterów zawiera starter przedni zewnętrzny (F3) i starter przedni wewnętrzny (FIP), drugi zestaw starterów zawiera starter tylny zewnętrzny (B3) i starter tylny wewnętrzny (BIP), zaś trzeci zestaw starterów zawiera starter przedni zapętlający (FL) i starter tylny zapętlający (BL) i przy czym pierwszy zestaw starterów to:
    ACTB-F3: AGTACCCCATCGAGCACG (NR ID. SEKW.: 13)
    ACTB-FIP: GAGCCACACGCAGCTCATTGTATCACCAACTGGGACGACA (NR ID. SEKW.: 14) drugi zestaw starterów to:
    ACTB-B3: AGCCTGGATAGCAACGTACA (NR ID. SEKW.: 15)
    ACTB-BIP: CTGAACCCCAAGGCCAACCGGCTGGGGTGTTGAAGGTC (NR ID. SEKW.: 16), zaś trzeci zestaw starterów to:
    ACTB-LF: TGTGGTGCCAGATTTTCTCCA (NR ID. SEKW.: 17)
    ACTB-LB: CGAGAAGATGACCCAGATCATGT (NR ID. SEKW.: 18).
  2. 2. Sposób według zastrzeżenia 1, w którym stosuje się ponadto próbkę negatywną i pozytywną SARS-CoV-2 jako odpowiednio kontrolę negatywną i pozytywną.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, w którym jako próbkę materiału biologicznego stosuje się wymaz z nosa, gardła lub noso-gardła.
  4. 4. Sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2, w którym
    a) w próbce materiału biologicznego pobranego od osobnika badanego, korzystnie wymazu z nosa, gardła lub noso-gardła, wykrywa się obecność materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 sposobem jak zdefiniowano w dowolnym z zastrzeżeń 1 do 3 ;
    b) diagnozuje się zakażenie wirusem SARS-CoV-2 w przypadku wykrycia obecności w próbce materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2.
PL446010A 2023-09-01 2023-09-01 Sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 oraz sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w wersji laboratoryjnej PL249160B1 (pl)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL446010A PL249160B1 (pl) 2023-09-01 2023-09-01 Sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 oraz sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w wersji laboratoryjnej

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL446010A PL249160B1 (pl) 2023-09-01 2023-09-01 Sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 oraz sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w wersji laboratoryjnej

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL446010A1 PL446010A1 (pl) 2025-03-03
PL249160B1 true PL249160B1 (pl) 2026-03-02

Family

ID=94771165

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL446010A PL249160B1 (pl) 2023-09-01 2023-09-01 Sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 oraz sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w wersji laboratoryjnej

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL249160B1 (pl)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112760420A (zh) * 2021-02-05 2021-05-07 中国科学院长春应用化学研究所 一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的引物、探针和试剂盒
CN113186357A (zh) * 2021-06-02 2021-07-30 上海真测生物科技有限公司 一种新型冠状病毒多重检测的rt-lamp引物组合及其试剂盒
WO2021245708A1 (en) * 2020-06-05 2021-12-09 Indian Council Of Medical Research A rapid and sensitive method for detecting sars-cov-2

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021245708A1 (en) * 2020-06-05 2021-12-09 Indian Council Of Medical Research A rapid and sensitive method for detecting sars-cov-2
CN112760420A (zh) * 2021-02-05 2021-05-07 中国科学院长春应用化学研究所 一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的引物、探针和试剂盒
CN113186357A (zh) * 2021-06-02 2021-07-30 上海真测生物科技有限公司 一种新型冠状病毒多重检测的rt-lamp引物组合及其试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUANG X ET AL.: "EBioMedicine. 2022; 75: 103736", DEVELOPING RT-LAMP ASSAYS FOR RAPID DIAGNOSIS OF SARS-COV-2 IN SALIVA. *
LALLI MA ET AL.: "Clin Chem. 2021; 67(2): 415-424", RAPID AND EXTRACTION-FREE DETECTION OF SARS-COV-2 FROM SALIVA BY COLORIMETRIC REVERSE-TRANSCRIPTION LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION. CLIN CHEM. 2021; 67(2): 415-424 *

Also Published As

Publication number Publication date
PL446010A1 (pl) 2025-03-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9404924B2 (en) Method of performing one-step, single cell RT-PCR
CN110468237B (zh) 检测中东呼吸综合征冠状病毒的引物探针混合液及试剂盒
ES2584228T3 (es) Nuevo método de detección para los HPV cervicales
CN109576397B (zh) 一种人类免疫缺陷病毒1型核酸定量检测试剂盒
DK2836607T3 (en) DETECTION OF IMMUNOGLOBULIN LIGHT CHAIN RESTRICTION BY RNA IN SITU HYBRIDIZATION
Romero-Montoya et al. Relationship of spermatoscopy, prostatic acid phosphatase activity and prostate-specific antigen (p30) assays with further DNA typing in forensic samples from rape cases
CN108048584A (zh) Raa荧光法检测布鲁氏杆菌的探针及试剂盒
EP4373971A1 (en) Diagnosing inflammatory bowel diseases
WO2010138456A2 (en) B cell signature associated with tolerance in transplant recipients
WO2023167250A1 (ja) 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する細胞性免疫応答活性の測定方法
KR102019804B1 (ko) 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 검출방법
PL249160B1 (pl) Sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 oraz sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w wersji laboratoryjnej
PL249159B1 (pl) Sposób wykrywania materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 oraz sposób diagnozowania in vitro zakażenia wirusem SARS-CoV-2 w wersji POC
CN113481326B (zh) 一种等温核酸扩增反应试剂、等温核酸扩增方法及其应用
US20230147242A1 (en) Colorimetric detection of nucleic acids
RU2663454C1 (ru) Набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения ДНК возбудителей вульвовагинального кандидоза в слизистой оболочке влагалища
US20150159224A1 (en) Ultrasensitive detection and characterization of clustered kras mutations using peptide nucleic acid clamp pcr in drop-based microfluidics
RU2795018C1 (ru) Олигонуклеотиды для определения мутации S:L452R SARS-CoV-2
RU2850880C1 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров для выявления РНК вируса эпидемического паротита
CN109055584A (zh) 基于数字lamp技术检测猪链球菌的引物及其试剂盒与方法
KR102572368B1 (ko) 파라인플루엔자 바이러스 1형 및 3형 동시 감별 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도
KR20200004267A (ko) 조류인플루엔자 바이러스 검사용 조성물 및 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 위한 칩 및 이를 이용한 조류인플루엔자 바이러스 검사방법
Kikuchi et al. Analysis of microRNAs by the Stem-Loop Real-Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Using A Double Quencher Probe
RU2722185C1 (ru) Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК вируса папилломы человека 51 типа высокого канцерогенного риска в слизистой оболочке цервикального канала
RU2700448C1 (ru) Тест-система для выявления ДНК возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci) у птиц