PL249801B1

PL249801B1 - Formulacja nanocząstek fosforanu wapnia o zwiększonym wychwycie komórkowym modyfikowanych lecytyną jako nośnika bisfosfonianów oraz sposób jej wytwarzania

Info

Publication number: PL249801B1
Application number: PL441261A
Authority: PL
Inventors: Michał Wojasiński; Jolanta CZERSKA-DUSZAK; Jolanta Czerska-Duszak; Joanna Latocha; Artur Małolepszy; Tomasz CIACH; Tomasz Ciach
Original assignee: Politechnika Warszawska
Priority date: 2022-05-24
Filing date: 2022-05-24
Publication date: 2026-06-22
Also published as: JP2025517853A; WO2023228105A1; US20250381141A1; CN118541142A; EP4426268A1; PL441261A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest formulacja nanocząstek fosforanu wapnia, korzystnie hydroksyapatytu, modyfikowanych lecytyną, korzystnie fosfatydylocholiną, o zwiększonym wychwycie komórkowym jako nośnik bisfosfonianu, charakteryzująca się tym że bisfosfonian jest wybrany z grupy leków-bisfosfonianów dopuszczonych do zastosowań medycznych obejmującej alendronian oraz zoledronian, bisfosfonian jest enkapsulowany w nanocząstkach fosforanu wapnia w ilości do 40% masowych a nanocząstki mają rozmiar poniżej 200 nm. Przedmiotem zgłoszenia jest również sposób otrzymywania formulacji.

Description

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy formulacji nanocząstek fosforanu wapnia, w tym hydroksyapatytu, modyfikowanych lecytyną, w tym fosfatydylocholiną, o zwiększonym wychwycie komórkowym jako nośnika leków z grupy bisfosfonianów, na przykład alendronianu sodu. Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania takiej formulacji.

Sposób wytwarzania nanocząstek hydroksyapatytu modyfikowanych lecytyną opisano w Pat.229015 oraz w zgłoszeniu patentowym P.434278. W pierwszym z dokumentów ujawniono sposób okresowego otrzymywania nanocząstek hydroksyapatytu w obecności lecytyny, która pełni dwie funkcje: środka kontrolującego rozmiar i kształt cząstek oraz środka zwiększającego ich biozgodność. W patencie tym wykazano pośrednio wpływ modyfikacji lecytyną na właściwości biozgodności. W drugim z dokumentów ujawniono reaktor do ciągłej syntezy nanocząstek hydroksyapatytu modyfikowanych lecytyną. Nanocząstki hydroksyapatytu mogą znaleźć zastosowanie terapeutyczne ze względu na swoje podobieństwo morfologiczne i chemiczne do mineralnej części kości. Takie zastosowania dotyczą regeneracji uszkodzeń i ubytków kości oraz wspieranie odbudowy i remodelowania mineralnej części tkanki kostnej.

Bisfosfoniany to grupa związków chemicznych, w których występują dwie grupy -C-P(O)-(OH)2 odporne na hydrolizę. Związki te wykazują silne powinowactwo do mineralnych składników kości - apatytów (Zhang, S., Gangal, G. i Uludag, H. Chem Soc Rev 36, 507-531 (2006)). Wykazują również aktywność w regulacji procesów remodelowania kości, przez co już od kilku dekad są podstawowym narzędziem w leczeniu osteoporozy i nowotworów kości. Do grupy bisfosfonianów należy kwas alendronowy czy częściej jego sól - alendronian sodu, jednak jego biodostępność przy podaniu doustnym jest bardzo niska (poniżej 1%) (Porras, A. G., Holland, S. D. & Gertz, B. J. Clin Pharmacokinet 36, 315-328 (1999)). Co więcej, przy podaniu doustnym lek ten generuje w górnym odcinku przewodu pokarmowego wiele skutków ubocznych, z których najpoważniejszym jest zwiększone ryzyko zachorowania na nowotwory (Sun, K., Liu, J. M., Sun, H. X., Lu, N. & Ning, G. Osteoporosis Int 24, 279-286 (2013)). Stąd, konieczne jest zaproponowanie odpowiednich formulacji farmaceutycznych bisfosfonianów do podawania doustnego, które poprawią biodostępność leku oraz zmniejszą skutki uboczne jego stosowania.

Z uwagi na potencjalny podwójny efekt terapeutyczny, wytwarzanie formulacji zawierających nanocząstki hydroksyapatytu i alendronian jest znane w dziedzinie.

J. Neamtu et al., J Therm Anal Calorim, 2017, 127:1567-1582E przedstawia sposób syntezy nanocząstek alendronian-hydroksyapatyt z azotanu wapnia, wodorofosforanu diamonu i alendronianu sposobem chemicznej precypitacji do zastosowań w biomateriałach. Formulację nanocząstek zawierających alendronian otrzymano w reaktorze okresowym na dwa sposoby:

1) dodanie roztworu alendronianu do mieszaniny po strąceniu nanocząstek hydroksyapatytu,

2) dodanie roztworu alendronianu do jednego z reagentów. Publikacja opisuje również wykorzystanie sposobów krystalograficznych, spektroskopowych oraz termicznych do charakterystyki chemicznej i fizycznej kompozytów oraz określenia profilu uwalniania alendronianu. W pracy nie wykazano żadnej dodatkowej modyfikacji potencjalnie poprawiającej biodostępność uzyskanej formulacji.

