PL249404B1

PL249404B1 - Sposób otrzymywania oczyszczonych ekstraktów owoców jagodowych oraz zastosowanie mikrosfer na bazie 4-winylopirydyny do oczyszczania ekstraktów z owoców jagodowych

Info

Publication number: PL249404B1
Application number: PL448492A
Authority: PL
Inventors: Ilona Sadok; Agnieszka Krzyszczak-Turczyn; Marta Grochowicz
Original assignee: Katolicki Uniwersytet Lubelski Jana Pawła Ii; Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej
Priority date: 2024-05-06
Filing date: 2024-05-06
Publication date: 2026-04-07
Also published as: PL448492A1

Abstract

Zgłoszenie dotyczy uproszczenia składu matrycy ekstraktów owoców jagodowych poprzez adsorpcję związków polifenolowych na porowatych mikrosferach 4-winylopirydyny usieciowanych trimetakrylanem trimetylolopropanu lub mikrosfer 4-winylopirydyny usieciowanych 1,4-dimetakrylanem hydrochinonu przed oznaczaniem innych związków o działaniu biologicznym z wykorzystaniem dostępnych technik analitycznych. Sposób otrzymywania wodnych ekstraktów z owoców jagodowych, oczyszczonych poprzez adsorpcję polifenoli z użyciem sorbentów stałych, charakteryzuje się tym, że pulpę owocową miesza się z wodą dejonizowaną do uzyskania zhomogenizowanej masy, przy czym stosuje się 5 - 20 g pulpy owocowej z 10 mL i prowadzi się ekstrakcję poprzez wytrząsanie w czasie od 1 do 30 min, a pozostałą pulpę owocową usuwa się poprzez odwirowanie i oddzielenie roztworu znad osadu, po czym tak przygotowany wodny ekstrakt owoców jagodowych ponownie wytrząsa się po uprzednim dodaniu porowatych mikrosfer polimerowych 4-winylopirydyny usieciowanych komonomerem metakrylowym w proporcji od 0,5 mL do 1,5 mL wodnego ekstraktu owoców jagodowych i od 5 mg do 10 mg mikrosfer polimerowych, po czym prowadzi się sorpcję polifenoli poprzez co najmniej jednokrotne wymieszanie w czasie od 1 do 30 min, w temperaturze pokojowej. Mikrosfery 4-winylopirydyny usieciowane komonomerami metakrylowymi trimetakrylanem trimetylolopropanu (poly(4VP-co-TRIM) do zastosowania w procesie oczyszczania ekstraktów owoców jagodowych ze związków polifenolowych.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania ekstraktów owoców jagodowych poprzez adsorpcję polifenoli przy pomocy mikrosfer 4-winylopirydyny usieciowanych trimetakrylanem trimetylolopropanu (poly(4VP-co-TRIM)) oraz mikrosfery 4-winylopirydyny usieciowanych 1,4-dimetakrylanem hydrochinonu (poly(4VP-co -14DMB) do zastosowania w procesie oczyszczania ekstraktów z owoców jagodowych poprzez adsorpcję polifenoli.

Owoce bogate w antocyjany są odżywcze, wartościowe i pełnią ważną rolę w odpowiednio zbilansowanej diecie w związku z wysoką zawartością substancji prozdrowotnych, w tym polifenoli. Z drugiej strony, owoce, jak również produkty ich przetwórstwa mogą być zanieczyszczone toksycznymi, mutagennymi i kancerogennymi związkami, np. mykotoksynami, pestycydami, dioksynami, furanami, polichlorowanymi bifenylami i wielopierścieniowymi węglowodorami aromatycznymi. Ich zawartości powinny być ściśle monitorowane ze względu na szkodliwy wpływ na organizmy żywe (Commission Regulation No 1881/2006). Rekomendowanym sposobem detekcji i oznaczenia ilościowego w/w toksycznych związków jest chromatografia, szczególnie chromatografia cieczowa lub gazowa połączona z tandemową spektrometrią mas (odpowiednio LC-MS/MS i GC-MS/MS). Metoda LC-MS/MS wyróżnia się spośród innych rozwiązań wysoką selektywnością i czułością, zdolnością do oznaczania dużej liczby związków podczas względnie krótkiego czasu analizy z małej objętości próbki (Azaiez i wsp. 2014). Niemniej jednak, metoda LC-MS/MS obarczona jest kilkoma wadami, w tym wieloetapową procedurą przygotowania próbki, jak również obecnością efektów matrycowych (Sadok i wsp. 2019). Te ostatnie prowadzą do wzrostu lub spadku odpowiedzi analitycznej analitu w obecności innych składników matrycy próbki w odniesieniu do sygnału otrzymanego w czystym rozpuszczalniku (Chambers i wsp. 2007).

