PL249602B1 - Fuzyjne białko rekombinowane, sposób otrzymywania fuzyjnego białka rekombinowanego i jego zastosowanie - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest fuzyjne białko rekombinowane oznaczone jako CBD_TP84_28_His o sekwencji obejmującej: a) domenę katalityczną w postaci endolizyny TP84_28_His pochodzącą z bakteriofaga TP-84, b) domenę wiążącą celulozę pochodzącą z celulazy Clostridium cellulovorans o właściwościach bakteriobójczych i zdolności wiązania z celulozą. Zgłoszenie obejmuje także sposób otrzymywania fuzyjnego białka rekombinowanego oznaczonego jako CBD_TP84_28_His na drodze, charakteryzujący się tym, że łączy się endolizynę TP84_28 pochodzącą z bakteriofaga TP-84 z domeną wiążącą celulozę pochodzącą z celulazy Clostridium cellulovorans poprzez fuzję genów kodujących endolizynę TP84_28 i domenę wiążącą celulozę enzymu celulazy z Clostridium cellulovorans. Przedmiotem zgłoszenia jest także zastosowanie fuzyjnego białka rekombinowanego, otrzymanego powyższym sposobem.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest fuzyjne białko rekombinowane oznaczone jako CBD_TP84_28_His o właściwościach bakteriobójczych i zdolności wiązania z celulozą oraz sposób jego otrzymywania. Wynalazek dotyczy również zastosowania fuzyjnego białka rekombinowanego oznaczonego jako CBD_TP84_28_His w biomedycynie, inżynierii tkanek lub przemyśle farmaceutycznym oraz szeroko pojętej ochronie zdrowia ludzi i zwierząt.

Oporność mikroorganizmów na antybiotyki jest narastającym problemem klinicznym w skali światowej. Amerykańska agenda Centers for Disease Control and Prevention (CDC) szacuje, że w samych Stanach Zjednoczonych rocznie dochodzi do co najmniej 2,8 mln zakażeń bakteriami antybiotykoopornymi i 35 000 zgonów w ich wyniku (CDC, 2022). Ostatnia nowa klasa antybiotyków powstała w 1984 r. (Shuch et al., 2022), w związku z czym poszukiwanie nowych cząsteczek antybakteryjnych stanowi wciąż aktualny problem. Jednym z potencjalnych źródeł takich substancji są bakteriofagi - wirusy, które atakują bakterie i używając maszynerii komórkowej gospodarza ostatecznie prowadzą do jego zniszczenia. Proces, w którym bakteriofag prowadzi do unicestwienia komórki bakteryjnej jest wieloetapowy i bierze w nim udział wiele białek, natomiast kluczową rolę w tym procesie pełnią endolizyny.

Endolizyny stanowią grupę białek enzymatycznych, które rozkładają konserwatywne wiązania odpowiedzialne za utrzymanie struktury peptydoglikanu. Rozpatrując rodzaj trawionych przez nie wiązań można je podzielić na glikozydazy, transglikozylazy, amidazy i endopeptydazy (Woźnica et al., 2015). Różnice między poszczególnymi endolizynami można również zaobserwować biorąc pod uwagę rodzaj bakterii, która jest gospodarzem dla faga, z którego pozyskano daną endolizynę. Endolizyny, które niszczą ścianę bakterii gram dodatnich charakteryzują się bimodularną budową - zadaniem jednej z domen jest trawienie wiązań w obrębie peptydoglikanu, zaś drugiej wiązanie się w miejscu przeprowadzania reakcji. Właściwości immobilizacji nie posiadają zaś endolizyny bakteriofagów bakterii gramujemnych, co prawdopodobnie wynika z faktu, iż unieruchomienie w miejscu trawienia nie jest konieczne, ze względu na obecność błony zewnętrznej, która spełnia właśnie tę funkcję (Maciejewska et al., 2018).

Endolizyny są obiecującą grupą czynników bakteriobójczych - badania eksperymentalne wskazują bowiem, że powstanie oporności wobec tych enzymów jest ekstremalnie rzadkim zjawiskiem (Grishin et al., 2020). Z drugiej strony białkowa natura endolizyn może ograniczać ich zastosowanie ze względu na możliwą inaktywację w warunkach środowiska (pH, temperatura, inhibitory, proteinazy w środowisku). Poszukiwane są zatem enzymy o dużej stabilności, w szczególności endolizyny termostabilne.

Znanym ze stanu techniki zastosowaniem endolizyn są kosmetyki marki Gladskin. Użycie endolizyn do dezynfekcji powierzchni, sprzętu lub jako składnik materiałów opatrunkowych jest jednak utrudnione ze względu na ich rozpuszczalność. Powoduje to szybką dyfuzję oraz zmywanie wodą i roztworami wodnymi enzymów z miejsca aplikacji. Efektem tego zjawiska jest krótkotrwała ekspozycja dezynfekowanych powierzchni na bioaktywne endolizyny, a zatem radykalny spadek efektywności dezynfekcji. Poszukiwane są zatem endolizyny o zdolności do immobilizacji na wybranych powierzchniach, w szczególności na powierzchniach materiałów opatrunkowych. Do chwili obecnej nie udało się znaleźć takiej endolizyny, która byłaby efektywnie wiązana przez dezynfekowane powierzchnie z jednoczesnym zachowaniem aktywności biologicznej.

Z polskiego opisu patentowego nr PL240801 B1 znany jest polinukleotyd kodujący białko bakteriofaga TP-84 wiążące dwuniciowy DNA i wykazujące aktywność rozplatania helisy DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza bakteryjnego oraz białko bakteriofaga TP-84 i jego zastosowanie.

Z publikacji Cloning and characterization of a thermostable endolysin of bacteriophage TP-84 as a potential disinfectant and biofilm-removing biological agent Żebrowska et al., 2022 znana jest endolizyna TP84_28_His, która jest enzymem bakteriofaga TP-84 o następujących właściwościach:

- jest termostabilna do ok. 75°C,

- działa w szerokim zakresie pH,

- wykazuje wysoką aktywność wobec szczepów bakterii gram-dodatnich „spokrewnionych” z gospodarzem faga TP-84,

- wykazuje wysoką aktywność wobec biofilmu niektórych bakterii.

Nieoczekiwanie powyższe problemy rozwiązuje fuzyjne białko rekombinowane według wynalazku, które stanowi cząsteczka polipeptydowa składająca się z dwóch domen białkowych: domeny katalitycznej - endolizyny TP84_28 His oraz domeny wiążącej celulozę (CBD, ang. Cellulose-Binding Domain). Skonstruowane białko fuzyjne rozwiązuje powyższy problem techniczny i ma cechy zaskakujące w porównaniu do naturalnych endolizyn, gdyż ma radykalnie zmienione właściwości, zachowując jednocześnie aktywność biologiczną sterylizacji powierzchni: jest białkiem znacznie większym oraz traci zdolność dyfuzji i nie ulega zmywaniu wodą i roztworami wodnymi z powierzchni zawierającymi celulozę. Zaskakujące jest również zachowanie aktywności enzymatycznej, mimo przyłączenia dużego partnera fuzyjnego (domeny CBD) na N-terminalnym końcu endolizyny, gdyż często N-końce białek są zaangażowane w utrzymanie trójwymiarowej, bioaktywnej konformacji białka oraz w aktywność katalityczną.

Biofilm stanowi szczególny problem zarówno w lecznictwie, jak i przemyśle, gdyż jest tworem, który chroni bakterie przed czynnikami zewnętrznymi, w tym substancjami bakteriobójczymi. W związku z powyższym zdolność endolizyny TP84_28_His do degradacji biofilmu ma szczególne znaczenie, gdyż jest ona zdolna torować drogę do celu innym substancjom przeciwbakteryjnym. Dotychczas zbadano aktywność endolizyny TP84_28_His wobec wybranych szczepów bakterii i tworzonego przez nich biofilmu, a potencjalny zakres zastosowań tej cząsteczki może być znacznie szerszy.

Biorąc pod uwagę białkową naturę endolizyn, ich najbardziej rokującym zastosowaniem jest zastosowanie zewnętrzne, np. do dezynfekcji powierzchni, utrwalania produktów spożywczych o określonych parametrach fizykochemicznych lub zewnętrznie u ludzi - np. w przypadku trudno gojących się ran czy infekcji skóry. Aby zastosowanie było celowane i efektywne konieczna staje się immobilizacja białka do wybranego materiału, np. celulozy, która jest powszechnie stosowanym materiałem o dobrze poznanych właściwościach.

Domeny CBD to domeny białkowe, które występują w naturze i wiążą celulozę np. będąc częścią enzymu celulazy, który ma za zadanie celulozę strawić - wówczas związanie substratu sprzyja efektywnemu procesowi litycznemu. Domena CBD użyta w wynalazku jest podjednostką celulazy występującej w bakterii Clostridium cellulovorans (Shoseyov, 1996). Wybór tej konkretnej podjednostki został podyktowany danymi literaturowymi, wskazującymi na 2 istotne cechy: (i) domena ta jest w dużej mierze autonomiczną częścią enzymu celulazy, co pozwala na umieszczenie jej w konstrukcie fuzyjnym z zachowaniem zdolności wiązania celulozy; (ii) ze względu na jej N-terminalne ułożenie w enzymie celulazie możliwe było jej umieszczenie w układzie fuzyjnym na N-końcu rekombinowanej endolizyny, który jest bardziej podatny na manipulacje genetyczne raz (iii) doświadc zalna weryfikacja zastosowania ww. domeny CBD do konstrukcji białek fuzyjnych innego rodzaju, wskazanych w Przykładzie 2. Wskazać jednak należy, że inne endolizyny oraz inne domeny CBD również mogą zostać połączone w białku fuzyjnym w analogiczny sposób.