E. Boanini et al., Biomaterials, 29, 2008, 790-796 opisuje sposób wytwarzania nanocząstek hydroksyapatytu z alendronianem oraz ich interakcję z osteoklastami i komórkami osteoblastopodobnymi in vitro. Według przeprowadzonych badań, obecność bisfosfonianów w nanokryształach hamuje proliferację osteoklastów oraz promuje wzrost i różnicowanie osteoblastów, a w szczególności osteoblastów hodowanych w obecności nanocząstek o stosunkowo wysokiej zawartości alendronianu, które wykazują podwyższone wartości aktywności fosfatazy alkalicznej i kolagenu typu I. Ponownie, autorzy nie opisali dodatkowych modyfikacji cząstek w celu potencjalnej poprawy biodostępności formulacji.

R. Bosco et al., Applied Surface Science 328, 2015, 516-524 przedstawia sposób pokrywania tytanowych implantów kostnych nanokryształami alendronian-hydroksyapatyt o zawartości alendronianu około 30% wag. Pokrycie uzyskane zostało sposobem elektrostatycznego osadzania natryskowego (ESD) lub zanurzania w roztworze zawierającym rozpuszczony bisfosfonian. Opisane wyniki badań in vitro wykazały aktywną rolę kryształów nHAALE w zmniejszaniu liczby żywych osteoklastów.

R. Sun et al. Nanomaterials, 2019, 10(1): 20 opisuje sposób otrzymywania amorficznych nanocząstek fosforanu wapnia przez działanie roztworem kwasu fosforowego w metanolu na zawiesinę cząstek amorficznego węglanu wapnia w metanolu. Tak otrzymane nanocząstki były następnie załadowywane lekiem z grupy bisfosfonianów - alendronianem. Publikacja wskazuje na zgodność otrzymanych nanocząstek amorficznego fosforanu wapnia niezaładowanych lekiem z komórkami pre-osteoblastycznymi mysimi linii MC3T3 w hodowli in vitro, przy jednoczesnym ograniczeniu tzw. efektu burst, czyli uwolnienia znaczącej ilości leku z nanocząstek w początkowym okresie badania wydzielania. W pracy nie wskazano jednak zastosowania dodatkowej modyfikacji powierzchni nanocząstek za pomocą czynników poprawiających biodostępność uzyskanej formulacji, jak również nie określono, czy nanocząstki załadowane lekiem są wychwytywane przez komórki chętniej niż cząstki niezawierające leku.

M. Fazil et al. Drug Deliv., 2015, 22(1): 1-9 wskazuje szereg sposobów na dostarczenie leków z grupy bisfosfonianów, w tym alendronianu i zoledronianu z wykorzystaniem nanocząstek, w celu poprawy biodostępności tej grupy leków i zmniejszenia ich skutków ubocznych. W grupie wymienionych w tej pracy sposobów znajdują się: nanocząstki polimerowe, liposomy, systemy podawania miejscowego, systemy przezskórne, implanty, bisfosfonianowe osteotropowe systemy dostarczania leków, mikrosfery oraz cementy fosforanowo-wapniowe. W opisanej powyżej grupie nie znalazły się jednak nanocząstki fosforanu wapnia, w tym hydroksyapatytu, a w szczególności nanocząstki fosforanu wapnia, w tym hydroksyapatytu modyfikowane lecytyną, w tym fosfatydylocholiną, które miałyby zwiększony wychwyt komórkowy i powodowałyby zwiększenie wychwytu bisfosfonianu, takiego jak alendronian lub zoledronian.

S. Simona et al. Nanomaterials, 2021, 11(11): 2983 opisuje proces otrzymywania nanocząstek lipidowych pokrytych warstwą fosforanu wapnia, które mogłyby służyć jako nośnik leków, np. w terapii osteoporozy. W przedstawionym rozwiązaniu, składnikiem lipidowego rdzenia nanocząstek jest lecytyna pochodząca z soi (95% fosfatydylocholiny). Po otrzymaniu nanocząstek lipidowych w „rozcieńczaniu mikroemulsji na zimno” - metodzie opracowanej przez zespół autorów omawianej pracy - zastosowano dwie metody pokrywania nanocząstek lipidowych warstwą fosforanu wapnia: 1. Dodano do jednego naczynia wodne roztwory chlorku wapnia oraz kwasu fosforowego i zawiesinę nanocząstek lipidowych, a następnie podniesiono pH mieszaniny do 8,5 za pomocą 1M roztworu NaOH mieszając; 2. Oczyszczono zawiesinę nanocząstek lipidowych, a następnie sekwencyjnie, metodą „layer-by-layer” nałożono warstwy fosforanu wapnia z wykorzystaniem naprzemiennie roztworów wodnych chlorku wapnia oraz wodorofosforanu sodu. W celu zbadania potencjalnych właściwości nanocząstek jako nośnika leku, w trakcie przygotowywania nanocząstek lipidowych do obu metod użyto modelowej substancji barwnika Sudan III. W opisywanej pracy, lecytyna, gównie fosfatydylocholina, stanowiła jedynie składnik nanocząstek lipidowych i jej zastosowanie nie miało na celu poprawy biodostępności uzyskanego nośnika leku, a w szczególności, poprawy wychwytu komórkowego tego nośnika.