Doczyszczanie ekstraktów roślinnych z użyciem stałych sorbentów jest powszechnie stosowanym sposobem umożliwiającym polepszenie parametrów analitycznych różnych technik analizy instrumentalnej (w tym metod LC-MS/MS) oraz ograniczenie kontaminacji układu pomiarowego (Azaiez i wsp. 2014, Sadok i wsp. 2023).

Wytrząsanie odpowiedniego sorbentu (lub kombinacji sorbentów) z ekstraktem (przez odpowiedni czas) pozwala na uproszczenie składu matrycy próbki poprzez usunięcie substancji niepożądanych i utrudniających pomiar analityczny (adsorpcja na materiale sorpcyjnym) przy ograniczonej stracie substancji oznaczanych - analitów. Pomimo różnorodności dostępnych komercyjnie sorbentów, niepożądana utrata analitów podczas etapu przygotowania próbki, jak również niedostateczne uproszczenie składu matrycy ekstraktów roślinnych jest nadal często spotykanym problemem. Dlatego nowe osiągnięcia w tej dziedzinie są wysoce pożądane.

Etap doczyszczania próbek może być przeprowadzony za pomocą różnych sorbentów, takich jak PSA (z ang. primary secondary amine), GCB (z ang. graphitized carbon black). PS-DVB (z ang. polystyrene-divinylbenzene), EMR-Lipid (z ang. enhanced matrix removal-lipid), modyfikowany żel krzemionkowy z tlenkiem cyrkonu (Z-Sep i Z-Sep+) lub ich kombinacji. Wybór sorbentu zależy głównie od rodzaju próbki i właściwości substancji oznaczanych. Dodatek sorbentu/sorbentów może zmniejszać zabarwienie ekstraktów owoców, ale ich efektywność jest różna (Mateus i wsp. 2021). Ponadto, dostępne sorbenty mogą wychwytywać anality, co skutkuje spadkiem ich odzysków (Mateus i wsp. 2021. Liu i wsp. 2014).

Zastosowanie polimerowych materiałów bazujących na 4-winylopirydynie może zapewnić pewne korzyści na etapie przygotowania próbki. Kopolimery 4-winylopirydyny w formie mikrosfer charakteryzują się rozwiniętą porowatą strukturą, jednolitym rozmiarem cząstek, mechaniczną wytrzymałością, stałą porowatością, wysoką selektywnością i możliwością ponownego wykorzystania (Grochowicz i wsp. 2015). Ponadto, sorbenty polimerowe wyróżniają się chemiczną odpornością względem organicznych rozpuszczalników, kwasów i zasad w porównaniu do innych komercjalnie dostępnych materiałów służących do upraszczania składu matrycy próbki i mogą być zastosowane w szerokim zakresie wartości pH (Grochowicz i wsp. 2015 i 2022).

Z opisu wynalazku Nr PL 226351 znany jest sposób otrzymywania porowatych, monodyspersyjnych mikrosfer kopolimerowych, syntezowanych w szczególnych warunkach z 4-winylopirydyny i komonomerów metakrylowych na bazie ziarna polimeru liniowego - polistyrenu, mających zastosowanie zwłaszcza jako wypełnienia chromatograficzne. Sposób charakteryzuje się tym, że w początkowej fazie do wodnego roztworu znanego surfaktanta, wprowadza się w określonych ilościach mieszaninę składającą się z, monomeru funkcyjnego 4-winylopirydyny i monomeru sieciującego.

Wynalazek rozwiązuje problem otrzymywania oczyszczonego ekstraktu z owoców jagodowych, gdzie etap oczyszczania ekstraktu prowadzi się poprzez adsorpcję związków polifenolowych na porowatych mikrosferach 4-winylopirydyny usieciowanych trimetakrylanem trimetylolopropanu (poly(4VP- co-TRlM)) lub mikrosferach 4-winylopirydyny usieciowanych 1,4-dimetakrylanem hydrochinonu (poly(4VP-co -14DMB).

Celem wynalazku jest uproszczenie składu matrycy ekstraktów owoców jagodowych poprzez adsorpcję związków polifenolowych na porowatych mikrosferach 4-winylopirydyny usieciowanych trimetakrylanem trimetylolopropanu (poly(4VP-co-TRIM)) lub mikrosferach 4-winylopirydyny usieciowanych 1,4-dimetakrylanem hydrochinonu (poly(4VP-co -14DMB) przed oznaczaniem innych związków o działaniu biologicznym z wykorzystaniem dostępnych technik analitycznych.