Istotą wynalazku jest fuzyjne białko rekombinowane oznaczone jako CBD_TP84_28_His obejmujące:

a) domenę katalityczną w postaci endolizyny TP84_28_His pochodzącą z bakteriofaga TP-84, b) domenę wiążącą celulozę pochodzącą z celulazy Clostridium cellulovorans.

Korzystnie, gdy fuzyjne białko rekombinowane obejmuje znacznik białkowy His-tag, co najmniej His6.

Sposób otrzymywania fuzyjnego białka rekombinowanego oznaczonego jako CBD_TP84_28_His na drodze genetycznej charakteryzujący się tym, że łączy się endolizynę TP84_28 pochodzącą z bakteriofaga TP-84 z domeną wiążącą celulozę pochodzącą z celulazy Clostridium cellulovorans poprzez fuzję genów kodujących endolizynę TP84_28 i domenę wiążącą celulozę enzymu celulazy z Clostridium cellulovorans.

Korzystnie, gdy dodatkowo dołącza się znacznik białkowy His-tag, co najmniej His6.

Istotą wynalazku jest również zastosowanie fuzyjnego białka rekombinowanego oznaczonego jako CBD_TP84_28_His opisanego powyżej jako środka dezynfekcyjnego do eliminacji bakterii i biofilmów.

Korzystnie, gdy zastosowanie białka fuzyjnego dotyczy formy rozpuszczalnej.

Korzystnie, gdy zastosowanie białka fuzyjnego dotyczy formy związanej z celulozą.

Aby otrzymać białko fuzyjne wg wynalazku konieczne jest odpowiednie przeprowadzenie reakcji PCR na matrycy genomu bakteriofaga TP-84 z odpowiednimi starterami wprowadzającymi miejsca rozpoznawania przez enzymy restrykcyjne. Następnie przeprowadzenie klonowania do wektora ekspresyjnego w tym przypadku pET28delSap_CBD_His oraz transformacja szczepu ekspresyjnego otrzymanym prawidłowym klonem plazmidowym. W kolejnym etapie przeprowadzenie ekspresji genu kodującego białko CBD_TP84_28_His w celu jego biosyntezy. Niezwykle ważnym etapem pozyskania wynalazku jest jego izolowanie z osadu bakteryjnego oraz o czyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa, chromatografii jonowymiennej NiNTA (ze względu na obecność znacznika His6), dializ oraz ultrafiltracji.

Otrzymane fuzyjne białko rekombinowane oznaczone jako CBD_TP84_28_His należy scharakteryzować określając jego tj.: (i) stężenie i warunki buforowe reakcji; (ii) właściwości lityczne na szczepach bakteryjnych za pomocą testów: dyfuzyjnego, redukcji mętności (TRA) z użyciem spektrofotometru; (iii) właściwości lityczne przeciwko biofilmowi; (iv) termostabilność; (v) zdolność wiązania do mikrocelulozy (nośnika). Opis sposobu otrzymywania mikrocelulozy i jej zastosowania jako bionośnika dla fuzyjnych białek, połączonych z domeną celulazy wiążącą mikrocelulozę (Żebrowska et al., 2024).

Innowacyjne podejścia skupiają się na tworzeniu hybrydowych materiałów białkowo-celulozowych, w których białka o różnych właściwościach są połączone lub osadzone na strukturze celulozowej. Te materiały mogą mieć szerokie zastosowanie w biomedycynie, inżynierii tkanek lub przemyśle farmaceutycznym. Zastosowanie celulozy jako macierzy do prezentacji białek może mieć wiele zalet, takich jak biokompatybilność, biodegradowalność, łatwość produkcji i potencjalnie niski koszt. To także otwiera możliwości w tworzeniu innowacyjnych systemów nośników lub dostarczania białek o potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych, diagnostycznych czy w inżynierii biologicznej. Warto zaznaczyć, że te technologie i badania nad wykorzystaniem celulozy jako nośnika białek są ciągle rozwijane, a aktualne doniesienia naukowe mogą dostarczyć najnowszych informacji na ten temat, pokazując różnorodne możliwości i aplikacje tej koncepcji.

Przedmiot wynalazku przedstawiono w przykładach realizacji nie ograniczając jego zakresu oraz na rysunku, na którym:

Fig. 1 przedstawia mapę plazmidu pET28_delSap_His, na której oznaczone zostały: LacO - operator LacO, RBS - miejsce wiązania rybosomu, Xbal, Sali, Ncol - miejsce restrykcyjne enzymów Xbal, SalI, Ncol; KanR - gen oporności na kanamycynę, ColEI origin moduł inicjacji replikacji wektorów bakteryjnych - replikon, lacl - operator laktozowy, T7 promotor T7, miejsce początku ekspresji genu.

Fig. 2 przedstawia mapę wektora pET28_CBD_His, na której oznaczone zostały: CBD - gen kodujący domenę wiążącą celulozę, LacO - operator LacO, RBS - miejsce wiązania rybosomu, Xhoi, Sapl - miejsce restrykcyjne enzymów XhoI, Sapl; KanR - gen oporności na kanamycynę, ColEl origin - moduł inicjacji replikacji wektorów bakteryjnych - replikon, lacl - operator laktozowy, T7 - promotor T7, miejsce początku ekspresji genu.

Fig. 3 przedstawia mapę plazmidu pUC57_GFPuv, na której oznaczone zostały: GFPuv - gen kodujący białko GFPuv, miejsce wiążące, RBS - miejsce wiązania rybosomu, Sapl - miejsce restrykcyjne enzymów Sapl; AmpR - gen oporności na ampicylinę.

Fig. 4 przedstawia mapę plazmidu pET28_Ubq_PDGF2_10, na której oznaczone zostały: His_Myc_Ubw_PDGF2 - gen kodujący kasetę wprowadzającą znacznik His na N-końcu, znacznik Myc, domenę ubikwityny, białko PDGF2_10-krotnie powtórzone, Lac operator - operator LacO, Sapl - miejsce restrykcyjne enzymów Sapl; KanR - gen oporności na kanamycynę, ori - moduł inicjacji replikacji wektorów bakteryjnych - replikon, lacl - operator laktozowy, T7 - promotor T7, miejsce początku ekspresji genu.

Fig. 5 przedstawia mapę plazmidu pET28_CBD_GFPuv_His, na której oznaczone zostały: CBD - gen kodujący domenę wiążącą celulozę, GFPuv - gen kodujący białko GFPuv, LacO - operator LacO, Sapl, XhoI, Ncol - miejsce restrykcyjne enzymów Sapl, XhoI, Ncol; KanR - gen oporności na kanamycynę, ColE1 ori - moduł inicjacji replikacji wektorów bakteryjnych - replikon, lacl - operator laktozowy, T7 - promotor T7, miejsce początku ekspresji genu.

Fig. 6 przedstawia mapę plazmidu pET28_CBD_PDGF2_10_His, na której oznaczone zostały: CBD - gen kodujący domenę wiążącą celulozę, PDGF210 - gen kodujący białko PDGF2_10-krotnie powtórzone, LacO - operator LacO, Sapl, XhoI, Ncol - miejsce restrykcyjne enzymów Sapl, XhoI, Ncol; KanR - gen oporności na kanamycynę, ColEI ori - moduł inicjacji replikacji wektorów bakteryjnych - replikon, lacl - operator laktozowy, T7 - promotor T7, miejsce początku ekspresji genu.

Fig. 7 przedstawia wynik analizy elektroforetycznej w żelu poliakryloamidowym w warunkach SDS-PAGE z ekspresji genu kodującego białko (A) CBD_GFPuv_His i (B) CBD_PDGF2_10_His; M - marker wielkości Prestained Protein Ladder; M1 - marker wielkości Unstained Protein Ladder; To - lizat bakteryjny przed indukcją hodowli IPTG, Ti - lizat bakteryjny po 1 godzinie od indukcji hodowli

IPTG, T2 - lizat bakteryjny po 2 godzinie od indukcji hodowli IPTG, T3 - lizat bakteryjny po 3 godzinie od indukcji IPTG, T4 - lizat bakteryjny po 4 godzinie od indukcji hodowli IPTG.

Fig. 8 przedstawia mapę plazmidu pET28_CBD_TP84_28_His, na której oznaczone zostały: TP84_28 - gen kodujący endolizynę TP84_28, CBD - gen kodujący domenę wiążącą celulozę, CBD_TP84_28_His - gen fuzyjny, który powstał, po wklonowaniu genu TP84_28 do plazmidu pET_CBD_His, LacO - operator LacO, RBS - miejsce wiązania rybosomu, pET-up - miejsce wiązania startera pET-up, pET-tert - miejsce wiązania startera pET-tert, pET_TP28_SapI_R - miejsce wiązania startera pET_TP28_SapI_R; pET_TP28_SapI_F - miejsce wiązania startera pET_TP28_SapI_F; Pagl, XhoI, Sapl, Ncol - miejsce restrykcyjne enzymów XhoI, Sapl, Ncol; KanR - gen oporności na kanamycynę, ColEI origin - moduł inicjacji replikacji wektorów bakteryjnych - replikon, lacl - operator laktozowy, M13 origin - inicjacja replikacji jednoniciowych wirusów bakteryjnych M13.

