PL249381B1 - Sposób wytwarzania koniugatów 1-amino-1,1-bisfosfonianów z betuliną - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób wytwarzania koniugatów 1-amino-1,1-bisfosfonianów z betuliną o wzorze ogólnym 3, gdzie R1=Me, CH2CH2CONHCH(PO(OEt)2)2, R2=H,Me, który polega na tym, że pochodną betuliny o wzorze ogólnym 1, gdzie R1=Me, CH2CH2COOH, R2=H,Me, kontaktuje się w środowisku gazu inertnego z N,N'-dicykloheksylokarbodiimidem (DCC) w stosunku molowym w zakresie od 1:1 do 1:4,0 i 1-amino-1,1-bisfosfonianem o wzorze ogólnym 2 w stosunku molowym w zakresie od 1:2,0 do 1:4,0, w rozpuszczalnikach organicznych, korzystnie w dichlorometanie (DCM), w ilości od 6,0 cm3 do 7,5 cm3 na 0,1 mmola pochodnej betuliny o wzorze ogólnym 1, reakcję prowadzi się w temperaturze 40°C do 50°C z wykorzystaniem ultradźwięków w czasie od 2h do 4h, następnie odparowuje się rozpuszczalnik organiczny pod ciśnieniem od 10 mmHg do 20 mmHg, a surowy produkt ekstrahuje rozpuszczalnikami organicznymi, korzystnie octanem etylu, następnie odparowuje się części lotne pod ciśnieniem od 10 mmHg do 20 mmHg, po czym produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej octan etylu/metanol, gradient w zakresie od 20:1 do 5:1; v/v.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania koniugatów 1 -amino-1,1 -bisfosfonianów z betuliną. Bisfosfoniany, jako strukturalne analogi naturalnie występującego, nieorganicznego pirofosforanu, to związki o wysokiej i różnokierunkowej aktywności biologicznej. Kluczowym elementem budowy bisfosfonianów jest szkielet P-C-P, zapewniający im wysoką trwałość i stabilność w warunkach in vivo (R. G. G. Russell, Bone 2011, 49, 2-19). Ponadto, ich wysokie powinowactwo do tkanki kostnej wynika ze zdolności atomów tlenu grup fosfonowych do chelatowania jonów wapnia, występujących na powierzchni hydroksyapatytu.

W literaturze naukowej opisano szerokie spektrum działania bisfosfonianów, w tym: działanie przeciwbakteryjne (M. A. Ermer, J. OralMaxillofac. Surg. 2018, 76, 553-560), przeciwwirusowe (A. Anisenko i wsp., Biochimie 2012, 94, 2382-2390) czy przeciwpasożytnicze (J. C. Branco Santos, Molecules 2020, 25, 2602). Związki te znane są jednak przede wszystkim z aktywności antyresorpcyjnej i od wielu lat są stosowane w przemyśle farmaceutycznym w profilaktyce i leczeniu chorób układu kostnego, m.in: osteoporozy, choroby Pageta czy hiperkalcemii (L. Widler i wsp., J. Med. Chem. 2002, 45, 3721-3738).

Bisfosfoniany wykazują również umiarkowane działanie przeciwnowotworowe (M. Gnant, P. Clezardin, Cancer Treat Rev. 2012, 38, 407-415). Badania in vitro oraz in vivo z udziałem bisfosfonianów nowszych generacji (zoledronian, rizedronian, ibandronian) potwierdziły, że hamują one proliferację komórek nowotworowych, indukują ich apoptozę oraz aktywują układ odpornościowy w celu zwiększenia cytotoksyczności limfocytów γδΤ (V. Stresing i wsp., Cancer Lett. 2007, 257, 16-35; P. Fournier i wsp., Cancer Res. 2002, 62, 6538-6544). Ponadto, zatrzymują one wzrost komórek nowotworowych raka szyjki macicy (E. Giraudo i wsp., J. Clin. Invest 2004, 114, 623-633), międzybłoniaka (S. Wakchoure i wsp., Clin. Cancer Res. 2006, 12, 2862-2868), kostniakomięsaka (J. Chang i wsp., Oncol. Lett. 2012, 4, 299-304; T. Ohba i wsp., J. Bone Miner. Res. 2014, 29, 1431-1445) oraz przerzuty do kości (T. Hiraga i wsp., Cancer Res. 2001, 61, 4418-4424; P. G. Fournier i wsp., Neoplasia 2010, 12, 571-578). Wspomniane wyżej korzystne efekty terapeutyczne obserwowano przy wysokich stężeniach bisfosfonianów, przekraczających dawki dopuszczalne dla człowieka, stąd nie są one zalecane do stosowania w samodzielnych terapiach onkologicznych (Z. Ouyang, H. Li, Z. Zhai, J. Xu, C. R. Dass, A. Qin, K. Dai, Curr. Drug Targets 2018, 19, 409-421). Z tego powodu działanie cytotoksyczne bisfosfonianów wykorzystuje się obecnie w terapiach kombinowanych, czego przykładem jest połączenie zoledronianu ze znanymi cytostatykami, takimi jak docetaksel (A. Ullen i wsp., Acta Oncol. 2005, 44, 644-650), gemcytabina (D. Santini i wsp., Nat. Clin. Pract. Oncol. 2006, 3, 325-338), doksorubicyna (H. L. Neville-Webbe i wsp., Int. J. Cancer 2005, 113, 364-371) czy cisplatyna (M. S. Benassi i wsp., Cancer Lett. 2007, 250, 194-205). Atutem takich terapii jest synergistyczne i/lub addytywne oddziaływanie pomiędzy związkami (D. Santini i wsp., Nat. Clin. Pract. Oncol. 2006, 3, 325-338).