Istota sposobu otrzymywania wodnych ekstraktów z owoców jagodowych oczyszczonych poprzez adsorpcję polifenoli z użyciem sorbentów stałych jest to, że pulpę owocową miesza się z wodą dejonizowaną do uzyskania zhomogenizowanej masy, przy czym stosuje się 5-20 g pulpy owocowej z 10 mL i prowadzi się ekstrakcję poprzez wytrząsanie w czasie od 1 do 30 min, a pozostałą pulpę owocową usuwa się poprzez odwirowanie i oddzielenie roztworu znad osadu, po czym tak przygotowany wodny ekstrakt owoców jagodowych ponownie wytrząsa się po uprzednim dodaniu porowatych mikrosfer polimerowych 4-winylopirydyny usieciowanych komonomerem metakrylowym w proporcji od 0,5 mL do 1,5 mL wodnego ekstraktu owoców jagodowych i od 5 mg do 10 mg mikrosfer polimerowych, po czym prowadzi się sorpcję polifenoli poprzez co najmniej jednokrotne wymieszanie w czasie od 1 do 30 min, w temperaturze pokojowej.

Korzystnym jest, że ekstrakt owoców jagodowych wytrząsa się z dodatkiem mikrosfer 4-winylopirydyny usieciowanych trimetakrylanem trimetylolopropanu (poly(4VP-co-TRIM) lub mikrosfer 4-winylopirydyny usieciowanych 1,4-dimetakrylanem hydrochinonu (poly(4VP-co -14DMB).

Korzystnym jest, że proces oczyszczania z polifenoli prowadzi się przed analizą ilościową i jakościową substancji o działaniu biologicznym.

Istotą według wynalazku są mikrosfery 4-winylopirydyny usieciowane komonomerami metakrylowymi trimetakrylanem trimetylolopropanu (poIy(4VP-co-TRIM) do zastosowania w procesie oczyszczania ekstraktów owoców jagodowych ze związków polifenolowych.

Korzystnie jest, że mikrosfery 4-winylopirydyny usieciowane 1,4-dimetakrylanem hydrochinonu (poly(4VP-co-14DMB) do zastosowania w procesie oczyszczania ekstraktów owoców jagodowych ze związków polifenolowych.

Zaletą rozwiązania według wynalazku jest uproszczenie składu matrycy ekstraktów owoców jagodowych poprzez adsorpcję związków polifenolowych na porowatych mikrosferach 4-winylopirydyny usieciowanych trimetakrylanem trimetylolopropanu lub mikrosferach 4-winylopirydyny usieciowanych 1,4-dimetakrylanem hydrochinonu przed oznaczaniem innych związków o działaniu biologicznym z wykorzystaniem dostępnych technik analitycznych.

Rozwiązanie według wynalazku objaśnione jest bliżej w załączonej tabeli i w przykładach.

Przedmiot wynalazku przedstawiono w sposób bardziej szczegółowy w poniższym przykładzie.

Przykład 1. Próbkę owoców jagodowych (truskawki, czerwonej maliny, czarnej porzeczki) dokładnie zblendowano, a 10 g zhomogenizowanej pulpy owocowej przeniesiono do probówki wirówkowej i dodano 10 mL wody dejonizowanej. Następnie próbkę energicznie wytrząsano przez 2 min, umieszczono w łaźni ultradźwiękowej na 5 min i wytrząsano w czasie 1 min. Próbkę następnie odwirowano dwukrotnie przy 8300 x g przez 15 min w temperaturze pokojowej, w celu uzyskania klarownego ekstraktu. Klarowny ekstrakt z owoców jagodowych (1 mL) wytrząsano przez 30 min po dodaniu 5 mg poly(4VP-co -14DMB) lub poly(4VP-co-TRlM) w temperaturze pokojowej (2000 rpm). Po odwirowaniu (16110 x g, 15 min), pobrano roztwór znad powierzchni sorbentu. Przygotowany w ten sposób ekstrakt wykorzystano do pomiarów spektrofotometrycznych, w celu wyznaczenia całkowitej zawartości polifenoli (TPC), całkowitej zawartości flawonoidów (TFC) i całkowitej zawartości antocyjanów (TAC). Oznaczenie TPC przeprowadzono z wykorzystaniem metody Folina-Ciocalteou na podstawie protokołu (Sadok i wsp. 2023). Do 100 μL wyjściowego ekstraktu potraktowanego badanymi polimerami dodano 1 mL 10-krotnie rozcieńczonego odczynnika Folina-Ciocalteou. Otrzymany roztwór wymieszano i po 20 min mierzono spektrofotometrycznie przy długości fali 750 nm. TPC wyznaczono na podstawie krzywej kalibracyjnej przygotowanej z wykorzystaniem wodnych roztworów kwasu galusowego o stężeniach od 5 do 250 mg/L. Pomiary spektrafotometryczne przeprowadzano z wykorzystaniem wody destylowanej jako roztworu odniesienia. Otrzymany wynik prezentowano jako mg kwasu galusowego na 100 g pulpy owocowej. Następnie wyznaczono TFC. Oznaczenie przeprowadzono z wykorzystaniem metody kolorymetrycznej na podstawie protokołu (Sadok i wsp. 2023). Do 125 μL wyjściowego ekstraktu potraktowanego badanymi polimerami dodano 550 μΐ wody destylowanej oraz 37,5 μL świeżo przygotowanego wodnego roztworu NaNO2 (15%, w/v). Po 6 min dodano 37,5 μΐ wodnego roztworu AlCh (10%, w/v), a po kolejnych 6 min 0,5 mL wodnego roztworu NaOH (4%, w/v). Otrzymany roztwór wymieszano i po 15 min mierzono spektrofotometrycznie przy długości fali 510 nm. Całkowitą zawartość flawonoidów wyznaczonej na podstawie krzywej kalibracyjnej przygotowanej z wykorzystaniem wodnych roztworów katechiny o stężeniach od 5 do 200 mg/L, Pomiary spektrofotom etryczne przeprowadzano z wykorzystaniem wody destylowanej jako roztworu odniesienia. Otrzymany wynik prezentowano jako mg katechiny na 100 g pulpy owocowej.