Fig. 9 przedstawia krzywą wzrostu bakterii E. coli BL(DE3) Gold zawierających rekombinowany plazmid pET28delSapI_CBD_TP84_28_His po indukcji ekspresji genu fuzyjnego cbd_tp84_28_His za pomocą IPTG, na której oznaczone zostały: E. coli BL21(DE3) Gold pETdelSapI_CBD_TP84, nieindukowane - szczep ekspresyjny zawierający rekombinowany plazmid zawierający gen kodujący rekombinowaną endolizynę CBD_TP84_28_His niepoddany działaniu IPTG; E. coli BL21(DE3) Gold pETdelSapI_CBD_TP84, indukowane - szczep ekspresyjny zawierający rekombinowany plazmid zawierający gen kodujący rekombinowaną endolizynę CBD_TP84_28_His poddany działaniu IPTG; E. coli BL21(DE3) Gold, indukowane - szczep ekspresyjny bez rekombinowanego plazmidu, indukowany IPTG.

Fig. 10 przedstawia analizę SDS-PAGE funkcjonalnie homogennej rekombinantowej fuzyjnej endolizyny CBD_TP84_28_His, na której oznaczone zostały: M - PageRuler Plus Stained Protein Ladder, E - endolizyna CBD TP84-28. Strzałka wskazuje prążek odpowiadający wielkością fuzyjnej endolizynie CBD_TP84-28 (64,2 kDa).

Fig. 11 przedstawia analizę interakcji z mikrocelulozą (nC): porównanie między endolizyną w fuzji z CBD (CBD_TP84_28) a endolizyną bez tej domeny (TP84_28). Panel (a) pokazuje wiązanie TP84_28 i CBD_TP84_28 z μC na płycie 96-dołkowej przy użyciu techniki Western blot. Oba białka posiadają znacznik His, który znajduje się na końcu C, co pozwala na wykrywanie białka przyczepionego do μC przy użyciu przeciwciał anty-His. Panel (b) pokazuje test dyfuzyjny aktywności endolizyny na płytkach z posianym gospodarzem G. stearothermophilus, szczep 10. Na płytkę nałożono: kontrolę, tj. μθ, kompleks μC utworzony z każdą z endolizyn oraz endolizyny niezwiązane z μθ. Panel (c) pokazuje wynik analizy elektroforetycznej SDS-PAGE kompleksów μC z CBD_TP84_28 i kompleksów μC z TP84_28, wraz z kolejnymi etapami wypłukiwania kompleksów; K-białko TP84_28/CBD_TP84_28; 1 - kompleks μC utworzony z TP84_28/CBD_TP84_28; 2 - supernatant powstały w wyniku tworzenia kompleksu; 3 - przemywanie kompleksu w roztworze 1 x PBS; 4 - pierwsze przemywanie kompleksu wodą; 5 - drugie przemywanie kompleksu wodą. Panel (d) pokazuje test dyfuzyjny wykonany przy użyciu próbek z panelu (c) wykorzystujący płytkę z posianym gospodarzem G. stearothermophilus, szczep 10 jako podłoże.

Fig. 12 przedstawia immunoblotting białka fuzyjnego według wynalazku na papierze celulozowym: (a) schemat wiązania domeny CBD z filtrem celulozowym oraz metki histydynowej z przeciwciałem anty-His-HRP, które umożliwia wywołanie barwnej reakcji po zastosowaniu DAB; (b) papier celulozowy z nakropionym kolejno PBS, roztworem TP84_28_His oraz CBD_TP84_28_His.

Fig. 13 przedstawia aktywność enzymu CBD_TP84_28_His wobec różnych szczepów bakteryjnych obserwowana w teście dyfuzyjnym. Górny rząd: aktywność CBD_TP84_28_His przeciwko szczepom mezofilowym (37°C): (a) B. cereus, (b) B. subtilis, (c) E. coli lac (+) (d) S. aureus. Dolny rząd: aktywność białka CBD_TP-84_28 przeciwko szczepom termofilnym (60°C): (d) G. stearothermophilus, szczep 10, (e) T. aquaticus, (f) G. ICI (g) B. stearothermophilus. Przejrzyste okręgi na środku obszaru bakteryjnego odpowiadają aktywności bakteriolitycznej w miejscu nakropienia roztworu CBD_TP84_28_His.

Fig. 14 przedstawia aktywność CBD_TP84_28_His przeciwko różnym szczepom bakteryjnym. Wykres pokazuje redukcję optyczności przy 600 nm (OD600) w bakteriach resuspensyjnych w standardowym buforze resuspensyjnym po dodaniu białka CBD_TP84_28_His w temperaturze 55°C. 1 - E. coli lac (+), 2 - G. ICI, 3 - G. stearothermophilus, szczep 10, 4 - B. stearothermophilus, 5 - B. cereus, 6 - T. aquaticus, 7 - B. subtilis, 8 - kontrola negatywna G. stearothermophilus szczep 10 bez dodatku CBD_TP84_28_His.

Fig. 15 przedstawia rozkład biofilmu utworzonego przez G. stearothermophilus, szczep 10. Wykres pokazuje pomiar wartości OD600 G. stearothermophilus, szczep 10, hodowanego przez 24 godziny w temperaturze 55°C na płytkach z agarem i dodatkiem 0,05-50 μg CBD_TP84_28_His. Pod wykresem przedstawiono barwienie biofilmu 0,1% fioletem krystalicznym: kontrola znajduje się po lewej stronie, następnie pokazano próbki traktowane rosnącymi ilościami fuzyjnej endolizyny CBD_TP84_28_His.

Fig. 16 przedstawia aktywność białka CBD_TP84_28_His po preinkubacji w 13 różnych temperaturach. Wykres pokazuje redukcję w OD600 zawiesinie G. stearothermophilus, szczep 10, zawieszonych w standardowym buforze do zawieszenia po dodaniu CBD_TP84_28_His inkubowanego w różnych temperaturach przed eksperymentem (37,7-95,8°C, autoklawowanie, bufor, kontrola (-). Pomiarów dokonano przy użyciu czytnika Tecan microplate reader.

Przykład 1. Sposób otrzymywania wektora ekspresyjnego pET28_CBD_His z możliwością wklonowania genu w miejsce restrykcyjne Sapl.

Przygotowanie wektora ekspresyjnego pET28_CBD_His polegało na projektowaniu i produkcji syntetycznego genu zawierającego kasetę syntetycznego DNA z genem kodującym domenę CBD, sekwencję aminokwasową rozpoznawaną przez enterokinazę oraz miejsce amplifikacji z miejscem rozpoznawania dla endonukleazy restrykcyjnej Sapl. Końce 5’ i 3' kasety zawierały miejsca restrykcyjne Bsal i XhoI. Wektor ekspresyjny pET28_delSapI_His (Fig. 1) trawiono endonukleazami restrykcyjnymi Ncol i XhoI, defosforylowano fosfatazą alkaliczną SAP i oczyszczono poprzez izolację na żelu agarozowego. Powstałe fragmenty DNA insertu i wektora połączono przy użyciu ligazy DNA T4. Rekombinowanym plazmidem DNA pET28_CBD_His transformowano chemikompetentne komórki E. coli NEB DH5-alfa. Uzyskane klony bakteryjne selekcjonowano za pomocą reakcji PCR. Rekombinowany plazmidowy DNA oczyszczono, selekcjonowano metodą mapowania restrykcyjnego oraz wykonano sekwencjonowanie DNA, weryfikujące prawidłowość sekwencji nukleotydowej klonu wektora ekspresyjnego z fragmentem genu kodującego domenę CBD - pET28_CBD_His (Fig. 2).

Przykład 2. Opis metody weryfikacji funkcjonalności wektora pET28_CBD_His oraz zachowania aktywności biologicznej fuzyjnej domeny CBD oraz partnerów fuzyjnych na przykładzie otrzymywania rekombinowanych fuzyjnych białek CBD_GFPuv_His i CBD_PDGF2_10_His - klonowanie, ekspresja i nadprodukcja białek.

Konstrukcja i klonowanie genu gfpuv i pdsf2 10 do wektora pET28 CBD His

W celu otrzymania białka GFPuv i PDGF_210 w fuzji z domeną CBD (CBD_GFPuv_His, CBD_PDGF2_10_His) zaprojektowano klonowanie nowego konstruktu genetycznego przy użyciu plazmidu pET28_CBD_His jako wektora ekspresyjnego oraz genu gfpuv/pdg2_10 jako insertu. Sekwencja kodująca domenę CBD znajduje się na N-końcu, następnie umiejscowiona jest sekwencja kodująca białko GFPuv/PDGF2_10, zaś na C-końcu znajduje się sekwencja kodująca znacznik His6.

Gen gfpuv został przygotowany przy użyciu reakcji PCR. Matrycą do otrzymania genu gfpuv był plazmidowy DNA pUC57_GFPuv (GeneUniversal) (Fig. 3). Na końcach 5’ i 3’ genu kodującego białko GFPuv wprowadzono miejsce rozpoznawania dla enzymu restrykcyjnego SapI. Do przeprowadzenia reakcji zastosowane zostały następujące enzymy: polimeraza Marathon (A&A biotechnology, Gdańsk, Polska) oraz następujące startery (Eurofins Genomics, Ebersberg, Niemcy):

M13 F 5’-gtaaaacgacggccagt-3’,

M13 R 5’-caggaaacagctatgac-3’.