Potencjał bisfosfonianów w terapiach onkologicznych może być również wykorzystany wg strategii, polegającej na chemicznym połączeniu bisfosfonianów z lekami. Korzyścią wynikającą ze stosowania takich hybryd molekularnych może być nie tylko wspomniane wyżej synergistyczne i/lub addytywne oddziaływanie obydwu związków, ale także ukierunkowane działanie powstałego koniugatu, dzięki obecności fragmentu bisfosfonowego.

Ważną z punktu widzenia strategii koniugacji podklasą bisfosfonianów są 1-amino-1,1-bisfosfoniany. Związki te posiadają reaktywną grupę aminową w pozycji Ca (P-C(NH2)-P), która otwiera możliwość dalszych modyfikacji strukturalnych cząsteczki bisfosfonianu i wykorzystania jej specyficznych właściwości w syntezie potencjalnych terapeutyków o ukierunkowanym działaniu (A. J. Roelofs i wsp., Principles of Bone Biology 2008, II (81), 1737-1767). Choć w literaturze brak informacji na temat aktywności przeciwnowotworowej 1-amino-1,1-bisfosfonianów, liczne doniesienia potwierdzają ich działanie przeciwwirusowe (C. M. Lacbay i wsp., J. Med. Chem. 2014, 57, 7435-74490; A. Anisenko i wsp., Biochimie 2012, 94, 2382-2390; J. Agapkina i wsp., Eur. J. Med. Chem. 2014, 73, 73-82), przeciwbakteryjne (P. Kosikowska i wsp., J. Enz. Inh. Med. Chem. 2016, 31, 931-938), przeciwpasożytnicze (S. Ghosh i wsp., J. Med. Chem. 2004, 47, 175-187; T. Galaka i wsp., Bioorg. Med. Chem. 2019, 27, 3663-3673) czy antyresorpcyjne (cykloheptyloaminometyleno-1,1-bisfosfonian, skomercjalizowany jako sól disodowa inkadronianu (YM 175) stosowany jest w praktyce klinicznej (T. Hiraga, S. Tanaka, M. Yamamoto, T. Nakagima, H. Ozawa, Bone 1996, 18, 1-7; V. D, Romanenko, V. P. Kukhar, Arkivoc 2012, iv, 127-166)).

1-Amino-1,1-bisfosfoniany z powodzeniem były koniugowane z różnymi lekami, antybiotykami czy innymi związkami biologicznie aktywnymi (K. B. Farrell i wsp., Bone Rep. 2018, 9, 47-60). Przykładem takiego połączenia jest koniugat 1-amino-1,1-bisfosfonianu z 17e-estradiolem, który przyczynił się do zwiększenia gęstości masy kostnej skuteczniej niż sam estradiol, a przy tym nie powodował zwiększenia masy macicy, co potwierdza jego efektywność w ukierunkowanym dostarczania hormonu do tkanki kostnej (M. Morioka i wsp., Bioorg. Med. Chem. 2010, 18, 1143-1148). Badania in vivo przeprowadzone przez zespół Mercera dowodzą, że koniugat 1-amino-1,1-bisfosfonianu z 5-fluorouracylem (5-FU) - jednym z najczęściej stosowanych cytostatyków w terapiach onkologicznych, wykazywał zwiększoną akumulację w tkance kostnej, a niezwiązany ulegał szybkiemu usuwaniu z organizmu (A. El-Mabhouh i wsp., CancerBiother. Radiopharm. 2004, 19, 627-640). Obiecujące wyniki uzyskano również z udziałem koniugatu 1-amino-1,1-bisfosfonianu z gemcytabiną w badaniach jego wpływu na częstość i nasilenie osteolitycznych zmian kostnych, wykorzystując mysi model przerzutów raka piersi do kości (A. A. El-Mabhouh i wsp., Oncol. Res. 2011, 19, 287-295). Preferencyjną lokalizację w tkance kostnej w warunkach in vivo potwierdziły dodatkowo badania, w których wykorzystano koniugat BP-GEM znakowany radionuklidem ^99mTc (A. A. El-Mabhouh i wsp., Nucl. Med. Biol. 2006, 33, 715-722).