Następnie wyznaczono TAC. Oznaczenie przeprowadzono z wykorzystaniem metody różnicowej na podstawie protokołu (Lee i wsp. 2005) wykorzystującego bufory o pH=1,0 (0,025 mol/L KCl) oraz pH=4,5 (0,4 mol/L CH3COONa). Do 125 μΐ ekstraktu potraktowanego badanymi polimerami dodano 1,125 mL buforu o pH=1. Równocześnie, do drugiej porcji ekstraktu owocowego o tej samej objętości (125 μL) dodano 1,125 mL buforu o pH=4,5. Pozwoliło to na 10-krotne rozcieńczenie próbki odpowiednimi buforami. Pomiary spektrofotometryczne prowadzono dla każdego roztworu przy dwóch długościach fal: 520 nm i 700 nm, 20-50 min od przygotowania roztworów. Następnie rozcieńczano próbkę buforami 20-krotnie i ponawiano pomiary spektrofotometryczne. Rozcieńczenia wykonywano dopóki ostateczny wynik (uwzględniający rozcieńczenie) nie był od nich zależny (ten. jeżeli rozcieńczymy próbkę dwa razy, wówczas dwukrotnie zmaleje wartość absorbancji. TAC było obliczane wg poniższego wzoru: TAC [cyd-3-glu] = (A-MW-DF) / (ε·1), gdzie: A (Absorbancja) = (A520 nm - A700 nm) pH 1,0 - (A520 nm A700 nm) pH 4,5; MW - masa cząsteczkowa cyjanidyno-3-gIukozydu (cyd-3-glu) - 449.2 g/mol; DF współczynnik rozcieńczenia, I - długość drogi optycznej [cm]; ε - molowy współczynnik ekstynkcji cyjanidyno-3-glukozydu (26 900) L-mol^-1-cm^-1). Wyniki przedstawiano jako mg cyd-3-glu na 1 g pulpy owocowej.

Proces prowadzono przy użyciu wodnych ekstraktów uzyskanych z owoców jagodowych, zawierających głównie pelargonidynę w zakresie 0,1-100 mg/100 g pulpy owocowej, jak truskawki (Fragaria spp.) (Fang 2015), ale można prowadzić przy użyciu innych owoców.

Proces prowadzono przy użyciu wodnych ekstraktów uzyskanych z owoców jagodowych, zawierających głównie cyjanidynę i peonidynę w zakresie 0,01-600 mg/100 g pulpy owocowej, jak czerwone maliny (Rubus idaeus), ale można prowadzić przy użyciu innych owoców jak maliny tekszla (Rubus arcticus), czarna maliny (Rubus occidentalis), owoców acai (Euterpe oleracea), jeżyna (Rubus spp.), tarniny (Prunus spinosa), pomarańczy chińskiej (Citrus sinensis), czeremcha (Prunus spp.), wiśni (Prunus cerasus), czereśni (Prunus avium), aronii (Aronia melanocarpa), żurawiny (Vaccinium macrocarpon), porzeczki czerwonej (Ribes rubrum), dzikiego bzu (Sambucus app.), wiciokrzewu (Lonicera caerulea), borówki brusznicy (vaccinium vitis-idaea), morwy białej (Morus spp.), śliwy (Prunus spp.), świdośliwy (amelanchier alnifolia) (Fang 2015).

Proces prowadzono przy użyciu wodnych ekstraktów uzyskanych z owoców jagodowych, zawierających antocyjanidyny w zakresie 0,01-600 mg/100 mg pulpy owocowej, jak czarnej porzeczki (Ribesnigrum), ale można prowadzić przy użyciu innych owoców jak wiśnia zachodnioindyjska (Malpighia emarginata), borówki (Vaccinium spp.), bażyna czarna (Empetrum nigrum), winogrona (Vitis spp.), czapetka kuminowa (Syzygium cumini), jagody maqui (Aristotelia chilensis) (Fang 2015).