W celu przeprowadzenia reakcji PCR, poddawano 25 μl mieszaniny reakcyjnej (12,5 μl 2x Marathon Reaction Buffer, 2,5 mM dNTPs, 0,25 μl 50 μM starter F, 50 μM starter R, 0,25 μl polimerazy Marathon, 0,5 μl 100 ng^l DNA matrycowego. Profil temperaturowy mieszaniny: 96°C przez 3 minuty, a następnie 30 cykli (30 s w 95°C, 30 s w 52°C, 1 min w 68°C), następnie mieszaninę utrzymywano w temperaturze 72°C przez 2 min i schłodzono do 10°C. Otrzymany prążek DNA oczyszczano standardową metodą ekstrakcji fenol-chloroform, a następnie precypitowano. Dzięki starterom wprowadzono miejsca rozpoznawane przez enzym Sapl w odpowiedniej konfiguracji, dając tym samym możliwość do klonowania genu gfpuv do wektora pET28_CBD_His metodą klonowania molekularnego z użyciem enzymu restrykcyjnego Sapl. W związku z tym, otrzymane DNA, które stanowiło insert, poddano trawieniu enzymem Sapl (New England Biolabs, Ipswich, USA). Mieszanina reakcyjna (1 μg DNA, 4 μl CutSmart Buffer, 2 μl Sapl, uzupełniono wodą do 20 μθ była utrzymywana w termocyklerze w 37°C przez 16 h, następnie podgrzewano ją do 65°C przez 10 min celem inaktywacji enzymu Sapl. Przeprowadzono elektroforezę w agarozie niskotopliwej, wycięto prążek o długości 867 bp odpowiadającej poszukiwanemu genowi, a następnie oczyszczono DNA przy użyciu zestawu Gel-Out AX (A&A Biotechnology, Gdańsk, Polska) i zawieszono w 20 μl wody jałowej.

Gen pdgf2_10 został przygotowany przy użyciu reakcji trawienia enzymem restrykcyjnym Sapl z plazmidowego DNA pET28_Ubq_PDGF2_10 (Fig. 4). Mieszanina reakcyjna (2 μg plazmidowy DNA, 6 μl CutSmart Buffer, 4 μl Sapl, uzupełniono wodą do 60 μθ była utrzymywana w termocyklerze w 37°C przez 16 h, następnie podgrzewano ją do 65°C przez 10 min celem inaktywacji enzymu Sapl. Przeprowadzono elektroforezę w agarozie niskotopliwej, wycięto prążek o długości 633 pz odpowiadającej poszukiwanemu genowi, a następnie oczyszczono DNA przy użyciu zestawu Gel-Out AX (A&A Biotechnology, Gdańsk, Polska) i zawieszono w 20 μl wody jałowej.

Następnie przeprowadzono reakcję ligacji insertów gfpuv i pdgf2_ 10 z wektorem przy użyciu ligazy T4 (New England Biolabs, Ipswich, USA). W tym celu wymieszano 38 ng gfpuv i 95 ng pdgf2_10 z 100 ng wektora (stosunek molowy odpowiednio 3:1 i 10:1), który został uprzednio poddany trawieniu enzymem Sapl oraz defosforylacji. Reakcję przeprowadzono poprzez umieszczenie mieszaniny reakcyjnej w bloku grzejnym w 16°C na 16 h, następnie przez 10 min inaktywowano enzym w temperaturze 65°C.

Po przeprowadzeniu reakcji ligacji przeprowadzono transformację chemikompetentnych bakterii Escherichia coli (E. coli) DH5a mieszaniną ligacyjną. Wykonano analizę otrzymanych klonów przy użyciu reakcji zestawu i instrukcji Clone ID (Lucigen Corporation, Middleton, USA) ze starterami pET-tert (5’-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3 ’) i pET-up (5’-GATGCGTCCGGCGTAGA-3‘) przy użyciu poniższego profilu temperaturowego: denaturacja - 98°C, 2 min; przyłączanie starterów - 52°C, 30 s; elongacja - 72°C, 1 min; cały cykl powtórzono 25x. Następnie utrzymywano mieszaninę reakcyjną w temperaturze 72°C przez 3 min i schłodzono do temperatury 4°C. Wyodrębniono wstępnie pozytywne klony konstruktu. Otrzymane konstrukty potencjalnie pozytywnych klonów poddano sekwencjonowaniu w laboratorium zewnętrznym (Eurofins Genomics, Ebersberg, Niemcy). Na podstawie analizy wyników sekwencjonowania potwierdzono powodzenie ligacji i transformacji i wytypowano 1 klon użytku. Mapę konstruktu plazmidowego pET28_CBD_GFPuv_His przedstawia figura 5, mapę konstruktu plazmidowego pET28_CBD_PDGF2_10_His przedstawia figura 6. W celu przeprowadzenia ekspresji genu chemikompetentne komórki bakteryjne E. coli BL21(DE3) Gold zostały transformowane plazmidowym DNA pET28_CBD_GFPuv_His i pET28_CBD_PDGF2_10_His.

Ekspresja i nadprodukcja rekombinantowych białek fuzyjnych CBD GFPuv His i CBD PDGF2 10 His

Z płytki agarowej pobrano kolonię bakteryjną transformowaną DNA pET28_CBD_GFPuv_His i pET28_CBD_PDGF2_10_His, zaszczepiono 10 ml pożywki LB z dodatkiem kanamycyny o końcowym stężeniu 30 μg/ml, a następnie inkubowano w wytrząsarce w temp. 37°C. Hodowle nocne zaszczepiono 1 L świeżo przygotowanej pożywki LB w dwóch oddzielnych kolbach do gęstości optycznej wynoszącej 0,1 przy długości fali 600 nm (OD600nm = 0,1) i inkubowano w wytrząsarce w temperaturze 37°C. Hodowlę prowadzono do uzyskania OD600nm = 0,6-0,7 i w tym momencie dokonywano indukcji ekspresji genu przy użyciu IPTG, który dodawano do końcowego stężenia 1 mM. Hodowlę prowadzono w temperaturze 30°C. Po 4 h zwirowano hodowlę (2739 x g, 15 min), a uzyskany osad został przeznaczony do oczyszczania pożądanego białka. Równolegle prowadzono hodowlę niezaindukowaną IPTG w takich samych warunkach jak hodowlę indukowaną.

Wzrost bakterii E. coli BL21(DE3) pET28_CBD_GFPuv_His i pET28_CBD_PDGF2_10_His po indukcji IPTG monitorowano za pomocą pomiarów absorbancji przy długości fali 600 nm (OD600nm). Reakcję monitorowano analizą SDS-PAGE (Fig. 7).

Sposób pokazuje, że jest to prawidłowe podejście do klonowania genów kodujących białka poprzez skonstruowanie uniwersalnego wektora do klonowania i ekspresji pET28_CBD_His (Fig. 2) i odpowiednie przygotowanie insertu/genu kodującego białko docelowe. Konstrukcja uniwersalnego plazmidu i przygotowanie insertów jest innowacyjne wykorzystujące standardowe metody klonowania molekularnego.

Przykład 3. Sposób otrzymywania fuzyjnego białka rekombinowanego - endolizyny CBD_TP84_28_His.

Konstrukcja i klonowanie genu tp84 28 do wektora pET28 CBD His

W celu otrzymania endolizyny TP84_28_His w fuzji z domeną CBD (CBD_TP84_28_His) zaprojektowano klonowanie nowego konstruktu genetycznego przy użyciu plazmidu pET28_CBD_His (Fig. 2) jako wektora ekspresyjnego oraz genu tp84_28 jako insertu. Sekwencja kodująca domenę CBD znajduje się na N-końcu, następnie umiejscowiona jest sekwencja kodująca endolizynę TP84_28, zaś na C-końcu znajduje się sekwencja kodująca znacznik His6.

Gen tp84_28 został przygotowany przy użyciu reakcji PCR. Matrycą do otrzymania genu tp84_28 było genomowe DNA bakteriofaga TP-84 (Epstein and Campbell, 1975) (genbank NC_041918.2). Do przeprowadzenia reakcji zastosowane zostały następujące enzymy: Q5® High Fidelity DNA Polymerase wraz z Q5® High GC Enhancer (New England Biolabs, Ipswich, USA) oraz następujące startery: F - pET_TP28_SapI_F - gagctcttcacccgggatgcaagcaagat, R - pET_TP28_SapI_R - CATGCTCTTCTGGGCCC-gtttggaattttgatcgt (Eurofms Genomics, Ebersberg, Niemcy).

W celu przeprowadzenia reakcji PCR, poddawano 25 μl mieszaniny reakcyjnej (5 μl 5x Q5 Reaction Buffer, 1 μl 5 mM dNTPs, 1,25 μί 10 μM starter F, 10 μM starter R, 0,25 μl Q5® High Fidelity DNA Polymerase, 1 μl DNA matrycowego, 5 μl Q5® High GC Enhancer, 10,75 μl wody bez nukleaz) podgrzaniu do 98°C, a następnie 30 cyklom PCR (30 s w 98°C, 30 s w 62°C), 2 min w 72°C), następnie mieszaninę utrzymywano w temperaturze 72°C przez 4 min i ochłodzono do 10°C. DNA oczyszczano standardową metodą ekstrakcji fenol-chloroform, a następnie precypitowano. Dzięki starterom wprowadzono miejsca rozpoznawane przez enzym Sapl w odpowiedniej konfiguracji, dając tym samym możliwość do klonowania genu tp84_28 do wektora pET28_CBD_His metodą klonowania molekularnego z użyciem enzymu restrykcyjnego Sapl. W związku z tym, otrzymane DNA, które stanowiło insert, poddano trawieniu enzymem Sapl (New England Biolabs, Ipswich, USA). Mieszanina reakcyjna (10 μl DNA, 2 μl CutSmart Buffer, 2 μl Sapl, 6 μl wody) była utrzymywana w termocyklerze w 37°C przez 16 h, następnie podgrzewano ją do 65°C przez 10 min celem inaktywacji enzymu Sapl. Przeprowadzono elektroforezę w agarozie niskotopliwej, wycięto prążek o długości 1212 bp odpowiadającej poszukiwanemu genowi, a następnie oczyszczono DNA przy użyciu zestawu Gel-Out AX (A&A Biotechnology, Gdańsk, Polska) i zawieszono w 20 μl wody jałowej.