Liczne doniesienia literaturowe wskazują na skuteczność związków uzyskiwanych w wyniku strategii koniugacji, a więc i słuszność w rozwoju tego kierunku badań. Jednak żaden z opisanych w literaturze koniugatów bisfosfonianów nie został do tej pory wprowadzony do praktyki klinicznej. Wciąż aktualny pozostaje zatem problem projektowania koniugatów 1-amino-1,1-bisfosfonianów o ściśle określonych, korzystnych właściwościach farmakokinetycznych, a także opracowania efektywnych metod ich syntezy.

Zagadnieniem technicznym wymagającym rozwiązania jest opracowanie prostego i efektywnego sposobu wytwarzania hybrydy molekularnej opartej na dwóch blokach budulcowych: szkielecie naturalnie występującej betuliny i syntetycznym 1-amino-1,1-bisfosfonianie, połączonych wiązaniem amidowym poprzez linker typu -CH2CH2CO-.

Betulina, izolowana z kory brzozy, jest interesującym przykładem biologicznie atrakcyjnej naturalnej cząsteczki macierzystej o wysokim profilu bezpieczeństwa (S. Amiri i wsp., Biotechnol. Adv. 2020, 38, 107409). Betulina oraz jej półsyntetyczne pochodne wykazują szerokie spektrum aktywności biologicznej, m.in. działanie przeciwnowotworowe, przeciwbakteryjne i przeciwwirusowe (S. C. Jonnalagadda i wsp., Studies in Natural Products Chemistry, Elsevier, 2017, 53, 45-84; A. Hordyjewska i wsp., J. Pre-Clin. Clin. Res. 2018, 12, 72-75; O. Salin i wsp., Biochem. Pharmacol. 2010, 80, 1141-1151). Aktywność przeciwnowotworową betuliny i jej pochodnych wielokrotnie potwierdzono w badaniach in vitro i in vivo, m.in. w leczeniu czerniaka, nerwiaka niedojrzałego czy wątrobiaka (S. Fulda, Mol. Nutr. Food Res. 2009, 53, 140-146; S. K. Król i wsp., BioMed Res. Int. 2015, 2015, 584189).

Z literatury niepatentowej znany jest sposób otrzymywania tylko jednego koniugatu 1-amino-1,1-bisfosfonianu z pentacyklicznym triterpenem (C. S. Becker, N. V. Chukanov, I. A. Grigor’ev, Phosphorus, Sulfur Silicon Relat. Elem. 2014, 190, 1201-1212). W wyniku sprzęgania chlorku kwasu betulonowego z 1-(2-aminoetyloamino)-1,1-etylidenobisfosfonianem tetraetylu w obecności trietyloaminy uzyskano odpowiedni koniugat z wydajnością 87%. Związek ten poddano redukcji przy użyciu NaBH4 w THF, co doprowadziło do oczekiwanej bisfosfonowej pochodnej kwasu betulinowego z wydajnością 95%. Niedogodnością tej metody jest wąski zakres zastosowania (1 model), złożoność sposobu wytwarzania koniugatu oraz stosowanie bloków budulcowych otrzymywanych na drodze wieloetapowej syntezy.

Przedmiotem rozwiązania według wynalazku jest metoda syntezy koniugatów 1-amino-1,1-bisfosfonianów z betuliną o wzorze ogólnym 3, gdzie R¹ = Me, CH2CH2CONHCH(PO(OEt)2)2, R² = H, Me, wspomagana ultradźwiękami.