Proces prowadzono przed analizą ilościową i jakościową substancji o działaniu biologicznym jak metabolity, aminokwasy, toksyny, pestycydy.

Ekstrakty owocowe poddano również analizie na obecność indywidualnych polifenoli z wykorzystaniem chromatografii cieczowej sprężonej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS). Oznaczenia prowadzono z wykorzystaniem ultrasprawnego chromatografu cieczowego (seria Infinity 1290) połączonego ze spektrometrem mas typu potrójny kwadrupol (model 6460) firmy Agilent Technologies. Jonizację próbki uzyskano poprzez elektrorozpraszanie w źródle Agilent Jet Stream. Rozdział chromatograficzny uzyskano na kolumnie Zorbax Eclipse Plus C18 column (2,1 x 50 mm; 1,8 μm) w temperaturze 25°C z zastosowaniem fazy ruchomej składającej się z 1% (v/v) kwasu mrówkowego w wodzie (faza wodna) i 1% (v/v) kwasu mrówkowego w acetonitrylu (faza organiczna). Zastosowano następujący gradient fazy ruchomej przy przepływie 0,3 mL/min: 5-50% fazy organicznej przez 12 min, a następnie 50-80% fazy organicznej przez kolejne 2 min. Na kolumnę dozowano 10 μL. Detekcję polifenoli prowadzono w trybie jonów dodatnich zgodnie z ustawieniami zebranymi w Tabeli 1.

PL 249404 Β1

Tabela 1. Ustawienia spektrometru mas typu potrójny kwadrupol, w celu detekcji wybranych polifenoli.

Analit	Jon prekursoro wy [m/z]	Jon molekular ny [m/z]	Czas retencji [min]	Aczas retecji [min]	Fragment or [V]	Energia kolizji [eV]
Kwas galusowy	169	125	1,92	2	60	14
97	16
Kwas 4 hydroksy benzoesowy	137	93	3,87	2	80	14
65	14
Kwas chlorogenowy	353	191	3,99	2	50	14
85	50
Katechina	289	245	4,02	2	60	10
203	16
Kwas kawowy	179	135	4,43	2	80	14
107	24
Kwas pkumarowy	163	119	5,61	2	50	14
93	30
Kwas elagowy	301	284	5,85	2	100	28
229	28
Rutyna	609,1	300	5,94	2	140	50
271	60
Kwas ferulowy	193,1	178	6,18	2	60	8
134	10
Mirycetyna	317	179	7,36	2	80	16
151	24
Kwercetyna	301	179	9,07	2	100	16
151	20
Naringenina	271	151	9,88	2	50	14
119	24
Apigenina	269	151	9,94	2	50	20
117	30

Napięcie nebulizera: 35 psi, temperaturę gazu (N2): 300°C, przepływ gazu (N2): 10 L/min; temperatura gazu osłonowego: 350°C, przepływ gazu osłonowego: 10 L/min; napięcie kapilary: 4000 V. Metoda detekcji: dMRM (z ang. dynamie multiple reaction monitoring).

Efektywność uproszczenia składu matrycy ekstraktów owoców jagodowych po wymieszaniu z poly(4VP-co-14DMB) lub poly(4VP-co-TRIM) porównano również do PSA i GCB (sorbentów komercyjnie dostępnych). W tym celu wyjściowe ekstrakty owocowe wymieszano z 5 mg PSA lub 5 mg GCB i procedowano jak opisano powyżej. W uzyskanych próbkach mierzono zmiany TPC, TFC i TAC wyznaczono metodą spektrofotometryczną.

Wyniki: Zdolność mikrosfer 4-winylopirydyny usieciowanej komonomerami metakrylowymi (poly(4VP-co-14DMB) i poly(4VP-co-TRIM)) do uproszenia matrycy ekstraktów owoców jagodowych potwierdzono poprzez badania na modelowych owocach jagodowych zaliczanych do różnych grup owocowych (Fang 2015): grupa 1 - owoce zawierające głównie pelargonidyne - np. truskawki (Fragaria spp.); grupa 2 - owoce zwierające głównie cyjanidynę/peonidynę - np. czerwona malina (Rubu sidaeus); grupa 3 - owoce składające się z wielu antocyjanidyn - np. czarna porzeczka (Ribes Nigrum).