Istnieje również szereg publikacji patentowych ujawniających zastosowanie kompozycji zawierającej hydroksyapatyt oraz alendronian. CN108478872A opisuje sposób wytwarzania cementu kostnego z PMMA zawierającego dodatkowo nanokompozyt hydroksyapatyt-alendronian do zastosowania w wypełnianiu ubytków kostnych. Publikacja patentowa WO2009035265 przedstawia sposób syntezy oraz zastosowanie fosforanów wapnia jako systemów opartych o mikrocząstki do doustnego podawania leków z grupy bisfosofnianów, w tym alendronianu, w leczeniu osteoporozy. Ujawniona zawartość leku w formulacji mieści się w zakresie 1-50% wagowych, w przeliczeniu na 100% wagowych hydroksyapatytu, a synteza przeprowadzana jest sposobem krystalizacji z układu emulsji woda-olej.

Patent US nr 8,158,153 ujawnia formulację do podawania doustnego opartą o nanocząstki (o rozmiarze nieprzekraczającym 2000 nm) z aktywnym kationem bisfosfonianu, zawierającą środek zwiększający przenikanie oraz środek chelatujący. Ujawniona formulacja nie zawiera fosforanów wapnia, w tym hydroksyapatytu. US6783772B1 ujawnia kompozycję doustną w postaci tabletki zawierającej terapeutyczne ilości alendronianu sodu do uwalniania alendronianu sodu w żołądku i przez przełyk. Formulacja zawiera sprasowany, granulowany rdzeń z alendronianem sodu osadzonym w matrycy z obojętnych terapeutycznie włókien na bazie cukru. EP 2 548 441 B1 ujawnia formulację zawierającą bisfosfonian o przedłużonym uwalnianiu podawaną dożylnie.

Pomimo występowania w literaturze różnego rodzaju formulacji mających zapewnić odpowiednie dostarczenie bisfosfonianów, w tym alendronianu jako środka aktywnego w terapii osteoporozy, nadal istnieje zapotrzebowanie na formulację o ulepszonym wychwycie komórkowym i powiększonym efekcie terapeutycznym.

Przedmiotem wynalazku jest formulacja nanocząstek fosforanu wapnia, modyfikowanych fosfatydylocholiną, o zwiększonym wychwycie komórkowym jako nośnik bisfosfonianu, charakteryzująca się tym, że bisfosfonian jest wybrany z grupy leków-bisfosfonianów dopuszczonych do zastosowań me dycznych obejmującej alendronian w postaci alendronianu sodu oraz zoledronian w postaci kwasu zoledronowego, bisfosfonian w nanocząstkach fosforanu wapnia jest w ilości do 40% masowych w przeliczeniu na 100% masowych nanocząstek hydroksyapatytu, a nanocząstki mają rozmiar poniżej 200 nm.

Korzystnie, alendronian jest wprowadzany do formulacji w postaci alendronianu sodu w stężeniu w zakresie 5 mM - 15 mM na objętość mieszaniny reakcyjnej.

Korzystnie, zoledronian jest wprowadzany do formulacji w postaci kwasu zoledronowego w stężeniu 5 mM na objętość mieszaniny reakcyjnej.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób otrzymywania nanocząstek fosforanu wapnia obejmujący etapy: a) rozpuszczania Ca(NO3)2 · 4H2O w roztworze lecytyny o stężeniu 0,6% wag./obj., b) równoległego rozpuszczania (NH4LHPO4 w roztworze bisfosfonianu o stężeniu w zakresie 5 mM do 15 mM, c) doprowadzania pH roztworu powstałego w etapie a. oraz roztworu powstałego w etapie b. do wartości 10 z zastosowaniem wody amoniakalnej, d) mieszania roztworów z etapu c. w reaktorze w celu otrzymania zawiesiny w temperaturze pokojowej, przy stałej szybkości dozowania roztworów wynoszącej 500 ml/h, e) odwirowania zawiesiny z etapu d. przez 30 minut z prędkością 4500 obr./min. w celu otrzymania osadu, f) oczyszczania osadu z etapu e. przez czterokrotne płukanie wodą ultraczystą, przy czym po każdym płukaniu osad jest odwirowywany przez 10 minut z prędkością 4500 obr./min., g) suszenia osadu z etapu f. w 50°C przez 12-24 h, h) mielenia osadu z etapu g. w młynie kulowym przez 10 minut, z prędkością 150 rpm, przy czym etap d. przeprowadzany jest w reaktorze ciągłym lub okresowym.

Korzystnie, reaktor stosowany w sposobie jest reaktorem ciągłym.

Krótki opis figur

Fig. 1. przedstawia zdjęcia wykonane skaningowym mikroskopem elektronowym cząstek zawierających lecytynę i alendronian otrzymanych w sposobie przy stężeniu alendronianu użytego do strącania wynoszącym a) 5 mM, c) 10 mM, e) 15 mM w przeliczeniu na objętość mieszaniny reakcyjnej oraz g) cząstek zawierających tylko lecytynę i zdjęcia cząstek zawierających alendronian otrzymanych w sposobie przy stężeniu alendronianu użytego do strącania wynoszącym b) 5 mM, d) 10 mM, f) 15 mM w przeliczeniu na objętość mieszaniny reakcyjnej oraz h) cząstek czystego hydroksyapatytu.

Fig. 2. przedstawia zdjęcia wykonane skanującym laserowym mikroskopem konfokalnym powstałe z nałożenia obrazu światła przechodzącego oraz fluorescencji nanocząstek hydroksyapatytu wzbudzanych laserem o długości fali 488 nm obrazujące komórki kostne w kontakcie z a) czystym hydroksyapatytem, b) hydroksyapatytem modyfikowanym lecytyną. Strzałki wskazują cząstki pobrane przez komórki. Skala wynosi 25 μm.