Sposób wytwarzania koniugatów 1-amino-1,1-bisfosfonianów z betuliną o wzorze ogólnym 3, gdzie R¹ = Me, CH2CH2CONHCH(PO(OEt)2)2, R² = H, Me, polega na tym, że pochodną betuliny o wzorze ogólnym 1, gdzie R¹ = Me, CH2CH2COOH, R² = H, Me, kontaktuje się w środowisku gazu inertnego z N,N’-dicykloheksylokarbodiimidem (DCC) w stosunku molowym w zakresie od 1 : 1,5 do 1 : 4,0 i 1-amino-1,1-metylidenobisfosfonian tetraetylu o wzorze 2 w stosunku molowym w zakresie od 1 : 2,0 do 1 : 4,0, w rozpuszczalnikach organicznych w ilości od 6,0 cm³ do 7,5 cm³ na 0,1 mmola pochodnej betuliny o wzorze ogólnym 1, reakcję prowadzi się w temperaturze 40°C do 50°C z wykorzystaniem ultradźwięków w czasie od 2 h do 4 h, następnie odparowuje się rozpuszczalnik organiczny pod ciśnie niem od 10 mmHg do 20 mmHg, a surowy produkt ekstrahuje rozpuszczalnikami organicznymi, następnie odparowuje się części lotne pod ciśnieniem od 10 mmHg do 20 mmHg, po czym produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej octan etylu/metanol, gradient w zakresie od 20 : 1 do 5 : 1; v/v.

Korzystnie w sposobie wytwarzania koniugatów według wynalazku jako gaz inertny stosuje się argon, azot.

Korzystnie w sposobie wytwarzania koniugatów według wynalazku jako rozpuszczalniki organiczne stosuje się dichlorometan, metanol, octan etylu.

3-O-Acetylo-28-O ’-(3’-karboksypropanoilo)betulina i 3-O -acetylo-28-O ’-(3’,3’-dimetylo-3’-karboksypropanoilo)betulina, stosowane w roli substratów, są łatwe do otrzymania w reakcji 3-O-acetylobetuliny z bezwodnikiem bursztynowym (SA) lub 2,2-dimetylobursztynowym (DMSA), jak zostało to opisane w pracach (N. G. Komissarova i wsp., Chem. Nat. Compd. 2019, 55, 300-304; I. Y. Strobykina i wsp., Chem. Nat. Compd. 2017, 53, 1101-1106; K. Krukiewicz i wsp., Electrochim. Acta 2016, 212, 694-700).

Wyjściowy 1-amino-1,1-metylidenobisfosfonian 2 zsyntezowano z 1-( N-Cbz)-1-etoksymetylofosfonianu dietylu wedle procedury opisanej przez Kuźnik (A. Kuźnik i wsp., Molecules 2022, 27, 3571) metodą dwustopniową, zachodzącą z wydzieleniem tworzącej się pośrednio soli fosfoniowej jako reaktywnego produktu pośredniego. Proponowana procedura jest prosta do przeprowadzenia i gwarantuje bardzo dobrą wydajność otrzymywania N-Cbz zabezpieczonej pochodnej bisfosfonianu na poziomie 82%. Następcza deprotekcja grupy N-Cbz w reakcji katalitycznej redukcji prowadzi do uzyskania oczekiwanego związku o wzorze ogólnym 2 z bardzo wysoką wydajnością przekraczającą 90%.

Zaletą rozwiązania według wynalazku jest możliwość stosowania dostępnych komercyjnie odczynników, a wykorzystanie ultradźwięków ma kluczowe znaczenie dla prowadzenia procesu w łagodnych warunkach, krótkim czasie (2-4 godziny) i co istotne, w sposób selektywny, co przekłada się na prosty sposób izolowania finalnego produktu.

Sposób otrzymywania pochodnych według wynalazku przedstawiono na Schemacie 1.

Przedmiot wynalazku w przykładowym, lecz nieograniczającym wykonaniu przedstawiono na poniższych przykładach, a produkty wykonanych przykładowych syntez zobrazowano wzorami (3a - 3c).

Przykład 1 Koniugat 3,28- bis (SANHCH(PO(OEt)2)2)BN (związek o wzorze 3a)

W kolbie okrągłodennej umieszcza się 3,28-O,O ’- bis (3-karboksypropanoilo)betulinę (0,10 mmol, 64,3 mg), N,N '-dicykloheksylokarbodiimid (0,40 mmol, 82,5 mg) oraz 1-amino-1,1-metylidenobisfosfonian tetraetylu (0,40 mmol, 121,3 mg), po czym w środowisku argonu wkrapla się dichlorometan (7,5 cm³). Reakcję prowadzi się przez 2 godziny w temperaturze 50°C, z wykorzystaniem ultradźwięków, następnie rozpuszczalnik odparowuje się pod obniżonym ciśnieniem (10 mmHg), a pozostałość ekstrahuje octanem etylu, po czym ponownie odparowuje się części lotne. Surowy produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej (octan etylu/metanol, gradient 20 : 1 do 5 : 1; v/v), otrzymując koniugat 3,28-bis (SANHCH(PO(OEt)2)2)BN 3a z wydajnością 69%.