Następnie przeprowadzono reakcję ligacji insertu z wektorem przy użyciu ligazy T4 (New England Biolabs, Ipswich, USA). W tym celu wymieszano 104 ng insertu z 50 ng wektora (stosunek molowy 6:1), który został uprzednio poddany trawieniu enzymem Sapl oraz defosforylacji. Reakcję przeprowadzono poprzez umieszczenie mieszaniny reakcyjnej (0,53 μl wektora, 8 μl insertu, 2 μl T4 DNA Ligase Reaction Buffer, 8,47 μl H2O, 1 μl ligazy T4) w bloku grzejnym w 16°C na 16 h, następnie przez 10 min inaktywowano enzym w temperaturze 65°C.

Po przeprowadzeniu reakcji ligacji przeprowadzono transformację chemikompetentnych bakterii E. coli DH5a mieszaniną ligacyjną. Wykonano analizę otrzymanych klonów przy użyciu reakcji zestawu i instrukcji Clone ID (Lucigen Corporation, Middleton, USA) ze starterami pET-tert (TGCTAGTTATTGCTCAGCGG) i pET-up (GATGCGTCCGGCGTAGA) przy użyciu poniższego profilu temperaturowego: denaturacja - 98°C, 2 min; przyłączanie starterów - 52°C, 30 s; elongacja - 72°C, 1 min; cały cykl powtórzono 25x. Następnie utrzymywano mieszaninę reakcyjną w temperaturze 72°C przez 3 min i schłodzono do temperatury 4°C. Wyodrębniono wstępnie pozytywne klony konstruktu - oczekiwany produkt reakcji PCR został zidentyfikowany w 4 koloniach spośród 38 badanych, z których wyizolowano DNA. Otrzymane konstrukty potencjalnie pozytywnych klonów poddano sekwencjonowaniu w laboratorium zewnętrznym (Eurofins Genomics, Ebersberg, Niemcy). Na podstawie analizy wyników sekwencjonowania potwierdzono powodzenie ligacji i transformacji i wytypowano 1 klon spośród 4 sprawdzanych do dalszego użytku. Mapę konstruktu plazmidowego pET28_CBD_TP84_28_His przedstawia Fig. 8. W celu przeprowadzenia ekspresji genu chemikompetentne komórki bakteryjne E. coli BL21(DE3) Gold zostały transformowane plazmidowym DNA pET28_CBD_TP84_28_His według protokołu: wymieszano 1 μl DNA, 20 μl 5 x bufor KCM i dopełniono do 100 μl wodą jałową. Dodano 100 μl komórek chemikompetentnych, wymieszano i inkubowano na lodzie przez 10 min, a następnie przez kolejne 10 min w temperaturze pokojowej. Dodano 1 ml SOC i przez godzinę inkubowano w wytrząsarce w 37°C. Wysiano 100 μl na murawę na płytkę z LA oraz dodatkiem antybiotyku kanamycyny o końcowym stężeniu 30 μg/ml.

Ekspresja i nadprodukcja rekombinantowej fuzyjnej endolizyny CBD TP84 28 His

Z płytki agarowej pobrano kolonię bakteryjną transformowaną DNA pET28_CBD_TP84_28_His, zaszczepiono 10 ml pożywki LB z dodatkiem kanamycyny o końcowym stężeniu 30 μg/ml, a następnie inkubowano w wytrząsarce w temp. 37°C. Hodowlą nocną zaszczepiono 1 L świeżo przygotowanej pożywki LB do gęstości optycznej wynoszącej 0,1 przy długości fali 600 nm (OD600nm = 0,1) i inkubowano w wytrząsarce w temperaturze 37°C. Hodowlę prowadzono do uzyskania OD600nm = 0,6-0,7 i w tym momencie dokonywano indukcji ekspresji genu przy użyciu IPTG, który dodawano do końcowego stężenia 1 mM. Hodowlę prowadzono w temperaturze 30°C. Po 4 h żwirowano hodowlę (2739 x g, 15 min), a uzyskany osad został przeznaczony do oczyszczania pożądanego białka. Równolegle prowadzono hodowlę niezaindukowaną IPTG w takich samych warunkach jak hodowlę indukowaną.

Wzrost bakterii E. coli BL21 (DE3) pET28_CBD_TP84_28_His po indukcji IPTG monitorowano za pomocą pomiarów absorbancji przy długości fali 600 nm (ODeoonm). Dzięki temu potwierdzono, że CBD_TP84_28_His, podobnie jak sama TP84_28_His, nie jest w stanie całkowicie zahamować wzrostu hodowli bakteryjnej, zauważono natomiast, że stymulacja nadprodukcji tego białka spowalnia wzrost kultury bakteryjnej w porównaniu zarówno z hodowlą nieindukowaną, jak i hodowlą pozbawioną sztucznie wprowadzonego plazmidu (Fig. 9).

Oczyszczanie rekombinantowej fuzyjnej endolizyny CBD TP84 28 His

Osad bakteryjny (1,6 g) otrzymany w wyniku nadprodukcji został zawieszony w buforze A (50 mM Tris-HCI pH=7,0, 500 mM NaCI) w proporcji masowej 1:10. Dodano 200 μl PMSF do końcowego stężenia 1 mM oraz 1 ml lizozymu do końcowego stężenia 0,5 mg/ml. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono na 30 min w temperaturze 4°C. Następnie poddano ją 10 cyklom 5-minutowych sonikacji przy 50% mocy. Sonikację prowadzono na lodzie. Uzyskany lizat wirowano przy 16 000 x g przez 20 min. Supernatant przefiltrowano przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,22 μΜ. Dalsze oczyszczanie obejmowało podgrzewanie lizatu do temperatury 55°C przez 10 min celem usunięcia białek termolabilnych. Po procesie ogrzewania mieszaninę wirowano przy prędkości 12 000 x g przez 30 min. Do supernatantu dodano polietylenoiminy (PEI) do końcowego stężenia 0,2% i inkubowano przez 16 h. Mieszaninę wirowano przy prędkości 12000 x g przez 30 min, a supernatant dializowano do buforu 50 mM Tris-HCI, 500 mM NaCl (pH=7,0), który umożliwiał wykonanie kolejnego kroku, czyli oczyszczania przy użyciu chromatografii powinowactwa do unieruchomionych jonów niklu. Do tego celu użyto aparatury NGC - Next Generation Chromatography (Bio-Rad, Hercules, USA) i złoża NiNTA His Trap HP (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden) o pojemności 5 ml. Naniesiono 15 ml mieszaniny białek, złoże przepłukano 50 ml buforu A, następnie eluowano za pomocą gradientu o wzrastającym stężeniu imidazolu od 0 mM do 500 mM. Białko CBD_TP84_28_His eluowano przy stężeniu imidazolu 300-400 mM. Następnie ultrawirowano próbkę białka przy użyciu membran odcinających MWCO o wielkości porów 10 kDa, jednocześnie zagęszczając białko CBD_TP84_28_His i wymieniając bufor na 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl. W celu analizy czystości i stężenia białka przeprowadzono elektroforezę SDS-PAGE w 12% żelu poliakryloamidowym (Fig. 10).

Po pomyślnym procesie oczyszczenia białka CBD_TP84_28_His przy użyciu metod opisanych powyżej, potwierdzono czystość preparatu bliską 99% przy użyciu elektroforezy SDS-PAGE (Fig. 10). Oczyszczony aktywny enzym można przechowywać w temperaturze 4°C przez ponad 3 miesiące, a w temperaturze -80°C z dodatkiem glicerolu (10%) przez ponad 6 miesięcy. Uzyskano 2 mg fuzyjnej endolizyny CBD_TP84_28_His o stężeniu 0,5 mg/ml z 1 L hodowli użytej do przeprowadzenia ekspresji genu.

Przykład 4. Oddziaływanie rekombinowanej fuzyjnej endolizyny CBD_TP84_28_His z mikrocelulozą (μφ.

Jakościowe oznaczanie tworzenia kompleksu metodą dot blot oraz potwierdzenie aktywności kompleksu metodą testu dyfuzyjnego

W celu oceny właściwości wiązania celulozy przez rekombinowaną fuzyjną CBD_TP84_28_His, 96-dołkową silnie wiążącą płytkę pokryto zawiesiną μC w 1 x PBS i inkubowano przez 18 h w temperaturze 4°C. Następnie płytka była odwirowywana przy prędkości 4000 x g przez 10 minut. W kolejnych dołkach wykonano seryjne rozcieńczenia endolizyn: TP84_28_His i CBD_TP84_28_His rozpoczynając od stężenia 1 μg/100 μl (na jeden dołek): w rzędzie A seryjne rozcieńczenia endolizyny TP84_28_His, a w rzędzie B - fuzyjną endolizynę CBD_TP84_28_His i inkubowano przez 18 godzin w temperaturze 4°C. Po tym czasie płytkę ponownie odwirowano, a supernatant odciągnięto. Dołki 3-krotnie przepłukiwano poprzez dodanie 1 x PBS i odwirowanie. Następnie do dołków dodano 100 μl buforu blokującego (Bio-Rad, Hercules, USA) i wytrząsano przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dołki były ponownie wytrząsane i przepłukiwane 3-krotnie roztworem TBST (50 mM Tris-HCl pH 7,5; 150 mM NaCl; 0,1% Tween 20). Powstałe kompleksy były ponownie zawieszone w 100 μl roztworu przeciwciał anty-His z enzymem peroksydazą chrzanową (HRP) w proporcji 1:2000 (Merck, Darmstadt, Germany) i inkubowane przez 1 h w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie odwirowano i przepłukano dołki 3- krotnie buforem TBST. Roztwór DAB (3,3’-diaminobenzydyna tetrahyrochloride, Sigma-Aldrich, Saint Louis,

USA) został dodany do przepłukanych studzienek, aby poprzez reakcję DAB z HRP uwidocznić kompleksy pC-CBD_TP84_28_His. Wyniki omówiono poniżej oraz przedstawiono na Fig. 11A.