Fig. 3. przedstawia wyniki wydzielania alendronianu (średnia masa uwolnionego alendronianu (mg) w odniesieniu do masy próbki formulacji użytej do badania (0,5 g)) z cząstek hydroksyapatytu zawierających alendronian i lecytynę oraz cząstek zawierających tylko alendronian a) w medium do wydzielania o pH=7,4 (n=3), b) w medium do wydzielania o pH=5,0 (n=3).

Korzystne przykłady wykonania wynalazku obejmują przede wszystkim formulację nanocząstek hydroksyapatytu zmodyfikowanych lecytyną, które zawierają bisfosfonian, korzystnie kwas alendronowy lub jego sól sodową. Takie korzystne formulację otrzymywane są w reakcji strącania w reaktorze przepływowym, gdzie do reakcji użyto do około 500 mg alendronianu sodu, co stanowi maksymalną dopuszczalną zawartość alendronianu sodu (rozpuszczalność w wodzie: 10 mg/mL) w roztworze reagenta (50 mL) w reakcji strącania. Dodatkowo, takie formulacje strącane są w obecności lecytyny (około 98% fosfatydylocholiny) w celu zwiększenia wychwytu komórkowego nanocząstek formulacji, a przez to potencjalnemu zwiększeniu biodostępności formulacji.

Poniżej wynalazek został opisany w szczegółowych przykładach wykonania. Przedstawione przykłady nie mają jednak charakteru ograniczającego.

Przykład 1 - nHAp-LE-AL 5 mM

Odważono 0,3 g lecytyny (fosfatydylocholina, Lipoid S PC-3, Lipoid GmbH, Niemcy) i rozpuszczono w 50 mL wody ultraczystej w temperaturze około 60°C przez około 30 minut mieszając. Następnie odważono 5,904 g czterowodnego azotanu (V) wapnia - Ca(NO3)2 · 4H2O, które następnie rozpuszczono w ostudzonym wcześniej roztworze lecytyny. Odważono 162,5 mg alendronianu sodu (5 mM w przeliczeniu na 100 mL mieszaniny reakcyjnej) i rozpuszczono w 50 mL wody ultraczystej. Następnie odważono 1,981 g wodorofosforanu di-amonu - (NH4EHPO4 i rozpuszczono w roztworze alendronianu sodu. Wykorzystując roztwór wody amoniakalnej, ustawiono pH obu reagentów na wartość 10. Przygotowane roztwory zmieszano w reaktorze przepływowym w temperaturze pokojowej przy zachowaniu stałej szybkości dozowania równej 500 mL/h. Zastosowano reaktor przepływowy o geometrii Y z kanałami wlotowymi o długości 50 mm oraz kanałem wylotowym o długości 10 mm, wymiarach przekroju kwadratowego kanałów wynoszących 1 mm x 1 mm. Otrzymaną w zbiorniku odbiorczym zawiesinę (100 mL) odwirowywano przez 30 minut przy prędkości 4500 rpm. Następnie supernatant zlano, a pozostały osad czterokrotnie oczyszczono poprzez przepłukanie wodą ultraczystą i odwirowanie (10 minut, 4500 rpm). Końcowy produkt pozostawiono do suszenia w temperaturze 50°C przez ok. 12 h, a następnie mielono w młynie kulowym przez 10 minut, z prędkością 150 rpm. Otrzymany produkt miał formę proszku o białawym kolorze. Produkt oznaczono akronimem nHAp-LE-AL 5 mM.

Przykład 2 - nHAp-LE-AL 10 mM

Odważono 0,3 g lecytyny (fosfatydylocholina, Lipoid S PC-3, Lipoid GmbH, Niemcy) i rozpuszczono w 50 mL wody ultraczystej w temperaturze około 60°C przez około 30 minut mieszając. Następnie odważono 5,904 g czterowodnego azotanu (V) wapnia - Ca(NOs)2 · 4H2O, które następnie rozpuszczono w ostudzonym wcześniej roztworze lecytyny. Odważono 325,0 mg alendronianu sodu (10 mM w przeliczeniu na 100 mL mieszaniny reakcyjnej) i rozpuszczono w 50 mL wody ultraczystej. Następnie odważono 1,981 g wodorofosforanu di-amonu - (NHty-HPO.··'. i rozpuszczono w roztworze alendronianu sodu. Wykorzystując roztwór wody amoniakalnej, ustawiono pH obu reagentów na wartość 10. Przygotowane roztwory zmieszano w reaktorze przepływowym w warunkach opisanych w przykładzie 1. Otrzymaną w zbiorniku odbiorczym zawiesinę (100 mL) oczyszczono i produkt końcowy przygotowano tak jak w przykładzie 1. Otrzymany produkt miał formę proszku o białawym kolorze. Produkt oznaczono akronimem nHAp-LE-AL 10 mM.