Przykład 2 Koniugat 3-OAc-28-SANHCH(PO(OEt)2)2BN (związek o wzorze 3b)

Postępując jak w przykładzie 1, w reakcji 3-O-acetylo-28-O’-(3’-karboksypropanoilo)betuliny (0,10 mmol, 58,5 mg) z 1-amino-1,1-metylidenobisfosfonianem tetraetylu (0,20 mmol, 60,6 mg), wobec N,N’-dicykloheksylokarbodiimidu (0,15 mmol, 30,9 mg) rozpuszczonych w dichlorometanie (6,0 cm³) w środowisku azotu, po 4 godzinach prowadzenia reakcji w temperaturze 45°C z wykorzystaniem ultradźwięków i następczym odparowaniu rozpuszczalnika pod obniżonym ciśnieniem (15 mmHg) oraz ekstrakcji pozostałości octanem etylu i ponownym odparowaniu części lotnych, otrzymuje się koniugat 3-OAc-28-SANHCH(PO(OEt)2)2BN 3b z wydajnością 86%.

Przykład 3 Koniugat 3-OAc-28-DMSANHCH(PO(OEt)2)2BN (związek o wzorze 3c)

Postępując jak w przykładzie 1, w reakcji 3-O-acetylo-28-O’-(3’-karboksy-3,3-dimetylopropanoilo)betuliny (0,10 mmol, 61,3 mg) z 1-amino-1,1-metylidenobisfosfonianem tetraetylu (0,20 mmol, 60,6 mg), wobec N,N '-dicykloheksylokarbodiimidu (0,15 mmol, 30,9 mg) rozpuszczonych w dichlorometanie (6,0 cm³) w środowisku argonu, po 4 godzinach prowadzenia reakcji w temperaturze 40°C z wykorzystaniem ultradźwięków i następczym odparowaniu rozpuszczalnika pod obniżonym ciśnieniem (20 mmHg) oraz ekstrakcji pozostałości octanem etylu i ponownym odparowaniu części lotnych, otrzymuje się koniugat 3-OAc-28-DMSANHCH(PO(OEt)2)2BN 3c z wydajnością 90%.

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania koniugatów 1-amino-1,1-bisfosfonianów z betuliną o wzorze ogólnym 3, gdzie R¹ = Me, CH2CH2CONHCH(PO(OEt)2)2, R² = H, Me, znamienny tym, że pochodną betuliny o wzorze ogólnym 1, gdzie R¹ = Me, CH2CH2COOH, R² = H, Me, kontaktuje się w środowisku gazu inertnego z Λ/,Λ/'-dicykloheksylokarbodiimidem (DCC) w stosunku molowym w zakresie od 1 : 1,5 do 1 :4,0 i 1-amino-1,1-metylidenobisfosfonian tetraetylu o wzorze 2 w stosunku molowym w zakresie od 1 :2,0 do 1 :4,0, w rozpuszczalnikach organicznych w ilości od 6,0 cm³ do 7,5 cm³ na 0,1 mmola pochodnej betuliny o wzorze ogólnym 1, reakcję prowadzi się w temperaturze 40°C do 50°C z wykorzystaniem ultradźwięków w czasie od 2 h do 4 h, następnie odparowuje się rozpuszczalnik organiczny pod ciśnieniem od 10 mmHg do 20 mmHg, a surowy produkt ekstrahuje rozpuszczalnikami organicznymi, następnie odparowuje się części lotne pod ciśnieniem od 10 mmHg do 20 mmHg, po czym produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej octan etylu/metanol, gradient w zakresie od 20 : 1 do 5 :1; v/v.
2. 2. Sposób wytwarzania koniugatów według zastrz. 1 znamienny tym, żejako gaz inertny stosuje się argon, azot.
3. 3. Sposób wytwarzania koniugatów według zastrz. 1 znamienny tym, że jako rozpuszczalniki organiczne stosuje się dichlorometan, metanol, octan etylu.