Przygotowano płytki z pożywką LA i wysiano 200 μl hodowli nocnej gospodarza Geobacillus stearothermophilus (G. stearothermophilus), szczep 10. Na tak przygotowane płytki nakrapiano kolejno po 10 pl: w górnym rzędzie: μC w 1 x PBS, μC po inkubacji i płukaniu z preparatem TP84_28, białko TP84_28 oraz w dolnym rzędzie: pC w 1 x PBS, pC po inkubacji i płukaniu z CBD_TP84_28_His i białko CBD_TP84_28_His. Następnie płytki zostały wstawione na noc do cieplarki w temperaturze 55°C. Wyniki omówiono poniżej oraz przedstawiono na Fig. 11B.

Oznaczenie obecności białka CBD TP84 28 His w kompleksie z mikrocelulozą metodą analizy elektroforetycznej oraz potwierdzenie aktywności kompleksu metodą testu dyfuzyjnego

Przeprowadzono reakcję kompleksowania pC i białka TP84_28_His oraz CBD_TP84_28_His poprzez inkubację przez 18 h w 4°C (próbka 1), supernatant odciągnięto (próbka 2). Następnie kompleksy przepłukiwano 3-krotnie 1 x PBS poprzez wirowanie przy prędkości 10 000 x g przez 5 min i ponownie zawieszono w 1 x PBS (próbki 2, 3, 4). Następnie płukano wodą i wszystkie próbki analizowano w 12% żelu poliakryloamidowym (Fig. 11C) oraz metodą testu kropkowego na płytce agarowej z gospodarzem G. stearothermophilus, szczep 10 (Fig. 11d).

Analizę przeprowadzono w 12% żelu SDS-PAGE nakładano po 20 pl próbek:

K - oczyszczony preparat białka TP84_28_His/CBD_TP84_28_His

- próbka po reakcji kompleksowania pC - TP84_28_His/pC-CBD_TP84_28_His, pC zawieszona w 1 x PBS

- supernatant po kompleksowaniu

- supernatant po płukaniu 1 x PBS

- supernatant po płukaniu wodą

- kompleksy pC-TP84_28_His/pC-CBD_TP84_28_His po płukaniach PBS i wodą, pC zawieszona w 1 x PBS

Próbki analizowano pod kątem aktywności i w tym celu przygotowano płytki z pożywką LA, na których wysiano 300 pl hodowli nocnej G. stearothermophilus, szczep 10. Na tak przygotowane płytki nakrapiano kolejno po 10 pl kolejnych próbek K, 1, 2, 3, 4, 5 uzyskanych w procesie kompleksowania do pC białka TP84_28_His (górny rząd) oraz białka fuzyjnego CBD_TP84_28_His z pC. Następnie płytki zostały wstawione na noc do cieplarki w temperaturze 55°C. Wyniki omówiono poniżej oraz przedstawiono na Fig. 11D.

Wyniki:

Jakościowe oznaczanie tworzenia kompleksu metoda dot blot oraz potwierdzenie aktywności kompleksu metoda testu dyfuzyjnego

Wybarwieniu uległ materiał znajdujący się w studzienkach, w których przeprowadzono seryjne rozcieńczenie CBD_TP84_28_His; w studzienkach, w których rozcieńczano TP84_28_His zaobserwowano jedynie bezbarwną pC (Fig. 11A).

Zaobserwowano przejaśnienia i brak wzrostu bakterii w miejscach nakrapiania TP84_28_His, kompleksu pC-CBD_TP84_28_His oraz CBD_TP84_28_His; normalny wzrost bakterii obserwowano w miejscu nakrapiania pC oraz pC z TP84_28_His. Dowodzi to bakteriolitycznej aktywności obydwu endolizyn (TP84_28_His oraz CBD_TP84_28_His) oraz faktu tworzenia trwałych kompleksów pC z CBD_TP84_28_His (Fig. 11B).

Oznaczenie obecności białka CBD TP84 28 His w kompleksie z mikrocelulozą metodą analizy elektroforetycznej oraz potwierdzenie aktywności kompleksu metodą testu dyfuzyjnego

Zaobserwowano obecność prążków odpowiadających wielkością TP84_28_His w próbce kontrolnej (K) oraz próbce (2), co dowodzi, iż TP84_28_His nie związało się z pC. W przypadku kompleksowania pC z CBD_TP84_28_His zaobserwowano prążki odpowiadające wielkością ok. 60 kDa w próbce kontrolnej oraz próbce (1); mimo kilkukrotnego przemywania, w kolejnych supernatantach nie zaobserwowano obecności CBD_TP84_28_His co dowodzi, iż, endolizyna fuzyjna trwale związała się z pC (Fig. 11C).

W teście dyfuzyjnym w przypadku białka TP84_28_His zaobserwowano przejaśnienia w próbce kontrolnej (K) oraz w supernatancie po kompleksowaniu (2) oraz płukaniu 1 x PBS (3). Aktywność nieobecna była w próbce (1), czyli w przypadku zwirowanej pC - dowodzi to, iż TP84_28_His nie związał się z pC i pozostał rozpuszczony w supernatancie. W przypadku nakrapiania płytki próbkami uzyskanymi w toku kompleksowania pC z białkiem fuzyjnym CBD_TP84_28_His zaobserwowano aktywność inhibującą próbki kontrolnej (K) oraz jej kompleksu z μθ (1). Próbki supernatantu uzyskanego po kolejnych przemywaniach 1 x PBS-em i 2 x wodą nie uwidoczniły aktywności. Próbka o numerze 5 wykazała aktywność co oznacza, że białko CBD_TP84_28_His silnie oddziałuje z μθ pozostając z nią w kompleksie (Fig. 11D).

Powyższe wyniki wskazują, że rekombinowana fuzyjna endolizyna CBD_TP84_28_His wykazuje silne wiązanie z ^lC.

Przykład 5. Oddziaływanie rekombinowanej fuzyjnej endolizyny CBD_TP84_28_His z celulozą.

Właściwości wiązania celulozy przez białko CBD_TP84_28_His oceniono również za pomocą immunoblottingu na filtrze celulozowym, metodą opisaną przez Sun i wsp. (2022). Procedurę przeprowadzono równolegle dla CBD_TP84_28_His i kontroli: TP84_28_His i buforu 1 x PBS. Roztwór z CBD_TP84_28_His (10 μg) oraz roztwory kontrolne TP84_28_His (10 μg) i 20 μl 1 x PBS nakrapiano na filtr celulozowy i pozostawiano do wyschnięcia na 2 minuty w temperaturze pokojowej i przepłukiwano 1-krotnie w 5 ml 1 x PBS. Następnie filtr celulozowy inkubowano 10 min z 5 ml bufom blokującego (5% mleka w buforze TBS), po czym płukano w buforze TBST. Następnie filtr inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 30°C z przeciwciałami anty-His sprzężonymi z HRP rozcieńczonymi w stosunku 1:2000 w 3 ml 1 x TBST, a następnie płukano 3-krotnie w 5 ml buforu TBST płuczącego i wywoływano przygotowaną mieszaniną DAB (3,3-diaminobenzydyna; substrat dla enzymu HRP). Obserwacje i wnioski opisano poniżej i przedstawiono na Fig. 12A.

Wyniki

Pojawienie się ciemnych plam na filtrze wskazuje na działanie enzymu HRP z substratem DAB poprzez pomyślne przyłączenie się przeciwciała do etykiety His-tag. W przypadku CBD_TP84_28_His widoczny jest pozytywny efekt reakcji i ciemna plamka, ponieważ białko uprzednio związało się do filtra celulozowego poprzez domenę CBD. Jednak w przypadku białka TP84_28_His, które również posiada etykietę His, przeciwciało anty-His nie wiąże się, ponieważ białko bez domeny CBD nie kotwiczy się do filtra celulozowego, więc zostało wcześniej odpłukane roztworem 1 x PBS (Fig. 12B).