Przykład 3 - nHAp-LE-AL 15 mM

Odważono 0,3 g lecytyny (fosfatydylocholina, Lipoid S PC-3, Lipoid GmbH, Niemcy) i rozpuszczono w 50 mL wody ultraczystej w temperaturze około 60°C przez około 30 minut mieszając. Następnie odważono 5,904 g czterowodnego azotanu (V) wapnia - Ca(NOs)2 · 4H2O, które następnie rozpuszczono w ostudzonym wcześniej roztworze lecytyny. Odważono 487,5 mg alendronianu sodu (15 mM w przeliczeniu na 100 mL mieszaniny reakcyjnej) i rozpuszczono w 50 mL wody ultraczystej. Następnie odważono 1,981 g wodorofosforanu di-amonu - (NHty-HPO.··'. i rozpuszczono w roztworze alendronianu sodu. Wykorzystując roztwór wody amoniakalnej, ustawiono pH obu reagentów na wartość 10. Przygotowane roztwory zmieszano w reaktorze przepływowym w warunkach opisanych w przykładzie 1. Otrzymaną w zbiorniku odbiorczym zawiesinę (100 mL) oczyszczono i produkt końcowy przygotowano tak jak w przykładzie 1. Otrzymany produkt miał formę proszku o białawym kolorze. Produkt oznaczono akronimem nHAp-LE-AL 15 mM.

Przykład 4 - nHAp-LE-ZL 5 mM

Odważono 0,3 g lecytyny (fosfatydylocholina, Lipoid S PC-3, Lipoid GmbH, Niemcy) i rozpuszczono w 50 mL wody ultraczystej w temperaturze około 60°C przez około 30 minut mieszając. Następnie odważono 5,904 g czterowodnego azotanu (V) wapnia - Ca(NOs)2 · 4H2O, które następnie rozpuszczono w ostudzonym wcześniej roztworze lecytyny. Odważono 145,1 mg kwasu zoledronowego 1-hydrat (5 mM w przeliczeniu na 100 mL mieszaniny reakcyjnej) i rozpuszczono w 50 mL wody ultraczystej. Następnie odważono 1,981 g wodorofosforanu di-amonu - (NH4)2HPO4 i rozpuszczono w roztworze zolendronianu. Wykorzystując roztwór wody amoniakalnej, ustawiono pH obu reagentów na wartość 10. Przygotowane roztwory zmieszano w reaktorze przepływowym w warunkach opisanych w przykładzie 1. Otrzymaną w zbiorniku odbiorczym zawiesinę (100 mL) oczyszczono i produkt końcowy przygotowano tak jak w przykładzie 1. Otrzymany produkt miał formę proszku o białawym kolorze. Produkt oznaczono akronimem nHAp-LE-ZL 5 mM.

Przykład 5 (porównawczy) - nHAp-AL 5 mM

Odważono 5,904 g czterowodnego azotanu (V) wapnia - Ca(NOs)2 · 4H2O, które następnie rozpuszczono w 50 mL wody ultraczystej. Odważono 162,5 mg alendronianu sodu (5 mM w przeliczeniu na 100 mL mieszaniny reakcyjnej) i rozpuszczono w 50 mL wody ultraczystej. Następnie odważono 1,981 g wodorofosforanu di-amonu - (NH4)2HPO4 i rozpuszczono w roztworze alendronianu sodu. Wykorzystując roztwór wody amoniakalnej, ustawiono pH obu reagentów na wartość 10. Przygotowane roztwory zmieszano w reaktorze przepływowym w warunkach opisanych w przykładzie 1. Otrzymaną w zbiorniku odbiorczym zawiesinę (100 mL) oczyszczono i produkt końcowy przygotowano tak jak w przykładzie 1. Otrzymany produkt miał formę proszku o białawym kolorze. Produkt oznaczono akronimem nHAp-AL 5 mM.

Przykład 6 (porównawczy) - nHAp-AL 10 mM

Odważono 5,904 g czterowodnego azotanu (V) wapnia - Ca(NO3)2 · 4H2O, które następnie rozpuszczono w 50 mL wody ultraczystej. Odważono 325,0 mg alendronianu sodu (10 mM w przeliczeniu na 100 mL mieszaniny reakcyjnej) i rozpuszczono w 50 mL wody ultraczystej. Następnie odważono 1,981 g wodorofosforanu di-amonu - (NH4)2HPO4 i rozpuszczono w roztworze alendronianu sodu. Wykorzystując roztwór wody amoniakalnej, ustawiono pH obu reagentów na wartość 10. Przygotowane roztwory zmieszano w reaktorze przepływowym w warunkach opisanych w przykładzie 1. Otrzymaną w zbiorniku odbiorczym zawiesinę (100 mL) oczyszczono i produkt końcowy przygotowano tak jak w przykładzie 1. Otrzymany produkt miał formę proszku o białawym kolorze. Produkt oznaczono akronimem nHAp-AL 10 mM.

Przykład 7 (porównawczy) - nHAp-AL 15 mM

Odważono 5,904 g czterowodnego azotanu (V) wapnia - Ca(NO3)2 · 4H2O, które następnie rozpuszczono w 50 mL wody ultraczystej. Odważono 487,5 mg alendronianu sodu (15 mM w przeliczeniu na 100 mL mieszaniny reakcyjnej) i rozpuszczono w 50 mL wody ultraczystej. Następnie odważono 1,981 g wodorofosforanu di-amonu - (NH4)2HPO4 i rozpuszczono w roztworze alendronianu sodu. Wykorzystując roztwór wody amoniakalnej, ustawiono pH obu reagentów na wartość 10. Przygotowane roztwory zmieszano w reaktorze przepływowym w warunkach opisanych w przykładzie 1. Otrzymaną w zbiorniku odbiorczym zawiesinę (100 mL) oczyszczono i produkt końcowy przygotowano tak jak w przykładzie 1. Otrzymany produkt miał formę proszku o białawym kolorze. Produkt oznaczono akronimem nHAp-AL 15 mM.