Po traktowaniu ekstraktów owoców jagodowych poly(4VP-co-14DMB) lub poly(4VP-co-TRIM) obserwowano spadek wartości TPC o ok. 50% (w przypadku ekstraktów z truskawek i czerwonych malin) i ok. 20% (w przypadku ekstraktów z czarnej porzeczki) w stosunku do próby kontrolnej: (wyjściowy ekstrakt owoców jagodowych). Wytrząsanie ekstraktów z wykorzystaniem testowanych sorbentów powodowało obniżenie wartości TFC o ok. 50% (w przypadku ekstraktów z truskawek i czerwonych malin) i ok. 38% (w przypadku czarnej porzeczki) w stosunku do próby kontrolnej. Porowate mikrosfery poly(4VP-co -14DMB) i poly(4VP-co-TRIM) również wykazały zdolność do usuwania antocyjanów - spadek wartości TAC o ok. 30-38% (ekstrakty z truskawek), o ok. 15% (ekstrakty z czerwonej maliny) i o ok. 10% (ekstrakty z czarnej porzeczki) w porównaniu do próby kontrolnej. Wyniki zamieszczono na Rysunku 1. Potwierdzono również zdolność porowatych mikrosfer poly(4VP-co -14DMB) i poIy(4VP-co -TRIM) do usuwania indywidualnych polifenoli z ekstraktów owoców jagodowych. W wyniku przeprowadzonych analiz potwierdzono, że niektóre związki polifenolowe ulegają sorpcji na mikrosferach poly(4VP-co -14DMB) oraz (poli(4VP-co-TRIM) i mogą być usuwane z ekstraktów owoców jagodowych. Wyniki zamieszczono na Rysunku 2. W ekstraktach z truskawek zaobserwowano spadek sygnału kwercetyny, kwasu galusowego, katechiny, naringeniny, kwasu elagowego, kwasu 4-hydroksybenzoesowego, kwasu p -kumarowego nawet odpowiednio o 90%, 85%, 80%, 70%, 60%, 35%, 20% po wymieszaniu z mikrosferami ply(4VP-co -14DMB) lub poly(4VP-co-TRIM). W ekstraktach z czerwonej maliny, ilości naringeniny, kwasu galusowego, kwercetyny, kwasu elagowego, mirycytyny, katechiny, kwasu chlorogenowego, kwasu kawowego zmniejszyły się odpowiednio o ok. 95%, 88%, 87%, 77%, 75% i 37% po wytrząsaniu z mikrosferami poly(4VP-co -14DMB) i poly(4VP-co-TRIM) w stosunku do wyjściowych próbek. Oba testowane sorbenty okazały się również skuteczne w usuwaniu polifenoli z ekstraktów z czarnej porzeczki (odnotowano spadki sygnałów katechiny, naringeniny, kwasu elagowego, kwasu galusowego, kwasu chlorogenowego, kwasu kawowego, kwasu ferulowego i kwasu p -kumarowego nawet o odpowiednio 90%, 90%, 70%, 70%, 60%, 30%, 16% i 14%). Wyniki przedstawiono na Rysunku 2.

Porównano również efektywności porowatych mikrosfer poly(4VP-co-14DMB) i poly(4VP-coTRIM) z komercyjnie dostępnymi sorbentami w kierunku efektywności uproszczenia składu matrycy ekstraktów owoców jagodowych. Badania przeprowadzono na trzech modelowych ekstraktach owoców jagodowych: truskawki, czerwonej maliny i czarnej porzeczki. Mikrosfery poly(4VP-co-14DMB) i poly(4VP-co-TRIM) wykazały większą efektywność w redukcji wartości TPC i TFC z ekstraktów owoców jagodowych w porównaniu z komercyjnie dostępnymi sorbentami (PSA, GCB) stosowanymi do usuwania pigmentów na etapie przygotowania próbki. GCB okazał się bardziej skuteczny w redukcji wartości TAC w porównaniu z poly(4VP-co -14DMB) i poly(4VP-co-TRIM). Wyniki zaprezentowano na Rysunku 3.

W wyniku badań, twórcy wynalazku stwierdzili, że traktowanie ekstraktów owoców jagodowych z porowatymi mikrosferami poly(4VP-co -14DMB) lub poly(4VP-co-TRIM)) powoduje zmniejszenie zabarwienia próbki, obniżenie wartości TPC, TFC i TAC oraz poziomów niektórych związków polifenolowych, co powoduje uproszczenie składu matrycy próbki. Potwierdzono również większą efektywność mikrosfer poly(4VP-co-14DMB) i poly(4VP-co-TRIM) w redukcji wartości TPC, TFC i TAC mierzonych w ekstraktach owoców jagodowych, w porównaniu z komercyjnie dostępnymi sorbentami stosowanymi do usuwania polifenoli (PSA i GCB).

Przez całkowitą zawartość polifenoli (TPC) w przeliczeniu na kwas galusowy rozumie się zawartość oznaczoną metodą spektrofotometryczną z użyciem odczynnika Folina-Ciocalteu, przy długości fali 750 nm (Sadok i wsp, 2023).

Przez całkowitą zawartość flawonoidów (TFC) w przeliczeniu na katechinę rozumie się zawartość oznaczoną metodą spektrafotometryczną przy długości fali 510 nm (Sadok i wsp. 2023).