Powyższe wyniki wskazują, że rekombinowana fuzyjna endolizyna CBD_TP84_28 wykazuje silne wiązanie z celulozą

Przykład 6. Właściwości lityczne rekombinowanej fuzyjnej endolizyny CBD_TP84_28_His Test dyfuzyjny

Przygotowano płytki z pożywką odpowiednią dla bakterii, które miały być przedmiotem testów [LA (na 1000 mL pożywki: 10 g trypton, 5 g ekstrakt drożdżowy, 10 g NaCl, 15 g agar) dla E. coli (KPD 168- BA), Bacillus subtilis (B. subtilis) (KPD 112-BA), Bacillus cereus (B. cereus) (KPD 110-BA), Bacillus stearothermophilus (B. steartothermophilus) (KPD109-BA), G. stearothermophillus, szczep 10 (BGSC No. 9A21) oraz 2xYT stała (na 1000 mL: 16 g trypton, 10 g ekstrakt drożdżowy, 5 g NaCl, 15 g agar) dla Geobacillus ICI (G. ICI) (KPD 1699) i TM (in 1000 mL: 3 g trypton, 2 g ekstrakt drożdżowy, 100 mL 10 x soli Castenholz, 20 g agar) dla Thermus aquaticus (T. aquaticus) (DSM 625) i wykonano posiew na murawę przy użyciu 100 μl nocnej hodowli bakteryjnej. Bakterie hodowano w optymalnej dla danego szczepu temperaturze (E. coli, B. subtilis, B. cereus - 37°C, G. stearothermophillus, szczep 10 - 55°C, B. steartothermophilus, T. aquaticus, G. ICI - 60°C) przez kilka godzin do momentu pojawienia się jednolitej murawy, a następnie na środek płytki nakrapiano po 10 μl roztworu zawierającego białko CBD_TP84_28_His o stężeniu 0,145 mg/mL i pozostawiano na 40 min celem wchłonięcia. Płytki pozostawiano na 3 h w cieplarce w odpowiedniej temperaturze (E. coli, B. subtilis, B. cereus - 42°C, G. stearothermophillus, szczep 10 - 55°C, B. steartothermophilus, T. aquaticus, G. ICI - 60°C) a następnie oceniano wizualnie (ocena jakościowa) aktywność białka CBD_TP_84_28 wobec badanego szczepu. Wyniki omówiono poniżej oraz przedstawiono na Fig. 13.

Test redukcji mętności (TRA) przy użyciu spektrofotometru

Użyty test TRA był metodą zaadaptowaną od Donovan et al. (2006) używaną wcześniej przez nas zespół w badaniach nad endolizyną (Żebrowska et al., 2022). Założono hodowlę nocną wybranych szczepów bakteryjnych i inkubowano przez 16 h w wytrząsarce powietrznej w odpowiedniej dla szczepu temperaturze i pożywce (pożywka LB w 37°C dla E. coli, B. subtilis, B. cereus; pożywka LB w 55°C dla G. stearothermophilus, szczep 10; pożywka LB w 60°C dla B. steartothermophilus, G. ICI, pożywka 2xYT płynna w 60°C T. aquaticus). Następnie odmładzono hodowlę nocną, zaszczepiając świeżą pożywkę wybraną dla danego szczepu bakteryjnego do OD600nm = 0,1 i hodując do OD600nm = 0,6. Następnie hodowlę wirowano (4000 x g, 10 min, 4°C). Otrzymany osad bakteryjny ponownie zawieszono w buforze (50 mM Na/PO4, 150 mM NaCl) w temperaturze pokojowej do OD600nm = 0,6. Następnie, do 10 ml świeżo przygotowanej hodowli zawieszonej w buforze dodawano 100 μΙ endolizyny CBD_TP84_28_His do końcowego stężenia 1,45 μg/ml. Tak przygotowaną mieszaninę inkubowano w wytrząsarce powietrznej w temperaturze 55°C. W 5-minutowych odstępach pobierano 1 ml próbki w celu pomiaru OD600mn przy użyciu spektrofotometru (Jenyway 7205, Cole-Parmer Ltd., UK). Wyniki zostały przedstawione w formie wykresu na Fig. 14.

Test na aktywność lityczną przeciwko biofilmowi

Potencjał białka fuzyjnego CBD_TP84_28_His wobec biofilmu wytworzonego przez bakterie: E. coli (DSM 1103), Staphylococcus aureus (S. aureus) (ATCC25923), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) (ATCC 17503), Salmonella enteritidis S. enteritidis (ATCC 25928), B. cereus (DSM 31) i G. stearothermophilus, szczep 10 (BGSC No. 9A21) został oceniony przy użyciu ilościowego testu spektrofotometrycznego w płytkach do mikromiareczkowania, zgodnie z procedurą opisaną w artykule charakteryzującym endolizynę TP84_28_His (Żebrowska et al., 2022): najpierw bakterie były pozostawiane na noc w stosunku 1:150 w pożywce TSBg (1,7% pepton K; 0,3% pepton SP; 0,5% NaCl; 0,25% K2HPO4; 0,25% glukoza, pH 7,3), a następnie 4 ml roztworu przelewano do jednego z dołków 6-dołkowej płytki z płaskim dnem z polistyrenu (Nest Scientific Biotechnology). Aby dokonać analizy skuteczności przeciwko biofilmowi utworzonemu przez G. stearothermophilus, szczep 10 dodawano fuzyjną endolizynę CBD_TP84_28_His: w ilości 0,05-50 μg (Fig. 15), zaś aby przeanalizować skuteczność przeciwko innym rodzajom bakterii patogennych używano 2 μg enzymu. Następnie płytki z biofilmem i dodanym enzymem inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 55°C (G. stearothermophilus, szczep 10) lub przez 24 godziny w temperaturze 37°C i 1 h w temperaturze 55°C (pozostałe bakterie). Następnie płytki zostały przemyte 4 ml 1 x PBS (137 mM NaCl; 10 mM Na2HPO4; 1,8 mM KH2PO4; 2,7 mM KCl, pH=7,4) i były barwione 0,1% roztworem fioletu krystalicznego w 33% kwasie octowym (Harleco; EMD Millipore Chemicals) przez 15 minut oraz ponownie dwukrotnie przemyte 4 ml 1 x PBS. Pomiar OD600mn był wykonywany przy użyciu czytnika mikropłytkowego Spectra Wallac 1420 Victor 3. Jako kontroli negatywnej użyto TSBg oraz biofilmu bakterii nie poddanych działaniu białka CBD_TP84_28_His. Zbadano także wpływ fuzyjnej endolizyny CBD_TP84_28_His na tworzenie biofilmu przez patogenne bakterie mezofilne E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, S. enteritidis. oraz B. cereus stanowiące problem w medycynie klinicznej. Wyniki doświadczenia omówiono poniżej oraz przedstawiono w tabeli 1.

Wyniki

Test dyfuzyjny

W przypadku bakterii mezofilnych nie zaobserwowano istotnych przejaśnień w miejscu nakrapiania CBD_TP84_28_His na płytki z wysianymi szczepami: B. subtilis i S. aureus, natomiast zaobserwowano niewielkie zahamowanie wzrostu w przypadku E. coli lac (+) oraz brak wzrostu szczepu B. cereus. W przypadku bakterii termofilnych G. stearothermophlius, szczep 10, T. aquaticus, G. ICI, B. stearothermophilus obserwowano wyraźne przejaśnienia w miejscu nakrapiania CBD_TP84_28 (Fig. 13). Test redukcji mętności (TRA) przy użyciu spektrofotometru

Redukcja wartości OD600 w roztworach zawierających zawieszone bakterie po dodaniu CBD_TP84_28_His była wyraźna w przypadku T. aquaticus, G. ICI, B. stearothermophilus oraz G. stearothermophilus, szczep 10. Niejednoznaczny efekt lityczny zaobserwowano wobec B. cereus i B. subtilis oraz E. coli lac (+). Wyniki przedstawiono na Fig. 14.

Test na aktywność lityczną przeciwko biofilmowi

Dodanie 0,05 μg CBD_TP84_28_His zmniejszyło tworzenie biofilmu przez G. stearothermophilus , szczep 10 o 10%, dodanie 0,25 μg białka zmniejszyło je o 59%, zastosowanie 0,5 μg zmniejszyło je o 79%, a użycie 5 μg i 50 μg CBD_TP84_28_His spowodowało redukcję tworzenia biofilmu odpowiednio o 96% i 98% (Fig. 15). W przypadku bakterii patogennych, fuzyjna endolizyna CBD_TP84_28_His najsilniej hamowała tworzenie biofilmu przez bakterie S. aureus (aż 81,25%); dla P. aeruginosa wyniosło to 42,04%, dla E. coli 39,63%, a dla Salmonella sp. i B. cereus hamowanie tworzenia biofilmu wyniosło nieco ponad 30% w ciągu 1 h inkubacji w temperaturze 55°C (Tabela 1).

Tabela 1. Rozkład biofilmu utworzonego przez E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, S. enteritidis, B. cereus i G. stearothermophilus, szczep 10 (gospodarz). Tabela przedstawia wartości OD600nm mierzone po zastosowaniu 2 μg CBD_TP84_28_His wobec określonych szczepów bakteryjnych i oraz bez jej zastosowania. Inkubacja odbywała się w temperaturze 37°C przez 24 godziny i w temperaturze 55°C przez 1 godzinę.

PL 249602 Β1

Lp.	Szczep bakterii	Próbka kontrolna [ODeoo]	Próbka poddana działaniu CBD_TP84_28_His [ODeoo]	Stopień hamowania [%]
1	£. coli DSM 1103	5,4	3,26	39.63
2	S. aureus ATCC 25923	1,6	0,3	81.25
3	P. aeruginosa ATCC 17503	14,89	8,63	42,04
4	S. enteritidis ATCC 25928	0,141	0,093	34,04
5	B. cereus DSM 31	11,98	8,02	33.06
6	Kontrola negatywna	0,00	0,00	0,00

Powyższe wyniki wskazują, że CBD_TP84_28_His wykazuje silną aktywność lityczną wobec szczepów bakterii termofilnych G. stearothermophlius, szczep 10, T. aquaticus, G. ICI oraz B. stearothermophilus oraz niewielką aktywność wobec mezofilnego szczepu B. cereus należącego do tego samego rodzaju bakterii, co gospodarz faga TP-84, z którego pochodzi endolizyną TP84_28_His. Zaobserwowano również niewielką aktywność wobec E. coli lac (+), szczepu bakterii mezofilnej odległej filogenetycznie od gospodarza G. stearothermophlius, szczep 10. CBD_TP84_28_His skutecznie rozkłada biofilm tworzony przez G. stearothermophlius, szczep 10 oraz S. aureus oraz w mniejszym, ale wciąż istotnym stopniu biofilm tworzony przez P. aeruginosa, E. coli, S. enteritidis i B. cereus.