Przykład 8 (porównawczy) - nHAp

Odważono 5,904 g czterowodnego azotanu (V) wapnia - Ca(NO3)2 · 4H2O, które następnie rozpuszczono w 50 mL wody ultraczystej. Następnie odważono 1,981 g wodorofosforanu di-amonu (NH4)2HPO4 i rozpuszczono w 50 mL wody ultraczystej. Wykorzystując roztwór wody amoniakalnej, ustawiono pH obu reagentów na wartość 10. Przygotowane roztwory zmieszano w reaktorze przepływowym w warunkach opisanych w przykładzie 1. Otrzymaną w zbiorniku odbiorczym zawiesinę (100 mL) oczyszczono i produkt końcowy przygotowano tak jak w przykładzie 1. Otrzymany produkt miał formę proszku o białawym kolorze. Produkt oznaczono akronimem nHAp.

Przykład 9 (porównawczy) - nHAp-LE

Odważono 0,3 g lecytyny (fosfatydylocholina, Lipoid S PC-3, Lipoid GmbH, Niemcy) i rozpuszczono w 50 mL wody ultraczystej w temperaturze około 60°C przez około 30 minut mieszając. Następnie odważono 5,904 g czterowodnego azotanu (V) wapnia - Ca(NO3)2 · 4H2O, które następnie rozpuszczono w ostudzonym wcześniej roztworze lecytyny. Następnie odważono 1,981 g wodorofosforanu diamonu - (NH4)2HPO4 i rozpuszczono w 50 mL wody ultraczystej. Wykorzystując roztwór wody amoniakalnej, ustawiono pH obu reagentów na wartość 10. Przygotowane roztwory zmieszano w reaktorze przepływowym w warunkach opisanych w przykładzie 1. Otrzymaną w zbiorniku odbiorczym zawiesinę (100 mL) oczyszczono i produkt końcowy przygotowano tak jak w przykładzie 1. Otrzymany produkt miał formę proszku o białawym kolorze. Produkt oznaczono akronimem nHAp-LE.

Przykład 10 - Skaningowa mikroskopia elektronowa

Rozmiar pojedynczych cząstek hydroksyapatytu określono na podstawie zdjęć pochodzących ze skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Przed obrazowaniem próbki hydroksyapatytu napylano 10 nm warstwą przewodzącą - złoto-pallad. Wykorzystano napylarkę Q150T (Quorum, UK), natomiast zdjęcia SEM wykonano skaningowym mikroskopem elektronowym SU8230 (Hitachi, Japonia). Zdjęcia badanych cząstek zebrano na figurze 1. Cząstki z dodatkiem alendronianu do syntezy wykazywały znaczący wzrost rozmiaru pojedynczej cząstki w porównaniu do cząstek niezawierających tej substancji aktywnej.

Przykład 11 - Pomiar rozmiarów cząstek

Zdjęcia SEM poddano analizie cyfrowej w celu określenia rozmiaru cząstek hydroksyapatytu. Analizy dokonano za pomocą programu ImageJ (wersja 2.3.0/1.53f). Dla każdej badanej próbki wykonano 100 niezależnych pomiarów wielkości cząstek. Wynik jako średnią wraz z odchyleniem standardowym podano w tabeli 1. Zaobserwowano znaczący wzrost rozmiaru cząstek po dodaniu do syntezy alendronianu sodu.

PL 249801 Β1

Przykład 12 - Pomiar rozmiaru cząstek w zawiesinie wodnej

Pomiary rozmiaru cząstek w zawiesinie wodnej wykonano z wykorzystaniem aparatu Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., UK) wyposażonego w laser czerwony o długości fali 633 nm. Próbki do analizy przygotowano poprzez sporządzenie 1% (wag./obj.) zawiesiny proszku hydroksyapatytu w 10 mM KNO3. Próbki poddawano dodatkowo działaniu ultradźwięków przez ok. 10 minut przy użyciu homogenizatora ultradźwiękowego UP100H (Hielscher Ultrasonics, Niemcy), a następnie 50-krotnie rozcieńczano i filtrowano z zastosowaniem filtra strzykawkowego o rozmiarze porów wynoszącym 0,45 μΠΊ w celu usunięcia zanieczyszczeń i pyłów. Pomiary wykonywano w stałej temperaturze 25°C w pięciu powtórzeniach. Wynik podano w tabeli 1 jako średnią wraz z odchyleniem standardowym. Średnie obliczono na podstawie rozkładów rozmiarów cząstek ważonych liczbowo. Wzrost średniego rozmiaru cząstek zawierających alendronian sodu, w porównaniu do cząstek niezawierających substancji aktywnej wskazuje na możliwą enkapsulację środka aktywnego wewnątrz cząstek i/lub jego przyłączenie na powierzchni cząstek.

Przykład 13 - Pomiar potencjału zeta

Pomiary potencjału zeta wykonano z wykorzystaniem aparatu Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., UK) wyposażonego w laser czerwony o długości fali 633 nm. Próbki do analizy przygotowano poprzez sporządzenie 1% (wag./obj.) zawiesiny proszku hydroksyapatytu w 10 mM KNO3. Próbki poddawano dodatkowo działaniu ultradźwięków przez ok. 10 minut przy użyciu homogenizatora ultradźwiękowego UP100H (Hielscher Ultrasonics, Niemcy), a następnie 50-krotnie rozcieńczano. Pomiary wykonywano w stałej temperaturze 25°C w pięciu powtórzeniach. Wynik podano jako średnią wraz z odchyleniem standardowym w tabeli 1. Zmiany wartości potencjału zeta powierzchni badanych cząstek są nieznaczne, a zmierzone wartości wskazują, że otrzymane proszki hydroksyapatytu zawierające lecytynę i alendronian sodu oraz proszki zawierające tylko alendronian sodu mają tendencję do tworzenia aglomeratów w środowisku wodnym. Aglomeraty te można jednak skutecznie dyspergować sposobami znanymi w dziedzinie.