Przez całkowitą zawartość antocyjanów (TAC) rozumie się zawartość oznaczoną metodą spektrofotometryczną wykorzystującą różnice w absorbancji mierzonej w buforze o pH=1,0 i w buforze o pH=4,5 oraz przy dwóch długościach fali: 520 nm i 700 nm (Sadok i wsp. 2023).

Sposób uproszczenia matrycy próbek zgodnie z wynalazkiem polega na sorpcji polifenoli z wodnych ekstraktów owoców jagodowych poprzez co najmniej jednokrotne wymieszanie z porowatymi mikrosferami 4-winylopirydyny usieciowanymi komonomerami metakrylowymi w odpowiedniej ilości i czasie. Wodne ekstrakty owoców jagodowych można uzyskać bez lub z dodatkiem zasad, kwasu nieorganicznego lub organicznego. Według wynalazku korzystnym sposobem uzyskania wodnych ekstraktów owoców jagodowych jest zmieszanie zhomogenizowanej pulpy owocowej z rozpuszczalnikiem i prowadzenie ekstrakcji poprzez kilkuminutowe wytrząsanie lub mieszanie. Dobre efekty można również osiągnąć poprzez umieszczenie próbki na kilka minut w łaźni ultradźwiękowej. W celu uzyskania klarownego ekstraktu, pozostałą pulpę owocową można usunąć na drodze filtracji lub poprzez odwirowanie próbki i zebranie roztworu znad osadu. Tak przygotowany ekstrakt owoców jagodowych wytrząsa się z dodatkiem porowatych mikrosfer poly(4VP-co -14DMB) lub poly(4VP-co-TRIM).

W kontekście wynalazku, zadowalające uproszczenie składu matrycy próbki uzyskano wytrząsając 1 mL odwirowanego ekstraktu przez 30 min z 5 mg mikrosfer poly(4VP-co -14DMB) lub poly(4VP- co-TRIM) w temperaturze pokojowej. Dobrą wydajność usuwania polifenoli można również uzyskać stosując inne proporcje objętości ekstraktu roślinnego do masy porowatych mikrosfer, dostosowując czas, temperaturę i prędkość wytrząsania.

Wynalazek można zastosować do wodnych ekstraktów uzyskanych z różnych owoców jagodowych i do usuwania związków zaliczanych do polifenoli.

Wynalazek może znaleźć zastosowanie na etapie przygotowania próbek owoców jagodowych do uproszczenia składu matrycy próbki przed analizą ilościową i jakościową substancji o działaniu biologicznym (np. metabolitów, aminokwasów, toksyn, pestycydów, dioksyn, furanów, polichlorowanych bifenyli, wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych). Usunięcie polifenoli z ekstraktów roślinnych przed analizą, może poprawić parametry analityczne metod opartych na rozdziale chromatograficznym oraz detekcji z wykorzystaniem detektorów UV-Vis lub spektrometrów mas, a także ograniczyć interferencje podczas oznaczeń spektrofotometrycznych, czyli elektrochemicznych.

W przypadku oznaczeń prowadzonych metodami chromatograficznymi połączonymi ze spektrometrią mas, wynalazek może być zastosowany do ograniczenia występowania ujemnego efektu matrycowego, polegającego na zmniejszeniu wartości sygnałów substancji oznaczanych mierzonych w próbkach rzeczywistych w odniesieniu do sygnałów obserwowanych w rozpuszczalniku (Chambers i wsp. 2007). Supresja sygnałów analitów wynika głównie ze złożoności matrycy owocowej, jak również z procedury przygotowania próbki, warunków rozdziału chromatograficznego i typu jonizacji. Ponadto, efekt matrycowy jest trudny do kontrolowania i prognozowania (Chambers i wsp. 2007). W celu zminimalizowania efektu matrycowego, co jest kluczowe do otrzymania rzetelnych wyników, poprawy czułości i selektywności oznaczeń, należy zastosować odpowiednią procedurę przygotowania próbki zorientowaną na selektywne usuwanie niepożądanych, interferujących związków i/lub izolację analitów.

Bibliografia

Azaiez, I., Giusti, F., Sagratini, G., Manes, J., Fernandez-Franzón, M., Multi-mycotoxins Analysis in Dried Fruit by LC/MS/MS and a Modified QuEChERS Procedurę, Food Anal.Methods. 7(2014) 935-945. https://doi.org.10.1007/312161-013-9785-3

Chambers, E., Waprimski-Diehl, D.M., Lu, Z., Mazzeo, J.R., Systematic and comprehensive strategy for reducing matrix effets in LC/MS/MS analyses, J. Chromatograf. B: 852 (2007) 23-34. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2006.12.030.