Przykład 7. Wrażliwość rekombinowanej fuzyjnej endolizyny CBD_TP84_28_His na temperaturę.

Test redukcji mętności TRA przy użyciu czytnika mikropłytkowego Tecan po preinkubacji CBD TP84 28 His w gradiencie temperaturowym.

Założono hodowlę nocną G. stearothermophilus, szczep 10 i inkubowano w wytrząsarce powietrznej w temperaturze 55°C przez 16 h. Następnie odmłodzono hodowlę nocną, zaszczepiając świeżą pożywkę wybraną dla danego szczepu bakteryjnego do ODeoomn = 0,6. Hodowlę odwirowano (4000 x g, 10 min, 4°C). Otrzymany osad bakteryjny został ponownie zawieszony w buforze (50 mM Na/PO4,150 mM NaCI) w temperaturze pokojowej, aż osiągnął ODeoonm bliskie ODeoomn = 0,6. Zawiesinę bakteryjną (95 μΙ) umieszczono w każdym z 14 dołków, a do każdego dołka dodano 5 μΙ CBD_TP84_28_His o stężeniu 0,5 mg/mL, uzyskując końcowe stężenie 25 μg/mL. Białko CBD_TP84_28_His (stężeniu 0,5 mg/ml 100 μΙ) w buforze 50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI przed dodaniem do dołków zostało poddane preinkubacji w różnych temperaturach (37,7°C, 45,7°C, 50,0°C, 57,5°C, 65,1 °C, 70°C, 81,2°C, 86,2°C, 90,0°C, 95,8°C, 100°C przez 30 min oraz autoklawowaniu 121 °C, 20 min) celem ustalenia wpływu temperatury na trwałość cząsteczki i jej aktywność wobec bakterii. Pomiar ODeoomn wykonywano w 5-minutowych regularnych odstępach czasu w jednakowym czasie dla wszystkich dołków (Fig. 16).

Dodatkowo do wyznaczenia temperatury topnienia białka CBD_TP84_28_His użyto NanoDSF, zaawansowanej fluorometrii różnicowej, do pomiaru temperatury rozwijania białka CBD_TP84-28 (Prometheus Panta, NanoTemper Technologies, Monachium, Niemcy). Próbka białka o stężeniu 0,5 mg/mL w buforze 50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI została wprowadzona do kapilary i poddana pomiarom laserowym. Białka zawierające reszty tryptofanu, absorbują światło przy długości fali 280 nm. Ich właściwości emisyjne zmieniają się w zależności od środowiska chemicznego. Gdy są chronione przed roztworem wodnym, tak jak po złożeniu, mają pik emisji fluorescencji przy 330 nm.

Po wystawieniu na działanie roztworu hydrofobowe łańcuchy boczne mają inne właściwości emisji i mają maksimum fluorescencji przy 350 nm. Występuje również ogólne przesunięcie emisji tyrozyny, co jest przydatne w rzadkich przypadkach, gdy białko nie zawiera reszt tryptofanu. Wykreślenie stosunku F350/F330 względem gradientu stężenia próbki daje wykres, który ma punkt przegięcia w punkcie temperatury topnienia. Wysoce czuła optyka umożliwia monitorowanie przesunięcia fluorescencji przypisywanego rozwijaniu z powodu denaturacji termicznej lub chemicznej. Parametry rampy termicznej - gradient 25°C do 95°C, szybkość 1 °C/min, DLS 500msec. Wyniki jednoznacznie wskazują termostabilność białka, którego temperatura topnienia wynosi 73,06°C, a początek rozfałdowywania się białka, co wiąże się z utratą części aktywności, następuje w temperaturze 64,98°C.

Porównywalną aktywność lityczną obserwowano dla próbek preinkubowanych w zakresie temperatur od 30°C do 65,1 °C. Zauważono znaczny spadek aktywności litycznej w próbce preinkubowanej w temperaturze 70°C, a dalszy spadek tempa reakcji obserwowano w próbce inkubowanej w temperaturze 74,8°C (Fig. 16). Dalszy wzrost temperatury preinkubacji nie wpłynął na aktywność enzymu.

Powyższe wyniki wskazują, że rekombinowana fuzyjną endolizyną CBD_TP84_28_His wykazuje wysoką termostabilność, a jej temperatura rozwijania się białka mieści się w zakresie od 65,1°C do 74,8°C. Pomiary na urządzeniu Prometheus Panta (NanoTemper Technologies, Monachium, Niemcy) potwierdziły te obserwacje. Na podstawie wskazanych wyników, potwierdzających stabilność konformacji białka w wysokich temperaturach, wysoce prawdopodobnym jest, że fuzyjne białko będzie wykazywało wyjątkowo wysoką stabilność podczas długoterminowego przechowywania oraz aplikacji na powierzchnie celulozowe.

Literatura:

1. Centers for Disease Control and Prevention, 2019 AR Threats Report, https://www.cdc.gov/drugresistance/biggest-threats.html#:~:text=Learn%20how%20CDC%20is%20taking,people%20die%20as%20a%20result., data dostępu: 16.02.2024,

2. Schuch R, Cassino C, Vila-Farres X. Direct Lytic Agents: Novel, Rapidly Acting Potential Antimicrobial Treatment Modalities for Systemic Use in the Era of Rising Antibiotic Resistance. Front Microbiol. 2022 Mar 3; 13:841905. doi:10.3389/fmicb.2022.841905. PMID: 35308352; PMCID: PMC8928733,

3. Maciejewska B, Olszak T, Drulis-Kawa Z. Applications of bacteriophages versus phage enzymes to combat and cure bacterial infections: an ambitious and also a realistic application? Appl Microbiol Biotechnol. 2018 Mar; 102(6):2563-2581. doi:10.1007/s00253-018-8811-1. Epub 2018 Feb 13. PMID: 29442169; PMCID: PMC5847195,

4. Grishin AV, Karyagina AS, Vasina DV, Vasina IV, Gushchin VA, Lunin VG. Resistance to peptidoglycan-degrading enzymes. Crit Rev Microbiol. 2020 Nov; 46(6):703-726. doi:10.1080/1040841X.2020.1825333. Epub 2020 Sep 26. PMID: 32985279,

5. Gladskin EU 2022, Eczemact dermatitis Cream for itching & Redness https://www.gladskin.co.uk/products/eczema-cream, data dostępu: 23.01.2024,

6. Żebrowska J, Żołnierkiewicz O, Ponikowska M, Puchalski M, Krawczun N, Makowska J, Skowron P. Cloning and Characterization of a Thermostable Endolysin of Bacteriophage TP-84 as a Potential Disinfectant and Biofilm-Removing Biological Agent. Int J Mol Sci. 2022 Jul 9; 23(14):7612. doi:10.3390/ijms23147612. PMID: 35886960; PMCID: PMC9325043,

7. Sun X, Yang S, Al-Dossary AA, Broitman S, Ni Y, Guan M, Yang M, Li J. Nanobody-Functionalized Cellulose for Capturing SARS-CoV-2. Appl Environ Microbiol. 2022 Mar 8; 88(5):e0230321. doi:10.1128/aem.02303-21. Epub 2022 Jan 5. PMID: 34985974; PMCID: PMC8904043,

8. Żebrowska J, Mucha P, Prusinowski M, Krefft D, Żylicz-Stachula A, Deptuła M, Skoniecka A, Tymińska A, Zawrzykraj M, Zieliński J, Pikuła M and Skowron P. Development of hybrid biomicroparticles: cellulose exposing functionalized fusion proteins. Microbial Cell Factories (2024) 23:81; https://doi.org/10.1186/s12934-024-02344-x.

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Fuzyjne białko rekombinowane oznaczone jako CBD_TP84_28_His obejmujące:

   a) domenę katalityczną w postaci endolizyny TP84_28 pochodzącą z bakteriofaga TP-84, b) domenę wiążącą celulozę CBD pochodzącą z celulazy Clostridium cellulovorans.
2. 2. Fuzyjne białko rekombinowane według zastrz. 1, znamienne tym, że obejmuje znacznik białkowy His-tag, co najmniej His6.
3. 3. Sposób otrzymywania fuzyjnego białka rekombinowanego oznaczonego jako CBD_TP84_28_His na drodze genetycznej, znamienny tym, że łączy się endolizynę TP84_28 pochodzącą z bakteriofaga TP-84 z domeną wiążącą celulozę pochodzącą z celulazy Clostridium cellulovorans poprzez fuzję genów kodujących endolizynę TP84_28 i domenę wiążącą celulozę enzymu celulazy z Clostridium cellulovorans.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że dodatkowo dołącza się znacznik białkowy His- tag, co najmniej His6.
5. 5. Zastosowanie fuzyjnego białka rekombinowanego oznaczonego jako CBD_TP84_28_His jak określono w zastrz. 1-2 jako środka dezynfekcyjnego do eliminacji bakterii i biofilmów.
6. 6. Zastosowanie białka fuzyjnego według zastrz. 5 w formie rozpuszczalnej.
7. 7. Zastosowanie białka fuzyjnego według zastrz. 5 w formie związanej z celulozą.