Przykład 14 - Analiza termograwimetryczna

Pomiary w analizie termograwimetrycznej (TGA) wykonano przy użyciu aparatu Mettler Toledo TGA/DSC 3+ w zakresie temperatur od 30 do 1000°C przy szybkości wygrzewania wynoszącej 10°C/min. Badania przeprowadzono przy ciągłym przepływie powietrza o strumieniu 30 mL/min. Na podstawie otrzymanych wyników określono zawartość alendronianu sodu w przygotowanych formulacjach stosując zależności:

- dla hydroksyapatytu niemodyfikowanego lecytyną:

., _x ^^wnHAp-AL ~ ^^wnHAp _Λ

AL (% masowy) = —------------- x 100%

Aw_al - Aw_nHAp

- dla hydroksyapatytu modyfikowanego lecytyną:

...... , ^^WnHAp-LE-AL ~ L.W_leLE — Aw_nHAp(l — LE)

AL (% masowy) = --------------------------------X 100%

Aw_al - Aw_nHAp gdzie:

Awal, Awle, AwnHAp, AwnHAp-AL, AwnHAp-LE-AL oznaczają ubytek masy próbek, odpowiednio: alendronianu sodu (AL), lecytyny (LE), nanocząstek hydroksyapatytu (nHAp), nanocząstek hydroksyapatytu zawierających alendronian (nHAp-AL) oraz nanocząstek hydroksyapatytu zawierających lecytynę i alendronian (nHAp-LE-AL) w badaniu TGA, wyrażony w ułamku masowym;

LE - oznacza zawartość lecytyny w proszku nanocząstek hydroksyapatytu wyrażoną w ułamku masowym.

Obliczone zawartości alendronianu sodu (% masowy) w proszkach formulacji z przykładów według wynalazku (przykłady 1-4) i przykładów porównawczych (przykłady 5-9) zastawiono w Tabeli 1.

PL 249801 Β1

Tabela 1

Zawartość AL w proszkach (TGA) [% masowy]	34,8	38,5	39,3	22,5	o. cs	25,8	26,5		1
Potencj ał zeta w zawiesinie wodnej ± SD [mV]	o -H 1	-9,3 ± 0,6	-5,2 ± 1,5	0,0 ±0,1	cn -H O	-13,1 ±2,4	-11,6 ± 1,3	-11,6 ± 1,8	-H 00 1
Średni rozmiar cząstek w zawiesinie wodnej ± SD [nm]	49 ±6	41 ±9	60 ± 10	79 ±29	43 ± 12	54 ±25	48 ±21	± o	36 ± 6
Rozmiar cząstki ± SD (SEM) [nm]	-H	55 ± 15	64 ± 15	40 ±9	43 ± 13	51 ± 15	56 ± 15	22 ±5	21 ±5
Formulacja	Formulacja według przykładu 1	Formulacja według przykładu 2	Formulacja według przykładu 3	Formulacja według przykładu 4	Formulacja według przykładu 5	Formulacja według przykładu 6	Formulacja według przykładu 7	Formulacja według przykładu 8	Formulacja według przykładu 9

Przykład 15 - Pomiar zwiększonego wychwytu komórkowego nanocząstek hydroksyapatytu

Do badania zwiększonego wychwytu komórkowego nanocząstek hydroksyapatytu zmodyfikowanych powierzchniowo lecytyną użyto komórek ludzkiego mięsaka kości linii MG63 (SigmaAldrich,

Niemcy). Przed eksperymentem komórki namnażano w medium hodowlanym DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) suplementowanym przez dodanie 10% obj./obj. surowicy bydlęcej oraz antybiotyków (100 U/mL penicyliny, 100 mg/mL streptomycyny). Zawiesinę komórek o stężeniu 105 kom/mL przeniesiono na powierzchnię sterylnych okrągłych szkiełek nakrywkowych umieszczonych w dołkach płytki 24 dołkowej. Do każdego dołka podano 1 mL zawiesiny komórek. Przygotowano po dwa powtórzenia dla każdego badanego proszku hydroksyapatytu (n=2). Do badania przygotowano próbki proszków hydroksyapatytu modyfikowanego lecytyną (nHAp-LE) oraz czystego hydroksyapatytu (nHAp). Próbki proszków do badania przygotowano poprzez sporządzenie 1% (wag./obj.) zawiesiny proszku hydroksyapatytu w buforze fosforanowym (PBS, pH=7,4). Próbki poddawano dodatkowo działaniu ultradźwięków przez ok. 10 minut przy użyciu homogenizatora ultradźwiękowego UP100H (Hielscher Ultrasonics, Niemcy), a następnie 50-krotnie rozcieńczono i filtrowano z zastosowaniem filtra strzykawkowego o rozmiarze porów wynoszącym 0,45 ąm w celu usunięcia zanieczyszczeń, pyłów oraz w celu dodatkowej sterylizacji próbek. Po 4 h inkubacji komórek osteoblastów z zawiesinami nanocząstek nHAp-LE i nHAp odciągnięto zawiesiny znad komórek i przepłukano komórki dwukrotnie sterylnym PBS oraz utrwalono komórki sposobem znanym w dziedzinie, z wykorzystaniem paraformaldehydu. Szkiełka nakrywkowe, na których hodowano komórki przeniesiono na zwilżone szkiełka podstawowe i obserwowano przy użyciu konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego Zeiss LSM880 (Zeiss, Niemcy). Wykonano zdjęcia preparatów wykorzystując światło przechodzącego oraz fluorescencję nanocząstek hydroksyapatytu wzbudzanych laserem o długości fali 488 nm. W ten sposób przedstawiono wychwyt nanocząstek nHAp-LE i nHAp przez komórki kostne (figura 2). Nanocząstki modyfikowane lecytyną były chętniej wychwytywane przez komórki kostne w przedstawionym badaniu.