Commission Regulation (EC) No 1881/2006 of 19 December 2006 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs (Text with EEA relevance), 2006, str. 1-35. https://data.eu- ropa.eu/eli/reg/2006/1881/oj/eng (accessed May 26, 2022).

Fang, J., Classification of fruits based on anthocyanin types andrelevance to their health effects, Nutrition. 31 (2015) 1301-1306. https://doi.org/10.1016/j.nut.2015.04.015.

Grochowicz, M., Szajnecki, Ł., Gawdzik, B., 4-Vinylpyridine-Trimethylolopropane Trimethacrylate Composite Polymer Particles and Their Application as Adsorbents, Adsorpt. Sci. Technol. 33 (2015) 609-616. https://doi.org/10.1260/0263-6174.33.68.609.

Grochowicz, M., Szajnecki, Ł. Rogulska, M., Crosslinkes 4-Vinylpyridine Monodisperse Functional Microspheres for Sorption od Ibuprofen and Ketoprofen, Polymers. 14 (2022) 2080 https://doi.org/10.3390/polym14102080.

Lee, J., Durst, K.W., Wrolstad, K.E., Determination of total monomeric anthocyanin pigment content of fruit juices, beverages, natural colorants, and wines by the pH differential method: Collaborative study. Journal of AOAC International 88(5) (2005) 1269-1278.

https://doi.org/10.1093/jaoac/88.5.1269.

Liu, Y., Han, S., Lu, M., Wang, J., Wang, J., Modified QuEChERS method combined with ultrahigh performance liquid chromatography tandem mass spectrometry for the simultaneous determinaation of 26 mycotoxins in sesame butter, J. Chromatogr. B. Analul. Technol. Biomed. Life. Sci. 970 (2014) 68-76. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2014.06.033.

Mateus, A.R.S., Barros, S., Pena A., Silva, A.S., Development and Validation of QuChERS Followed by UBPLC-ToF-MS Method for Determination od f Multi-Mycotoxins in Pistachio Nuts, Molecules. 26 (2021) 5754, https://doi.org/10.3390/molecules26195754.

Sadok, I., Stachniuk, A. Staniszewska, M., Developments in the Monitoring of Patulin in Fruits Using Liquid Chromatography: an Overview, Food Anal. Methods. 12 (2019) 76-93. https://doi.Org/10.1007/S12161 -018-1340-9.

Sadok, I., Szmagara, A., Krzyszczak, A., Validated QoEChERS-based UHPLC-ESI-MS/MS method for the postharvest control of patulin (mycotoxin) contamination in redpigmented fruits, Food Chem. 400 (2023) 134066. https://doi.org?10.1016/j.foodchem.2022.134066.

Claims

1. Sposób otrzymywania wodnych ekstraktów z owoców jagodowych oczyszczonych poprzez adsorpcję polifenoli z użyciem sorbentów stałych znamienny tym, że pulpęe owocową miesza się z wodą dejonizowaną do uzyskania zhomogenizowanej masy, przy czym stosuje się 5-20, g pulpy owocowej z 10 mL i prowadzi się ekstrakcję poprzez wytrząsanie w czasie od 1 do 30 min, a pozostałą pulpę owocową usuwa się poprzez odwirowanie i oddzielenie roztworu znad osadu, po czym tak przygotowany wodny ekstrakt owoców jagodowych ponownie wytrząsa się po uprzednim dodaniu porowatych mikrosfer polimerowych 4-winylopirydyny usieciowanych komonomerem metakrylowym w proporcji od 0,5 mL do 1,5 mL wodnego ekstraktu owoców jagodowych i od 5 mg do 10 mg mikrosfer polimerowych, po czym prowadzi się sorpcję polifenoli poprzez co najmniej jednokrotne wymieszanie w czasie od 1 do 30 min, w temperaturze pokojowej.

2. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że ekstrakt owoców jagodowych wytrząsa się z dodatkiem mikrosfer 4-winylopirydyny usieciowanych trimetakrylanem trimetylolopropanu (poly(4VP-co-TRlM) lub mikrosfer 4-winylopirydyny usieciowanych 1,4-dimelakrylanem hydrochinonu (poly(4VP-co-14DMB).

3. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że proces oczyszczania z polifenoli prowadzi się przed analizą ilościową i jakościową substancji o działaniu biologicznym.

4. Mikrosfery 4-winylopirydyny usieciowane komonomerami metakrylowymi trimetakrylanem trimetylolopropanu (poly(4VP-co-TRIM) do zastosowania w procesie oczyszczania ekstraktów owoców jagodowych ze związków polifenolowych,

5. Mikrosfery 4-winylopirydyny usieciowane 1,4-dimetakrylanem hydrochinonu (poly(4VP-co -14DMB) do zastosowania w procesie oczyszczania ekstraktów owoców jagodowych ze związków polifenolowych.