Przykład 16 - Pomiar szybkości wydzielania alendronianu z formulacji

Odważono po 500 mg proszku nHAp-LE-AL 5 mM (174,0 mg AL w proszku) i nHAp-AL 5 mM (135,2 mg AL w proszku) i zawieszono w 10 mL medium do wydzielania każdy. W taki sposób przygotowano po 3 próbki każdego z badanych materiałów na eksperyment (n=3). Jako medium do wydzielana użyto PBS o pH wynoszącym 7,4 (eksperyment nr 1) oraz pH wynoszącym 5,0 (eksperyment nr 2). Eksperymenty badania wydzielania alendronianu z formulacji nanocząstek hydroksyapatytu według wynalazku prowadzano przez 30 dni. Podczas trwania eksperymentów utrzymywano temperaturę naczyń do badania wydzielania wynoszącą 37°C, a zawiesiny mieszano. Próbki pobierano w ustalonych odstępach czasowych. Przed pobraniem próbek, badane zawiesiny poddawano wirowaniu (10 minut, 4500 rpm). Po wirowaniu, z każdego naczynia do badania szybkości wydzielania pobierano dwie próbki supernatantu o objętości 0,5 mL, a następnie natychmiast uzupełniano medium do wydzielania o pobraną objętość. Następnie zmieszano każdą pobraną próbkę z 0,5 mL 0,4 mM roztworu FeCh w 4 M HCIO4. Zmierzono absorbancję tak przygotowanej mieszaniny (przy długości fali wynoszącej 290 nm), a stężenie alendronianu określono na podstawie wcześniej przygotowanej krzywej wzorcowej. Wyniki przedstawiono jako średnią masę uwolnionego alendronianu (mg) w odniesieniu do masy próbki formulacji użytej do badania (0,5 g) ± SD (n=3). Wydzielanie substancji aktywnej z formulacji przebiegało szybciej w warunkach o niższym z badanych pH, które odpowiada pH w endosomach komórek.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Formulacja nanocząstek hydroksyapatytu, modyfikowanych fosfatydylocholiną, o zwiększonym wychwycie komórkowym jako nośnik bisfosfonianu, znamienna tym, że bisfosfonian jest wybrany z grupy leków-bisfosfonianów dopuszczonych do zastosowań medycznych obejmującej alendronian w postaci alendronianu sodu oraz zoledronian w postaci kwasu zoledronowego, bisfosfonian w nanocząstkach fosforanu wapnia jest w ilości do 40% masowych w przeliczeniu na 100% masowych nanocząstek hydroksyapatytu, a nanocząstki mają rozmiar poniżej 200 nm.
2. Formulacja według zastrz. 1, znamienna tym, że alendronian jest wprowadzany do formulacji w postaci alendronianu sodu w stężeniu w zakresie 5 mM - 15 mM na objętość mieszaniny reakcyjnej.
3. Formulacja według zastrz. 1, znamienna tym, że zoledronian jest wprowadzany do formulacji w postaci kwasu zoledronowego w stężeniu 5 mM na objętość mieszaniny reakcyjnej.
4. Sposób otrzymywania formulacji według zastrz. 1 obejmujący etapy:

a. rozpuszczania Ca(NO3)2 · 4H2O w roztworze lecytyny o stężeniu 0,6% wag./obj.,

b. równoległego rozpuszczania (NH4)2HPO4 w roztworze bisfosfonianu o stężeniu w zakresie 5 mM do 15 mM,

c. doprowadzania pH roztworu powstałego w etapie a. oraz roztworu powstałego w etapie b. do wartości 10 z zastosowaniem wody amoniakalnej,

d. mieszania roztworów z etapu c. w reaktorze w celu otrzymania zawiesiny w temperaturze pokojowej, przy stałej szybkości dozowania roztworów wynoszącej 500 ml/h,

e. odwirowania zawiesiny z etapu d. przez 30 minut z prędkością 4500 obr./min. w celu otrzymania osadu,

f. oczyszczania osadu z etapu e. przez czterokrotne płukanie wodą ultraczystą, przy czym po każdym płukaniu osad jest odwirowywany przez 10 minut z prędkością 4500 obr./min.,

g. suszenia osadu z etapu f. w 50°C przez 12-24 h,

h. mielenia osadu z etapu g. w młynie kulowym przez 10 minut, z prędkością 150 rpm, przy czym etap d. przeprowadzany jest w reaktorze ciągłym lub okresowym.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że reaktor jest reaktorem ciągłym.